Her presenterer vi en protokoll for veiledning om menneskets primære prostata organoid håndtering så foreslår endepunktene for å vurdere fenotypen. Såing, kultur vedlikehold, utvinning fra matrix gel, er morfologiske kvantifisering innebygging og skjæring, FFPE skjæring, hele-mount flekker og anvendelse av kommersielle analyser beskrevet.
Dette dokumentet beskriver en detaljert protokoll for tredimensjonale (3D) dyrking, håndtering og evaluering av menneskelig primære prostata organoids. Prosessen omfatter såing av epitelceller tynt i en 3D matrix gel på en 96-brønnen microplate med media endringer å dyrke ekspansjon i organoids. Morfologi vurderes deretter av hele-og fangst av z-stakk bilder. Komprimering av z-stabler oppretter ett i fokus bilde som organoids måles for å kvantifisere ulike utganger, inkludert sirkularitet, rundhet og området. DNA, RNA og protein kan hentes fra organoids fra matrisen gel. Celle populasjoner av interesse kan bli vurdert av organoid dissosiasjon og flow cytometri. Formalin-fiksering–parafininnstøper (FFPE) etterfulgt av skjæring brukes til histologiske vurdering og antistoff flekker. Hele-mount immunofluorescent flekker bevarer organoid morfologi og forenkler observasjon av protein lokalisering i organoids i situ. Kommersielle analyser som tradisjonelt brukes for 2D monolayer celler kan endres for 3D organoids. Teknikkene i denne protokollen brukes sammen, og gir en robust verktøykasse for å kvantifisere prostata organoid vekst, morfologiske egenskaper og uttrykk for differensiering.
Organoids er et verdifullt verktøy for å studere organogenesen og sykdom. De gir et billigere alternativ til dyremodeller og pasient-avledede organoids er utvikling som en strategi for personlige medisin1,2,3. Tredimensjonale (3D) kultur systemet innebærer seeding stammen eller progenitor celler (høstet fra vev eller indusert pluripotent stamceller) i en gel ekstracellulær matrix komponenter (matrise gel)4. Cellene spredning og differensiere, som resulterer i organotypic strukturer som recapitulate mobilnettet hierarkiet og morfologi av orgelet av interest funksjonell enhet. Organoids har vokst med celler fra forskjellige organer, inkludert salivary kjortelen, mage, tarm, lever, prostata, lunge og hjernen4. Men det er flere protokoller som beskriver fremgangsmåten for å opprette prostata organoids5,6, er det utfordrende å finne tilstrekkelig detaljert metoder på hvordan å oppnå kvantitative endepunkter fra organoids. Denne artikkelen oppsummerer metoder utviklet for menneskelig primære prostata celler og detaljer en rekke foreslåtte endepunktene å vurdere organoid fenotyper. Disse teknikkene var optimalisert for prostata organoids og kan anvendes på andre 3D cellekulturer.
Prostata organoid kulturer har nylig dukket opp som en verdifull i vitro modell som mangler begrensningene for monolayer kulturer bruker etablert udødeliggjort linjer. Godartet prostata epitel og prostatakreft er utfordrende modell i vitro bruker udødeliggjort linjer. Godartet cellelinjer er begrenset, og alle har gjennomgått en transformasjon med oncogenes7. Primære prostata epitelceller i monolayers ikke skille ut luminal celler og mangler androgen reseptorer8. Flertallet av prostatakreft cellelinjer har ikke funksjonelle androgen reseptorer, en betydelig megler til tidlig sykdom og manglende viktige genetiske endringer som har blitt funnet i pasienten svulster9. Prostata organoid kulturer kan dyrkes lett fra godartet epitel og er verdifulle i å studere stamcelleforskningen egenskaper, stamfar celler, differensiering og effekter av eksperimentell endringer i microenvironment4,5. Prostatakreft organoids kan dyrkes som del av en presisjon medisin tilnærming til modellering pasientens sykdom og respons på behandling10.
Denne protokollen er utarbeidet fra eksisterende protokoller som bruker ulike celletyper, men det er optimalisert her for bruk i menneskelig primære prostata celler. Den komplementerer protokoller skissert av Sawyers, Clevers og Shen5,6 som beskriver vekst, passaging, lyse-feltet bildebehandling, kryonisk bevaring og RNA og DNA isolering av prostata musen og menneskelige organoids. Hele-mount protokollen endres fra Mahé et al. 11, som brukte gastrointestinal epithelial organoids og beskriver live bildebehandling og frosne og parafinen innebygging. Borten et al. 12 beskrevet analyse av bryst, tykktarm og endetarmskreft organoid morfologi lyse-feltet bildebehandling. I tillegg Richards et al. 13 brukte en metode for morfologiske vurdering av prostata organoids. Til slutt, Hu et al. 14 beskrevet en metode for å overholde prostata organoids et kammer lysbilde over natten før den immunofluorescent flekker å observere enkeltceller og spredning av kuler for flyt cytometri analyse.
Målet med denne protokollen er å demonstrere i tilstrekkelig detalj metodene teknisk utfordrende som en protokoll, inkludert celle frø; Media og matrix gel vedlikehold; samlingen av celler for flowcytometri; RNA og DNA protein utvinning; morfologiske vurdering fra lyse-feltet z stabel analyse; embedding, behandling og snitting til histologiske farging; og hele-montering for immunofluorescence eller fluorescerende sonde analyser. Biologiske relevansen og tolkning av disse ulike endepunktene varierer blant eksperimentell design og antistoffer brukes til analyseformål. Gjennom utnyttelse av denne protokollen, bør brukere føler forberedt på å sette opp et eksperiment med et verktøysett for endepunkt.
Menneskets primære prostata (PrE) epitelceller ble etablert i laboratoriet av protokollen beskrevet av Peehl15,16 og vedlikeholdes til et begrenset antall ganger (opptil fire) som beskrevet tidligere17, men de er også tilgjengelig fra kommersielle leverandører. Hepatocyte serum-free mediebasert6, KSFM-baserte13og R-spondin 1-conditioned5 medier publiseres alle som har produsert organoids. KSFM-baserte krever færrest tilsetningsstoffer, slik det er beskrevet her.
Organotypic kultur er en spennende ny metode for recapitulating vev av et i vitro miljø. Foreløpig vokse labs organoids fra mange typer vev for ulike endepunkter. Metodene som er beskrevet i denne artikkelen oppsummerer nyttig endepunktene og markere nye teknikker for å fullt karakterisere 3D primære prostata cellekulturer.
Det finnes en rekke medier oppskrifter dyrke human primære prostata celle organoids5,6,13. Mens alle oppnå levedyktig og sammenlignbare resultater, bruker KSFM-baserte medier13 minimal tilsetningsstoffer slik det er beskrevet her. I tillegg har artikler blitt publisert i flere konsentrasjoner matrix gel, fra 10% til 75% til kultur prostata organoids5,6,13. Fordi matrisen gel er en dyr reagens, og 33% matrix gel har vist seg å være tilstrekkelig til å dyrke langsiktige (2-3 uker), levedyktig, unclumped organoids13, dette er den anbefalte konsentrasjonen. Men kan matrix gel varierer i protein konsentrasjon mellom partinumre, så dette bør tas i betraktning når plating. Det anbefales også å kjøpe matrix gel i bulk for bruk over flere eksperimenter for å redusere inkonsekvens mellom. Andre labs har publisert forskjellige formater for plating matrix gel, som dråper i stedet for belegg en 96-brønns plate med5. Begge metodene danne levedyktige organoids, men formatet beskrevet her gir cellene til å være belagt mer tynt, som har vist seg å fremme ekspansjon av celler i større organoids13. Imidlertid bør plating tetthet optimeres basert på pasient-spesifikke formasjon effektivitet. Matrix gel er tilgjengelig i mange formater, inkludert vekst faktor-redusert, fenol red-fri, høy konsentrasjon, osv. Vekstfaktor-redusert anbefales for definert oppdrettsforholdene, og fenol red-fri anbefales når du arbeider med celler som uttrykker GFP eller eksperimenter som involverer z stabel bildeoppløsning. Det er viktig at alle matrise gel plating trinnene utføres med iskald reagenser, som matrise gel stivner raskt ved romtemperatur.
Organoids dyrket under annerledes eksperimentell behandlinger kan resultere i endringer for figuren så lyse-feltet imaging er mye brukt til å studere observert morfologiske fenotyper. Likevel, opptak og kvantifisere området eller figur er en utfordring for to grunner: 1) utvalget bias bildeoppløsning og 2) bruker en todimensjonal parameter som området et tredimensjonalt utvalg. En strategi for bildebehandling er å registrere et tilfeldig felt og måle et forhåndsbestemt antall organoids i dette feltet, men dette kan skape bias under valget, og alle organoids i det valgte feltet kan ikke være i fokus. Hel-og bildebehandling optimalisert for 96-brønnen microplate formatet eliminerer denne prøvetaking skjevhet ved å samle hele organoid befolkningen av interesse. Imidlertid avhengig av mikroskopet målene på hånden må flere felt samles inn og side ved side for å få en hel-og bilde. Noen labs har beskrevet måle området fra en enkelt z-plane12, men for å fange alle organoids i fokus, er det anbefalt å samle og stable flere fly i en enkelt EDF-image13. I noen tilfeller en menisk i matrix gel forårsake vignettering i bildet, og bakgrunnen korreksjonsmetoder må brukes ved hjelp av analyseprogramvare. Nøyaktig volum ligger passende målene for organoid størrelse; Dette er imidlertid vanskelig å nettopp ha, selv med flere z-stakk bilder. Andre nyttige morfologiske dimensjoner, for eksempel sirkularitet og maksimum/minimum forhold, kan lett bli beregnet fra alle organoids i en hel-og EDF bilde. Sammen disse metodene overvinne prøvetaking bias utfordringer og aktiverer måling av 2D parameterne fra 3D-objekter i et 3D-rom.
Formalin fiksering og parafin innebygging av organoids er en vanlig måte å få hematoxylin og eosin (H & E), immunohistochemical (IHC) og immunofluorescent (hvis) flekker for visualisering og analyseverktøy6,11, 20. men publikasjoner som har beskrevet denne teknikken mangler omfattende informasjon om innebygging prosessen. I tillegg kan finne organoids i parafin blokken være utfordrende. Noen labs pre flekken organoids med trypan blå før innebygging for å hjelpe sted under snitting11. Metoden beskrevet her omfatter bruk av en histologiske fargestoff for retningen av organoid/histology gelplug under innebygging for å fremme effektiv snitting. H & E lysbilder rette undersøkelse av nekrose, kjernefysiske tekstur og spredning, og dermed bør det være et obligatorisk endepunkt for organoid kultur slik at cellene er sunt i hele området. En styrke for organoid kultur er at prøver består av en heterogen blanding av celler som ligner bedre i vivo pasienten vev. I prostata, for eksempel finnes både basal og luminal celler i prostata organoids5, mens celler dyrket i 2D mangel luminal differensiering8. For å vurdere organoid differensiering, anbefales det at forskere vurdere basale markører som CK5 og p63 og luminal markører som androgen reseptorer og CK88. Noen andre eksperimentelle proteiner rundt kan også studeres disse flekker teknikkene.
FFPE deler tillater visualisering av cellene er bosatt i indre rommet via histologic metoder (H & E, hvis IHC), bilder er begrenset til tverrsnitt og organoid form kan endres av innebygging prosessen. Hele-mount flekker kan en organoid farget og observert i situ, bevare morfologiske fenotyper og tillater bilder av protein lokalisering. Hele-montering er et verktøy benyttet til stain hele-vev eller hele-dyr prøver, som sebrafisk eller mus fosteret, og er lett tilpasses for organoids. Teknikken er beskrevet her ble endret fra prosedyren av Mahéet al. 11, som viser den opprinnelige veksten og kultur av gastrointestinal organoids direkte i et kammer lysbilde til farging, og krever fiksering av hele overordnede kultur. Metoden skissert her innebærer overføring av en enkelt organoid (eller organoids) av interesse på et kammer lysbilde ved flekker. Dette gjør utvalget av individuelle organoids for hele-mount analyse i et pågående eksperiment uten fiksering av overordnede kultur. Når du utfører hele-mount flekker, er det nødvendig å optimalisere permeabilization og inkubasjon tiden for primær og sekundær antistoffer å sikre penetrasjon i prøven (hvor som helst fra én eller flere dager anbefales). Når fotografert via AC confocal mikroskopi, kan 3D-gjengivelser produseres for å aktivere visualisering og lokalisering av et bestemt protein og beregne antall positivt farget celler i et utvalg. Flowcytometri er et nyttig sluttpunkt å kvantifisere bestander av basale, luminal, eller stamceller5,14. Dette er celler utvinnes fra matrix gel og forsiktig avstand til farging. Brukere bør nøye velge riktig markører for å skille basert på gjeldende litteratur. Menneskets primære prostata epitelceller er CD26 og CD49f egnet luminal og basal markører, henholdsvis5,21.
I sammendraget detaljer denne protokollen menneskelige primære prostata organoid vekst, innsamling og eksperimentelle endepunktene. Av notatet, kan montering teknikken beskrevet brukes til en rekke andre analyser som brukes vanligvis for 2D celler, for eksempel fluorescerende probe-baserte eksperimenter ser på spredning19apoptose og subcellular organelle flekker. Innsamling og dissosiasjon metoden beskrevet her kan i tillegg benyttes i forberedelse til én celle RNA sekvensering18. Kollektivt, viser dette muligheten for en rekke roman, Hi-Fi-endepunkter som forskere kan optimalisere og utforske i fremtiden.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker UIC Biorespository medlemmer, Dr. Klara Valyi-Nagy og Alex Susma, samt urologer, Dr. Michael Abern, Daniel Moreira og Simone Crivallero, for tilrettelegging av vev kjøp for primært cellekulturer. Vi takker UIC urologi pasienter for donerer vev til forskning. Dette arbeidet ble finansiert, delvis av den avdeling av forsvarer prostata kreft forskning Program helse forskjeller ideen Award PC121923 (Nonn) og UIC Center for klinisk og oversettelse naturfag for kliniske og translasjonsforskning forskere (Pre-doctoral PECTS) Program (McCray og Richards) og National Institutes of Health’s National Cancer Institute, Grant tall U54CA202995, U54CA202997 og U54CA203000, kjent som Chicago helse egenkapital samarbeidet (Nonn og Richards). Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health eller forsvarsdepartementet.
Cells of interest | |||
Keratinocyte-SFM (KSFM) | ThermoFisher Scientific | 17005042 | |
Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12676029 | |
5α-Dihydrotestosterone (DHT) | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
Matrigel (matrix gel) | Corning | Various | Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application |
Ice Bucket | |||
Cell Culture Hood | |||
1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical | ThermoFisher Scientific | 05-408-130, 339650 | |
Centrifuge | |||
Dispase (neutral protease) | STEMCELL Technologies | 7923 | neutral protease |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | suggested RNA extraction solution |
RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | suggested protein extraction solution |
DNAzol | ThermoFisher Scientific | 10503027 | suggested DNA extraction solution |
Organoids | |||
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
Brightfield microscope with camera capabilities | ex. EVOS FL Auto Imaging System | ||
Photo analysis software | ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler | ||
Graphing software | ex. Graphpad, Excel, etc | ||
Organoids | |||
Ice pack | |||
Masking tape | |||
Pipette tips (1000 μL) | |||
Razor blade | |||
Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9045 | |
HistoGel (histology-gel) | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
Pencil | |||
"Plunger" from 1 cc insulin syringe | |||
Tissue Casette | Thomas Scientific | 1202D72 | |
Container to hold fixative | |||
10% neutral buffered formalin (NBF) | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Histology pen, xylene and EtOH-resistant | Sigma-Aldrich | Z648191-12EA | STATMARK pen |
Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | For fixation and graded dilutions during processing |
Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
Deionized water | |||
Paraffin | Leica | various | |
Tissue processor | |||
Embedding workstation | |||
Economy Tissue Float Bath | Daigger | EF4575E XH-1001 | |
Microtome | |||
Microtome blades | Ted Pella | 27243 | |
Positively charged microscope slides | Thomas Scientific | 1158B91 | |
Laboratory Oven | ThermoFisher Scientific | PR305225G | |
Hematoxylin and Eosin Stain Kit | Vector Laboratories | H-3502 | Suggested H&E staining kit |
ABC Peroxidase Standard Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 32020 | Suggested immunohistochemistry staining kit |
Androgen Receptor Primary Antibody (AR) | Cell Signaling Technology | 5153S | Suggested primary antibody for IHC |
FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide | |||
Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | dilutions should be performed using deinoized water |
Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
Deionized water (DI H2O) | |||
Antigen retrieval solution | Sigma-Aldrich, Abcam | C9999, ab93684 | |
1x Phosphate Buffered Saline – PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
Normal Horse Serum | thermoFisher Scientific | 31874 | |
Bovin Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
Confocal microscope | |||
Coplin | Fisher Scientific | 19-4 | |
Staining rack | IHC World | M905-12DGY | |
Staining dish | IHC World | M900-12B | |
Decloaking chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
Humidity chamber | Thomas Scientific | 1219D68 | |
Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
Microscope cover glass | Globe Scientific | 1414-10 | |
Anti-fade mounting media | ThermoFisher Scientific | S36972 | |
Organoids | |||
Pipette tips (1000 μL) | |||
Pipette tips (200 μL) | |||
8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
Cell-Tak | Corning | CB40240 | optional adherent reagent |
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
4% paraformaldehye (PFA) | Biotium | 22023 | other fixatives such as methanol or formalin can be used |
50mM NH4Cl | sigma-Aldrich | 254134 | |
Triton™ X-100 (non-ionic detergent) | sigma-Aldrich | X100-1L | |
Normal Horse Serum (NHS) | thermoFisher Scientific | 31874 | |
Bovin Serum Albumin (BSA) | sigma-Aldrich | A2058 | |
Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Counterstain (phalloidin) | thermoFisher Scientific | A22287 | |
Sodium azide | sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
Confocal microscope | |||
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
Visikol HISTO-M | Visikol | various | optional clearing agent |
Organoids | |||
Pipette tips (1000 μL) | |||
Pipette tips (200 μL) | |||
8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
Cell-Tak | Corning | CB40240 | |
1x Phosphate Buffered Saline – PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Cell assay of interest | Various | Various | Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc) |
Organoids | |||
Ice bucket | |||
Cell culture hood | |||
1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical | |||
Microcentrifuge | |||
Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175079 | |
Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
Cytokeratin 5 Antibody – FITC | Millipore Sigma | FCMAB291F | Suggested flow antibody |
Cytokeratin 8 Antibody – Alexafluor 405 | Abcam | ab210139 | Suggested flow antibody |
CD49f – Alexafluor 647 | BioLegend | 313609 | Suggested flow antibody |
CD26 – PE | BioLegend | 320576 | Suggested flow antibody |