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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Bearbeitung und Bewertung der menschlichen primäre Prostata organoide Kultur

Published: January 17, 2019 doi: 10.3791/59051
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3, 1,3
1Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 2Departments of Urology, Physiology, and Biophysics, University of Illinois at Chicago, 3University of Illinois Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um menschliche primäre Prostata organoide Handhabung führen dann empfehle Endpunkte zur Beurteilung der Phänotyp. Aussaat, Kultur Wartung, Wiederherstellung von Matrix Gel sind morphologische Quantifizierung, einbetten und schneiden, FFPE-Schnitt, ganz-Mount Färbung und Anwendung von kommerziellen Assays bezeichnet.

Abstract

Dieses Whitepaper beschreibt ein detailliertes Protokoll für dreidimensionale (3D) Kultivierung, Handhabung und Auswertung des menschlichen primäre Prostata Organellen. Der Prozess umfasst Aussaat von Epithelzellen dünn in eine 3D Matrix Gel auf einer 96-Well-Mikrotestplatte mit Medien Änderungen an Expansion in Organellen zu kultivieren. Morphologie ist dann durch die ganze gut Erfassung von Z-Stapel Bilder bewertet. Kompression des Z-Stacks erstellt ein Einzelbild im Fokus aus dem Organellen gemessen werden, um eine Vielzahl von Ausgaben, einschließlich der Zirkularität, Rundheit und Umgebung zu quantifizieren. DNA, RNA und Proteine können von Organellen erholt aus dem Matrix-Gel gesammelt werden. Zell-Populationen von Interesse durch organoide Dissoziation beurteilt werden können und flow Cytometry. Formalin-Fixierung-Paraffin-Einbettung (FFPE) gefolgt von schneiden die histologische Bewertung und Antikörper Färbung dient. Vollständig-hängen immunofluorescent Färbung erhält organoide Morphologie und erleichtert die Beobachtung von Protein-Lokalisierung in Organellen in Situ. Kommerziellen Assays, die traditionell für 2D Monolage Zellen verwendet werden können für 3D Organellen geändert werden. Zusammen verwendet werden, bieten die Techniken in diesem Protokoll eine robuste Toolbox um Prostata organoide Wachstum, morphologische Merkmale und Ausdruck der Differenzierung Marker zu quantifizieren.

Introduction

Organellen sind ein wertvolles Instrument zur Organogenese und Krankheit zu studieren. Sie bieten eine preiswertere Alternative zu Tierversuchen und Patienten-abgeleitete Organellen sind als Strategie zur personalisierten Medizin1,2,3entwickelt. Dieses dreidimensionale (3D) Kultursystem umfasst zu einem Gel der extrazellulären Matrix Komponenten (Matrix Gel)4Aussaat Stammzellen und Vorläuferzellen Zellen (geerntet aus Gewebe oder induzierte pluripotente Stammzellen). Die Zellen vermehren und zu differenzieren, was zu organotypischen Strukturen, die die zellulären Hierarchie und Morphologie der Orgel von Interesse der Funktionseinheit zu rekapitulieren. Organellen sind mit Zellen aus verschiedenen Organen, einschließlich der Speicheldrüse, Magen, Darm, Leber, Prostata, Lunge und Gehirn4gewachsen worden. Zwar gibt es zahlreiche Protokolle beschreibt Schritte, um Prostata Organellen5,6herzustellen, ist es schwierig, ausreichend detaillierte Methoden zu finden, wie quantitative Endpunkte von Organellen zu erreichen. Dieses Dokument fasst Methoden für menschliche primäre Prostata-Zellen entwickelt und beschreibt eine Reihe von vorgeschlagenen Endpunkte die organoide Phänotypen zu beurteilen. Diese Techniken wurden optimiert für Prostata Organellen und können für andere 3D Zellkulturen gelten.

Prostata organoide Kulturen sind vor kurzem entstanden, als ein wertvollen in-vitro- Modell, das die Grenzen der Monolayer-Kulturen mit fehlt immortalisierte Zelllinien etabliert. Gutartige Prostata Epithel und Prostatakrebs ist herausfordernd, Modell in Vitro mit immortalisierte Zelllinien. Die Anzahl der gutartigen Zelllinien ist begrenzt, und alle haben Transformation mit Onkogene7unterzogen. Primäre epitheliale Zellen der Prostate in Monolagen luminalen Zellen differenzieren und Androgen-Rezeptoren8fehlt nicht. Die Mehrheit der Prostatakrebs-Zelllinien muss keinen funktionalen Androgen-Rezeptoren, eine bedeutende Vermittler der frühen Krankheitsstadium und fehlen wichtige genetische Veränderungen, die im Patienten Tumoren9gefunden wurden. Prostata organoide Kulturen von gutartige Epithel leicht angebaut werden können und sind wertvolle im Studium Stammzellen Eigenschaften, Vorläuferzellen, Differenzierung und Auswirkungen von Änderungen in der Mikroumgebung4,5. Prostatakrebs Organellen können als Bestandteil einer Präzisionsanflug Medizin zur Modellierung Patienten Krankheit und Reaktion auf Therapien10angebaut werden.

Dieses Protokoll wurde von bestehenden Protokolle, mit denen verschiedene Zelltypen zusammengestellt, aber es wurde hier für den Einsatz in primären menschlichen Prostata-Zellen optimiert. Es Komplimente Protokolle von Holzfällern, Clevers und Shen skizziert5,6 , die Wachstum, Passagierung Hellfeld Bildgebung, Kryokonservierung und RNA und DNA-Isolierung der Prostata Maus und menschlichen Organellen zu beschreiben. Das ganze-Mount-Protokoll wird von Mahé Et Al. geändert. 11, die Magen-Darm-epitheliale Organellen verwendet und beschreibt live imaging und gefrorenen und paraffin einbetten. Borten Et al. 12 beschriebenen Analyse der Brust-, Darm und Darmkrebs organoide Morphologie von Hellfeld Imaging. Darüber hinaus Richards Et Al. 13 verwendet eine Methode für die morphologische Beurteilung der Prostata Organellen. Zu guter Letzt Hu Et al. 14 beschrieb eine Methode von anhaftenden Prostata Organellen zu einer Kammer-Folie über Nacht vor der immunofluorescent Färbung Einzelzellen und Streuung der Kugeln für Flow-Zytometrie-Analyse zu beobachten.

Das Ziel dieses Protokolls ist ausreichend detailliert diese technisch anspruchsvollen Methoden als ein Protokoll, einschließlich der Zelle Aussaat nachweisen; Medien und Matrix gel Wartung; Auflistung von Zellen für Durchflusszytometrie; RNA, DNA und Protein Extraktion; morphologische Beurteilung von Hellfeld Z-Stapel-Analyse; einbetten, Verarbeitung und Schnitt für histologische Färbung; und ganz-Halterung für Immunfluoreszenz oder fluoreszierende Sonde Assays. Die biologische Bedeutung und Interpretation dieser verschiedenen Endpunkte variiert unter den Versuchsplan und Antikörper, die für die Analyse verwendet. Durch Nutzung dieses Protokolls sollten Benutzer einrichten, ein Experiment mit einem Toolkit von Endpunkten vorbereitet.

Menschliche primäre Prostate (PrE) Epithelzellen entstanden im Labor durch das Protokoll von Peehl15,16 beschrieben und beibehalten, um eine begrenzte Anzahl von Passagen (bis zu vier) als zuvor beschriebenen17, aber sie sind auch von kommerziellen Anbietern erhältlich. Hepatozyten serumfreie Medien basierende6, KSFM-basierte13und R-Spondin 1-konditionierte5 Medien sind alle veröffentlichten als Organellen erfolgreich produziert. KSFM-basierte erfordert die geringste Anzahl von Zusatzstoffen, so dass es hier beschrieben wird.

Protocol

Das folgende Protokoll wurde durch menschliche primäre epithelialen Zellen der Prostata geerntet von Patienten Gewebe an der University of Illinois in Chicago Krankenhaus optimiert. Allen menschliche Geweben verwendet für diese Experimente wurden erworbenen über eine Institutional Review Board genehmigt Protokoll und/oder Befreiung an der University of Illinois at Chicago. Die Kulturbedingungen variiert abhängig von der Zelle Art von Interesse, können die Endpunkte auf Organellen von anderen Geweben angewendet werden.

(1) Aussaat von Epithelzellen in Matrix-Gel und wechselnden Medien

  1. Notwendige Materialien sammeln: menschliche primäre Prostate Epithelzellen (PrE), Matrix-Gel auf dem Eis, 96-Well Mikrotestplatte Keratinozyten serumfreie Medien (KSFM) auf dem Eis, Kohle, abgespeckte fetalen bovine Serum (FBS) und Dihydrotestosteron (DHT).
  2. Bereiten Sie KSFM-basierte organoide Medien durch die Kombination von 47,5 mL KSFM mit 2,5 mL Holzkohle abgespeckte FBS und Dihydrotestosteron (DHT), eine Endkonzentration von 10 nM DHT, dann Reserve auf Eis.
  3. Platte Zellen in eine 3D Matrix in eine Zelle-Kultur-Haube mit steriler Technik.
    1. Sanft Mischung kalte KSFM basierende organoide Medien mit eiskalten Matrix Gel zu einer 50 %-Matrix gel-Mischung von langsam rauf und runter pipettieren, Luftblasen zu vermeiden.
      Hinweis: Matrix Gel sollte über Nacht bei 4 ° C aufgetaut und auf Eis, wann immer möglich gehalten werden. Es erstarrt schnell bei Raumtemperatur (RT).
    2. Vornässen einer Pipettenspitze in kalte Medien und Transfer 40 – 50 μL der 50 % Matrix gel auf der Unterseite von jedem Bohrloch auf einer 96-Well-Platte verwendet werden. Streichen Sie die Unterseite des Brunnens eine Basisschicht zu bilden.
      Hinweis: Verzichten Sie nicht vollständig bis zum zweiten Anschlag auf Pipette, da Luftblasen erzeugt werden können.
    3. Legen Sie die 96-Well-Platte in 37 ° C Inkubator für 30 – 45 min um die Basisschicht zu festigen.
      Hinweis: Epithelzellen auf die Tragschicht nicht Teller, bis es verfestigt hat, oder Zellen fallen durch die Matrix auf der Unterseite der Platte und als eine Monolage wachsen können.
    4. Mischen Sie Epithelzellen in KSFM-basierte organoide Matrix Gel, eine Endkonzentration von 100 – 1.000 Zellen/100 μL zu erreichen und 33 % Matrix Gel Medien ausgesetzt. Platte Epithelzellen auf Tragschichten mit 100 μl 33 % Matrix Gel/Zelle Mischung pro Bohrloch.
      Hinweis: Frühere Experimente haben gezeigt, dass die Aussaat Epithelzellen zu dicht in 3D beschränken die Größe des organoide Wachstum, während Aussaat zu dünn sehr geringe Ausbeute13kann dazu führen. Es ist wichtig, seeding Bedingungen für den Typ von Interesse, die Patienten-spezifischen organoide Bildung Effizienz zu optimieren.
  4. Legen Sie die 96-Well-Platte in einem Inkubator 37 ° C für 30-45 min erlauben das Matrix-Gel zu festigen, dann sanft 100 μL KSFM basierende organoide Medien auf Zellen durch Pipettieren langsam gegen den Rand des Brunnens.
  5. Wechseln Sie das Medium alle 2 – 3 Tage. Gegen die Seite des Brunnens Pipettieren mit Abstand das Medien und Matrix-Gel sorgfältig entfernen Sie 50 μL der Medien und mit 50 μL der frische Medien ersetzen.
    Hinweis: Für eine langfristige Kultur, das Matrix-Gel alle 2 – 3 Wochen gewechselt werden muss. Wenn die Matrix Gel Kultur instabil scheint und durchscheinende Falten unter dem Mikroskop zeigt, das Matrix-Gel ist kaputt und muss ersetzt werden.

2. Sammlung von Organellen von Matrix-Gel

Hinweis: Sammlung von Organellen ist notwendig für Matrix Gel Änderungen, Passagierung oder Endpunkte der RNA-Extraktion, DNA-Extraktion und Proteingewinnung Durchflusszytometrie.

  1. Warmen neutrale Protease und Hanks ausgewogen Salzlösung (HBSS) im Wasserbad 37 ° C.
  2. Entfernen Sie vorsichtig Medien aus Brunnen, ohne Störung der Matrix-Gel.
  3. Jedes gut ~ 1 ~ 200 μL der neutrale Protease hinzufügen: 2 Verhältnis von Matrix Gel: neutrale Protease und 20 min bei 37 ° c inkubieren
  4. Mechanisch distanzieren Sie die Matrix Gel: neutrale Protease Mischung von Pipettieren rauf und runter.
  5. 20 min bei 37 ° c inkubieren
  6. Übertragen Sie die neutrale Protease-Matrix-Gel-Zell-Mischung zu einem Microcentrifuge Schlauch oder konische Rohr, je nach Volumen. Zentrifugieren Sie bei 300 X g für 3 – 5 min zum pellet-Zellen.
    Hinweis: Wenn keine Zelle Pellet angezeigt wird, das Matrix-Gel kann nicht vollständig getrennt und als transluzente Phase am unteren Ende der Röhre unterscheidet sich von der rosa überstand visualisiert werden. Entfernen Sie des Überstands fügen Sie mehr neutrale Protease im Verhältnis 1:2 Matrix das Gel Pellet hinzu, weitere 20 – 40 Minuten bei 37 ° C inkubieren Sie und wiederholen Sie Zentrifugation bei 300 X g.
  7. Wenn eine organoide Pellet erworben wird, entfernen Sie den überstand. Fahren Sie mit organoide Lyse für RNA oder DNA-Protein-Extraktion Passagierung (siehe Schritt 2.7.1), (siehe Schritt 2.7.2), Verarbeitung einzelne Zellen durch Durchflusszytometrie und einzellige Sequenzierung (siehe Schritt 2.7.3).
    1. Aufschwemmen Sie für langfristige Kultur sanft intakte Organellen in 33 % frische Matrix Gel und Teller durch die beschriebenen Schritte in Schritten 1,1 bis 1,5. Um Organellen zu distanzieren und replate als Einzelzellen, das Pellet in 1 mL warme Zelle-Dissoziation Enzyme Aufschwemmen und Inkubation bei 37 ° C für 10-15 min, einmal mit 5 mL HBSS waschen und neu Platte in das frische Matrix-Gel nach Schritte 1.1-1.5.
    2. Aufschwemmen Sie organoide Pellet in einem geeigneten Lyse-Puffer für RNA-Extraktion, DNA-Extraktion oder Proteingewinnung wie entnehmen Sie bitte der Tabelle der Materialien und folgen Sie des Herstellers Protokoll.
    3. Organellen in 1 mL warme Zelle-Dissoziation Enzyme Aufschwemmen und Inkubation bei 37 ° C für 10-15 min zu die Organellen in Einzelzellen zu distanzieren. Einmal mit 5 mL HBSS waschen Sie und fahren Sie mit dem Protokoll für Flow Cytometry5 oder einzellige Sequenzierung18.
      Hinweis: Um in die einzelnen Zellen bei niedrigen Konzentrationen von Matrix-Gel zu distanzieren, die neutrale Protease nicht erforderlich sein, und Zelle-Dissoziation Enzyme können direkt an den Brunnen nach Schritt 2.2 angewendet werden.

(3) ganz gut Bilderfassung und Analyse von organoide Morphologie

  1. Ganz gut Z-Stapel Bilder mit invertierten Durchlichtmikroskop mit einem motorisierten X / Y Scan-Bühne (Workflow, dargestellt in Abbildung 1A).
    1. Beginnen Sie mit der Fokuslage an der Unterseite des Brunnens angepasst mit Schwerpunkt nach oben, bis die ersten organoide gefunden wird, die in der Mitte des Brunnens aufgrund der Meniskus aus dem base-Layer werden. Legen Sie die untere Z-Ebene an dieser Stelle.
    2. Weiter nach oben bis die letzten organoide im Fokus, ist die in der Peripherie des Brunnens werden. Setzen Sie die obere Z-Ebene an dieser Stelle.
      Hinweis: Nach der Einstellung der oberen und unteren Rand der Z-Stack, stellen Sie sicher, dass diese Positionen die Organellen innerhalb aller übrigen Brunnen erfassen und oben/unten nach Bedarf anpassen. Dies ermöglicht den Z-Bereich für einen einzelnen Scan verwendet werden, die jeden organoide innerhalb jedes gut schließt.
    3. 15 – 35 Z-Flugzeuge pro Bohrloch mit einer größeren Anzahl für höhere Auflösung zu erfassen. Erfassen Sie das gesamte gut Bild zu, Zusammenführen Sie und sammeln Sie Quadranten oder Unterabschnitte zu, wenn nötig.
      Hinweis: Es wird empfohlen, zu mehreren Z-Ebenen im Gegensatz zu einem einzigen Z-Ebene, wie in Abbildung 1 b in der Organellen unscharf sind, wenn nur eine Z-Ebene zu erfassen.
    4. Z-Stapel Bilder für nachgelagerte Analyse gespeichert werden.
  2. Analysieren von Bildern mit Bild-Software mit Freiform Zeichenfunktionen.
    1. Öffnen Sie ein Einzelbild Z-Ebene vom Schritt 3.1.4.
    2. Ggf. sollte die Aufnahmen mit jeder einzelnen Z-Ebene in ein einzelnes, ganz gut Bild Fliese. Speichern Sie das neue Bild als separate Datei. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Z-Ebene erworben.
    3. Image-Software verwenden, öffnen Sie das ganze gut Bild für jeden Z-Plane aus einem einzigen Brunnen und erstellen Sie eine erweiterte Schärfentiefe Feldbild (EEF) aus dem Stapel des Z-Planes.
      Hinweis: Diese Art von Bild wählt die besten Fokusregion jeder Z-Ebene um ein Einzelbild im Fokus des Brunnens zu erstellen.
    4. Setzen Sie die Pixel Skalierung der Software auf der Maßstab des Bildes, der gemessen wird.
    5. Mit dem Freiform-Zeichnung Werkzeug der Bild-Software verfolgen Sie den Rand jeder organoide im Brunnen.
    6. Erhalten Sie die Messung Metriken für vektorisierte organoide Umfänge von Image-Software.
      Hinweis: Empfohlene Parameter sind Bereich, Rundheit und maximale/minimale Radius Verhältnis. Repräsentative Ergebnisse illustrieren die Anwendung dieser Kennzahlen sind in Abbildung 1dargestellt. Bereich errechnet sich aus dem Polygon durch die organoide Perimeter definiert. Zirkularität ist das Verhältnis des Bereichs organoide auf der Fläche eines Kreises mit einem Durchmesser gleich der organoide maximale Frettchen, wobei 0 weniger Runden und 1 ist mehr kreisförmig. Maximale/minimale Radius Ratio ist das Verhältnis zwischen der maximalen Radius und Mindestradius der nachgezeichneten organoide.
      Zirkularität =Equation 1
      Radius-Verhältnis =Equation 2

4. Formalin Fixierung und Paraffin Einbettung der Organellen für histologische Endpunkte

  1. Bereiten Sie einbetten Lieferungen: HBSS, 2 % Agar Lösung, histologische Kennzeichnung Farbstoff, Histologie Gel, pipette, Spitze Form, Klebeband, Kolben aus einer 1 cc Insulin Spritze, Eisbeutel, Kassetten, 10 % neutral gepuffertem Formalin (NBF), Bleistift und 75 % histologische Grad Ethanol (EtOH).
    1. Bereiten Sie zwei Mikrozentrifugenröhrchen 2 % Agar Lösung. Inkubieren Sie im Wasserbad oder auf einem Heizblock bei 100 – 110 ° C, Agar in flüssiger Form zu erhalten. Fügen Sie 1 – 2 Tropfen der histologischen Kennzeichnung Farbstoff auf eines der 2 % Agar-Lösungen, die oben auf dem Agar bezeichnen werden anschließen und helfen dabei, die Orientierung während der Einbettung hinzu. Mischen Sie gut.
    2. Die Histologie-Gel in einem Wasser-Bad oder Hitze-Block bei 55 – 65 ° c warm
    3. Erstellen Sie mithilfe einer Pipettenspitze 1000 μL Formen durch einen kleinen Ausschnitt aus der Pipettenspitze um einen Zylinder zu machen, der ~ 50 μL hält herausschneiden. Erstellen Sie eine zweite, größere Form, die rund um das erste Werkzeug passt.
    4. Erstellen Sie einen kalten Block durch umwickeln einen Eisbeutel mit Klebeband (klebende Seite nach oben) und die Einhaltung von Formen auf das Band.
    5. Erstellen Sie einen Kolben, indem Sie den Kolben aus einer 1 cc Insulin Spritze.
  2. Einbetten der Organellen in einer Histologie Gel Stecker für Verarbeitung, nach den Workflow, dargestellt in Abbildung 2A.
    1. Das Matrix-Gel distanzieren und pellet Organellen, indem Sie die folgenden Schritte 2.1-2.7.
    2. Waschen Sie organoide Pellet einmal mit 1 mL HBSS und neu pellet von spinning für 3 – 5 min bei 300 X g und den Überstand zu entfernen.
    3. Wieder aussetzen Sie organoide Pellet in 30 – 50 μL der flüssigen Histologie Gel. Mischen Sie vorsichtig, durch Pipettieren langsam rauf und runter. Übertragen Sie die Histologie Gel/organoide Mischung in eine Form auf dem kalten Block und lassen Sie die Probe abkühlen und erstarren in einen Stecker.
    4. Verwenden Sie einen Kolben, schieben Sie den Stecker aus der kleinen Form und in der größeren Form. Pipette klar 2 % Agar um den Stecker, die größere Form füllen.
    5. Pipette histologische Färbung getönt 2 % Agar auf den Stecker an der Spitze der Probe zu kennzeichnen.
    6. Sobald Sie abgekühlt, verwenden Sie einen Kolben, um den Stecker in eine Histologie-Kassette zu übertragen. Beschriften Sie die Kassette mit Bleistift und Ort Kassette in 10 % NBF zur Fixierung über Nacht.
    7. Übertragen Sie die Kassette von 10 % NBF, histologische Grad 70 % EtOH.
  3. Prozess der Histologie-Gel mit einem voreingestellten Biopsie-Protokoll auf einem Prozessor stecken, falls vorhanden. Wenn Preset nicht verfügbar ist, geben Sie die folgende Sequenz und Längen: 70 % EtOH für 6 min, 70 % EtOH für 10 min, 80 % EtOH für 10 min, 95 % EtOH 2 mal 10 min, 100 % EtOH 3 Mal für 10 min, Xylol 3 Mal für 15 min , und Paraffin 3 Mal für 15 min. von der empfohlenen abweichende Bearbeitung Folge geplatzten Organellen (Abbildung 3A) führen kann.
  4. Einbetten des Histologie Gel Steckers mit den farbigen Teil nach oben, da dies ermöglicht es den verfärbten Teil enthält die Organellen, in erste geschnitten werden.
  5. Abschnitt der Proteinkinase Histologie gel Blöcke:
    1. Notwendigen Vorräte zu sammeln: Proteinkinase Histologie gel-Blöcke, Histologie Stift, Gewebe Wasser Floatbad, Eiskübel mit Eis, Mikrotom, Mikrotom klingen, Workstation, positiv geladenen Objektträger und Labor-Ofen einbetten.
    2. Füllung-Wasserbad bis sehr voll und Satz auf 40 ° C, dann bereits warm Labor Ofen 45 – 50 ° C.
    3. Bereiten Sie einen Eiskübel, dann mit Eis füllen Sie und fügen Sie Wasser hinzu, um ein Eis-Wasser-Suspension zu erstellen. Kühlen Sie die Blöcke auf dem Eis, bis sie sehr kalt sind.
      Hinweis: Blöcke auf Eis für bis zu 1 Tag eingestellt werden, aber wenn über Nacht verlassen, die Blöcke werden hydratisiert werden und erneut verarbeitet werden müssen.
    4. Legen Sie einen Block in Mikrotom Kassette Klemme, Messerhalter die Klinge hinzu, und entsperren Sie Verriegelungen Schutzmaßnahmen auf dem Computer zu.
    5. Zunächst schneiden das Gesicht der Paraffinblock (vor sich) bei einer Dicke von 10 µm. Sobald ein Abschnitt mit dem Stecker Bereich entsteht, stoppen Sie trimmen zu, sperren Sie die Mikrotom-Rotor und übertragen Sie den Block zurück aufs Eis zu kühlen. Wenn mehrere Blöcke geschnitten werden sollen, face-off jeden blockieren wechselte 4.5.6 treten.
    6. Bewegen Sie die Klinge auf einen neuen, unbenutzten Teil und übertragen Sie den Block zurück zur Klemme. Das Gerät zu entsperren und Trimmen bei 5 μm pro Abschnitt zu beginnen.
      Hinweis: 5 μm empfiehlt sich für optimale Ergebnisse zu erzielen, aber 3 – 10 μm ist auch akzeptabel.
    7. Mit einer Pinzette, Abschnitt um die 40 ° C-Wasserbad und Abschnitt um sich auszubreiten. Übertragen Sie den Abschnitt auf einer Folie durch senkrecht ins Wasser eintauchen.
      Hinweis: Eintauchen in einem Winkel können Luftblasen aus dem Boden des Bades auf Abschnitt übertragen und verursachen Verzerrung der Stichprobe.
    8. Visualisieren Sie den Abschnitt unter Mikroskop (Abb. 2 bC).
      Hinweis: Wenn eine organoide vorhanden, wird es ähnlich wie bei den roten Pfeil in Abbildung 2 b angezeigt. Bläschen (Abb. 2 b, blauer Pfeil) können ähnlich wie Organellen erscheinen und sind relativ leicht zu erkennen auf einer frisch-Folie wie trockene Organellen transluzente (Abbildung 2) erscheinen. Wenn keine Organellen sind vorhanden, Abschnitt weiter in den Block.
  6. Bei Folien mit Organellen erworben haben, Kreisen Sie die Gegend rund um den Bereich auf der Rückseite der Folie mit Histologie Stift und Backen über Nacht bei 45 – 50 ° C.
  7. Folien zu sammeln und fahren Sie mit H & E (siehe Schritt 4.9.1), immunhistochemische (siehe Punkt 4.9.2), oder immunofluorescent Färbung (siehe Schritt 5).
    Hinweis: Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 3 bangezeigt.
    1. H & E Färbung ausführen, erhalten Sie ein Set aus der Liste der Materialien und folgen Sie den Angaben des Herstellers.
    2. Zur Durchführung der immunhistochemischen Färbung erhalten ein Kit und primären Antikörper aus der Materialliste und folgen Sie den Angaben des Herstellers.

5. immunofluorescent Färbung der Proteinkinase und geschnittenen Organellen

  1. Vorräte sammeln: gebackene Rutsche aus Schritt 4, Xylol, 100 % EtOH, 95 % EtOH, 70 % EtOH, deionisiertes Wasser (DI H2O), Coplin Gläser, 1 x Antigen Retrieval Lösung (Natrium-Citrat-Puffer oder EDTA-Tris-Puffer), Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), normales Pferd Serum () 5 % NHS) mit 0,1 % nicht-ionische Reinigungsmittel mit PBS-Puffer, 1 % Rinderserumalbumin (BSA) mit 0,3 % nicht-ionische Reinigungsmittel in PBS, Färbung Rack, Färbung der Schale, enttarnen, Kammer, hydrophobe Barriere Stift, feuchte Kammer, 1° und 2° Antikörper der Zins- und Counterstains des Interesse.
  2. Deparaffinize und rehydrieren die Folien durch Eintauchen in Coplins gefüllt mit den folgenden Lösungen: Xylol (3 Dips, 5 min), 100 % EtOH (2 Dips, 3 min), 95 % EtOH (je 2 Dips, 3 min), 70 % EtOH (je 2 Dips, 3 min) und DI H2O (2 Dips 3 min).
  3. Füllen Sie die Färbung Schale mit Antigen-Retrieval-Lösung und Pre enttarnen Wärmekammer bis 100 ° C.
  4. Führen Sie Antigen-Retrieval durch Eintauchen der Folien in die vorgewärmte Schüssel Färbung und 5 – 10 min bei 100 ° c inkubieren Sobald der Zyklus abgeschlossen ist, können Sie die enttarnen Kammer für 20 min sitzen vor dem Öffnen des Deckels.
  5. Sobald die Folie Schale auf RT abgekühlt ist, legen Sie die Färbung Schale unter fließendem DI H2O, die Folien für 5 min spülen.
  6. Entfernen Sie die Folien aus der Färbung Schale, zeichnen Sie einen Kreis um die Probe mit einem hydrophobe Barriere-Stift und legen Sie die Folie auf die feuchte Kammer.
  7. Eine unspezifische Antikörper Färbung durch die Anwendung von 5 % NHS mit 0,1 % nicht-ionische Reinigungsmittel mit PBS-Puffer an den hydrophoben Kreis um die Probe zu blockieren (ca. 30 μl benötigt wird, um die Probe zu decken).
  8. Wash Folien in Coplins gefüllt mit PBS 3 Mal für 5 Minuten.
  9. Fügen Sie die 1° Antikörper (Table of Materials) in 1 % BSA mit 0,3 % nicht-ionische Reinigungsmittel mit PBS-Puffer an den hydrophoben Kreis um die Probe verdünnt (etwa 30 μl sollte im Abschnitt), dann 1 h bei RT oder über Nacht bei 4 ° C in feuchten Kammer inkubieren.
  10. Waschen Sie die Objektträger in Coplins gefüllt mit PBS 3 Mal für 5 min.
  11. Hinzufügen den 2 ° c-Antikörper mit 1 % BSA mit 0,3 % nicht-ionische Reinigungsmittel mit PBS-Puffer an den hydrophoben Kreis um die Probe verdünnt (etwa 30 μl decken den Bereich), dann 1 h bei RT in feuchten Kammer inkubieren.
  12. Waschen Sie die Objektträger in Coplin gefüllt mit PBS 3 Mal für 5 min.
  13. Fügen Sie DAPI, verdünnt, um den Vorgaben des Herstellers, in 1 % BSA mit 0,3 % nicht-ionische Reinigungsmittel mit PBS-Puffer an den hydrophoben Kreis um die Probe dann 2 – 5 min bei RT in der Dunkelheit (30 μl) inkubieren.
  14. Waschen Sie die Objektträger in Coplins gefüllt mit PBS 3 Mal für 5 min.
  15. Montieren Sie die Folien mit antifade Montage Medien und Deckglas, dann visualisieren Sie die Ergebnisse unter dem Mikroskop.

6. ganze-Montage von Organellen für Immunofluorescent Färbung

  1. Vorräte sammeln: Kammer Folie oder konfokale Gericht, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), Fixativ, 50 mM NH4Cl in PBS, 0,1 % nicht-ionische Waschmittel in PBS, 5 % NHS mit 0,1 % nicht-ionische Reinigungsmittel mit PBS-Puffer, 1 % BSA mit 0,3 % nicht-ionische Reinigungsmittel in PBS, 1° und 2° Antikörper von Interesse, und Counterstains von Interesse.
  2. Entfernen Sie vorsichtig so viel Medien möglichst ohne Unterbrechung die organoide Kultur durch Pipettieren gegen die Seite des Brunnens, wobei Raum zwischen Medien und Matrix-Gel.
  3. Mit einer gestutzten Vornässen mit Medien oder PBS, 1.000 μl Pipettenspitze erarbeiten einen Tropfen (25 – 50 μL) Matrix-Gel, das die Organoid(s) von Interesse enthält und verzichten auf die Mitte der Kammer Folie gut oder konfokale Platte.
    Hinweis: 33 % Matrix Gel ist keine solide. Es ist eine gallertartige Flüssigkeit, die ähnlich wie eine Götterspeise behandelt, die nicht vollständig gesetzt hat. Eine getrimmte Pipettenspitze mit großer Öffnung verhindert Organellen brechen beim Umsteigen.
  4. Ersetzen Sie Organellen in die übergeordnete Kultur bleiben, Medien mit warmen KSFM-basierte Medien.
  5. Aspirieren Sie mit dem bloßen Auge oder sezierenden Umfang das überschüssige Medien und Matrix-Gel aus der Kammer-Folie mit einer feinen Spitze Pipette (10 – 200 μL).
    Hinweis: Es ist optional für die Kammer-Folie mit einer Einhaltung Reagenz vorbehandeln.
  6. Platte ein gleiches Volumen der Matrix Gel in einen leeren Brunnen der Kammer Folie als ein optionales Steuerelement, Autofluoreszenz des übrig gebliebenen Matrix zu beobachten.
  7. Legen Sie die Kammer-Folie in einem Inkubator 37 ° C für 30-45 min zur Förderung der organoide um das Glas halten und verhindern den Verlust von Proben während Waschen Schritte.
  8. Pipettieren langsam zu verhindern Loslösung von Folie, Organellen mit 200 μl 1 X PBS für 5 min bei RT zu waschen, während sanft schütteln.
  9. Entfernen Sie die 1 x PBS und Fix mit 200 μL der 4 % Paraformaldehyd für 30 min bei RT unter sanft schütteln. Sicherzustellen Sie, dass das Matrix-Gel nach diesem Schritt klar erscheint.
    Hinweis: Methanol oder Formalin Fixierung sind ebenfalls möglich. Befestigungsmethode sollte für spezifische Antikörper optimiert werden, wie bestimmte Fixierung Methoden Crosslink Antigene von Interesse vielleicht oder Leuchtstoff-Kennzeichnung-Proteine des Interesses zu stillen.
  10. Entfernen Sie das Fixiermittel und zweimal mit 200 μl 1 X PBS für 5 min zu waschen Sie, während sanft schütteln.
    Hinweis: Die Länge der Waschschritte sollte je nach organoide Größe optimiert werden. Fünf Minuten ist ein ausreichender Ausgangspunkt, aber die Waschschritt kann je nach Bedarf verlängert werden.
  11. Autofluoreszenz mit 200 μl 50 mM NH4Cl in 1 X PBS für 30 min bei RT unter sanft schütteln zu stillen.
    Hinweis: Dieser Schritt stillen Autofluoreszenz von Schmutz in das Lumen der organoide und fluoreszierende Protein-Expression (z. B. GFP), die aus experimentellen Design präsentieren kann. Es sollte enthalten sein, wenn es gewünscht wird, ein Fluorophor in 488 Kanal zu verwenden, sondern übersprungen werden, kann falls gewünscht, GFP-Signal zu erhalten.
  12. Entfernen Sie NH4Cl und waschen Sie zweimal mit 200 μl 1 X PBS für 5 min unter sanft schütteln.
  13. Permeabilize Organellen in 200 μl von 0,1 % nicht-ionische Waschmittel-100 mit 1 X PBS-Puffer für 30 min bei RT unter sanft schütteln.
  14. Entfernen Sie die 0,1 % nicht-ionische Waschmittel-100 in 1 x PBS und zweimal mit 200 μl 1 X PBS für 5 min waschen unter sanft schütteln.
  15. Block mit 5 % NHS mit 200 μL von 0,1 % nicht-ionische Reinigungsmittel x-100 mit PBS-Puffer und 60 min bei RT inkubieren, während sanft schütteln.
  16. Entfernen Sie die blockierenden Puffer und waschen Sie zweimal mit 200 μl 1 X PBS für 5 min unter sanft schütteln.
  17. Verdünnen den 1° Antikörper in 1 % BSA mit 0,3 % Triton x-100 mit 1 X PBS-Puffer und 200 μL der Kammer Folie hinzufügen, dann 1 – 3 Tage bei 4 ° c inkubieren
  18. Entfernen Sie 1° Antikörper zu und waschen Sie zweimal mit 200 μl 1 X PBS für 5 min unter sanft schütteln.
  19. Verdünnen den 2° Antikörper in 1 % BSA mit 0,3 % Triton x-100 mit 1 X PBS-Puffer und 200 μL der Kammer Folie hinzufügen, dann 1 – 3 Tage bei 4 ° C im Dunkeln inkubieren.
    Hinweis: Die Länge der Inkubationszeiten sollte für organoide Größe und Antikörper optimiert werden. Einige benötigen mehr Zeit, um die organoide durchdringen. Antikörperkonzentration müssen auch optimiert werden. In der Regel 2 X die Konzentration verwendet für Proteinkinase Abschnitte eignet sich für 1° Antikörper und die gleiche Konzentration für Proteinkinase Abschnitte eignet sich für 2° Antikörper.
  20. Entfernen Sie 2°-Antikörper zu und waschen Sie zweimal mit 200 μl 1 X PBS für 5 min unter sanft schütteln.
  21. Gegenfärbung Aktin mit Phalloidin und der Zellkern mit DAPI oder Hoechst, entsprechend den Empfehlungen des Herstellers in 1 % BSA mit 0,3 % verdünnt Triton-X in 1 X PBS. 200 μL Kammer Folie hinzufügen, dann 40 min im Dunkeln bei RT inkubieren.
  22. In 200 μl des frischen 1 x PBS oder Montage Medien montieren und sofort Bild (Fluoreszenz sollte erhalten bleiben für bis zu 5 Tage, wenn nicht mehr). Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 3dargestellt.
    Hinweis: Natriumazid kann hinzugefügt werden, zu Proben, um Kontaminationen zu vermeiden, wenn konfokale Bildgebung nicht leicht zugänglich ist. Hinzufügen eines Clearing-Agents kann Bildgebung verbessert werden.

7. ganze-Montage von Organellen für Assays und fluoreszierende Sonden

Hinweis: Es gibt im Handel erhältlichen Tests und Sonden/Fluoreszenzfarbstoffen (Beispiele sind auf der Liste der Materialien enthalten) für den Einsatz auf ganze montierte Organellen zu beobachten, eine Vielzahl von nützlichen Endpunkte19geändert. Das folgende Protokoll ist für das Eindringmittel gekennzeichnet EdU Verbreitung Kit, aber jedes Kit für den Einsatz mit einer gesamten montierte Probe geändert werden kann.

  1. Sorgfältig entfernen 50 μL der Medien und ersetzen mit 50 μL von 20 μM 2 x EdU Lösung durch Pipettieren gegen die Seite des Brunnens, wobei Raum zwischen Medien und Matrix Gel arbeiten.
  2. 1 – 3 Tage (die von Ihnen gewünschte Zeitspanne für EdU Einarbeitung sollte für Zelltyp Wahl optimiert) bei 4 ° C inkubieren.
  3. Führen Sie die Schritte 6,2-6,8 Organellen von Interesse auf eine Kammer Folie oder konfokale Gericht übertragen.
  4. Entfernen von PBS und fixieren mit 200 μL von 3,7 % Paraformaldehyd für 30 min bei RT unter sanft schütteln. Sicherstellen, dass die Matrix Gel nach diesem Schritt klar erscheinen.
  5. Entfernen Sie das Fixiermittel und zweimal mit 200 μl 1 X PBS für 5 min zu waschen Sie, während sanft schütteln. Entfernen Sie PBS zu, und fügen Sie 200 μL von 0,5 % nicht-ionische Waschmittel-100 mit 1 X PBS-Puffer für 30 min bei RT unter sanft schütteln.
  6. 1 x cocktail nach den Vorgaben des Herstellers fluoreszierende Reaktion vorzubereiten.
  7. Entfernen Sie 0,5 % nicht-ionische Waschmittel-100 und waschen Sie zweimal mit 200 μL der 3 % BSA mit 1 X PBS-Puffer für 5 min unter sanft schütteln.
  8. Fügen Sie Reaktion Cocktail und inkubieren Sie für 30 min bei RT in der Dunkelheit.
  9. Entfernen Sie die fluoreszierende Reaktion cocktail und Waschen einmal mit 200 μL der 3 % BSA mit 1 X PBS-Puffer für 5 min, während sanft schütteln. Gegenfärbung und montieren, indem Sie die folgenden Schritte 6.21 – 6.22 (Abbildung 3D).

Representative Results

Nach erfolgreichen Kultur der menschlichen primäre Prostata Organellen können Morphologie und Differenzierung mit Hellfeld Bildanalyse und Proteinkinase und vollständig-hängen befleckenden Techniken bewertet.

Der Prozess der Hellfeld Bilderfassung ist in Figur 1Adargestellt. Organellen in einer 3D Matrix angebaut und über verschiedene Schwerpunkte Flugzeuge verstreut. Um Organellen im Fokus über viele Flugzeuge zu beobachten, wird vorgeschlagen, um ein EDF-Bild (Abbildung 1 b, rechts) anstelle einer Z-Ebene (Abbildung 1 b, links) zu verwenden. Im Labor führen Änderungen in der Morphologie Organellen, die unter verschiedenen experimentellen Bedingungen angebaut. Mit Bereich, Rundheit (definiert durch wie die organoide zu einem Kreis ähnelt) und Max/min Radius (Maß für die Länge) Benutzer einen Hinweis auf organoide Größe und Form geben und bieten eine quantifizierbare Auslesen der Morphologie. Um den Nutzen dieser Maßnahmen zu unterstreichen, sind repräsentative Bilder von Organellen mit ähnlichen Bereich aber unterschiedliche Morphologie in Abbildung 1, gezeigt, in denen eine lange organoide werden weniger kreisförmig und haben eine größere maximal/minimal-Verhältnis als eine sphärische organoide.

Einbetten von Organellen für Histologie ist ein nützliche Endpunkt das Innere der Proben zu beobachten und sicherstellen, dass die Nekrose nicht im Kern eine organoide vorhanden ist. Ein Workflow für diesen Prozess und repräsentative Ergebnisse der ungefärbten, geschnittenen Proben unter dem Hellfeld Mikroskop sind gemäß Abbildung 2AB, C. Abbildung 3A zeigt ein fehlgeleitetes organoide (links) im Vergleich zu richtig Organellen in Abbildung 3A (rechts) und Abbildung 3 bübergeben. Um die Differenzierung-Zustand der Probe zu bestimmen, empfiehlt es sich, Basalzell-Marker (Cytokeratin 5 und p63)8 zusammen mit der luminalen Zelle Marker (Cytokeratin 8)8anschauen. Wenn es gewünscht ist, Organellen Fleck in Situ, ganze-Mount-Färbung ist eine bequeme Alternative, und diese repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 3D. zur Verfügung gestellt

Figure 1
Abbildung 1: Beurteilung der Morphologie der Organellen in 3D Culture. (A) Bild Sammlung und Kompression Workflow für menschliche primäre Prostata Organellen erworben durch eine Durchlicht-Mikroskop mit einem motorisierten invertiert X / Y Scansoftware Bühne und Begleiter. (B) repräsentative Bilder von einem Z-Stapel (links) Vs. ein EDF-Bild (rechts) einer Probe ganz gut der menschlichen primäre Prostata Organellen, zeigen, dass mehr Organellen im Mittelpunkt stehen, wenn mehrere Z-Stapel zu einem projizierten Bild kombiniert werden (Maßstabsleiste = 1000 µm). (C) repräsentative Bilder Bereich, Rundheit und Max/min-Verhältnis von morphologisch unterschiedliche menschliche primäre Prostata Organellen, die der gleichen Gegend haben (Maßstabsleiste = 200 µm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: organoide einbetten, Workflow und Vertreter Ergebnisse-Schnitt. (A) menschliche primäre Prostata organoide Einbettung Workflow. (B) repräsentatives Bild einer ungefärbten, frische Folie mit menschlichen primäre Prostata Organellen unter dem Hellfeld-Mikroskop Darstellung Agar (grüner Pfeil), Histologie Gel (schwarzer Pfeil), Blase (blauer Pfeil), Organellen (rote Pfeile) (Maßstabsleiste = 1000 µ (m). (C) unbefleckt frisch geschnittene Folie (links) Vs. ungefärbten trocken Folie (rechts), Organellen (rote Pfeile) erscheinen durchscheinenden, trockenem (Maßstabsleiste = 500 µm) und sind schwerer zu erkennen, unter dem Hellfeld Mikroskop. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: histologische Färbung auf geschnitten und ganze montierte Organellen. (A) H & E Färbung von einer gebrochenen menschlichen primäre Prostata organoide von Misshandlung (aggressive pipettieren, falsche Handgriffe Protokoll, links) neben einem gut verarbeiteten organoide (rechts) (Maßstabsleiste = 100 µm). (B) menschliche primäre Prostata organoide, das Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten, geschnitten, gefärbt mit basalen Cytokeratin 5 oder luminalen Cytokeratin 8 (oben) oder basalen p63 und luminalen Cytokeratin 8 (unten) und mit confocal Mikroskop (abgebildet Maßstabsleiste = 100 µm). (C) eine ganze montierte menschliche primäre Prostata organoide mit basalen Cytokeratin 5 oder luminalen Cytokeratin 8 befleckt und counterstained mit Phalloidin und DAPI, abgebildet mit confocal Mikroskop (Maßstabsleiste = 100 µm). (D) eine ganze montierte menschliche primäre Prostata Zelle organoide gebeizt mit Gewebekulturen beschriftet EdU und Zähler mit Hoechst, abgebildet mit confocal Mikroskop befleckt (Maßstabsleiste = 500 µm) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Organotypischen Kultur ist eine spannende neue Methode zur Rekapitulation Gewebe mit dem Komfort einer in-vitro- Umgebung. Derzeit wachsen Labs Organellen aus vielen Arten von Geweben für verschiedene Endpunkte. In diesem Artikel beschriebenen Methoden nützlich Endpunkte zusammenfassen und neue Techniken zur Charakterisierung von vollständig 3D primäre Prostata Zellkulturen zu markieren.

Es gibt eine Vielzahl von Medien-Rezepten für den Anbau von menschlichen primäre Vorsteherdrüse-Zelle Organellen5,6,13. Während alle lebensfähigen und vergleichbare Ergebnisse erzielen, nutzt KSFM-basierte Medien13 minimale Zusatzstoffe so es beschrieben ist hier. Darüber hinaus wurden Papiere mit mehreren Konzentrationen für Matrix-Gel von 10 % bis 75 % auf Kultur Prostata Organellen5,6,13veröffentlicht. Da Matrix Gel eine teure Reagenzien ist und 33 % Matrix Gel gezeigt hat, dass ausreichen, um langfristige (2-3 Wochen), kultivieren lebensfähig, unclumped Organellen13, dies ist die empfohlene Konzentration. Matrix-Gel kann jedoch variieren in Proteinkonzentration zwischen Chargennummern versehen, so dass dies bei Beschichtung berücksichtigt werden sollten. Es wird auch empfohlen, Matrix-Gel in großen Mengen für den Einsatz über mehrere Experimente Inkonsistenz zwischen viel zu kaufen. Anderen Labors haben verschiedene Formate für Matrix-Gel, wie Tropfen statt einer 96-Well-Platte gut5Beschichtung Beschichtung veröffentlicht. Beide Methoden bilden tragfähige Organellen, aber das hier beschriebene Format ermöglicht Zellen mehr dünn überzogen werden, gezeigt worden, um die Expansion der Zellen in größeren Organellen13zu fördern. Jedoch sollten Dichte Beschichtung optimiert werden aus Patienten-spezifischen Bildung Effizienz basiert. Matrix-Gel gibt es in vielen Formaten einschließlich Wachstumsfaktor reduziert, Phenol Red-frei, hohe Konzentration, etc.. Wachstumsfaktor-reduzierte empfiehlt sich für Kulturbedingungen definierten und Phenol Rotfrei empfiehlt sich beim Arbeiten mit Zellen, die GFP ausdrücken oder bei Experimenten, bei denen Z-Stapel-Bilderfassung. Es ist wichtig, dass jede Matrix Gel Überzug Schritte mit eiskalten Reagenzien durchgeführt werden, wie Matrix-Gel bei Raumtemperatur schnell erstarrt.

Organellen, die unter verschiedenen experimentellen Behandlungen gewachsen können führen Änderungen in Form, also Hellfeld Bildgebung am meisten benutzt ist, beobachteten morphologische Phänotypen zu studieren. Erfassung und Quantifizierung der Fläche oder Form ist jedoch eine Herausforderung aus zwei Gründen: 1) Vorwählervorspannung während der Bildaufnahme und (2) ein dreidimensionales Muster einen zweidimensionalen Parameter z. B. Bereich zuweisen. Eine Strategie der Bilderfassung ist ein zufälliges Feld erfassen und Messen eine vorbestimmte Anzahl von Organellen in diesem Bereich, aber kann dadurch Verzerrungen bei der Auswahl und alle Organellen in das ausgewählte Feld möglicherweise nicht im Fokus. Ganz gut Bildgebung für die Mikrotestplatte 96-Well-Format optimiert beseitigt diese Probenahme Vorspannung durch das Sammeln der gesamten organoide Bevölkerung von Interesse. Jedoch können je nach Mikroskop auf der Seite, mehrere Felder müssen gesammelt und gefliest um ein Bild ganz gut zu erhalten. Einige Labors haben Messbereich von einer einzigen Z-Plane12beschrieben, aber es empfiehlt sich alle Organellen im Fokus zu erfassen, zu sammeln und Stapeln von mehreren Ebenen in einem einzigen EDF-Bild13. In einigen Fällen ein Meniskus in der Matrix-Gel verursachen Vignettierung in das Bild und Hintergrund Korrekturmethoden müssen möglicherweise mithilfe von Bildanalyse-Software angewendet werden. Exakte Volumen ist im Idealfall das am besten geeignete Maß für organoide Größe; Dies ist jedoch schwierig, genau zu erhalten, sogar mit mehreren Z-Stapel-Bildern. Andere nützlichen morphologische Dimensionen wie Zirkularität und maximal/minimal-Verhältnis, können leicht aus der Organellen in einem ganz gut EDF Bild berechnet werden. Zusammen, diese Methoden sampling Bias Herausforderungen überwinden und ermöglichen die Messung von 2D 3D Objekte im 3D-Raum.

Formalin Fixierung und Paraffin Einbetten von Organellen ist eine gängige Methode, Hämatoxylin und Eosin (H & E), immunhistochemische (IHC) und immunofluorescent (IF) Färbung für Visualisierung und Analyse6,11, zu erhalten 20. Publikationen, die diese Technik beschrieben sind allerdings umfassende Informationen zum Einbetten von Prozess. Darüber hinaus kann die Ortung Organellen innerhalb der Paraffinblock schwierig sein. In einigen Übungseinheiten vor Fleck Organellen mit Trypan blau vor dem Einbetten um in Lage zu helfen, während11-Schnitt. Die hier beschriebene Methode beinhaltet die Verwendung einer histologischen Färbung zur Orientierung der organoide/Histologie Gelplug während der Einbettung zur Förderung der Effizienz der schneiden. H & E Folien erleichtern Prüfung der Nekrose, atomare Struktur und Verbreitung, und so sollte es eine verbindliche Endpunkt für organoide Kultur um sicherzustellen, dass die Zellen im gesamten Bereich gesund sind. Eine Stärke des organoide Kultur ist, dass Proben eine heterogene Mischung aus Zellen bestehen, die besser in Vivo Patienten Gewebe ähneln. In der Prostata sind z. B. basale und luminalen Zellen in Prostata Organellen5, während Zellen in 2D fehlen luminalen Differenzierung8gewachsen. Um organoide Differenzierung zu beurteilen, empfiehlt es sich, dass Forscher basalen Marker wie CK5 und p63 und luminalen Marker wie Androgen-Rezeptoren und CK88bewerten. Interessierender experimentelle Proteine können auch mit diesen befleckenden Techniken untersucht werden.

Obwohl FFPE Abschnitte Visualisierung von Zellen mit Wohnsitz in Innenfach über histologische Methoden (H & E, IF, IHC) ermöglichen, Bilder beschränken sich auf Querschnitten und organoide Form kann durch die Einbettung Prozess verändert werden. Vollständig-hängen Färbung ermöglicht eine organoide eingefärbt und in Situ, Erhaltung der morphologische Phänotypen und schönem Bilder von Protein Lokalisierung beobachtet. Gesamte Montage ist ein Werkzeug verwendet, um ganze Gewebe oder ganze Tier Exemplare, wie dem Zebrafisch oder Maus Embryo, färben und Organellen leicht angepasst. Die hier beschriebene Technik wurde von MahéEt Al. von der Prozedur geändert. 11, die details der ursprünglichen Wachstum und Kultur des Magen-Darm-Organellen direkt auf einer Kammer-Folie zum Beizen und Fixierung der gesamte übergeordnete Kultur erfordert. Die hier beschriebene Methode beinhaltet die Übertragung eines einzigen organoide (oder Organellen) von Interesse in eine Kammer-Folie zum Zeitpunkt der Färbung. Dies ermöglicht die Auswahl der einzelnen Organellen für die gesamte-Mount Analyse in ein laufendes Experiment ohne Fixierung der übergeordnete Kultur. Bei der Durchführung ganz-Mount Färbung, es ist notwendig, Optimierung Permeabilisierung und die Inkubationszeit für primäre und sekundäre Antikörper gegen Eindringen während der Probe zu gewährleisten (überall von einem oder mehreren Tagen wird empfohlen). Sobald über konfokalen Mikroskopie abgebildet, können 3D-Renderings hergestellt werden, um zu ermöglichen, Visualisierung und Lokalisierung eines spezifischen Proteins und berechnen Sie die Anzahl der positiv gefärbten Zellen in einer Probe vorhanden. Durchflusszytometrie ist eine nützliche Endpunkt Populationen von basalen, luminalen quantifizieren oder Stammzellen-5,14. Um dies zu tun, sind Zellen erholt aus dem Matrix-Gel und sanft zum Beizen dissoziiert. Benutzer sollten entsprechende Markierungen für die Trennung anhand der aktuellen Literatur sorgfältig wählen. Für menschliche primäre epitheliale Zellen der Prostata sind CD26 und CD49f geeignete luminalen und basalen Marker, bzw.5,21.

Zusammenfassend lässt sich sagen details dieses Protokolls menschliche primäre Prostata organoide Wachstum, Sammlung und experimentelle Endpunkte. Der Hinweis kann die Montage-Technik beschrieben zu einer Vielzahl von anderen Assays angewandt werden, die normalerweise für 2D Zellen, wie z. B. fluoreszierende Testbasierte Experimente betrachten Verbreitung19, Apoptose und subzelluläre Organelle Flecken eingesetzt werden. Darüber hinaus könnten die hier beschriebene Erhebung und Dissoziation Methode in Vorbereitung auf die einzelne Zelle RNA Sequenzierung18genutzt werden. Kollektiv, zeigt dies die Möglichkeit für eine Vielzahl von Roman, High-Fidelity-Endpunkte, die Forscher optimieren und in der Zukunft erkunden können.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir danken der UIC Biorespository Mitglieder, Dr. Klara Valyi-Nagy und Alex Susma, sowie den Urologen DRS. Michael Abern, Daniel Moreira und Simone Crivallero, zur Erleichterung der Gewebe-Erwerb für den primären Zellkulturen. Wir danken der UIC-Urologie-Patienten für die Spende von ihr Gewebe zu erforschen. Diese Arbeit wurde teilweise durch die Abteilung der Verteidigung Prostata Krebs Forschung Programm Gesundheit Disparitäten Idee Award PC121923 (Nonn) und das UIC-Zentrum für klinische und Pre-doctoral Wissenschaftsbildung Übersetzung für klinische und translationale Wissenschaftler (finanziert ENTIERT) Programm (McCray und Richards) und durch die National Institutes of Health National Cancer Institute, Grant-Nummern U54CA202995, U54CA202997 und U54CA203000, bekannt als die Chicago Gesundheits-Equity Collaborative (Nonn und Richards). Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health oder das Department of Defense.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells of interest
Keratinocyte-SFM (KSFM) ThermoFisher Scientific 17005042
Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS) ThermoFisher Scientific 12676029
5α-Dihydrotestosterone (DHT) Sigma-Aldrich D-073-1ML
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate ThermoFisher Scientific 161093
Matrigel (matrix gel) Corning Various Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application
Ice Bucket
Cell Culture Hood
1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical ThermoFisher Scientific 05-408-130, 339650
Centrifuge
Dispase (neutral protease) STEMCELL Technologies 7923 neutral protease
Hanks' balanced salt solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14025076
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) ThermoFisher Scientific 12605036 Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)
TRIzol ThermoFisher Scientific 15596018 suggested RNA extraction solution
RIPA Lysis and Extraction Buffer ThermoFisher Scientific 89900 suggested protein extraction solution
DNAzol ThermoFisher Scientific 10503027 suggested DNA extraction solution
Organoids
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate ThermoFisher Scientific 161093
Brightfield microscope with camera capabilities ex. ‎EVOS FL Auto Imaging System
Photo analysis software ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler
Graphing software ex. Graphpad, Excel, etc
Organoids
Ice pack
Masking tape
Pipette tips (1000 μL)
Razor blade
Dispase STEMCELL Technologies 7923
Agarose Sigma-Aldrich A9045
HistoGel (histology-gel) ThermoFisher Scientific HG-4000-012
Pencil
"Plunger" from 1 cc insulin syringe
Tissue Casette Thomas Scientific 1202D72
Container to hold fixative
10% neutral buffered formalin (NBF) Sigma-Aldrich HT501128
Histology pen, xylene and EtOH-resistant Sigma-Aldrich Z648191-12EA STATMARK pen
Ethanol (histologic grade) Fisher Scientific A405P-4 For fixation and graded dilutions during processing
Xylenes Sigma-Aldrich 214736-1L
Deionized water
Paraffin Leica various
Tissue processor
Embedding workstation
Economy Tissue Float Bath Daigger EF4575E XH-1001
Microtome
Microtome blades Ted Pella 27243
Positively charged microscope slides Thomas Scientific 1158B91
Laboratory Oven ThermoFisher Scientific PR305225G
Hematoxylin and Eosin Stain Kit Vector Laboratories H-3502 Suggested H&E staining kit
ABC Peroxidase Standard Staining Kit ThermoFisher Scientific 32020 Suggested immunohistochemistry staining kit
Androgen Receptor Primary Antibody (AR) Cell Signaling Technology 5153S Suggested primary antibody for IHC
FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide
Ethanol (histologic grade) Fisher Scientific A405P-4 dilutions should be performed using deinoized water
Xylenes Sigma-Aldrich 214736-1L
Deionized water (DI H2O)
Antigen retrieval solution Sigma-Aldrich, Abcam C9999, ab93684
1x Phosphate Buffered Saline - PBS ThermoFisher Scientific 10010023
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-1L
Normal Horse Serum thermoFisher Scientific 31874
Bovin Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
Counterstain (DAPI, Hoescht) Sigma-Aldrich D9542
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 suggested for storage but not required
Confocal microscope
Coplin Fisher Scientific 19-4
Staining rack IHC World M905-12DGY
Staining dish IHC World M900-12B
Decloaking chamber Biocare Medical DC2012
Humidity chamber Thomas Scientific 1219D68
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) ARP American Research Products 03-GP11 suggested primary antibody for IF
p63-alpha antibody (p63) Cell Signaling Technology 4892S suggested primary antibody for IF
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) Biolegend 905501 suggested primary antibody for IF
Goat anti-rabbit secondary ThermoFisher Scientific A21245 suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)
Goat anti-guinea pig secondary ThermoFisher Scientific A-11075 suggested secondary antibody for CK8 detection
Microscope cover glass Globe Scientific 1414-10
Anti-fade mounting media ThermoFisher Scientific S36972
Organoids
Pipette tips (1000 μL)
Pipette tips (200 μL)
8-well chamber slide ThermoFisher Scientific 154534PK It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user
Cell-Tak Corning CB40240 optional adherent reagent
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific 10010023
4% paraformaldehye (PFA) Biotium 22023 other fixatives such as methanol or formalin can be used
50mM NH4Cl sigma-Aldrich 254134
Triton™ X-100 (non-ionic detergent) sigma-Aldrich X100-1L
Normal Horse Serum (NHS) thermoFisher Scientific 31874
Bovin Serum Albumin (BSA) sigma-Aldrich A2058
Counterstain (DAPI, Hoescht) Sigma-Aldrich D9542
Counterstain (phalloidin) thermoFisher Scientific A22287
Sodium azide sigma-Aldrich S2002 suggested for storage but not required
Confocal microscope
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) ARP American Research Products 03-GP11 suggested primary antibody for IF
p63-alpha antibody (p63) Cell Signaling Technology 4892S suggested primary antibody for IF
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) Biolegend 905501 suggested primary antibody for IF
Goat anti-rabbit secondary ThermoFisher Scientific A21245 suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)
Goat anti-guinea pig secondary ThermoFisher Scientific A-11075 suggested secondary antibody for CK8 detection
Visikol HISTO-M Visikol various optional clearing agent
Organoids
Pipette tips (1000 μL)
Pipette tips (200 μL)
8-well chamber slide ThermoFisher Scientific 154534PK It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user
Cell-Tak Corning CB40240
1x Phosphate Buffered Saline - PBS ThermoFisher Scientific 10010023
Cell assay of interest Various Various Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)
Organoids
Ice bucket
Cell culture hood
1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical
Microcentrifuge
Dispase STEMCELL Technologies 7923
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) ThermoFisher Scientific 12605036 Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)
Hanks' balanced salt solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14175079
Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap Fisher Scientific 08-771-23
Cytokeratin 5 Antibody - FITC Millipore Sigma FCMAB291F Suggested flow antibody
Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405 Abcam ab210139 Suggested flow antibody
CD49f - Alexafluor 647 BioLegend 313609 Suggested flow antibody
CD26 - PE BioLegend 320576 Suggested flow antibody
Flow cytometer

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References

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