Summary
Nous présentons ici un protocole pour cultiver le microbiote intestinal du côlon in vitro, à l’aide d’une série de bioréacteurs qui simulent les conditions physiologiques du tractus gastro intestinal.
Abstract
La microflore intestinale humaine joue un rôle essentiel dans la santé humaine et la maladie. Étudier le microbiote intestinal à l’aide d’un modèle in vivo , est difficile en raison de sa complexité et son association diversifiée avec des composants de mammifères. L’objectif de ce protocole est à la culture le microbiote intestinal in vitro, qui permet l’étude de la dynamique de microflore intestinale, sans avoir à tenir compte de la contribution du milieu chez les mammifères. L’utilisation in vitro culture technologique, l’état physiologique du tractus gastro intestinal est simulés, y compris les paramètres tels que le pH, la température, conditions anaérobies et temps de transit. La surface intestinale du côlon est simulée en ajoutant transporteurs enduit de mucine, créant une phase muqueuse, dimension supplémentaire. Le microbiote intestinal est introduit en inoculant avec les matières fécales humaines. Après l’inoculation avec ce mélange complexe de bactéries, microbes spécifiques sont enrichies dans les différents longitudinale (ascendant, transverses et descendants de colons) et des environnements (luminales et muqueuses) transversales du modèle in vitro. Il est essentiel permettre au système d’atteindre un état stable, dans laquelle la communauté et les métabolites produits demeurent stables. Les résultats expérimentaux dans ce manuscrit démontrent comment la communauté de microflore intestinale inoculées se développe dans une communauté stable au fil du temps. Une fois que l’état d’équilibre est atteint, le système peut servir à analyser les interactions bactériennes et fonctions communautaires ou pour tester les effets des additifs sur le microbiote intestinal, comme les aliments, composants alimentaires ou des produits pharmaceutiques.
Introduction
Le microbiote intestinal est une communauté de micro-organismes qui se trouvent dans le tractus gastro-intestinal (TGI). Cette communauté a atteint une concentration maximale dans le côlon, ce qui est prévu pour tenir 1013-1014 bactéries, 500-1 000 espèces, qui vivent en symbiose avec le colon du milieu1,2. La composition et la fonctionnalité de la microbiote intestinal changent dans l’espace le long de la GIT, formant des communautés spécifiques de région, avec la plus grande diversité trouve son extrémité distale2,3,4,5. Pour chaque région anatomique, distincts des communautés microbiennes résident dans la lumière et sur la muqueuse6. La communauté de lumen a un accès plus direct aux nutriments comme substrats traversent le compartiment Luminale7. Malgré cela, certaines bactéries résident préférentiellement dans la couche de mucus, utilisant la mucine produite par les cellules du côlon comme une énergie source1,5,8. La différence de micro-environnements entre les phases luminales et muqueuses donnent divergence et le développement des communautés spécifiques de phase. Ensemble, ces collectivités assurent des fonctions métaboliques, tels que le métabolisme des éléments nutritifs et la production de vitamines et des fonctions immunologiques, telles que la prévention de la colonisation des pathogènes humains1,3, 9. le microbiote intestinal fonctionne également sur le plan fonctionnel en conjugaison avec le côlon humain cellules3.
Une partie importante de la GIT humaine, il n’est pas surprenant que le microbiote intestinal est connu pour contribuer à ces deux hôtes santé et maladie état3,9,10,11,12. Un changement dans la population microbienne de l’intestin a été associé à plusieurs maladies humaines, y compris les troubles GIT comme maladie intestinale de l’intestin (MICI) et syndrome de l’intestin intestinale (IBS), mais aussi des autres maladies comme l’obésité, les maladies circulatoires et autisme 3 , 9 , 10 , 11 , 12. métabolites issus de la microbiote intestinal ont un effet global, pour atteindre des endroits loin l’intestin12,13. Par exemple, l’axe cerveau-intestin est associée à des troubles mentaux comme la dépression et l’anxiété14. Par conséquent, étudier le microbiote intestinal est important à plusieurs champs de recherche et s’applique à de nombreuses maladies, même ceux pas souvent associée à la GIT.
Alors qu’il est largement reconnu qu’étudier le microbiote intestinal est important, c’est une entreprise compliquée. Plusieurs modèles animaux sont disponibles, de petits animaux comme le poisson-zèbre, les rats et les souris, aux plus grands comme des singes et des porcs15-19. Toutefois, l’application de ces animaux en fonction de la microflore intestinale humaine n’est pas simple, étant donné que ces animaux ont un unique bactériennes communautaires qui a évolué sur l’environnement et l’alimentation, et qu’ils sont anatomiquement distincts de l’homme20 , 21. l’utilisation de sujets humains supprime la question de la pertinence, mais introduit une autre série de défis. Études sur les humains sont coûteux, chronophages et sont moralement contraints de11. En outre, des facteurs de confusion influencent le microbiote intestinal dans les études chez l’homme, y compris l’âge ou le stade de développement, l’environnement, alimentation, médicaments et facteurs génétiques2,4,22. Il y a aussi des restrictions sur ce qui peut être testé chez l’homme, et quel type d’échantillons peut être récoltée à quel fois4.
Un inconvénient essentiel d’utiliser un système in vivo pour étudier le microbiote intestinal est la présence de composants de mammifères. Le microbiote intestinal et les cellules humaines interagissent entre eux, et dans in vivo définition, il est impossible de distinguer les deux. Les métabolites produits par le microbiote intestinal sont recueillies par les cellules du côlon, si des mesures ne peuvent être calculés avec précision. Par conséquent, toute étude mécanistique doit être limitée au point final mesure11. Un autre inconvénient majeur pour les études in vivo est l’impossibilité de récolter des échantillons de différentes régions du TGI longitudinalement23. Cela ne permet pas pour l’évaluation des changements qui peuvent survenir dans les micro-environnements du côlon au fil du temps,12. Nombreuses in vivo études, y compris les études chez l’homme, s’appuient sur l’analyse des échantillons de matières fécales pour détecter les modifications apportées à la gut microbiota12. Tout cela est instructif, il ne fournit pas de données sur le microbiote intestinal dans le GIT et ne différencie pas entre les communautés Luminale et muqueux5,6,7,8.
Pour le microbiote intestinal, l’application d’une méthode in vitro est nécessaire pour étudier la dynamique des communautés bactériennes, sans ingérence des composants chez les mammifères. À l’aide d’une méthode in vitro permet le contrôle serré des conditions environnementales10, essais de plusieurs paramètres en même temps et la possibilité de déguster longitudinalement et grands volumes11. Puisqu’une méthode in vitro utilise un dispositif mécanique et pas une foule, aucune considération n’est nécessaires pour l’âge, environnement, alimentation ou l’origine génétique. Ces systèmes peuvent servir à tester soit la communauté de microflore intestinale entière, sélectionné seulement les organismes ou souches même unique. Ce qui est important, les résultats obtenus in vitro sont reproductibles, tout en conservant un niveau de diversité comparable aux études in vivo11,22.
Selon l’hypothèse en question et les résultats escomptés, j’ai des étudesin vitro n peuvent être effectuées de diverses façons. Ils peuvent utiliser des systèmes single-navires et des méthodes simples, tels qu’incuber les échantillons fécaux homogénat24 ou exécuter des cultures de lot unique au cours des 24 à 48 h25. Ils peuvent également être exécutées à l’aide des systèmes single-navires et des méthodes plus complexes, telles que l’utilisation d’un système chémostat pour produire un de communauté microbienne intestinale stable11. Cependant, l’utilisation d’un seul réacteur peut trop simplifier le microbiote12 puisqu’il ne représente qu’une partie du côlon, même si le côlon est composé des régions ascendantes, transversales et descendantes.
Afin d’étudier la communauté microflore intestinale qui se développe dans les différentes régions du côlon (les régions de l’ascendants, transversales et descendants), un système complex, plusieurs étape peut être employé. Dans ces systèmes, plusieurs navires sont mis en place pour imiter les différentes régions du côlon, donc le microbiote intestinal des régions ascendants, transversales et descendants sont cultivés séparément. Ces vaisseaux sont reliés, à l’aide de pompes pour déplacer des substrats dans l’ordre, de l’ascension vers le tube transversal aux régions du côlon descendant, imitant le flux d’éléments nutritifs par l’intermédiaire de la GIT.
L’objectif de cette étude était de démontrer comment un système de culture in vitro de 5 étages (voir Table des matières) peut servir à cultiver la communauté de microflore intestinale et de démontrer la dynamique communautaire en termes de stabilité et de la composition. Dans ce système, un seul navire représente l’estomac et un représente l’intestin grêle. Le côlon est divisé en trois régions (ascendant, transverse, descendant), avec un seul navire représentant chaque région26. Dans ce dispositif expérimental, deux systèmes complets ont été exécutés en parallèle, avec 1 unité contenant des transporteurs de mucine à représente la surface de la muqueuse et l’unité 2 ne contenant aucune transporteurs de mucine. Les communautés qui ont mis au point dans les phases luminales et muqueuses de chaque région ont été comparées les uns aux autres et à l’inoculum fécal au fil du temps en utilisant le séquençage des gènes ARNr 16 s et l’analyse de l’AGCC. Les résultats présentés montrent le type de communauté, à la fois en termes de composition et de la fonctionnalité, qui peut provenir de ce type de système in vitro.
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Protocol
1. substances et préparations
Remarque : Le milieu défini est acheté sous forme de poudre (voir la Table des matières). La composition du milieu défini en g/L est la suivante : arabinogalactane (1.2), pectine (2.0), xylane (0,5), Glucose (0,4), extrait de levure (3.0), peptone spéciale (1.0), mucine (2.0), L-cystéine-HCl (0,2).
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Préparer le milieu défini
- Remplissez une fiole de 4 L avec 2 L d’eau distillée désionisée double.
- Ajouter 29,2 g de poudre de moyen défini à l’eau et mélanger unité complète homogénéisée.
- Ajouter un agitateur magnétique et visser le couvercle.
- Autoclave à 121 ° C pendant 30 min.
- Après refroidissement, entreposer le milieu défini préparé au réfrigérateur à 4 ° C sous agitation constante (agitateur magnétique).
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Préparer le suc pancréatique
- Autoclave a ajouté 2L d’eau distillée, déminéralisée dans un récipient de 5L avec une barre d’agitateur, à 121 ° C pendant 30 min.
- Après la stérilisation, laisser l’eau refroidir à température ambiante.
- Ajouter 12,5 g de NaHCO3, 6 g bile et pancréatine 0,9 g. Placer sur un agitateur magnétique pour mélanger.
Remarque : Le suc pancréatique doit être tous les 2-3 jours et réfrigéré avec agitation après qu’il fait.
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Tampon phosphate
- Placez une fiole de 1 litre contenant une barre d’agitateur magnétique sur un agitateur magnétique. Ajouter 0,5 L d’eau distillée, déminéralisée et mettre en marche l’agitation.
- Ensuite, ajoutez 6,8 g KH2PO4et 8,8 g K2HPO4thioglycolate de sodium 0,1 g. Couronner le tout avec de l’eau pour un volume final de 1 L.
- Lorsque les composants ont entièrement dissout, ajuster le pH à 7.0 à l’aide de NaOH.
- Verser le tampon dans un récipient de 2 L avec un bouchon à vis couvercle et stériliser à 121 ° C pendant 30 min. veiller à ce que le couvercle est vissé sur souplement et pas bien fermée.
- Après avoir retiré de l’autoclave, laisser la solution refroidir jusqu'à la température de la pièce. Stocker le tampon à la température ambiante pendant 2 semaines.
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Préparer les transporteurs de gélose de mucine
- Les transporteurs de mucine plastique autoclave (voir Table des matières), pinces, maille en plastique (forme tubulaire) et attaches à 131 ° C pendant 30 min.
- Autoclave 300 mL de double distillée, radiation ionisée eau à 131 ° C pendant 30 min. magasin à la température ambiante jusqu'à utilisation.
- Dans une coffret avec l’écoulement laminaire de biosécurité, remplir des plats de pétri stérile avec les transporteurs de mucine en plastique à l’aide d’une pince stérile.
Remarque : Les transporteurs de mucine sont des cercles en plastique creux qui sont remplis de gélose de mucine. Une fois rempli, le couvercle peut être placé sur le dessus et ceux-ci peuvent être mis de côté. - Pour préparer la gélose de mucine, ajouter 3 g d’agar bactérienne et 15 g de mucines à 300 mL d’eau stérilisés à l’autoclave.
- Sous une hotte, bouillir cette solution, puis retirer du feu et laisser refroidir pendant 1 min. Répétez le point d’ébullition et de refroidissement pour un total de 3 fois.
- Une fois que le récipient en verre contenant la solution d’agar de mucine est assez froid au toucher, la déplacer dans la prévention des risques biotechnologiques armoire avec flux laminaire.
- Dans la prévention des risques biotechnologiques meuble avec l’écoulement laminaire, verser l’agar de mucine liquide sur les transporteurs de mucine en plastique qui ont été placés dans la boîte de pétri. Veiller à ce que tous les transporteurs sont complètement remplis de gélose de mucine.
- Replacez le couvercle sur la boîte de Pétri et laissez-le refroidir sous hotte à flux laminaire.
- Pour assembler les transporteurs de mucine, prendre le filet en plastique autoclavable et insérer les supports de mucine contenant de l’agar de mucine solidifié de la boîte de pétri à l’aide d’une pince stérile.
- Utilisez les attaches pour fermer les extrémités de la maille. De cette façon les fonctions nettes pour contenir les transporteurs de mucine remplis de gélose de mucine. Conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
2. mise en place, l’Inoculation et fonctionnement du système
- Mettre en place du système de culture
Remarque : le simulateur de jumeau de l’écosystème microbien Intestinal humain a été utilisé pour cette étude.- Placer 10 bioréacteurs contenant les barres de l’agitateur sur agitateurs magnétiques et tourner sur l’agitation.
Remarque : Chaque unité comprendra 5 bioréacteurs, donc 2 unités nécessitera 10 bioréacteurs. - Connecter les 5 bioréacteurs les uns aux autres, utilisez un tuyau de silicone dans l’ordre au moyen de la pompe péristaltique (Figure 1). Utiliser les pompes à transverse le contenu liquide d’un bioréacteur à l’autre.
- Étiqueter les bioréacteurs dans l’ordre suivant : estomac, intestin grêle, côlon ascendant, côlon transverse, descendant du côlon pour représenter l’ordre du tractus gastro-intestinal.
Remarque : Les bioréacteurs peuvent tous être identiques, ou les bioréacteurs de l’estomac et l’intestin grêle peuvent être plus petit comparées à bioréacteurs côlon puisqu’ils détiennent moins de volume. Mise en place de bioréacteurs de cette façon signifie que la région du côlon ascendant reçoit des nutriments dans l’intestin grêle, la côlon transverse région reçoit des nutriments de la région du côlon ascendant et la région du côlon descendant reçoit des nutriments provenant de la région de la transversale. De cette façon, le système imite le mouvement séquentiel des nutriments dans le tractus gastro-intestinal. - Place le milieu défini et du suc pancréatique dans un réfrigérateur à 4 ° C sous agitation constante à l’aide d’agitateurs magnétiques. Utilisez un tuyau silicone, branchez le milieu défini sur le bioréacteur estomac via une pompe péristaltique et le suc pancréatique dans l’intestin grêle via une pompe péristaltique.
- Ajouter agent solidifiant à un sac de drainage des urines. Connectez le côlon descendant à la poche à urine drainage au moyen de la pompe péristaltique. Jeter le solidifié comme un déchet biologique pendant l’expérience.
- Utilisez un tuyau silicone, connectez la chemise d’eau de chaque navire dans l’ordre et chaque extrémité pour le bain d’eau circulant. Remplir le bain d’eau circulant de l’eau distillée (ce montant peut varier selon le type de bain de l’eau en circulation) et réglé à 37 ° C.
- Utilisez un tuyau silicone, connectez l’acide et la base sur le couvercle de chaque navire au moyen de pompes péristaltiques. Les concentrations recommandées sont 0,5 M HCl et NaOH 0,5 de M.
- Insérer les sondes pH pour chaque navire dans le port désigné dans le couvercle. Ce port est conçu pour tenir la sonde pH et le visser sur le couvercle (Figure 1). La valeur du pH pour chaque région comme suit : estomac, pH = 2 ; Intestin grêle, pH = 6,7 à 6,9 ; Côlon ascendant, pH = 5,6 à 5,9 ; Côlon transverse, pH = 6.15-6.4 ; Côlon descendant, pH = 6,6 et 6,9.
Remarque : Au cours de la phase initiale, la communauté permet de différencier selon la différence des valeurs de pH de région. Cependant, une fois que les cycles d’alimentation commencent, les communautés mûriront plus basée sur les différences dans l’apport de nutriments. - Se connecter à une ligne d’azote à l’aide de tubes de silicone sur le couvercle de chaque vaisseau en utilisant le port désigné. La ligne de l’azote doit circuler dans l’ordre suivant : estomac, intestin grêle, côlon ascendant, côlon transverse, du côlon descendant. S’assurer que chaque unité dispose de son propre éclat pour éviter toute contamination croisée.
Remarque : Azote sert à oxygène enlevé du système et maintient l’anaérobiose durant l’expérience. - Insérer un tube échantillon de métal à travers le couvercle de chaque bioréacteur en utilisant le port désigné. Le tube en métal se prolonge vers le bas dans le bioréacteur et sert à recueillir des échantillons de liquide.
- Ajouter un petit morceau de tube de silicone à l’extrémité supérieure du tube échantillon et brancher un raccord Luer Lock pour permettre l’utilisation d’une seringue lors de l’échantillonnage.
- Placer 10 bioréacteurs contenant les barres de l’agitateur sur agitateurs magnétiques et tourner sur l’agitation.
- Inoculation du système
- Remplir les régions du côlon avec le milieu défini en utilisant les volumes suivants : 500 mL dans le côlon ascendant, 800 mL dans le côlon transverse et 600 mL dans le côlon descendant.
- Ajouter des transporteurs de mucine agar vers les régions du côlon, d’un montant proportionnel au volume du réacteur. Pour cette expérience, 60 transporteurs par réacteur ont été utilisés.
- Enlever tout excès milieu défini en utilisant une seringue et le tube à essais depuis ajout des transporteurs augmente le niveau de liquide dans le bioréacteur.
- Allumez les sondes pH pour ajuster le pH dans chaque réacteur à l’aide de l’ordinateur.
- Activer la chasse d’eau d’azote pendant 20 min.
Remarque : L’homogénat fécale utilisée pour l’inoculation est acheté comme 10 % matières fécales homogénéisés dans 10 % solution de glycérol (voir Table des matières). L’échantillon fécal est choisi au hasard parmi un groupe de bailleurs de fonds avec les critères suivants : un américain consomme un régime occidental typique (pas végétalien ou végétarien), âgés de 21 à 45 ans, antibiotique gratuite pendant au moins 1 an, avec un indice de masse corporelle moyen (18,5 à 24,9) . Pour ce protocole, seulement un seul donneur est utilisé. Toutefois, cela peut être modifiée en raison de la conception expérimentale. - Avant l’inoculation, décongeler l’homogénat fécale suivant les directives du fabricant.
- Inoculer chaque réacteur du côlon en ajoutant l’homogénat fécale en un montant égal à 5 % le volume du réacteur par l’orifice de l’échantillon, à l’aide d’une seringue de 60 mL (25 mL pour le côlon ascendant, 40 mL pour le côlon transverse, 30 mL pour le côlon descendant).
- Développer les cultures dans les bioréacteurs du jour au lendemain avec contrôle du pH.
- Après la croissance durant la nuit, récolter des échantillons du liquide luminal de chaque région du côlon tel que décrit ci-après à la section 3. Lorsque l’échantillonnage est terminée, activer le programme d’ordinateur à commence à se nourrir.
- Tous les jours alimentation cycles
Remarque : les cycles de l’alimentation quotidiennes sont ordinateur automatisé.- Trois fois par jour, pompe 140 mL de milieu défini dans le bioréacteur de l’estomac et incubés pendant 1 h.
- Après 1 h d’incubation, pomper le contenu de l’estomac dans l’intestin grêle. Dans le même temps, pompe 60 mL de suc pancréatique dans l’intestin grêle.
- Dans l’intestin grêle, ajuster le pH à un pH de 6,7 à 6,9, s’allume et laisser incuber pendant 90 minutes. Durant l’incubation, allumez le vidage de l’azote pour chaque système, pour un total de 10 min chacun.
- Après l’incubation de 90 min, mettre les pompes de l’intestin grêle, le côlon ascendant, le côlon ascendant, le côlon transverse, le côlon transverse, le côlon descendant et le côlon descendant des déchets simultanément.
- Montage expérimental
Remarque : le système in vitro utilisé ici est exploité de façon continue pendant environ 8 semaines dans la longueur. Voici un montage expérimental recommandé, cependant, cela peut être modifié suivant les exigences et l’objectif de l’expérience.- Mis en place le système suivants étapes répertoriées à l’étape 2.1.
- Récolter des échantillons de croissance durant la nuit suivant le protocole ci-dessous. Commencer le cycle quotidien, alimentation trois fois par jour selon le protocole ci-dessus.
- Exécutez l’expérience pour un total de 2 semaines pour permettre aux bactéries de se stabiliser.
Remarque : Fonctionnant avec le système signifie que le pH est maintenu, les cycles d’alimentation quotidiennes sont suivies trois fois par jour, et les transporteurs muqueux sont changés 2 ou 3 fois chaque semaine. - Après stabilisation, exécuter l’expérience pendant 2 semaines la période de contrôle.
- Après la période de contrôle, utiliser le système pour tester les différents composants ou variables, connues comme la période de traitement.
- Après la période de traitement, arrêter d’ajouter les composants ou les variables et les conditions de retour à la normale. Ceci est considéré comme la période de wash-out et est utilisée pour déterminer si oui ou non les modifications apportées à la communauté sont permanentes.
3. les échantillons prélevés dans le système de récolte
Remarque : Pendant l’expérience, les échantillons peuvent être récoltées de la phase Luminale ou muqueuse de n’importe quelle région à tout moment, après le dessous.
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Récolte d’échantillons luminales
- Récolter des échantillons de liquide luminales via le port de l’échantillon qui s’étend au milieu de la liquide de culture. Commencer par nettoyer le raccord Luer Lock sur le port de l’échantillon avec de l’éthanol 70 % ou le tampon d’alcool petit et laisser pour sécher.
- S’assurer que tout l’air est évacué d’une seringue de 30 mL et branchez-le sur le port de l’échantillon. Tirer verticalement 3 - 5 fois pour obtenir un bon mélange des composants navire. Après, dessiner un total de 30 mL de la culture.
- Aliquote les échantillons luminales comme nécessaires dans des tubes de faucon stérile et magasin sur la glace. Après que échantillonnage est terminé transférer celles-ci à un congélateur à-80 ° C.
- Pour l’analyse de l’AGCC, 15 mL de l’échantillon Luminale est filée à 4 ° C, 5 000 x g pendant 10 min. Le surnageant est seringue filtrée à l’aide d’un filtre de 0,2 μM de PES. Stocker le surnageant filtré à-80 ° C.
- Pour l’analyse de l’ADN, spin 1 mL de liquide luminal à 4 ° C, 5 000 x g pendant 10 min. éliminer le surnageant et stocker les granulés à-80 ° C.
- Comme une sauvegarde, stocker 10 mL de liquide luminal à-80 ° C pour la plupart des expériences.
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Récolte d’échantillons de muqueuses
Remarque : changer de transporteurs muqueux tous les 2-3 jours.- Retirer et mettre en évidence les transporteurs de mucine préparés du réfrigérateur.
- Activer la chasse d’eau azote et ouvrez le couvercle de réacteur rapidement. Enlever 50 % des transporteurs de mucine et ajouter de nouveaux.
- Sceller le couvercle rapidement et garder l’azote affleurant sur pendant 20 min.
- Pour l’extraction de l’ADN, aliquote de 0,25 à 0,5 g d’agar dans un tube de 2 mL et stockées à-80 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
4. analyse, séquençage et l’Extraction d’ADN
Remarque : L’ADN est extrait à l’aide de la méthode d’extraction de l’ADN CTAB avec homogénéisation physique dans une hotte de fumées29. Après extraction, un spectrophotomètre permettant de quantifier la quantité d’ADN dans chaque échantillon.
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Préparer le tampon CTAB
- Dissoudre 4,2 g K2HPO4 et 4,09 g de NaCl dans 200 mL d’eau déionisée, distillée, puis à l’autoclave à 121 ° C pendant 30 min.
- Laisser la solution refroidir à température ambiante.
- Ajouter 10 g de bromure d’Hexadécyltriméthylammonium (CTAB) et de la chaleur à 60 ° C sous agitation.
- Une fois tous le CCCC est dissoute, enlever la solution de chaleur et laisser refroidir à température ambiante.
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Préparer la solution de PEG-6000
- Dissoudre 300 g de polyéthylène glycol 6000 et 93,5 g NaCl dans 1 L d’eau déionisée, distillée.
- Après toutes les particules se dissolvent, autoclave, la solution à 121 ° C pendant 30 min.
- Après la stérilisation, laisser refroidir la solution à température ambiante avant utilisation.
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Effectuer l’extraction de l’ADN
- Ajouter 500 μl de tampon CTAB et 500 μL de phénol-chloroforme-Isoamylique alcool au tube d’échantillon de 2 mL et vortex pour homogénéiser.
- Transférer le contenu du tube à échantillon à un 0,1 mm physique homogénéisation tube (voir Table des matières).
- Homogénéiser les tubes pendant 20 s à la plus haute mise deux fois, avec une pause de 20 s entre les deux, à l’aide d’un homogénéisateur physique (voir Table des matières).
- Centrifuger les tubes homogénéisés à 3 000 x g pendant 5 minutes.
- Transférer 300 μL de surnageant dans un tube propre, de 1,7 mL et ajouter 500 μl de tampon CTAB dans le tube original.
- Homogénéiser ce tube à l’aide des méthodes dans les étapes 4.3.2-4.3.3 et centrifuger à 3 000 x g pendant 5 min.
- Après centrifugation, transférer un autre 300 μL de surnageant dans le nouveau tube qui contient à présent 600 μL.
- Ajouter un total de 600 alcool de chloroforme-Isoamylique μL dans le tube contenant 600 μL du liquide surnageant.
- Il faut inverser les tubes pour mélanger et centrifuger brièvement. Transférer 500 μL de la phase supérieure dans un tube propre de 1,7 mL. Veiller à ce que pour prendre la phase supérieure.
- Ensuite, ajouter 1000 μL de solution Peg-6000, inverser les tubes pour mélanger et puis incuber à température ambiante pendant 2 h.
- Après incubation, centrifuger les tubes à x 18 200 g, 4 ° C, pendant 10 min.
- Jeter le surnageant et nettoyer la pastille avec de l’éthanol 70 % froid de glace.
- Centrifuger les tubes à nouveau à 18 200 x g, 4 ° C, 10 min. éliminer le surnageant et permettre le culot sécher dans l’armoire de biosécurité sous hotte à flux laminaire.
- Après que la pastille est sèche, ajouter 75 μL de RNAse librement, sans DNAse, eau stérile dans chaque tube.
- Quantifier l’ADN remises en suspension par un spectrophotomètre et ensuite envoyer pour le séquençage du gène 16 s ARNr.
5. courte chaîne d’acide gras (AGCC) détection et analyse
- Décongeler les échantillons congelés à 40° C pendant 30 min et extraire les acides gras à courte chaîne à l’aide de l’éther dans un ratio de 2:1 (v : v).
- Transférer la phase organique à une GC/MS (voir Table des matières), équipée d’une colonne, 30 m, 0. 25 mm ID, 0,25 µm, (voir Table des matières) où 10 µL est injecté.
- Définissez la température port injection et colonne initiale à 260 ° C et 125 ° C respectivement. Maintenez la température initiale pendant 1 min et puis augmenter ceci à 250 ° C, plus de 11,5 min avec un débit de colonne de 1 mL/min.
Remarque : La température de MS pour la source d’ionisation est de 220° C et 250° C pour l’interface. - Quantifier la quantité de chaque AGCC à l’aide des courbes d’étalonnage et de l’acide 2-méthylhexanoïque comme étalon interne.
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Representative Results
Le protocole ci-dessus décrit la mise en place, l’inoculation et le fonctionnement d’un système in vitro de 5 étapes pour étudier le microbiote intestinal du côlon. Pour générer les données présentées ci-dessous, après extraction de l’ADN, séquençage d’ADN gène 16 s ARNr marqueur de la région de V1V2 a été réalisé en utilisant le haut débit séquençage (p. ex., MiSeq Illumina plate-forme) par le centre de Microbiome à l’hôpital pour enfants de Philadelphie,27. QIIME (Insight quantitatives en écologie microbienne) version 1.928 a été utilisé pour traiter les données de séquençage et l’analyse statistique a été réalisée sur l’environnement de R pour le calcul statistique29. Affectations taxonomiques ont été générées à l’aide de la base de données de référence de Greengenes 16 s30,31. OTU abondance relative valeurs ont été calculées en divisant que l’OTU lu comte par le nombre total de lectures dans l’échantillon. Niveaux de secourisme ont été quantifiés en utilisant le protocole décrit.
Le à la vitro communautés atteindre un équilibre stationnaire
La possibilité d’étudier le microbiote intestinal et courte chaîne d’acide gras (AGCC) production in vitro avec un système multi-étape exige que les communautés microbiennes atteint un état d’équilibre. Cela se produit après l’inoculation les taxons sont sont établis dans leurs niches et la composition de la communauté et leurs métabolites sont n’est plus fluctuant. Dans un état stable, la communauté et ses produits restent les mêmes au fil du temps. Pour les études de microflore intestinale in vitro, la stabilité est une condition essentielle ; sans stabilité, il est impossible de déterminer si oui ou non les changements observés sont produisent en raison des conditions expérimentales, ou si elles résultent de la variation. Selon ce qui a été proposé dans la littérature, une communauté peut être considéré comme stable lorsqu’il y a 80 % de similarité entre temps points32.
En utilisant les résultats du séquençage du gène 16 s ARNr marqueur, parcelles d’analyse en coordonnées principales (PCoA) non pondérée et pondérée des distances de UniFrac ont été générés pour les communautés qui ont mis au point dans chaque région du système au fil du temps (Figure 2). Une analyse non pondérée compare les communautés en ce qui concerne la présence ou l’absence d’espèces. L’analyse pondérée compare basée non seulement sur la présence ou l’absence d’espèces mais aussi considère que leur abondance. Pour 1 unité, cela inclus les phases luminales et muqueux et pour l’unité 2 seule la phase Luminale. Selon cette analyse, on a observé que la communauté a changé sensiblement entre 1 et 7 jours. Cependant, de jour 11 après l’inoculation jusqu'à la fin de l’expérience, les échantillons occupent une petite région de l’espace du PCoA. Cela était vrai pour les scores d’échantillon distance basés sur OTU présence-absence (Figure 2 a) ou sur l’abondance de l’OTU (Figure 2 b). Ainsi, on a fait observer que, après 11 jours, l’abondance et les types de bactéries sont restés stables depuis un échantillon point à l’autre. Cette tendance a été observée pour les phases luminales et muqueuses de toutes les régions de deux trois points de l’unité 1 et la phase Luminale de l’unité 2. Ces résultats illustrent que les phases luminales et muqueuses atteint une stabilité et que cela s’est produit en même temps.
La stabilité du système a été également sondée par l’analyse de la production d’acides gras à chaîne courte (AGCC) au fil du temps. Les trois plus importants AGCC (acide propionique, acide butanoïque et acide acétique)38 ont été mesurées dans chaque échantillon au cours de l’expérience à l’aide de la chromatographie en phase gazeuse CPG/SM. Ces mesures ont révélé que l’acide propionique, acide butanoïque et l’acide acétique a fluctué depuis le début de l’expérience jusqu'à 15 jours après l’inoculation (Figure 3 a-C). Après 15 jours, les montants de ces AGCC produites dans chaque région de côlon est restée inchangée, seuls des changements minimes qui se produisent jusqu'à la fin de l’expérience (Figure 3 a-C). La différence entre les points dans le temps a été en moyenne de 6,8 % pour l’acide propionique, 7,2 % pour l’acide acétique et 8,02 % pour l’acide butanoïque. Ceci suggère que semblable à la composition de la communauté, les propriétés métaboliques de la communauté entré dans un état stable, comme en témoigne la production de quantités stables d’AGCC au fil du temps. Unité 1 et l’unité 2 produisent des quantités similaires de l’AGCC, sans différence significative entre les deux (p > 0,05). Il a indiqué que la production d’AGCC n’était pas affectée par la présence ou l’absence de la communauté de muqueuse. Il est à noter que le point de stabilité déterminé dans cette expérience est semblable à celle décrite précédemment, dans laquelle il a été dit que la stabilisation de la communauté dans un système in vitro de 5 étages a eu lieu environ 2 semaines après l’inoculation33, 34,35.
Les communautés développé dans le à la vitro système sont semblables à l’inoculum
Le second nécessaire élément pour une expérience de microflore intestinale in vitro, c’est que la communauté développée dans le modèle préserve la diversité microbienne de l’inoculum fécal. Étant donné que le système utilisé dans cette expérience prévoit trois régions distinctes de colon on ne peut pas s’attendre que toute une région exactement la même chose que l’inoculum fécal. Cependant, il est prévu que les membres de chaque communauté sont dérivées de l’inoculum fécal et tous ensemble de maintenir un niveau similaire de la diversité comme inoculum.
Selon les résultats du séquençage du gène 16 s ARNr marqueur, la communauté moyenne et stable pour la phase Luminale et muqueuse de chaque région du côlon a été déterminée (jours 15 à 28 après l’inoculation) et par rapport à la communauté de l’inoculum fécal (Figure 4 a). Ces résultats démontrent que les communautés qui ont mis au point dans les régions de deux points particuliers du système in vitro ressemblaient à l’inoculum fécale dans la composition. Les deux ordres principaux dans le réacteur, Clostridiales et Bacteroidales, correspondaient à ceux observés dans l’inoculum. Toutefois, plusieurs commandes bactériennes de faible abondance dans les régions du côlon différaient de l’inoculum, avec les différences principales entre les commandes Burkholderiales et Synergistales (Figure 4 a).
La diversité alpha pour système in vitro a été comparée à l’inoculum, comme une autre mesure de la structure de la communauté après la stabilisation. L’indice de Shannon, calculé pour chaque région, au fil du temps, a atteint un niveau similaire de la diversité comme inoculum pour toutes les régions, à l’exception des échantillons luminales de la région ascendante (Fig. 4 b). Globalement, ces résultats démontrent que le système de culture in vitro a été en mesure de produire une communauté comparable à l’inoculum fécal, tant en termes de composition et de la diversité (Figure 4 a-B).
Utiliser un à la vitro système permet le développement de la région et des communautés spécifiques de phase
Les régions de côlon trois représentées dans ce système sont maintenues à différentes valeurs de pH et recevoir différents approvisionnements en éléments nutritifs. (Cela a été mentionné dans la section protocole). Sur cette base, il est prévu que les communautés de ces régions différenciera 33. Les communautés stables de luminal (jours 15 à 28) dans l’unité 1 et l’unité 2 ont été déterminées au niveau de la famille et tracées selon abondance relative (Figure 5). La divergence entre les régions de deux trois points en fonction de l’abondance des taxons particuliers, montre que chaque région développe une communauté unique. Ceci est également soutenu par les résultats de la Figure 2 et Figure 4 a. Dans la Figure 2, les communautés matures qui a mis au point dans chaque région du cluster à différents endroits sur la liste du PCoA. Dans la Figure 4 a, les communautés de chaque région du côlon diffèrent dans les pourcentages, les membres de l’ordre dominant.
Pour cette expérience, unité 1 a reçu des transporteurs muqueuses, tandis qu’unité 2 n’a aucun transporteurs de mucine. Basé sur cette conception expérimentale, la contribution de la surface des muqueuses pourrait être examinée. À des fins de comparaison, les communautés stables luminales et muqueuses (jours 15 à 28) pour 1 unité, au niveau de la famille, ont été tracées ensemble selon l’abondance relative (Figure 6). Il est clair que la composition des communautés luminales et muqueuses pour tous trois points-virgules diffère dans l’abondance de certains taxons, le plus important étant Lachnospiraceae et Bacteroidaceae. Ces résultats démontrent également que les communautés muqueuses dans les trois régions sont différentes les uns des autres. Par exemple, Clostridiaceae est enrichi dans les communautés muqueuses des régions descendantes et transverses, et Veillonellaceae est plus élevée dans la phase muqueuse du côlon ascendant, mais pas dans le tube transversal ou décroissant des régions du côlon. Pris ensemble, les résultats présentés dans ces chiffres montrent qu’il y a une nette différence entre les communautés à chaque étape et chaque région pour certains taxons, illustrant que la composition entre les régions est semblable et qu’il y a une différence dans abondance.
Bien que l’analyse du séquençage de l’ADN révèle le développement d’une communauté axée sur la région, il n’y a aucune différence apparente dans la production de l’AGCC entre régions. Le ratio moyen d’acide acétique : acide propionique : acide Butanoïque pour la communauté stable (15-28 jours) a été calculé pour chaque région (Figure 7 a). Alors que les ratios de l’AGCC différent est resté assez similaires, il y a une augmentation du montant total de l’AGCC produites entre les régions de l’ascendantes, transversales et descendantes, avec les niveaux les plus élevés disponibles dans les environs de décroissant (Figure 7 b). Cela était vrai pour l’unité 1 et l’unité 2.
Figure 1 : Illustration de la conception expérimentale de 5 étages, in vitro. Le système complet se compose des éléments suivants : une circulation d’eau bain, courant d’azote, un ensemble de bioréacteurs de verre, un ensemble de barres de l’agitateur magnétique et agitateurs magnétiques, des sondes de pH, une console informatisé contenant 40 pompes péristaltiques, un écran d’ordinateur et d’un réfrigérateur. Le système principal est composé d’un ensemble de bioréacteurs imitant l’estomac, intestin grêle et les régions du colon ascendant, transversale et descendant. Deux unités complètes sont configurées pour s’exécuter en parallèle, prévoyant un expérimental et un groupe témoin. Cela signifie que les 10 bioréacteurs 10 sondes de pH et 10 agitateurs magnétiques sont requis pour cette expérience. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : la communauté in vitro se stabilise par jour 11 après l’inoculation. PCoA analyse basée sur des distances non pondéré (A) et (B) pondérée en fonction du Unifrac pour la phase Luminale et muqueuse de chaque région au fil du temps pour 1 unité et pour la phase Luminale de l’unité 2. L’intrigue est à facette dans les composants après avoir calculé les axes PCoA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : la production d’AGCC par le système in vitro stabiliser d’ici 15 jours après l’inoculation. Mesures d’acide propionique et acétique acide Butanoïque au fil du temps pour le côlon Transverse de croissant (A) du côlon (B) et (C) du côlon descendant. L’expérience a été réalisée en trois exemplaires. Les résultats représentent une moyenne de trois mesures indépendantes, avec des barres d’erreur décrivant la déviation standard. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : comparaison des communautés stables depuis le système in vitro pour l’inoculum fécal. (A), l’écurie de communautés (D15-28), au niveau de l’ordre étaient en moyenne et formatées en camemberts pour la phase deux muqueuse et Luminale de chaque région du côlon et de l’inoculum fécal. (B) la Shannon diversité pour la muqueuse et Luminale phase de chaque région de deux points par rapport à l’inoculum fécal (pointillé noir). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : la phase Luminale et muqueuse dans chaque région du côlon favorisent la croissance des communautés distinctes. L’abondance relative moyenne, au niveau de la famille, pour les communautés stables (D15-28) pour la phase Luminale et muqueuse et l’inoculum, ont été calculés et comploté ensemble pour chaque région du côlon. Barres d’erreur représentent l’écart entre les points. AC1 = croissant du côlon unité 1 ; TC1 = côlon Transverse unité 1 ; DC1 = descendant du côlon unité 1 ; AC2 = croissant du côlon unité 2 ; TC2 = côlon Transverse unité 2 ; DC2 = descendant du côlon unité 2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : chaque région du côlon du système in vitro développe une communauté unique. L’abondance relative moyenne, au niveau de la famille, pour les communautés stables (D15-28) dans chaque région du côlon et l’inoculum fécal, ont été calculés et tracés ensemble. L’expérience a été réalisée en trois exemplaires. Les résultats représentent une moyenne de trois mesures indépendantes, avec des barres d’erreur décrivant la déviation standard. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : le ratio de l’acide acétique : propionique acide : l’acide Butanoïque est similaire pour chaque région du colon. (A) les quantités d’acide acétique, acide propionique et l’acide butanoïque pour les communautés stables (D15-28) de chaque région du côlon ont été calculées et converties en un ratio. (B) les ratios ont été tracées sous forme de pourcentages pour chaque région du côlon. Barres d’erreur représentent l’écart entre les points. AC1 = croissant du côlon unité 1 ; TC1 = côlon Transverse unité 1 ; DC1 = descendant du côlon unité 1 ; AC2 = croissant du côlon unité 2 ; TC2 = côlon Transverse unité 2 ; DC2 = descendant du côlon unité 2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Systèmes de culture in vitro ont été développés pour étudier le microbiote intestinal du gros intestin. Ils utilisent des appareils conçus pour simuler les conditions physiologiques du tractus intestinal gastro, favorisant la croissance d’une communauté bactérienne de l’intestin mature pour chaque région du côlon33. Si le concept est logique et compréhensible, le fonctionnement réel des systèmes de culture in vitro pour étudier le microbiote intestinal nécessite précision et la compréhension de ce qui est nécessaire et devrait produire des résultats fiables.
Les éléments requis pour une expérience de microflore intestinale in vitro sont que la communauté doit atteindre une stabilité après l’inoculation et qu’elle doit maintenir la diversité microbienne de l’inoculum fécal. Si l’expérience est exécutée correctement, ces deux éléments requis sont atteints facilement et de manière prévisible. Des étapes cruciales dans le protocole qui aura une incidence sur la stabilité du système et la diversité sont les suivantes : la préparation du milieu défini et du suc pancréatique doit être précise, et la livraison de ces substrats doit être conforme. Conditions anaérobies doivent être maintenues pendant l’expérience. Le pH de chaque région intestinale doit être maintenu avec précision au fil du temps. Variations de ces trois paramètres lors de l’expérience peuvent entraîner des fluctuations de population et la production de métabolites variable.
En utilisant ce type de système in vitro multi-étape présente plusieurs avantages. Notamment, ils simulent les différentes régions du côlon. Ils peuvent également être conçus pour simuler la digestion in vitro des aliments dans la TGIS, y compris les composants enzymatiques de la salive et l’ajout de la pancréatine et la bile. Une phase muqueuse peut être incorporée dans chaque réacteur du côlon, ajoutant davantage de complexité8. Cela se traduit par le développement de la région et les communautés microbiennes phase spécifiques qui peuvent être individuellement analysées et comparées. Ces types de systèmes peuvent être facilement manipulées, selon le protocole expérimental par le biais de reconfiguration physique, modifications des paramètres physiologiques tels que le pH, la température ou les temps de transit, ou l’inoculation avec spécifiques fécale échantillons26 . Ce qui est important, recherche a montré que les communautés développées dans ces systèmes in vitro représentent l’intestin communauté microbienne11,26,34.
Alors que l’utilisation des systèmes in vitro de plusieurs degrés peut être utilisée pour étudier mécaniquement le microbiote intestinal, ils ont des limites. Tout d’abord, alors que les conditions physiologiques sont programmables, ils sont fixés à l’aide des valeurs moyennes, traduisant ainsi la personne moyenne. Il s’agit d’une simplification puisqu’il y a beaucoup de variations inter-individus12,23. Deuxièmement, bien que l’absence de composants mammifères est une raison pour utiliser un système in vitro, elle aussi doit considérer une limitation. L’absence de certains composants de mammifères, comme le système immunitaire, peut entraîner des différences entre le modèle in vitro et le correspondant du12,in vivo microenvironnement23. Toutefois, ces limitations ne nuisent pas à la valeur et la perspicacité qui peut être tirée de l’utilisation des systèmes in vitro pour étudier mécaniquement le microbiote intestinal. Enfin, les cultures sont cultivées dans des bioréacteurs de verre avec aucune absorption d’eau ou de métabolites. Il s’agit d’une différence importante, et l’effet peut être vu dans la mesure de l’AGCC où les montants totaux des AGCC augmentent le croissant transversal décroissant des régions du côlon (Figure 7). C’est le contraire de ce qui est observé in vivo, où les concentrations les plus élevées de l’AGCC sont disponibles dans la partie proximale, dans la région ascendante, et les plus faibles concentrations trouvent dans la partie distale36. Toutefois, lorsque la production nette de l’AGCC est considérée pour chaque région, il peut décider que la plupart de la production CSAF se produit dans le côlon ascendant. Il convient également de mentionner ici que la charge bactérienne n’a pas été mesurée dans cette expérience. En charge bactérienne des différences entre les régions dans ce système peuvent avoir une incidence sur les montants totaux des AGCC produites.
En conclusion, il est bien connu que le microbiote intestinal joue un rôle dans la santé humaine et la maladie, et il est considéré comme pour servir de médiateur entre l’alimentation et la santé métabolique37,38. Ici, l’application d’un système in vitro pour étudier le microbiote intestinal a été examinée, et ont été présentés les résultats d’une expérience démontrant le développement d’une communauté stable. Un système in vitro présente de nombreux avantages et favorise le développement d’une communauté dynamique et complexe, qui est illustrée dans l’expérience décrite. Ce type de système est mieux utilisé pour étudier les interactions et les changements au sein de la communauté de microflore intestinale en réponse à des facteurs externes, tels que les composants alimentaires et de médicaments. Les résultats de ces études in vitro peuvent alors être complétés par des études in vivo, d’acquérir une profonde compréhension de la fonction et la contribution de la microbiote intestinal à la santé et la maladie.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrentes. La mention de noms commerciaux ou des produits commerciaux dans cette publication est uniquement dans le but de fournir des informations spécifiques et n’implique pas de recommandation ou une approbation par le U.S. Department of Agriculture. USDA est un fournisseur de l’égalité des chances et l’employeur.
Acknowledgments
Mme Audrey Thomas-Gahring est reconnu pour son GC/MS de travail. Nous tenons également à remercier Massimo Marzorati pour l’édition du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TWINSHIME | Prodigest | NA | |
| Defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch) | Prodigest | NA | |
| Masterflex tubing | cole Parmer | NA | |
| Urine Drainage bag | Bard | NA | |
| Labsorb | Sigma-Aldrich | NA | |
| Fecal sample | Openbiome | NA | |
| Syringes | Becton Dickson | NA | |
| Defined medium | Prodigest | NA | |
| Oxgall Bile | Becton Dickson | NA | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Glass ware | Ace Glass | NA | |
| Porcine mucin | Sigma-Aldrich | NA | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | NA | |
| Sterilization pouches | VWR | NA | |
| BeadBug | Benchmark Scientific | NA | |
| Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1 mm Bead beater tube | Benchmark Scientific | NA | |
| RNAse free, DNAse free, sterile water | Roche | NA | |
| Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS | Shimadzu | NA | |
| Stabilwax-DA column, 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 µm | Restek | NA | |
| plastic mucin carriers | Prodigest | NA |
References
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