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Bioengineering

हैंडलिंग और मानव प्राथमिक प्रोस्टेट Organoid संस्कृति का आकलन

Published: January 17, 2019 doi: 10.3791/59051
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3, 1,3
1Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 2Departments of Urology, Physiology, and Biophysics, University of Illinois at Chicago, 3University of Illinois Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम मानव प्राथमिक प्रोस्टेट organoid हैंडलिंग का मार्गदर्शन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत तो अंतिमबिंदु phenotype का आकलन करने के लिए सुझाव. सीडिंग, संस्कृति रखरखाव, मैट्रिक्स जेल से वसूली, सुघड़ ठहराव, embedding और अनुभाग, FFPE, पूरे माउंट धुंधला, और वाणिज्यिक परख के आवेदन वर्णित हैं ।

Abstract

यह कागज तीन आयामी (3 डी) संवर्धन, हैंडलिंग, और मानव प्राथमिक प्रोस्टेट organoids के मूल्यांकन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन । प्रक्रिया organoids में विस्तार की खेती के लिए मीडिया परिवर्तन के साथ एक ९६-अच्छी तरह से microplate पर एक 3 डी मैट्रिक्स जेल में उपकला कोशिकाओं के बोने के लिए शामिल है । आकृति विज्ञान तो z-ढेर छवियों के पूरे अच्छी तरह से कब्जा द्वारा मूल्यांकन किया जाता है । z-स्टैक के संपीड़न में एक एकल में फोकस छवि बनाता है जिसमें से organoids परिपत्र, गोलाई, और क्षेत्र सहित outputs की एक किस्म को यों तो मापा जाता है. डीएनए, आरएनए, और प्रोटीन मैट्रिक्स जेल से बरामद organoids से एकत्र किया जा सकता है । ब्याज की कोशिका आबादी organoid पृथक्करण और प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । Formalin-निर्धारण-आयल-embedding (FFPE) के बाद खोदी गई ऊतकवैज्ञानिक आकलन और एंटीबॉडी धुंधलाने के लिए प्रयोग किया जाता है. पूरे माउंट immunofluorescent धुंधला organoid आकृति विज्ञान को बरकरार रखता है और organoids में सीटूमें प्रोटीन स्थानीयकरण के अवलोकन की सुविधा । वाणिज्यिक परख कि परंपरागत रूप से 2d monolayer कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल कर रहे है 3 डी organoids के लिए संशोधित किया जा सकता है । एक साथ प्रयोग किया जाता है, इस प्रोटोकॉल में तकनीक प्रोस्टेट organoid वृद्धि, सुघड़ विशेषताओं, और भेदभाव मार्करों की अभिव्यक्ति के लिए एक मजबूत toolbox प्रदान करते हैं ।

Introduction

Organoids organogenesis और रोग का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण हैं । वे पशु मॉडलों के लिए एक कम खर्चीला विकल्प प्रदान करते हैं, और रोगी व्युत्पंन organoids व्यक्तिगत दवा1,2,3के लिए एक रणनीति के रूप में विकसित कर रहे हैं । यह तीन आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणाली स्टेम या जनक कोशिकाओं (ऊतक या प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से काटा) extracellular मैट्रिक्स घटकों के एक जेल में (मैट्रिक्स जेल)4सीडिंग शामिल है । कोशिकाओं पैदा करना और अंतर, organotypic संरचनाओं कि दोहराऊंगा सेलुलर पदानुक्रम और ब्याज की कार्यात्मक इकाई के अंग की आकृति विज्ञान में जिसके परिणामस्वरूप. Organoids, लार ग्रंथि, पेट, आंत, जिगर, प्रोस्टेट, फेफड़े, और4मस्तिष्क सहित अंगों की एक किस्म से उत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग कर उगाया गया है । हालांकि कई प्रोटोकॉल प्रोस्टेट organoids5,6स्थापित करने के लिए कदम का वर्णन कर रहे हैं, यह कैसे organoids से मात्रात्मक अंतिमबिंदु प्राप्त करने के लिए पर पर्याप्त रूप से विस्तृत तरीकों को खोजने के लिए चुनौतीपूर्ण है । यह कागज मानव प्राथमिक प्रोस्टेट कोशिकाओं के लिए विकसित तरीकों और विवरण organoid phenotypes का आकलन करने के लिए सुझाव अंतिमबिंदु की एक श्रृंखला संक्षेप । इन तकनीकों प्रोस्टेट organoids के लिए अनुकूलित किया गया है और अंय 3 डी सेल संस्कृतियों के लिए लागू हो सकता है ।

प्रोस्टेट organoid संस्कृतियों हाल ही में एक महत्वपूर्ण इन विट्रो मॉडल के रूप में उभरा है कि monolayer संस्कृतियों की सीमाओं का उपयोग कर स्थापित अमर सेल लाइनों का अभाव है । सौम्य प्रोस्टेट उपकला और प्रोस्टेट कैंसर में अमर सेल लाइनों का उपयोग कर इन विट्रो में मॉडल को चुनौती दे रहा है. सौम्य सेल लाइनों की संख्या सीमित है, और सभी7oncogenes के साथ परिवर्तन आया है । monolayers में प्राथमिक प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं चमकदार कोशिकाओं और कमी एण्ड्रोजन रिसेप्टर्स8में अंतर नहीं है. प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइनों के बहुमत कार्यात्मक एण्ड्रोजन रिसेप्टर्स नहीं है, प्रारंभिक रोग राज्य के एक महत्वपूर्ण मध्यस्थ, और कमी महत्वपूर्ण आनुवंशिक परिवर्तन है कि रोगी ट्यूमर9में पाया गया है. प्रोस्टेट organoid संस्कृतियों सौम्य उपकला से आसानी से उगाया जा सकता है और स्टेम सेल गुण का अध्ययन करने में मूल्यवान हैं, जनक कोशिकाओं, भेदभाव, और microenvironment4,5में प्रयोगात्मक परिवर्तन के प्रभाव. प्रोस्टेट कैंसर organoids रोगी रोग और10चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया मॉडलिंग के लिए एक सटीक दवा दृष्टिकोण के हिस्से के रूप में उगाया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल है कि विभिंन प्रकार के सेल का उपयोग मौजूदा प्रोटोकॉल से संकलित किया गया है, लेकिन यह मानव प्राथमिक प्रोस्टेट कोशिकाओं में उपयोग के लिए यहां अनुकूलित किया गया है । यह तारीफ प्रोटोकॉल Sawyers, चालाक, और शेन5,6 कि वृद्धि, passaging, उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग, cryopreservation, और आरएनए और प्रोस्टेट माउस और मानव organoids के डीएनए अलगाव का वर्णन द्वारा उल्लिखित । पूरे-माउंट प्रोटोकॉल Mahé एट अल से संशोधित किया गया है । 11, जो जठरांत्र उपकला organoids का इस्तेमाल किया और लाइव इमेजिंग और जमे हुए और आयल embedding का वर्णन करता है । Borten एट अल. 12 स्तन, बृहदांत्र के विश्लेषण का वर्णन है, और उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग से कोलोरेक्टल कैंसर organoid आकृति विज्ञान । इसके अतिरिक्त, रिचर्ड्स एट अल। 13 प्रोस्टेट organoids के सुघड़ आकलन के लिए एक विधि का इस्तेमाल किया । अंत में, हू एट अल. 14 एक कक्ष स्लाइड करने के लिए एक कक्ष immunofluorescent से पहले रात भर के लिए एकल कोशिकाओं और प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए क्षेत्रों के फैलाव का निरीक्षण धुंधला करने के लिए प्रोस्टेट organoids का पालन करने की एक विधि वर्णित है ।

इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के लिए पर्याप्त विस्तार में प्रदर्शित करने के लिए है एक प्रोटोकॉल के रूप में इन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण तरीकों, सेल सीडिंग सहित; मीडिया और मैट्रिक्स जेल रखरखाव; प्रवाह cytometry के लिए कक्षों का संग्रह; आरएनए, डीएनए, और प्रोटीन निष्कर्षण; उज्ज्वल क्षेत्र z-ढेर विश्लेषण से सुघड़ आकलन; embedding, प्रसंस्करण और ऊतकवैज्ञानिक धुंधला के लिए अनुभाग; और पूरे-इम्यूनोफ्लोरेसेंस या फ्लोरोसेंट जांच परख के लिए बढ़ते । इन विभिंन अंतिमबिंदु की जैविक प्रासंगिकता और व्याख्या प्रयोगात्मक डिजाइन और एंटीबॉडी विश्लेषण के लिए इस्तेमाल के बीच भिन्न हो जाएगा । इस प्रोटोकॉल के उपयोग के माध्यम से, उपयोगकर्ताओं को अंतिमबिंदु के एक टूलकिट के साथ एक प्रयोग सेट अप करने के लिए तैयार महसूस करना चाहिए ।

मानव प्राथमिक प्रोस्टेट उपकला (पूर्व) कोशिकाओं Peehl द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल द्वारा प्रयोगशाला में स्थापित किए गए15,16 और मार्ग की एक सीमित संख्या के लिए बनाए रखा (चार) के रूप में पहले17वर्णित है, लेकिन वे भी कर रहे हैं वाणिज्यिक विक्रेताओं से उपलब्ध है । Hepatocyte सीरम-मुक्त मीडिया आधारित6, KSFM-आधारित13, और R-spondin 1-वातानुकूलित5 मीडिया सभी सफलतापूर्वक organoids का उत्पादन होने के रूप में प्रकाशित कर रहे हैं । KSFM-आधारित additives की सबसे अधिक संख्या की आवश्यकता है, तो यह यहां वर्णित है ।

Protocol

निंनलिखित प्रोटोकॉल शिकागो अस्पताल में इलिनोइस विश्वविद्यालय में रोगी ऊतक से काटा मानव प्राथमिक प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं का उपयोग कर अनुकूलित किया गया था । सभी मानव इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया ऊतकों एक संस्थागत समीक्षा बोर्ड के माध्यम से प्राप्त कर रहे थे-अनुमोदित प्रोटोकॉल और/या शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय में छूट । जब संस्कृति की स्थितियां रुचि के कक्ष प्रकार के आधार पर बदलती हैं, तो अंतिमबिंदु अंय ऊतकों के organoids पर लागू किया जा सकता है ।

1. मैट्रिक्स जेल और बदलते मीडिया में उपकला कोशिकाओं के सीडिंग

  1. आवश्यक सामग्री इकट्ठा: मानव प्राथमिक प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं (पूर्व), बर्फ पर मैट्रिक्स जेल, ९६-अच्छी तरह से microplate, keratinocyte सीरम मुक्त मीडिया (बर्फ पर KSFM), लकड़ी का कोयला भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) छीन लिया, और dihydrotestosterone (DHT).
  2. KSFM आधारित organoid मीडिया चारकोल के २.५ मिलीलीटर छीन FBS और dihydrotestosterone (dht) के साथ KSFM के ४७.५ मिलीलीटर के संयोजन से 10 एनएम dht के अंतिम एकाग्रता के लिए तैयार है, तो बर्फ पर रिजर्व ।
  3. एक सेल संस्कृति हूड में एक 3 डी मैट्रिक्स में प्लेट कोशिकाओं बाँझ तकनीक का उपयोग कर ।
    1. धीरे मिश्रण ठंडा KSFM-बर्फ शीत मैट्रिक्स जेल के साथ organoid मीडिया आधारित एक ५०% मैट्रिक्स जेल मिश्रण प्राप्त करने के लिए धीरे से ऊपर और नीचे pipetting, बुलबुले से परहेज ।
      नोट: मैट्रिक्स जेल 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात गल जाना चाहिए और जब भी संभव बर्फ पर रखा । यह कमरे के तापमान (आरटी) पर जल्दी जम जाता है ।
    2. पूर्व ठंडा मीडिया और हस्तांतरण में एक पिपेट टिप गीले 40-50 μL के तल पर ५०% मैट्रिक्स जेल के एक अच्छी तरह से एक ९६ पर इस्तेमाल किया जा प्लेट अच्छी तरह से । कोट अच्छी तरह के तल के लिए एक आधार परत फार्म ।
      नोट: यह बुलबुले बना सकते हैं के रूप में, पिपेट पर दूसरा बंद करने के लिए पूरी तरह से बांटना नहीं है.
    3. आधार परत जमना के लिए 30-45 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में ९६-अच्छी तरह से थाली रखें ।
      नोट: आधार परत पर उपकला कोशिकाओं प्लेट नहीं जब तक यह जम गया है, या कोशिकाओं मैट्रिक्स के माध्यम से थाली के तल पर गिर जाते हैं और एक monolayer के रूप में विकसित हो सकता है.
    4. मिश्रण उपकला कोशिकाओं KSFM आधारित मैट्रिक्स जेल के साथ organoid मीडिया में निलंबित 100 की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए-1000 कोशिकाओं/100 μL और ३३% मैट्रिक्स जेल । प्लेट आधार परतों के शीर्ष पर उपकला कोशिकाओं ३३% मैट्रिक्स जेल के १०० μL का उपयोग/
      नोट: पिछले प्रयोगों से पता चला है कि बीज बोने की उपकला कोशिकाओं को भी 3 डी में घनी organoid विकास के आकार को प्रतिबंधित करेगा, जबकि बहुत कम सीडिंग13में परिणाम कर सकते हैं. रोगी-विशिष्ट organoid गठन कुशलता के आधार पर, ब्याज के सेल प्रकार के लिए सीडिंग की स्थिति का अनुकूलन महत्वपूर्ण है ।
  4. 30 के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में ९६-अच्छी तरह से थाली प्लेस-45 मिनट जमना के लिए जेल की अनुमति है, तो धीरे KSFM के १०० μL-आधारित organoid मीडिया की कोशिकाओं के शीर्ष पर धीरे pipetting से जोड़ने के लिए अच्छी तरह से बढ़त के खिलाफ ।
  5. मीडिया को हर 2-3 दिन में बदल दो । Pipetting मीडिया और मैट्रिक्स जेल के बीच अंतरिक्ष के साथ अच्छी तरह के पक्ष के खिलाफ, ध्यान से मीडिया के ५० μL को हटाने और ताजा मीडिया के ५० μL के साथ प्रतिस्थापित करें ।
    नोट: एक दीर्घकालिक संस्कृति के लिए, मैट्रिक्स जेल की जरूरत है हर 2-3 सप्ताह बदल सकता है । यदि मैट्रिक्स जेल संस्कृति अस्थिर दिखाई देता है और माइक्रोस्कोप के तहत पारदर्शी झुर्रियों को प्रदर्शित करता है, तो मैट्रिक्स जेल टूट गया है और जगह की जरूरत है ।

2. मैट्रिक्स जेल से Organoids का संग्रह

नोट: organoids का संग्रह मैट्रिक्स जेल परिवर्तन, passaging या आरएनए निष्कर्षण, डीएनए निष्कर्षण, प्रोटीन निष्कर्षण, और प्रवाह cytometry के समापन के लिए आवश्यक है ।

  1. एक ३७ ° c पानी स्नान में गर्म तटस्थ चिढ़ाने और हैंक्स ' संतुलित नमक समाधान (HBSS) ।
  2. ध्यान से मीडिया कुओं से मैट्रिक्स जेल में खलल डाले बिना हटा दें ।
  3. जोड़ें ~ २०० एक अच्छी तरह से एक ~ 1:2 मैट्रिक्स जेल के अनुपात में तटस्थ को छेड़ने के μL: तटस्थ को छेड़ो और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए मशीन ।
  4. यांत्रिक मैट्रिक्स जेल अलग कर देना: तटस्थ pipetting ऊपर और नीचे से मिश्रण को चिढ़ाने ।
  5. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए मशीन ।
  6. एक microcentrifuge ट्यूब या शंकु ट्यूब करने के लिए तटस्थ को छेड़ो-मैट्रिक्स जेल-सेल मिश्रण, मात्रा के आधार पर स्थानांतरण । 3 के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक-5 गोली कोशिकाओं को मिनट ।
    नोट: यदि कोई सेल गोली प्रकट होता है, मैट्रिक्स जेल पूरी तरह से असंबद्ध नहीं हो सकता है और गुलाबी supernatant से अलग ट्यूब के तल पर एक पारदर्शी चरण के रूप में visualized किया जा सकता है । supernatant निकालें और एक 1:2 के अनुपात में और अधिक तटस्थ चिढ़ाने के लिए मैट्रिक्स जेल गोली, एक और 20 के लिए-40 मिनट में ३७ डिग्री सेल्सियस, और ३०० x जीपर दोहराने केंद्रापसारक के लिए मशीन जोड़ें
  7. जब एक organoid गोली प्राप्त की है, supernatant को हटा दें । passaging के साथ आगे बढ़ें (चरण 2.7.1 देखें), आरएनए, डीएनए, या प्रोटीन निष्कर्षण के लिए organoid lysis (कदम 2.7.2 देखें), प्रवाह cytometry द्वारा एकल कोशिकाओं प्रसंस्करण, और एकल-सेल अनुक्रमण (कदम 2.7.3 देखें).
    1. लंबे समय तक संस्कृति के लिए, धीरे ३३% ताजा मैट्रिक्स जेल और प्लेट में बरकरार organoids चरणों का पालन करने से 1.1-1.5 चरणों में वर्णित स्थगित । अलग कर देना organoids और एकल कोशिकाओं के रूप में प्लेट, गर्म सेल के 1 मिलीलीटर में गोली replate-पृथक्करण एंजाइमों और ३७ ° c में 10 के लिए गर्मी-15 मिनट, HBSS के 5 मिलीलीटर के साथ एक बार धोने, और पुनः ताजा मैट्रिक्स जेल में प्लेट 1.1-1.5 निंनलिखित कदम ।
    2. आरएनए निष्कर्षण, डीएनए निष्कर्षण, या प्रोटीन निष्कर्षण के लिए एक उपयुक्त lysis बफर में organoid गोली resuspend के रूप में सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध है और निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें ।
    3. गर्म सेल के 1 मिलीलीटर में organoids resuspend-पृथक्करण एंजाइमों और ३७ ° c में 10 के लिए मशीन-15 मिनट के लिए एकल कोशिकाओं में organoids अलग कर देना । HBSS के 5 मिलीलीटर के साथ एक बार धोने और प्रवाह cytometry5 या एकल सेल अनुक्रमण18के लिए प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ना ।
      नोट: मैट्रिक्स जेल के कम सांद्रता पर एकल कोशिकाओं में अलग कर देना करने के लिए, तटस्थ छेड़ने की जरूरत नहीं हो सकता है, और सेल-पृथक्करण एंजाइमों सीधे अच्छी तरह से करने के लिए कदम २.२ के बाद लागू किया जा सकता है ।

3. पूरे अच्छी तरह से छवि अधिग्रहण और Organoid आकृति विज्ञान का विश्लेषण

  1. एक मोटर चालित एक्स के साथ एक प्रेषित प्रकाश औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर पूरे अच्छी तरह से जेड-ढेर छवियों के अधिग्रहण (कार्यप्रवाह चित्र 1aमें सचित्र).
    1. फोकल स्थिति के साथ अच्छी तरह से नीचे करने के लिए समायोजित, ऊपर की ओर ध्यान केंद्रित शुरू जब तक पहली organoid सामना करना पड़ा है, जो अच्छी तरह से आधार परत से meniscus के कारण के केंद्र में होगा । इस स्थिति में नीचे z-विमान सेट करें ।
    2. ऊपर की ओर ध्यान केंद्रित जब तक पिछले organoid ध्यान में है, जो अच्छी तरह की परिधि में होगा जारी है । इस स्थिति में शीर्ष z-विमान सेट करें ।
      नोट: ऊपर और नीचे की स्थापना के बाद z-स्टैक, सुनिश्चित करें कि इन पदों पर सभी शेष कुओं के भीतर organoids पर कब्जा और आवश्यकतानुसार ऊपर/ यह z-श्रेणी के लिए एक एकल स्कैन है कि प्रत्येक organoid के भीतर हर अच्छी तरह शामिल है के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है ।
    3. कब्जा 15 – 35 जेड-विमानों प्रति अच्छी तरह से, अधिक से अधिक संकल्प के लिए एक बड़ी संख्या का उपयोग. पूरी तरह से छवि पर कब्जा, विलय और अगर जरूरत चक्रों या उपधाराओं इकट्ठा ।
      नोट: यह एकाधिक z-विमानों लेने के रूप में एक z-विमान का विरोध करने की सिफारिश की है, के रूप में चित्रा 1b जिसमें organoids ध्यान से बाहर है जब केवल एक z-विमान पर कब्जा कर रहे है में सचित्र ।
    4. बहाव विश्लेषण के लिए z-स्टैक छवियाँ सहेजें ।
  2. मुक्ताकार आरेखण क्षमताओं के साथ छवि सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके छवियां विश्लेषण करें ।
    1. एक एकल z-विमान छवि चरण 3.1.4 से सेट खोलें ।
    2. यदि आवश्यक हो, एक एकल, पूरी अच्छी तरह से छवि में प्रत्येक व्यक्ति z-विमान में लिया छवियों टाइल । नई छवि को एक पृथक फ़ाइल के रूप में सहेजें । प्रत्येक z-विमान अधिग्रहीत के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ ।
    3. छवि सॉफ्टवेयर का प्रयोग, एक अच्छी तरह से हर जेड के लिए पूरी तरह से छवि को खोलने के लिए और z-विमानों के ढेर से क्षेत्र (ईडीएफ) छवि की एक विस्तारित गहराई बनाने के लिए ।
      नोट: छवि के इस प्रकार के प्रत्येक z-विमान का सबसे अच्छा ध्यान क्षेत्र का चयन करने के लिए अच्छी तरह से एक एकल में ध्यान केंद्रित छवि बनाने जाएगा ।
    4. सॉफ़्टवेयर के पिक्सेल स्केल को उस छवि के स्केल बार पर सेट करें जिसे मापा जा रहा है ।
    5. छवि सॉफ़्टवेयर के मुक्ताकार आरेखण उपकरण का उपयोग करके, हर organoid की परिधि को अच्छी तरह से ट्रेस करें ।
    6. छवि सॉफ़्टवेयर से traced organoid परिधि के लिए माप मेट्रिक्स प्राप्त करें ।
      नोट: अनुशंसित पैरामीटर्स क्षेत्र, प्रचलन, और अधिकतम/ंयूनतम त्रिज्या अनुपात हैं । प्रतिनिधि परिणाम इन मैट्रिक्स के आवेदन illustrating चित्रा 1Cमें दिखाया गया है । क्षेत्र organoid की परिधि द्वारा परिभाषित बहुभुज से गणना की जाती है । परिपत्र एक व्यास के साथ एक चक्र के क्षेत्र के लिए organoid के क्षेत्र का अनुपात है organoid अधिकतम फेर्रेट, जहां 0 कम परिपत्र है और 1 अधिक परिपत्र है । अधिकतम/न्यूनतम त्रिज्या अनुपात अधिकतम त्रिज्या और traced organoid की ंयूनतम त्रिज्या के बीच अनुपात है ।
      प्रचलन =Equation 1
      त्रिज्या अनुपात =Equation 2

4. ऊतकवैज्ञानिक अंतिमबिंदु के लिए Organoids की Formalin निर्धारण और आयल embedding

  1. एंबेडिंग आपूर्ति तैयार करें: HBSS, 2% आगर समाधान, ऊतकवैज्ञानिक अंकन डाई, प्रोटोकॉल जेल, पिपेट टिप मोल्ड, टेप, एक 1 सीसी इंसुलिन सिरिंज से गोताख़ोर, आइस पैक, कैसेट्स, 10% तटस्थ बफर formalin (NBF), पेंसिल, और ७५% ऊतकवैज्ञानिक ग्रेड इथेनॉल (ेतोः).
    1. 2% आगर समाधान के दो microcentrifuge ट्यूबों तैयार करें । एक पानी के स्नान में या 100-110 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी ब्लॉक में मशीन तरल रूप में आगर बनाए रखने के लिए । 1-2% आगर समाधान है, जो आगर प्लग के शीर्ष निरूपित करेंगे और embedding के दौरान अभिविन्यास को बनाए रखने में सहायता के लिए रंग अंकन histologic के 2 बूंदें जोड़ें । अच्छी तरह मिलाएं ।
    2. 55-65 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान या गर्मी ब्लॉक में प्रोटोकॉल जेल गर्म ।
    3. एक १००० μL पिपेट टिप का प्रयोग, बाहर पिपेट टिप के एक छोटे से अनुभाग काटने के लिए एक सिलेंडर है कि ~ ५० μL धारण बनाने के मोल्ड्स बनाएं । एक दूसरा, व्यापक मोल्ड है कि पहले मोल्ड के आसपास फिट बैठता है बनाएं ।
    4. टेप (चिपकने वाला पक्ष) के साथ एक आइस पैक लपेटकर और टेप करने के लिए molds का पालन करके एक ठंडा ब्लॉक बनाएं ।
    5. 1 सीसी इंसुलिन सिरिंज से गोताख़ोर निकालकर एक गोताख़ोर बनाएं ।
  2. चित्र 2aमें दर्शाए गए वर्कफ़्लो का अनुसरण करते हुए, संसाधन के लिए प्रोटोकॉल gel प्लग में organoids एंबेड करें ।
    1. अलग कर देना मैट्रिक्स जेल और गोली organoids चरणों का पालन करके 2.1 – 2.7 ।
    2. धो organoid गोली एक बार HBSS के 1 मिलीलीटर और फिर से गोली 3 के लिए कताई-5 मिनट ३०० x जी पर और supernatant को हटाने के साथ ।
    3. पुनः निलंबित organoid गोली 30 में-50 तरल प्रोटोकॉल जेल के μL । धीरे से ऊपर और नीचे pipetting करके धीरे से मिलाएं । कोल्ड ब्लॉक पर एक सांचे में ढालना में प्रोटोकॉल जेल/organoid मिश्रण स्थानांतरण और एक प्लग में शांत और जमना के लिए नमूना अनुमति देते हैं ।
    4. एक गोताख़ोर का प्रयोग करने के लिए छोटे सांचे में ढालना और बड़े सांचे में प्लग बाहर धक्का । पिपेट स्पष्ट 2% बड़ा मोल्ड को भरने के लिए प्लग के आसपास आगर ।
    5. पिपेट histologic डाई-रंगा हुआ 2% प्लग के शीर्ष पर आगर नमूना के शीर्ष निरूपित करने के लिए ।
    6. एक बार ठंडा, एक गोताख़ोर का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल कैसेट में प्लग हस्तांतरण । लेबल कैसेट का उपयोग कर एक पेंसिल और जगह में कैसेट 10% NBF निर्धारण के लिए रात भर ।
    7. 10% NBF से कैसेट ७०% ऊतकवैज्ञानिक ग्रेड ेतोः स्थानांतरण ।
  3. प्रक्रिया प्रोटोकॉल जेल प्लग एक प्रोसेसर पर एक पूर्व सेट बायोप्सी प्रोटोकॉल का उपयोग कर, यदि उपलब्ध है । प्रीसेट उपलब्ध नहीं है, तो निम्न अनुक्रम और लंबाई इनपुट: ७०% ेतोः के लिए 6 मिनट, ७०% ेतोः 10 मिनट के लिए, ८०% ेतोः 10 मिनट के लिए, ९५% ेतोः 10 मिनट के लिए 2 बार, 10 मिनट के लिए १००% ेतोः 3 बार, 15 मिनट के लिए xylene 3 बार , और आयल 15 min. Deviating के लिए अनुशंसित संसाधन अनुक्रम से 3 बार उठी organoids (चित्रा 3ए) में परिणाम कर सकते हैं ।
  4. रंग का सामना करना पड़ भाग के साथ प्रोटोकॉल जेल प्लग एंबेड, के रूप में यह organoids युक्त भाग को पहले में खोदी जा करने की अनुमति होगी ।
  5. FFPE प्रोटोकॉल जेल ब्लॉक अनुभाग:
    1. लीजिए आवश्यक आपूर्तियां: FFPE प्रोटोकॉल जेल ब्लॉकों, प्रोटोकॉल कलम, ऊतक फ्लोट जल स्नान, बर्फ के साथ बर्फ बाल्टी, microtome, microtome ब्लेड, कार्य केंद्र embedding, सकारात्मक चार्ज माइक्रोस्कोप स्लाइड, और प्रयोगशाला ओवन ।
    2. पानी स्नान भरें जब तक बहुत भरा है और ४० ° c के लिए सेट, तो पूर्व गर्म प्रयोगशाला ओवन को 45-50 ° c ।
    3. एक बर्फ की बाल्टी तैयार है, तो बर्फ के साथ भरें और एक बर्फ पानी के घोल बनाने के लिए पानी जोड़ें । बर्फ पर ब्लॉक ठंडा जब तक वे बहुत ठंडा कर रहे हैं ।
      नोट: ब्लॉक बर्फ पर अप करने के लिए 1 दिन के लिए सेट किया जा सकता है, लेकिन अगर रात भर छोड़ दिया, ब्लॉक हाइड्रेटेड हो जाएगा और फिर से संसाधित किया जा करने की आवश्यकता होगी ।
    4. microtome कैसेट दबाना में एक ब्लॉक डालें, चाकू धारक को ब्लेड जोड़ने के लिए, और मशीन पर किसी भी सुरक्षात्मक लॉकिंग उपाय अनलॉक ।
    5. तेल ब्लॉक के चेहरे छंटनी (बंद का सामना करना पड़) से शुरू एक 10 µm मोटाई पर । एक बार एक खंड उभर है कि प्लग क्षेत्र शामिल है, ट्रिमिंग बंद करो, microtome रोटर ताला, और बर्फ पर वापस ब्लॉक हस्तांतरण ठंडा करने के लिए । कई ब्लॉकों के लिए खोदी जा रहे हैं, तो कदम 4.5.6 के लिए जाने से पहले प्रत्येक ब्लॉक से बाहर ।
    6. एक नया, अप्रयुक्त भाग के लिए ब्लेड ले जाएं और ब्लॉक दबाना करने के लिए वापस स्थानांतरण । मशीन अनलॉक और अनुभाग प्रति 5 माइक्रोन पर ट्रिमिंग शुरू करते हैं ।
      नोट: 5 माइक्रोन सर्वोत्तम परिणामों के लिए सिफारिश की है, लेकिन 3-10 माइक्रोन भी स्वीकार्य है.
    7. चिमटी का प्रयोग, ४० डिग्री सेल्सियस पानी स्नान करने के लिए खंड को हस्तांतरण और अनुभाग से बाहर फैल अनुमति देते हैं । एक स्लाइड पर खंड को पानी में खड़ी सूई से स्थानांतरण ।
      नोट: एक कोण पर सूई स्नान के नीचे से बुलबुले खंड को हस्तांतरण और नमूने की विकृति का कारण बन सकता है ।
    8. माइक्रोस्कोप के तहत अनुभाग कल्पना (चित्र बी, सी) ।
      नोट: यदि एक organoid मौजूद है, यह चित्र बी में लाल तीर के समान दिखाई देगा । बुलबुले (चित्रा 2 बी, नीला तीर) organoids के समान प्रकट कर सकते हैं और एक ताजा स्लाइड पर विचार करने के लिए आसान कर रहे हैं के रूप में शुष्क organoids दिखाई पारदर्शी (चित्रा 2c). यदि कोई organoids मौजूद हैं, खंड में आगे अनुभाग ।
  6. जब organoids युक्त स्लाइड का अधिग्रहण किया गया है, एक प्रोटोकॉल कलम के साथ स्लाइड के पीछे पर अनुभाग के आसपास के क्षेत्र चक्र और 45-50 डिग्री सेल्सियस पर रात सेंकना ।
  7. स्लाइड ले लीजिए और एच & ई (चरण 4.9.1 देखें), immunohistochemical (चरण 4.9.2 देखें), या immunofluorescent धुंधला (चरण 5 देखें) के लिए आगे बढ़ें ।
    नोट: प्रतिनिधि परिणाम चित्र बीमें दिखाए जाते हैं ।
    1. करने के लिए एच & ई धुंधला, सामग्री सूची से एक किट प्राप्त करने और निर्माता के विनिर्देशों का पालन करें ।
    2. immunohistochemical धुंधला प्रदर्शन करने के लिए, सामग्री सूची से एक किट और प्राथमिक एंटीबॉडी प्राप्त करने और निर्माता के विनिर्देशों का पालन करें ।

5. FFPE और खोदी गई Organoids के Immunofluorescent दाग

  1. लीजिए आपूर्ति: चरण 4 से बेक्ड स्लाइड, xylene, १००% ेतोः, ९५% ेतोः, ७०% ेतोः, जल (डि एच2ओ), coplin जार, 1x प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान (सोडियम साइट्रेट बफर या EDTA-Tris बफर), फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब), 5% सामान्य हार्स सीरम ( एन एस) के साथ ०.१% गैर ईओण में डिटर्जेंट पंजाब, 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) पंजाब में ०.३% गैर ईओण डिटर्जेंट के साथ, धुंधला रैक, धुंधला पकवान, कपड़े का कपड़ा, hydrophobic बाधा कलम, आर्द्रता चैंबर, 1 ° और ब्याज की 2 ° एंटीबॉडी, और counterstains के ब्याज.
  2. Deparaffinize और निंन समाधानों से भरे coplins में सूई लगाकर स्लाइड को हाइड्रेट करें: xylene (3 डिप, 5 min प्रत्येक), १००% ेतोः (2 डिप, 3 min प्रत्येक), ९५% ेतोः (2 डिप, 3 min प्रत्येक), ७०% ेतोः (2 डिप, 3 min प्रत्येक), और DI H2O (2 डिप , 3 मिनट प्रत्येक) ।
  3. १०० ° c करने के लिए प्रतिजन पुनः प्राप्ति समाधान और पूर्व गर्मी लबादा के साथ धुंधला पकवान भरें ।
  4. पहले से गर्म धुंधला पकवान में स्लाइड विसर्जित और 5 के लिए गर्मी-10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर की मशीन प्रतिजन पुनर्प्राप्ति करते हैं । एक बार चक्र पूरा हो गया है, ढक्कन खोलने से पहले 20 मिनट के लिए बैठने के लिए लबादा चैंबर अनुमति देते हैं ।
  5. एक बार स्लाइड डिश आरटी के लिए ठंडा है, 5 मिनट के लिए स्लाइड कुल्ला करने के लिए चल DI H2O के तहत धुंधला पकवान जगह है ।
  6. धुंधला पकवान से स्लाइड निकालें, एक hydrophobic बैरियर पेन के साथ नमूने के चारों ओर एक सर्कल ड्रा, और आर्द्रता चैंबर पर स्लाइड रखना ।
  7. ब्लॉक किसी भी गैर विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ 5% एन एस लागू करने से धुंधला ०.१% गैर ईओण का hydrophobic सर्कल के लिए पंजाबियों में डिटर्जेंट नमूने के आसपास (के बारे में 30 μL के लिए नमूना कवर की जरूरत है) ।
  8. 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार पंजाबियों से भरे coplins में स्लाइड धो लो ।
  9. 1 ° एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) ०.३% गैर के साथ 1% BSA में पतला-hydrophobic सर्कल के लिए पंजाब में ईओण डिटर्जेंट नमूने के आसपास (के बारे में 30 μL अनुभाग को कवर करना चाहिए), तो 1 आर में या रात भर में 4 के लिए मशीन जोड़ें आर्द्रता कक्ष ।
  10. 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार पंजाबियों से भरे coplins में स्लाइड धो लो ।
  11. 2 ° ०.३% गैर के साथ 1% BSA में पतला एंटीबॉडी जोड़ें-hydrophobic सर्कल के लिए पंजाब में ईओण डिटर्जेंट नमूने के आसपास (के बारे में 30 μL क्षेत्र को कवर किया जाएगा), तो 1 के लिए गर्मी में आरटी पर आर्द्रता चैंबर ।
  12. 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार पंजाबियों से भरे coplin में स्लाइड धो लो ।
  13. DAPI जोड़ें, निर्माता के विनिर्देशों को पतला, 1% BSA में ०.३% गैर ईओण का नमूना के आसपास hydrophobic सर्कल के लिए पंजाब में डिटर्जेंट, तो 2 के लिए मशीन-अंधेरे (30 μL) में आरटी पर 5 मिनट ।
  14. 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार पंजाबियों से भरे coplins में स्लाइड धो लो ।
  15. माउंट antifade बढ़ते मीडिया और coverslip के साथ स्लाइड, तो एक खुर्दबीन के नीचे परिणाम कल्पना ।

6. पूरे-Immunofluorescent धुंधला के लिए Organoids के बढ़ते

  1. इकट्ठा की आपूर्ति: चैंबर स्लाइड या फोकल डिश, फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब), निर्धारण, ५० मिमी एनएच4पंजाबियों में सीएल, ०.१% गैर ईओण पंजाब में डिटर्जेंट, ०.१% गैर ईओण के साथ 5% एन एस, पंजाबियों में डिटर्जेंट, 1% ०.३% गैर ईओण के साथ BSA में डिटर्जेंट, 1 ° और 2 ° एंटीबॉडी ब्याज की, और ब्याज की counterstains ।
  2. ध्यान से, मीडिया और मैट्रिक्स जेल के बीच अंतरिक्ष छोड़ने के खिलाफ अच्छी तरह से pipetting द्वारा organoid संस्कृति को बाधित किए बिना संभव के रूप में ज्यादा मीडिया को हटा दें ।
  3. एक छंटनी, पूर्व मीडिया या पंजाबियों, १,००० μL पिपेट टिप के साथ गीला का उपयोग करना, एक बूंद (25-50 μL) मैट्रिक्स जेल है कि ब्याज की organoid (एस) शामिल है और एक चैंबर स्लाइड के बीच पर अच्छी तरह से वितरण या फोकल डिश आकर्षित ।
    नोट: ३३% मैट्रिक्स जेल एक ठोस नहीं है । यह एक चिपचिपा तरल पदार्थ है कि एक Jello है कि पूरी तरह से सेट नहीं है के समान संभालती है । एक बड़े खोलने के साथ एक छंटनी की पिपेट टिप organoids स्थानांतरण के दौरान तोड़ने से रोक देगा ।
  4. यदि organoids पैरेंट कल्चर में बने रहते हैं, तो मीडिया को उष्ण KSFM-आधारित मीडिया से बदलें ।
  5. नग्न आंखों या विदारक गुंजाइश के साथ, महाप्राण एक ठीक टिप पिपेट (10-200 μL) के साथ चैंबर स्लाइड से अतिरिक्त मीडिया और मैट्रिक्स जेल ।
    नोट: यह एक पालन एजेंट के साथ चैंबर स्लाइड का इलाज करने के लिए वैकल्पिक है.
  6. प्लेट एक वैकल्पिक नियंत्रण के रूप में चैंबर स्लाइड की एक खाली में मैट्रिक्स जेल का एक समान मात्रा बचे हुए मैट्रिक्स के autofluorescence का निरीक्षण करने के लिए ।
  7. 30 के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में चैंबर स्लाइड प्लेस-45 मिनट के लिए organoid को बढ़ावा देने के लिए कांच का पालन करें और धोने चरणों के दौरान नमूनों की हानि को रोकने के ।
  8. धीरे Pipetting स्लाइड से टुकड़ी को रोकने के लिए, organoids धो के साथ 5 मिनट के लिए 1x पंजाब के २०० μL के साथ धोने, जबकि धीरे मिलाते हुए ।
  9. 1x पंजाबियों निकालें और 4% paraformaldehyde के २०० μL के साथ आरटी में 30 मिनट के लिए ठीक है जबकि धीरे मिलाते हुए । सुनिश्चित करें कि इस चरण के बाद मैट्रिक्स जेल स्पष्ट दिखाई देता है ।
    नोट: मेथनॉल या formalin निर्धारण भी संभव है । निर्धारण विधि कुछ निर्धारण विधियों के रूप में विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ब्याज की एंटीजन या शमन फ्लोरोसेंट-लेबलिंग-ब्याज के प्रोटीन crosslink कर सकते हैं ।
  10. हटाने के निर्धारण और 5 मिनट के लिए 1x पंजाबियों के २०० μL के साथ दो बार धो जबकि धीरे मिलाते हुए ।
    नोट: धुलाई कदम की लंबाई organoid आकार के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए । पांच मिनट के एक पर्याप्त प्रारंभिक बिंदु है, लेकिन धुलाई कदम की जरूरत के रूप में लंबा किया जा सकता है ।
  11. autofluorescence पर 30 मिनट के लिए 1x पंजाब में ५० mM NH4Cl के २०० μL के साथ बुझाना जबकि धीरे मिलाते हुए ।
    नोट: यह कदम organoid के लुमेन में मलबे से और फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति से autofluorescence बुझाने होगा (जैसे GFP के रूप में) कि प्रयोगात्मक डिजाइन से उपस्थित हो सकता है । यह शामिल किया जाना चाहिए अगर यह ४८८ चैनल में एक fluorophore का उपयोग करने के लिए वांछित है, लेकिन GFP संकेत की रक्षा करने के लिए वांछित अगर छोड़ दिया जा सकता है.
  12. NH4सीएल निकालें और 5 मिनट के लिए 1x पंजाबियों के २०० μL के साथ दो बार धो जबकि धीरे मिलाते हुए ।
  13. Permeabilize organoids २०० में ०.१% गैर ईओण डिटर्जेंट-१०० के लिए 1x पंजाब में 30 मिनट के लिए आर टी में जबकि धीरे मिलाते हुए ।
  14. हटा ०.१% गैर ईओण डिटर्जेंट-१०० 1x पंजाब में और 5 मिनट के लिए 1x पंजाब के २०० μL के साथ दो बार धो जबकि धीरे मिलाते हुए ।
  15. ०.१% गैर के २०० μL के साथ 5% एन एस के साथ ब्लॉक-ईओण डिटर्जेंट एक्स-पंजाब में १०० और आर टी में ६० मिनट के लिए मशीन जबकि धीरे मिलाते हुए ।
  16. अवरुद्ध बफर निकालें और 5 मिनट के लिए 1x पंजाबियों के २०० μL के साथ दो बार धो जबकि धीरे मिलाते हुए ।
  17. 1% BSA में 1% एंटीबॉडी को पतला ०.३% ट्राइटन एक्स-१०० के साथ 1x पंजाब में और चैंबर स्लाइड के २०० μL में जोड़ें, तो 1 के लिए गर्मी-4 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिन ।
  18. 1 ° एंटीबॉडी निकालें और 5 मिनट के लिए 1x पंजाबियों के २०० μL के साथ दो बार धो जबकि धीरे मिलाते हुए ।
  19. ०.३% ट्राइटन X-१०० 1x पंजाब में के साथ 1% BSA में 2 ° एंटीबॉडी पतला और चैंबर स्लाइड के २०० μL में जोड़ने के लिए, तो 1 के लिए मशीन-3 दिन में 4 ° c अंधेरे में ।
    ध्यान दें: गर्मी के समय की लंबाई organoid आकार और एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । कुछ अधिक समय के लिए organoid के माध्यम से घुसना की आवश्यकता होगी । एंटीबॉडी एकाग्रता भी अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी । सामांय में, 2x FFPE वर्गों के लिए इस्तेमाल किया एकाग्रता 1 डिग्री एंटीबॉडी और FFPE वर्गों के लिए एक ही एकाग्रता के लिए उपयुक्त है 2 ° एंटीबॉडी के लिए उपयुक्त है ।
  20. 2 ° एंटीबॉडी निकालें और 5 मिनट के लिए 1x पंजाबियों के २०० μL के साथ दो बार धो जबकि धीरे मिलाते हुए ।
  21. Counterstain के साथ actin phalloidin और DAPI या Hoescht के साथ नाभिक, ०.३% BSA के साथ 1% ट्राइटन में निर्माता की सिफारिशों के अनुसार पतला 1x पंजाब में एक्स । चैंबर स्लाइड में २०० μL जोड़ें, तो अंधेरे में ४० मिनट के लिए आर टी पर मशीन ।
  22. २०० μL में माउंट ताजा 1x पंजाबियों या बढ़ते मीडिया और छवि के तुरंत (प्रतिदीप्ति के लिए संरक्षित किया जाना चाहिए 5 दिनों के लिए, नहीं तो अब) । प्रतिनिधि परिणाम चित्र 3सी में दिखाए जाते हैं ।
    नोट: सोडियम azide संक्रमण को रोकने के लिए नमूनों में जोड़ा जा सकता है अगर फोकल इमेजिंग आसानी से उपलब्ध नहीं है । एक क्लियरिंग एजेंट जोड़ने इमेजिंग में सुधार कर सकते हैं ।

7. पूरे-परख और फ्लोरोसेंट जांच के लिए Organoids के बढ़ते

नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध परख और फ्लोरोसेंट जांच कर रहे है/रंजक (उदाहरण सामग्री की सूची पर शामिल हैं) पूरे घुड़सवार organoids पर उपयोग के लिए संशोधित उपयोगी अंतिमबिंदु19की एक किस्म का पालन करें । निम्नलिखित प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट-बला EdU प्रसार किट के लिए है, हालांकि किसी भी किट को पूरे घुड़सवार नमूने के साथ उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है ।

  1. ध्यान से मीडिया के ५० μL निकालें और pipetting द्वारा 20 माइक्रोन 2x काम EdU समाधान के ५० μL के साथ अच्छी तरह से की ओर, मीडिया और मैट्रिक्स जेल के बीच अंतरिक्ष छोड़ने के साथ बदलें ।
  2. 1 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन-3 दिन (EdU निगमन के लिए समय की वांछित लंबाई पसंद के सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए) ।
  3. चरणों का पालन करें 6.2 – 6.8 एक चैंबर स्लाइड या फोकल डिश पर ब्याज की organoids हस्तांतरण करने के लिए ।
  4. पंजाबियों निकालें और आर टी पर 30 मिनट के लिए ३.७% paraformaldehyde के २०० μL के साथ ठीक है जबकि धीरे मिलाते हुए । सुनिश्चित करें कि इस चरण के बाद मैट्रिक्स जेल स्पष्ट दिखाई देते हैं ।
  5. हटाने के निर्धारण और 5 मिनट के लिए 1x पंजाबियों के २०० μL के साथ दो बार धो जबकि धीरे मिलाते हुए । हटाएं पंजाबियों और ०.५% गैर ईओण डिटर्जेंट-१०० के २०० μL में आर टी 30 मिनट के लिए आरटी पर धीरे से मिलाते हुए ।
  6. निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार एक 1x फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया कॉकटेल तैयार करें ।
  7. ०.५% गैर ईओण डिटर्जेंट-१०० निकालें और 5 मिनट के लिए 1x पंजाब में 3% BSA के २०० μL के साथ दो बार धो जबकि धीरे मिलाते हुए ।
  8. प्रतिक्रिया कॉकटेल जोड़ें और अंधेरे में आर टी में 30 मिनट के लिए मशीन ।
  9. फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया कॉकटेल निकालें और 5 मिनट के लिए 1x पंजाब में 3% BSA के २०० μL के साथ एक बार धो जबकि धीरे मिलाते हुए । Counterstain और माउंट चरणों का पालन करके 6.21 – 6.22 (चित्रा 3d).

Representative Results

मानव प्राथमिक प्रोस्टेट organoids, आकृति विज्ञान और भेदभाव के सफल संस्कृति पर उज्ज्वल क्षेत्र छवि विश्लेषण और FFPE और पूरे-धुंधला तकनीक माउंट का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है ।

उज्ज्वल क्षेत्र छवि कैद की प्रक्रिया चित्र 1aमें सचित्र है । Organoids एक 3 डी मैट्रिक्स में बड़े हो रहे है और विभिंन फोकल विमानों के पार फैलाया । कई विमानों में ध्यान में organoids का निरीक्षण करने के लिए, यह एक ईडीएफ छवि का उपयोग करने का सुझाव दिया है (1b आंकड़ा, सही) के बजाय एक z-विमान (आंकड़ा 1b, बाएं) । प्रयोगशाला में, विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के तहत उगाई organoids आकृति विज्ञान में परिवर्तन में परिणाम हो सकता है । क्षेत्र का उपयोग करना, परिपत्र (कैसे इसी तरह organoid एक सर्कल के लिए है द्वारा परिभाषित) और अधिकतम/न्यूनतम त्रिज्या (लंबाई के उपाय) उपयोगकर्ताओं organoid आकार और आकार का एक संकेत दे और आकृति विज्ञान के एक quantifiable readout प्रदान करते हैं । इन उपायों की उपयोगिता पर बल देने के लिए, समान क्षेत्र के साथ organoids की प्रतिनिधि छवियाँ, लेकिन भिन्न आकृति विज्ञान चित्रा 1Cमें दिखाए जाते हैं, जिसमें एक लंबी organoid कम परिपत्र होगा और एक गोलाकार से एक बड़ा अधिकतम/न्यूनतम अनुपात होगा organoid ।

प्रोटोकॉल के लिए organoids embedding नमूनों के इंटीरियर का निरीक्षण करने और यह सुनिश्चित करने के लिए एक उपयोगी समापन बिंदु है कि परिगलन एक organoid के मूल के भीतर मौजूद नहीं है । इस प्रक्रिया के लिए एक कार्यप्रवाह और एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत दाग, खोदी नमूनों के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2a, बी, सीमें प्रदान की जाती हैं । चित्रा 3 ए हैंडल organoid (बाएं) ठीक से चित्रा 3 ए में organoids हाथ की तुलना में पता चलता है (दाएं) और अंक बी। विभेदन-नमूना की स्थिति निर्धारित करने के लिए, यह बेसल सेल मार्कर (cytokeratin 5 और p63)8 चमकदार सेल मार्करों (cytokeratin 8) के साथ 8 पर देखने के लिएसिफारिश की है । यदि यह सीटू मेंorganoids दाग के लिए वांछित है, पूरे माउंट धुंधला एक सुविधाजनक विकल्प है, और इन प्रतिनिधि परिणाम चित्र 3सी, डी में प्रदान की जाती हैं ।

Figure 1
चित्रा 1:3 डी संस्कृति में organoids के आकृति विज्ञान मूल्यांकन । (एक) छवि संग्रह और मानव प्राथमिक प्रोस्टेट organoids के लिए संपीड़न कार्यप्रवाह एक मोटर चालित X/Y स्कैनिंग चरण और साथी सॉफ्टवेयर के साथ एक प्रेषित प्रकाश औंधा माइक्रोस्कोप द्वारा अधिग्रहीत किया । (ख) एक एकल z-ढेर के प्रतिनिधि छवियां (बाएं) बनाम। एक ईडीएफ छवि मानव प्राथमिक प्रोस्टेट organoids के एक पूरे अच्छी तरह से नमूना की (सही), दिखा रहा है कि अधिक organoids ध्यान में है जब एकाधिक z-ढेर एक ही अनुमानित छवि (स्केल बार = १००० µm) में संयुक्त कर रहे हैं । (ग) क्षेत्र, परिपत्र के लिए प्रतिनिधि छवियां, और अधिकतम/आकृति विज्ञान के समान मानव प्राथमिक प्रोस्टेट organoids जो एक ही क्षेत्र है (स्केल बार = २०० µm) के ंयूनतम अनुपात । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Organoid एंबेडिंग कार्यप्रवाह और प्रतिनिधि अनुभाग परिणाम । (क) मानव प्राथमिक प्रोस्टेट organoid एंबेडिंग कार्यप्रवाह । (ख) एक unstain हुआ, ताजा एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत मानव प्राथमिक प्रोस्टेट organoids युक्त स्लाइड की प्रतिनिधि छवि (हरा तीर), प्रोटोकॉल जेल (काला तीर), बुलबुला (नीला तीर), organoids (लाल तीर) (स्केल बार = १००० µ एम). (ग) दाग हौसले से कट स्लाइड (बाएं) बनाम धुंधला सूखी स्लाइड (दाएं), organoids (लाल तीर) पारदर्शी दिखाई जब सूखी (स्केल बार = ५०० µm) और एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत विचार करना कठिन है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: खोदी गई और पूरी मुहिम organoids पर दाग ऊतकवैज्ञानिक । (a) H & एक टूटी हुई मानव प्राथमिक प्रोस्टेट organoid के धुंधला से निपटने (आक्रामक pipetting, गलत प्रोसेसिंग प्रोटोकॉल, बाएं) एक अच्छी तरह से संभाला organoid (सही) (स्केल बार = १०० µm) के बगल में । (ख) मानव प्राथमिक प्रोस्टेट organoid कि गया है formalin-फिक्स्ड, आयल एंबेडेड, खोदी, और बेसल cytokeratin के साथ दाग 5 या चमकदार cytokeratin 8 (ऊपर) या बेसल p63 और चमकदार cytokeratin 8 (नीचे) और फोकल माइक्रोस्कोप के साथ imaged ( स्केल बार = १०० µm) । (ग) एक पूरे घुड़सवार मानव प्राथमिक प्रोस्टेट organoid बेसल cytokeratin 5 या चमकदार cytokeratin 8 और phalloidin और DAPI के साथ counterstained, फोकल माइक्रोस्कोप (स्केल बार = १०० µm) के साथ छवि के साथ दाग । (घ) एक पूरे घुड़सवार मानव प्राथमिक प्रोस्टेट सेल organoid फ्लोरोसेंट लेबल EdU और काउंटर Hoescht के साथ सना हुआ, फोकल माइक्रोस्कोप (स्केल बार = ५०० µm) के साथ imaged के साथ सना हुआ इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

Organotypic संस्कृति एक रोमांचक नई विधि recapitulating ऊतक के लिए एक इन विट्रो वातावरण की सुविधा के साथ है । वर्तमान में, प्रयोगशालाओं विभिंन समापन के लिए ऊतकों के कई प्रकार से organoids बढ़ने । इस पत्र में वर्णित तरीके उपयोगी अंतिमबिंदु संक्षेप और नई तकनीकों को उजागर करने के लिए पूरी तरह से 3 डी प्राथमिक प्रोस्टेट सेल संस्कृतियों की विशेषता ।

वहां मानव प्राथमिक प्रोस्टेट सेल organoids5,6,13की खेती के लिए मीडिया व्यंजनों की एक किस्म है । जबकि सभी व्यवहार्य और तुलनीय परिणाम प्राप्त, KSFM आधारित13 मीडिया कम additives का उपयोग करता है तो यह यहां वर्णित है । इसके अतिरिक्त, कागज मैट्रिक्स जेल के लिए कई सांद्रता का उपयोग कर प्रकाशित किया गया है, 10% से ७५% से संस्कृति प्रोस्टेट organoids5,6,13के लिए । क्योंकि मैट्रिक्स जेल एक महंगा रिएजेंट है, और ३३% मैट्रिक्स जेल के लिए लंबे समय (2-3 सप्ताह), व्यवहार्य, unclumpd13की खेती के लिए पर्याप्त होना दिखाया गया है, यह अनुशंसित एकाग्रता है । हालांकि, मैट्रिक्स जेल बहुत संख्या के बीच प्रोटीन एकाग्रता में भिंन हो सकते हैं, तो यह ध्यान में रखा जाना चाहिए जब चढ़ाना । यह भी कई प्रयोगों भर में उपयोग के लिए थोक में मैट्रिक्स जेल खरीद करने के लिए बहुत सारी के बीच विसंगति को कम करने की सिफारिश की है । अंय प्रयोगशालाओं ऐसी बूंदों के बजाय कोटिंग एक ९६-अच्छी तरह से थाली के रूप में चढ़ाना मैट्रिक्स जेल, के लिए विभिंन स्वरूपों प्रकाशित किया है5। दोनों तरीकों व्यवहार्य organoids फार्म, लेकिन यहां वर्णित स्वरूप कोशिकाओं के लिए और अधिक विरल, जो बड़ा organoids13में कोशिकाओं के विस्तार को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है चढ़ाया जा करने के लिए अनुमति देता है । हालांकि, चढ़ाना घनत्व रोगी विशेष गठन दक्षता बंद आधारित अनुकूलित किया जाना चाहिए । मैट्रिक्स जेल विकास कारक कम, phenol लाल मुक्त, उच्च एकाग्रता, आदिसहित कई प्रारूपों में उपलब्ध है । विकास कारक कम परिभाषित संस्कृति शर्तों के लिए सिफारिश की है, और phenol लाल-मुक्त की सिफारिश की है जब कोशिकाओं है कि एक्सप्रेस GFP या प्रयोग में है कि z-स्टैक छवि कैप्चर शामिल के साथ काम कर रहे । यह महत्वपूर्ण है कि किसी भी मैट्रिक्स जेल चढ़ाना कदम बर्फ ठंडा एजेंट के साथ प्रदर्शन किया, के रूप में मैट्रिक्स जेल कमरे के तापमान पर जल्दी जम जाता है ।

Organoids अलग प्रयोगात्मक उपचार के तहत हो आकार परिवर्तन में परिणाम हो सकता है, तो उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग व्यापक रूप से मनाया रूपात्मक phenotypes अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । फिर भी, रिकॉर्डिंग और मात्रा क्षेत्र या आकार दो कारणों के लिए एक चुनौती है: 1) छवि पर कब्जा और 2 के दौरान चयन पूर्वाग्रह) एक तीन आयामी नमूना के लिए क्षेत्र के रूप में एक दो आयामी पैरामीटर लागू । छवि पर कब्जा करने की एक रणनीति एक यादृच्छिक क्षेत्र रिकॉर्ड और उस क्षेत्र में organoids की एक पूर्व निर्धारित संख्या को मापने के लिए है, लेकिन यह चयन के दौरान पूर्वाग्रह बना सकते हैं, और चयनित क्षेत्र में सभी organoids ध्यान में नहीं हो सकता है । पूरे अच्छी तरह से इमेजिंग ९६ के लिए अनुकूलित-अच्छी तरह से microplate प्रारूप ब्याज की पूरी organoid जनसंख्या इकट्ठा करके इस नमूने पूर्वाग्रह समाप्त । हालांकि, हाथ पर माइक्रोस्कोप उद्देश्यों पर निर्भर करता है, कई क्षेत्रों के लिए एकत्र किया जा करने के लिए और एक पूरी अच्छी तरह से छवि प्राप्त करने के क्रम में टाइल की आवश्यकता हो सकती है । कुछ प्रयोगशालाओं एक z-विमान12से मापने क्षेत्र का वर्णन किया है, लेकिन ध्यान में सभी organoids पर कब्जा करने के लिए, यह एक एकल ईडीएफ-13छवि में इकट्ठा करने और ढेर कई विमानों की सिफारिश की है. कुछ मामलों में, एक meniscus मैट्रिक्स जेल में छवि में विगनेटिंग कारण हो सकता है, और पृष्ठभूमि सुधार विधियों छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर लागू करने के लिए की आवश्यकता हो सकती है । सटीक मात्रा आदर्श organoid आकार के लिए सबसे उपयुक्त माप है; हालांकि, यह ठीक से प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, यहां तक कि कई z-ढेर छवियों के साथ. अन्य उपयोगी रूपात्मक आयामों, जैसे कि परिपत्र और अधिकतम/न्यूनतम अनुपात, एक पूरी तरह से ईडीएफ छवि में सभी organoids से आसानी से गणना की जा सकती है. एक साथ, इन तरीकों का नमूना पूर्वाग्रह चुनौतियों पर काबू पाने और एक 3 डी अंतरिक्ष में 3 डी वस्तुओं से 2d मापदंडों का माप सक्षम करें ।

Formalin निर्धारण और organoids की आयल embedding hematoxylin और eosin (एच & ई), immunohistochemical (आइएचसी), और immunofluorescent (यदि) दृश्य और विश्लेषण के लिए धुंधला6,11प्राप्त करने के लिए एक आम विधि है, 20. हालांकि, प्रकाशन है कि इस तकनीक का वर्णन है एंबेडिंग प्रक्रिया पर व्यापक विवरण की कमी है । इसके अतिरिक्त, आयल ब्लॉक के भीतर organoids का पता लगाने चुनौतीपूर्ण हो सकता है । कुछ प्रयोगशालाओं पूर्व trypan नीले रंग के साथ organoids दाग को11के दौरान स्थान में सहायता embedding से पहले । विधि यहां वर्णित organoid/प्रोटोकॉल gelplug के उंमुखीकरण के लिए एक ऊतकवैज्ञानिक डाई के उपयोग को शामिल करने के लिए अनुभागीकरण की क्षमता को बढ़ावा देने के embedding के दौरान । H & E स्लाइड्स परिगलन, नाभिकीय बनावट, और प्रसार की परीक्षा की सुविधा प्रदान करते हैं, और इस प्रकार यह organoid संस्कृति के लिए एक अनिवार्य समापन बिंदु होना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कक्ष पूरे क्षेत्र में स्वस्थ हैं । organoid संस्कृति की एक ताकत है कि नमूनों कोशिकाओं का एक विषम मिश्रण है कि बेहतर vivo रोगी ऊतक में समान शामिल हैं । प्रोस्टेट में, उदाहरण के लिए, दोनों बेसल और चमकदार कोशिकाओं प्रोस्टेट organoids5में मौजूद हैं, जबकि कोशिकाओं 2d कमी चमकदार भेदभाव8में हो । organoid विभेद का आकलन करने के लिए, यह अनुशंसित है कि शोधकर्ताओं ने बेसल मार्कर जैसे CK5 और p63 और चमकदार मार्करों जैसे एण्ड्रोजन रिसेप्टर्स और CK88का आकलन करें । ब्याज की किसी भी अंय प्रयोगात्मक प्रोटीन भी इन धुंधला तकनीक का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है ।

हालांकि FFPE वर्गों histologic तरीकों (एच & ई, अगर, आइएचसी) के माध्यम से भीतरी डिब्बे में रहने वाले कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति, छवियों को पार वर्गों के लिए सीमित हैं, और organoid आकार embedding प्रक्रिया द्वारा बदला जा सकता है । पूरे-माउंट धुंधला एक organoid को दाग और सीटू मेंमनाया जाता है, रूपात्मक phenotypes संरक्षण और प्रोटीन स्थानीयकरण की अनुमति छवियों को सक्षम बनाता है । पूरे-बढ़ते एक ऐसे zebrafish या माउस भ्रूण के रूप में पूरे ऊतक या पूरे जानवर नमूनों, दाग का उपयोग उपकरण है, और आसानी से organoids के लिए अनुकूलित है । तकनीक यहां वर्णित प्रक्रिया से Mahéएट अल द्वारा संशोधित किया गया था । 11, जो प्रारंभिक विकास और जठरांत्र organoids की संस्कृति सीधे धुंधला के लिए एक चैंबर स्लाइड पर विवरण, और पूरे जनक संस्कृति के निर्धारण की आवश्यकता है । यहां उल्लिखित विधि धुंधला के समय एक चैंबर स्लाइड पर एक एकल organoid (या organoids) ब्याज की स्थानांतरण शामिल है । यह मूल संस्कृति के निर्धारण के बिना एक निरंतर प्रयोग में पूरे माउंट विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत organoids के चयन को सक्षम बनाता है । जब पूरे प्रदर्शन-धुंधला माउंट, यह permeabilization और प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए (कहीं भी एक या अधिक दिनों से सिफारिश की है) नमूना भर में प्रवेश सुनिश्चित करने के लिए गर्मी का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक है । एक बार फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से imaged, 3 डी प्रतिपादक एक विशिष्ट प्रोटीन के दृश्य और स्थानीयकरण सक्षम और सकारात्मक रूप से दाग एक नमूने में मौजूद कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए उत्पादन किया जा सकता है । फ्लो cytometry, बेसल, चमकदार, या स्टेम सेल5,14की आबादी यों तो एक उपयोगी समापन बिंदु है । ऐसा करने के लिए, कोशिकाओं मैट्रिक्स जेल से बरामद कर रहे है और धीरे धुंधला के लिए असंबद्ध । उपयोगकर्ताओं को सावधानी से वर्तमान साहित्य के आधार पर जुदाई के लिए उपयुक्त मार्कर का चयन करना चाहिए । मानव प्राथमिक प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं के लिए, CD26 और CD49f उपयुक्त चमकदार और बेसल मार्कर, क्रमशः5,21हैं ।

संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल मानव प्राथमिक प्रोस्टेट organoid वृद्धि, संग्रह, और प्रायोगिक अंतिमबिंदु विवरण । नोट की, बढ़ते तकनीक अंय परख कि आम तौर पर ऐसे फ्लोरोसेंट जांच के रूप में 2d कोशिकाओं, के लिए कार्यरत है की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता वर्णित-प्रसार19, apoptosis, और उपसेलुलर organelle दाग देख प्रयोगों के रूप में । इसके अतिरिक्त, संग्रह और पृथक्करण विधि यहां वर्णित एकल सेल आरएनए अनुक्रमण18के लिए तैयारी में उपयोग किया जा सकता है । सामूहिक रूप से, यह उपंयास, उच्च निष्ठा अंतिमबिंदु की एक किस्म है कि शोधकर्ताओं का अनुकूलन और भविष्य में तलाश कर सकते है के लिए संभावना को दर्शाता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम यूआईसी Biorespository सदस्यों, Dr. Klara Valyi-नागी, और एलेक्स सुसमा, साथ ही urologists, डीआरएस, माइकल Abern, डैनियल Moreira, और सिमोन Crivallero, प्राथमिक सेल संस्कृतियों के लिए ऊतक अधिग्रहण की सुविधा के लिए धंयवाद । हम अनुसंधान के लिए अपने ऊतक दान के लिए यूआईसी मूत्रविज्ञान रोगियों को धन्यवाद । यह काम, भाग में वित्त पोषित किया गया था, प्रतिरक्षा विभाग द्वारा प्रोस्टेट कैंसर अनुसंधान कार्यक्रम स्वास्थ्य असमानता विचार पुरस्कार PC121923 (Nonn) और नैदानिक और अनुवाद विज्ञान पूर्व के लिए यूआईसी केंद्र-नैदानिक और शोधों के वैज्ञानिकों के लिए डॉक्टरेट की शिक्षा ( PECTS) कार्यक्रम (McCray और रिचर्ड्स) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, अनुदान संख्या U54CA202995, U54CA202997, और U54CA203000, शिकागो स्वास्थ्य इक्विटी सहयोगी के रूप में जाना जाता है (Nonn और रिचर्ड्स) द्वारा । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों या रक्षा विभाग के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells of interest
Keratinocyte-SFM (KSFM) ThermoFisher Scientific 17005042
Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS) ThermoFisher Scientific 12676029
5α-Dihydrotestosterone (DHT) Sigma-Aldrich D-073-1ML
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate ThermoFisher Scientific 161093
Matrigel (matrix gel) Corning Various Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application
Ice Bucket
Cell Culture Hood
1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical ThermoFisher Scientific 05-408-130, 339650
Centrifuge
Dispase (neutral protease) STEMCELL Technologies 7923 neutral protease
Hanks' balanced salt solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14025076
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) ThermoFisher Scientific 12605036 Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)
TRIzol ThermoFisher Scientific 15596018 suggested RNA extraction solution
RIPA Lysis and Extraction Buffer ThermoFisher Scientific 89900 suggested protein extraction solution
DNAzol ThermoFisher Scientific 10503027 suggested DNA extraction solution
Organoids
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate ThermoFisher Scientific 161093
Brightfield microscope with camera capabilities ex. ‎EVOS FL Auto Imaging System
Photo analysis software ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler
Graphing software ex. Graphpad, Excel, etc
Organoids
Ice pack
Masking tape
Pipette tips (1000 μL)
Razor blade
Dispase STEMCELL Technologies 7923
Agarose Sigma-Aldrich A9045
HistoGel (histology-gel) ThermoFisher Scientific HG-4000-012
Pencil
"Plunger" from 1 cc insulin syringe
Tissue Casette Thomas Scientific 1202D72
Container to hold fixative
10% neutral buffered formalin (NBF) Sigma-Aldrich HT501128
Histology pen, xylene and EtOH-resistant Sigma-Aldrich Z648191-12EA STATMARK pen
Ethanol (histologic grade) Fisher Scientific A405P-4 For fixation and graded dilutions during processing
Xylenes Sigma-Aldrich 214736-1L
Deionized water
Paraffin Leica various
Tissue processor
Embedding workstation
Economy Tissue Float Bath Daigger EF4575E XH-1001
Microtome
Microtome blades Ted Pella 27243
Positively charged microscope slides Thomas Scientific 1158B91
Laboratory Oven ThermoFisher Scientific PR305225G
Hematoxylin and Eosin Stain Kit Vector Laboratories H-3502 Suggested H&E staining kit
ABC Peroxidase Standard Staining Kit ThermoFisher Scientific 32020 Suggested immunohistochemistry staining kit
Androgen Receptor Primary Antibody (AR) Cell Signaling Technology 5153S Suggested primary antibody for IHC
FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide
Ethanol (histologic grade) Fisher Scientific A405P-4 dilutions should be performed using deinoized water
Xylenes Sigma-Aldrich 214736-1L
Deionized water (DI H2O)
Antigen retrieval solution Sigma-Aldrich, Abcam C9999, ab93684
1x Phosphate Buffered Saline - PBS ThermoFisher Scientific 10010023
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-1L
Normal Horse Serum thermoFisher Scientific 31874
Bovin Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
Counterstain (DAPI, Hoescht) Sigma-Aldrich D9542
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 suggested for storage but not required
Confocal microscope
Coplin Fisher Scientific 19-4
Staining rack IHC World M905-12DGY
Staining dish IHC World M900-12B
Decloaking chamber Biocare Medical DC2012
Humidity chamber Thomas Scientific 1219D68
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) ARP American Research Products 03-GP11 suggested primary antibody for IF
p63-alpha antibody (p63) Cell Signaling Technology 4892S suggested primary antibody for IF
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) Biolegend 905501 suggested primary antibody for IF
Goat anti-rabbit secondary ThermoFisher Scientific A21245 suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)
Goat anti-guinea pig secondary ThermoFisher Scientific A-11075 suggested secondary antibody for CK8 detection
Microscope cover glass Globe Scientific 1414-10
Anti-fade mounting media ThermoFisher Scientific S36972
Organoids
Pipette tips (1000 μL)
Pipette tips (200 μL)
8-well chamber slide ThermoFisher Scientific 154534PK It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user
Cell-Tak Corning CB40240 optional adherent reagent
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific 10010023
4% paraformaldehye (PFA) Biotium 22023 other fixatives such as methanol or formalin can be used
50mM NH4Cl sigma-Aldrich 254134
Triton™ X-100 (non-ionic detergent) sigma-Aldrich X100-1L
Normal Horse Serum (NHS) thermoFisher Scientific 31874
Bovin Serum Albumin (BSA) sigma-Aldrich A2058
Counterstain (DAPI, Hoescht) Sigma-Aldrich D9542
Counterstain (phalloidin) thermoFisher Scientific A22287
Sodium azide sigma-Aldrich S2002 suggested for storage but not required
Confocal microscope
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) ARP American Research Products 03-GP11 suggested primary antibody for IF
p63-alpha antibody (p63) Cell Signaling Technology 4892S suggested primary antibody for IF
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) Biolegend 905501 suggested primary antibody for IF
Goat anti-rabbit secondary ThermoFisher Scientific A21245 suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time)
Goat anti-guinea pig secondary ThermoFisher Scientific A-11075 suggested secondary antibody for CK8 detection
Visikol HISTO-M Visikol various optional clearing agent
Organoids
Pipette tips (1000 μL)
Pipette tips (200 μL)
8-well chamber slide ThermoFisher Scientific 154534PK It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user
Cell-Tak Corning CB40240
1x Phosphate Buffered Saline - PBS ThermoFisher Scientific 10010023
Cell assay of interest Various Various Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc)
Organoids
Ice bucket
Cell culture hood
1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical
Microcentrifuge
Dispase STEMCELL Technologies 7923
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) ThermoFisher Scientific 12605036 Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells)
Hanks' balanced salt solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14175079
Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap Fisher Scientific 08-771-23
Cytokeratin 5 Antibody - FITC Millipore Sigma FCMAB291F Suggested flow antibody
Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405 Abcam ab210139 Suggested flow antibody
CD49f - Alexafluor 647 BioLegend 313609 Suggested flow antibody
CD26 - PE BioLegend 320576 Suggested flow antibody
Flow cytometer

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References

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हैंडलिंग और मानव प्राथमिक प्रोस्टेट Organoid संस्कृति का आकलन
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McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. J. Vis. Exp. (143), e59051, doi:10.3791/59051 (2019).

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