Vi præsenterer her, en protokol for at lede menneskers primære prostata organoid håndtering så foreslår slutpunkter for at vurdere fænotype. Såning, kultur vedligeholdelse, recovery fra matrix gel, er morfologiske kvantificering, integrering og skæring, FFPE skæring, hele-mount farvning og anvendelse af kommercielle assays beskrevet.
Dette papir beskriver en detaljeret protokol for tre-dimensionelle (3D) dyrkning, håndtering og vurdering af menneskers primære prostata organoids. Processen indebærer, såning af epitelceller tyndt i en 3D matrix gel på en 96-brønd mikrotiterplade med medieændringer at dyrke ekspansion i organoids. Morfologi vurderes derefter af hele-godt indfange af z-stak billeder. Komprimering af z-stakke skaber et enkelt i-fokus billede hvorfra organoids er målt til at kvantificere en række udgange, herunder cirkularitet, rundhed og område. DNA, RNA og protein kan indsamles fra organoids inddrives fra matrix gel. Cellepopulationer af interesse kan vurderes ved organoid dissociation og flow flowcytometri. Formalin-fiksering-paraffin-embedding (FFPE) efterfulgt af skæring bruges til histologisk vurdering og antistoffarvning. Hele-mount immunfluorescent farvning bevarer organoid morfologi og letter observation af protein lokalisering i organoids i stedet. Kommercielle assays, der traditionelt bruges til 2D éncellelag celler kan ændres for 3D organoids. Bruges sammen, giver teknikkerne i denne protokol en robust værktøjskasse for at kvantificere prostata organoid vækst, morfologiske kendetegn og udtryk for differentiering markører.
Organoids er et værdifuldt redskab til at studere organogenesis og sygdom. De giver et billigere alternativ til dyre modeller, og patienten-afledte organoids udvikler sig som en strategi for personlig medicin1,2,3. Dette tre-dimensionelle (3D) kultur system indebærer såning stilk eller stamfader celler (høstet fra væv eller induceret pluripotente stamceller) i en gel af ekstracellulære matrix komponenter (matrix gel)4. Cellerne formere sig og differentiere, hvilket resulterer i organotypic strukturer, at sammenfatte de cellulære hierarki og morfologi af orgel af interesses funktionel enhed. Organoids er dyrket ved hjælp af celler med oprindelse fra en række forskellige organer, herunder spytkirtel, maven, tarmen, leveren, prostata, lunge og hjerne4. Selvom der er talrige protokoller der beskriver trin for at oprette prostata organoids5,6, er det udfordrende at finder tilstrækkeligt detaljerede metoder til at opnå kvantitative slutpunkter fra organoids. Dette papir opsummerer metoder udviklet for menneskers primære prostata celler og detaljer en række foreslåede slutpunkter til at vurdere organoid fænotyper. Disse teknikker var optimeret til prostata organoids og kan anvendes til andre 3D cellekulturer.
Prostata organoid kulturer har for nylig vist sig som en værdifuld in vitro- model, der mangler begrænsningerne af éncellelag kulturer ved hjælp af etableret udødeliggjort cellelinjer. Benign prostata epitel og prostatakræft er udfordrende at model i vitro bruger udødeliggjort cellelinjer. Antallet af godartede cellelinjer er begrænset, og alle har gennemgået forvandling med onkogener7. Primære prostata epitelceller i encellelag ikke differentiere i luminale celler og mangler androgen receptorer8. Fleste af prostata cancer cellelinjer har ikke funktionelle androgenreceptorer, en betydelig mægler tidlig sygdom, og mangel på vigtige genetiske ændringer, der er blevet fundet i patient tumorer9. Prostata organoid kulturer kan dyrkes nemt fra godartede epitel og er værdifulde i at studere egenskaber for stamceller, stamceller, differentiering og virkningerne af eksperimentelle ændringer i mikromiljø4,5. Prostata cancer organoids kan dyrkes som en del af et præcisionsindflyvning medicin til modellering patientens sygdom og svar på terapier10.
Denne protokol er blevet kompileret fra eksisterende protokoller, der bruger forskellige celletyper, men det her er optimeret til brug i menneskelige primære prostata celler. Det komplimenter protokoller skitseret af Sawyers, Clevers og Shen5,6 , der beskriver vækst, passaging, lysfelt imaging, kryopræservering, og RNA og DNA isolation af prostata mus og menneskelige organoids. Hele-mount-protokollen er ændret fra Mahé et al. 11, der brugte gastrointestinale epitelial organoids og beskriver live imaging og frosne og paraffin indlejring. Borten et al. 12 beskrevne analyse af bryst, kolon og kolorektal cancer organoid morfologi fra lysfelt billeddannelse. Derudover Richards mfl. 13 anvendes en metode til morfologiske vurdering af prostata organoids. Endelig, Hu et al. 14 beskrevet en metode af vedhængende prostata organoids til et kammer dias natten før immunfluorescent farvning for at observere enkelt celler og spredning af kugler til flow flowcytometri analyse.
Målet med denne protokol er at påvise tilstrækkelig detaljeret disse teknisk udfordrende metoder som én protokol, herunder celle såning; medier og matrix gel vedligeholdelse; samling af celler til flowcytometri; RNA, DNA og protein udvinding; morfologiske vurdering fra lysfelt z-stakken analyse; indlejring, forarbejdning og skæring for histologiske farvning; og hele-montering til immunofluorescens eller fluorescerende sonde assays. Biologisk relevans og fortolkning af disse forskellige slutpunkter varierer blandt eksperimentelle design og antistoffer bruges til analyseformål. Gennem udnyttelse af denne protokol, bør brugere føler sig parat til at oprette et eksperiment med en værktøjskasse af slutpunkter.
Menneskelige primære prostata (PrE) epitelceller blev etableret i laboratoriet af protokollen beskrevet af Peehl15,16 og vedligeholdes således, at et begrænset antal passager (op til fire) som tidligere beskrevet17, men de er også tilgængelig fra kommercielle leverandører. Hepatocyt serumfrit mediebaseret6, KSFM-baserede13og R-spondin 1-aircondition5 medier offentliggøres alle som har med succes produceret organoids. KSFM-baserede kræver færrest mulige tilsætningsstoffer, så det er beskrevet her.
Organotypic kultur er en spændende ny metode til recapitulating væv med bekvemmeligheden af en in vitro- miljø. I øjeblikket vokse labs organoids fra mange typer af væv til forskellige slutpunkter. Metoderne beskrevet i denne hvidbog opsummere nyttige slutpunkter og fremhæve nye teknikker for at fuldt ud at beskrive 3D primære prostata cellekulturer.
Der er en bred vifte af medier opskrifter til at dyrke menneskelige primære prostata celle organoids5,6,13. Mens alle nå levedygtige og sammenlignelige resultater, bruger KSFM-baserede medier13 minimal tilsætningsstoffer så det er beskrevet her. Derudover er blevet offentliggjort papirer, ved hjælp af flere koncentrationer for matrix gel, fra 10% til 75% til kultur prostata organoids5,6,13. Fordi matrix gel er en bekostelig reagens, og 33% matrix gel har vist sig at være tilstrækkeligt til at dyrke langsigtede (2-3 uger), levedygtig, unclumped organoids13, dette er den anbefalede koncentration. Men matrix gel kan variere i proteinkoncentration mellem lotnumre, så dette bør tages i betragtning, når plating. Det anbefales også at købe matrix gel i bulk til brug på tværs af flere eksperimenter for at reducere uoverensstemmelse mellem masser. Andre labs har udgivet forskellige formater til plating matrix gel, som dråber i stedet for belægning en 96-brønd plade godt5. Begge metoder danne levedygtige organoids, men formatet beskrevet her mulighed for celler til at være forgyldt mere sparsomt, som har vist sig at fremme udvidelse af celler ind i større organoids13. Dog bør plating tæthed optimeres baseret off patient-specifikke dannelse effektivitet. Matrix gel er tilgængelig i mange formater herunder vækstfaktor-reduceret, phenol rød-fri, høj koncentration, osv. Vækstfaktor-reduceret anbefales for defineret dyrkningsbetingelser, og phenol rød-fri anbefales, når du arbejder med celler, der udtrykker normal god landbrugspraksis eller i eksperimenter, der involverer z-stakken billedoptagelse. Det er afgørende, at enhver matrix gel plating trin udføres med iskold reagenser, som matrix gel størkner hurtigt ved stuetemperatur.
Organoids dyrkes under forskellige eksperimentelle behandlinger kan medføre ændringer i form, så lysfelt imaging er meget udbredt at studere observerede morfologiske fænotyper. Optagelse og kvantificere område eller form er dog en udfordring af to årsager: 1) udvalg bias under billedoptagelse og 2) anvender en to-dimensionel parameter såsom område til en tre-dimensionel stikprøve. Én strategi billedoptagelse er at optage et tilfældigt felt og måle et forudbestemt antal organoids på dette område, men dette kan skabe bias i udvalg, og alle organoids i det valgte felt muligvis ikke være i fokus. Hele-godt imaging optimeret til formatet 96-brønd mikrotiterplade eliminerer denne prøveudtagning bias ved at samle hele organoid befolkning af interesse. Dog afhængig af mikroskop mål på hånd, flere felter muligvis være indsamlet og flise for at opnå en helhed-godt billede. Nogle laboratorier har beskrevet målefeltet fra en enkelt z-fly12, men for at fange alle organoids i fokus, anbefales det at indsamle og stable flere fly i en enkelt EUF-billede13. I nogle tilfælde, en menisk i matrix gel kan forårsage vignettering i billedet, og baggrunden korrektion metoder kan være nødvendigt at være anvendt ved hjælp af billede analyse software. Nøjagtige volumen er ideelt den mest passende måling for organoid størrelse; Det er imidlertid vanskeligt at netop få, selv med flere z-stak billeder. Andre nyttige morfologiske dimensioner, såsom cirkularitet og maksimum/minimum forholdet, kan let beregnes fra alle organoids i en helhed-godt EUF billede. Sammen, disse metoder overvinde prøveudtagning bias udfordringer og aktiverer måling af 2D parametre fra 3D-objekter i et 3D-rum.
Formalin fiksering og paraffin indlejring af organoids er en fælles metode til at opnå hæmatoxylin og eosin (H & E), immunhistokemisk (IHC) og immunfluorescent (IF) farvning for visualisering og analyse6,11, 20. imidlertid publikationer, der har beskrevet denne teknik mangler omfattende detaljer om indlejring processen. Derudover kan at lokalisere organoids inden for paraffin blok være udfordrende. Nogle laboratorier pre pletten organoids med trypan blå forud for indlejring støtte i placering ved skæring11. Metoden beskrevet her omfatter anvendelse af en histologisk farvestof til orientering af organoid/histologi gelplug under indlejring for at fremme effektiviteten af skæring. H & E dias lette undersøgelsen af nekrose, nukleare tekstur og spredning, og det bør således være en obligatorisk slutpunktet for organoid kultur til at sikre, at cellerne er sund i hele området. En styrke af organoid kultur er, at prøverne består af en heterogen blanding af celler, der bedre ligner i vivo patient væv. I prostata, eksempelvis er både basal og luminale celler til stede i prostata organoids5, mens celler dyrkes i 2D manglende luminale differentiering8. For at vurdere organoid differentiering, anbefales det, at forskere vurderer basal markører som CK5 og p63 og luminale markører som androgenreceptorer og CK88. Eventuelle andre eksperimentelle proteiner af interesse kan også studeres ved hjælp af disse farvning teknikker.
Selvom FFPE sektioner giver mulighed for visualisering af celler bosat i de indvendige rum via histologiske metoder (H & E, hvis, IHC), billeder er begrænset til cross sektioner, og organoid form kan ændres ved indlejring processen. Hele-mount farvning gør det muligt for en organoid at være plettet og observeret i situ, bevare morfologiske fænotyper og tillader billeder af protein lokalisering. Hele-montering er et værktøj, der er udnyttet til at pletten hele-væv eller hele-dyr prøver, såsom zebrafisk eller mus fosteret, og er let tilpasses til organoids. Den teknik beskrevet her blev ændret fra proceduren ved Mahéet al. 11, som indeholder oplysninger om den indledende vækst og kultur af gastrointestinal organoids direkte på et kammer dias til farvning, og som kræver fiksering af hele overordnet kultur. Metoden her skitserede indebærer overførsel af en enkelt organoid (eller organoids) af interesse på en kammer dias på tidspunktet for farvning. Dette giver mulighed for valg af individuelle organoids for hele-mount analyse i en igangværende eksperiment uden fiksation af den overordnede kultur. Når du udfører hele-mount farvning, det er nødvendigt at optimere permeabilization og inkubationstiden for primær og sekundær antistoffer til at sikre udbredelse i hele modellen (hvor som helst fra en eller flere dage anbefales). Når afbildet via Konfokal mikroskopi, kan 3D puds produceres for at aktivere visualisering og lokalisering af et specifikt protein og beregne antallet af positivt farvede celler findes i en prøve. Flowcytometri er en nyttig slutpunkt til at kvantificere populationer af basal, luminale, eller stilk celler5,14. For at gøre dette, er celler inddrives fra matrix gel og forsigtigt dissocieres til farvning. Brugere bør omhyggeligt vælge passende markører for adskillelse baseret på den aktuelle litteratur. For menneskers primære prostata epitelceller er CD26 og CD49f egnede luminale og basal markører, henholdsvis5,21.
I Resumé detaljer denne protokol menneskelige primære prostata organoid vækst, samling og eksperimenterende slutpunkter. Af note, kan montering teknik beskrevet anvendes til en lang række andre assays, der normalt er beskæftiget i 2D celler, såsom fluorescerende sonde-baserede eksperimenter ser på spredning19, apoptose og subcellulært organelle pletter. Derudover kunne samling og dissociation metoden beskrevet her udnyttes som forberedelse til én celle RNA sekventering18. Kollektivt, viser det muligheden for en bred vifte af roman, high-fidelity slutpunkter, at forskere kan optimere og udforske i fremtiden.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker UIC Biorespository medlemmer, Dr. Klara Valyi-Nagy, og Alex Susma, samt Urologer, Drs. Michael Abern, Daniel Moreira og Simone Crivallero, til lettelse af væv anskaffelsessum for de primære cellekulturer. Vi takker UIC Urologisk patienter for at donere deres væv til forskning. Dette arbejde blev finansieret, delvis af den afdeling af Defense prostata kræft forskning Program sundhed forskelle idé Award PC121923 (Nonn) og UIC Center for kliniske og oversættelse naturfagsundervisning Pre-doctoral for klinisk og translationel forskere ( PARTNERE) Program (McCray og Richards) og National Institutes of Health’s National Cancer Institute, Grant numre U54CA202995, U54CA202997 og U54CA203000, kendt som den Chicago sundhed Equity Collaborative (Nonn og Richards). Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health eller Department of Defense.
Cells of interest | |||
Keratinocyte-SFM (KSFM) | ThermoFisher Scientific | 17005042 | |
Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12676029 | |
5α-Dihydrotestosterone (DHT) | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
Matrigel (matrix gel) | Corning | Various | Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application |
Ice Bucket | |||
Cell Culture Hood | |||
1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical | ThermoFisher Scientific | 05-408-130, 339650 | |
Centrifuge | |||
Dispase (neutral protease) | STEMCELL Technologies | 7923 | neutral protease |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | suggested RNA extraction solution |
RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | suggested protein extraction solution |
DNAzol | ThermoFisher Scientific | 10503027 | suggested DNA extraction solution |
Organoids | |||
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
Brightfield microscope with camera capabilities | ex. EVOS FL Auto Imaging System | ||
Photo analysis software | ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler | ||
Graphing software | ex. Graphpad, Excel, etc | ||
Organoids | |||
Ice pack | |||
Masking tape | |||
Pipette tips (1000 μL) | |||
Razor blade | |||
Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9045 | |
HistoGel (histology-gel) | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
Pencil | |||
"Plunger" from 1 cc insulin syringe | |||
Tissue Casette | Thomas Scientific | 1202D72 | |
Container to hold fixative | |||
10% neutral buffered formalin (NBF) | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Histology pen, xylene and EtOH-resistant | Sigma-Aldrich | Z648191-12EA | STATMARK pen |
Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | For fixation and graded dilutions during processing |
Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
Deionized water | |||
Paraffin | Leica | various | |
Tissue processor | |||
Embedding workstation | |||
Economy Tissue Float Bath | Daigger | EF4575E XH-1001 | |
Microtome | |||
Microtome blades | Ted Pella | 27243 | |
Positively charged microscope slides | Thomas Scientific | 1158B91 | |
Laboratory Oven | ThermoFisher Scientific | PR305225G | |
Hematoxylin and Eosin Stain Kit | Vector Laboratories | H-3502 | Suggested H&E staining kit |
ABC Peroxidase Standard Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 32020 | Suggested immunohistochemistry staining kit |
Androgen Receptor Primary Antibody (AR) | Cell Signaling Technology | 5153S | Suggested primary antibody for IHC |
FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide | |||
Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | dilutions should be performed using deinoized water |
Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
Deionized water (DI H2O) | |||
Antigen retrieval solution | Sigma-Aldrich, Abcam | C9999, ab93684 | |
1x Phosphate Buffered Saline – PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
Normal Horse Serum | thermoFisher Scientific | 31874 | |
Bovin Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
Confocal microscope | |||
Coplin | Fisher Scientific | 19-4 | |
Staining rack | IHC World | M905-12DGY | |
Staining dish | IHC World | M900-12B | |
Decloaking chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
Humidity chamber | Thomas Scientific | 1219D68 | |
Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
Microscope cover glass | Globe Scientific | 1414-10 | |
Anti-fade mounting media | ThermoFisher Scientific | S36972 | |
Organoids | |||
Pipette tips (1000 μL) | |||
Pipette tips (200 μL) | |||
8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
Cell-Tak | Corning | CB40240 | optional adherent reagent |
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
4% paraformaldehye (PFA) | Biotium | 22023 | other fixatives such as methanol or formalin can be used |
50mM NH4Cl | sigma-Aldrich | 254134 | |
Triton™ X-100 (non-ionic detergent) | sigma-Aldrich | X100-1L | |
Normal Horse Serum (NHS) | thermoFisher Scientific | 31874 | |
Bovin Serum Albumin (BSA) | sigma-Aldrich | A2058 | |
Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Counterstain (phalloidin) | thermoFisher Scientific | A22287 | |
Sodium azide | sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
Confocal microscope | |||
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
Visikol HISTO-M | Visikol | various | optional clearing agent |
Organoids | |||
Pipette tips (1000 μL) | |||
Pipette tips (200 μL) | |||
8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
Cell-Tak | Corning | CB40240 | |
1x Phosphate Buffered Saline – PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Cell assay of interest | Various | Various | Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc) |
Organoids | |||
Ice bucket | |||
Cell culture hood | |||
1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical | |||
Microcentrifuge | |||
Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175079 | |
Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
Cytokeratin 5 Antibody – FITC | Millipore Sigma | FCMAB291F | Suggested flow antibody |
Cytokeratin 8 Antibody – Alexafluor 405 | Abcam | ab210139 | Suggested flow antibody |
CD49f – Alexafluor 647 | BioLegend | 313609 | Suggested flow antibody |
CD26 – PE | BioLegend | 320576 | Suggested flow antibody |