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Bioengineering

Aplicação avançada em Vitro cultivo tecnologia para estudar a Microbiota do intestino humano

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/59054
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 1
1Dairy and Functional Foods Research Unit, Eastern Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2ProDigest, 3Division of Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, Children's Hospital of Philadelphia

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para cultivo a microbiota do intestino do cólon in vitro, usando uma série de biorreatores que simulam as condições fisiológicas do tracto gastro-intestinal.

Abstract

A microbiota do intestino humano desempenha um papel vital na saúde e na doença. Estudar a microbiota do intestino utilizando um modelo in vivo , é difícil devido à sua natureza complexa e sua associação diversificada com componentes dos mamíferos. O objetivo do presente protocolo é cultura a microbiota do intestino in vitro, que permite o estudo da dinâmica de microbiota do intestino, sem ter que considerar a contribuição do meio de mamíferos. Usando em vitro tecnologia de cultivo, as condições fisiológicas do tracto gastro-intestinal são simuladas, incluindo parâmetros como pH, temperatura, anaerobiose e tempo de trânsito. A superfície intestinal do cólon é simulada adicionando transportadoras revestidas mucina, criando uma fase da mucosa, e adicionando outra dimensão. A microbiota do intestino é introduzida por inocular com o material fecal humano. Após a inoculação com esta mistura complexa de bactérias, micróbios específicos são enriquecidos na diferentes longitudinal (ascendente, transversais e descendentes de dois-pontos) e transversais (luminal e da mucosa) ambientes do modelo in vitro. É crucial permitir que o sistema alcança um estado estacionário, em que a Comunidade e os metabólitos produzidos permanecem estáveis. Os resultados experimentais neste manuscrito demonstram como a comunidade de microbiota do intestino inoculados se desenvolve em uma comunidade estável ao longo do tempo. Uma vez que o estado estacionário é alcançado, o sistema pode ser usado para analisar interações bacterianas e funções de Comunidade ou para testar os efeitos de quaisquer aditivos sobre a microbiota do intestino, tais como alimentos, componentes de alimentos ou produtos farmacêuticos.

Introduction

A microbiota do intestino é uma comunidade de microorganismos que residem no trato gastrointestinal humano (GIT).  Esta comunidade atinge a concentração máxima no cólon, que é estimado para segurar 10-13-1014 bactérias, de 500-1.000 espécies, que vivem em simbiose com o meio de cólon1,2. A composição e a funcionalidade da microbiota do intestino espacialmente mudam ao longo do GIT, formando comunidades específicas da região, com a maioria dos diversidade encontrada distalmente2,3,4,5. Para cada região anatômica, separadas das comunidades microbianas residem no lúmen e no forro mucosal6. A comunidade de lúmen tem acesso mais direto aos nutrientes como substratos se move através do compartimento luminal7. Apesar disso, algumas bactérias residam preferencialmente na camada de muco, utilizando mucina produzida pelas células do cólon como energia fonte1,5,8. A diferença entre as fases luminal e mucosas microambiente que resulta em divergência e o desenvolvimento de comunidades específicas de fase. Juntas, estas comunidades fornecem funções metabólicas, tais como o metabolismo de nutrientes e a produção de vitaminas e funções imunológicas, tais como prevenir a colonização de patógenos humanos1,3, 9. a microbiota do intestino também funciona funcionalmente em conjugação com as células de cólon humano3.

Como uma parte importante do GIT humano, não é surpreendente que a microbiota do intestino é conhecida por contribuir para ambos anfitrião saúde e doença estatuto3,9,10,11,12. Uma mudança na população microbiana do intestino tem sido associada com várias doenças humanas, incluindo transtornos do GIT como doença intestinal intestinal (IBD) e síndrome do intestino (IBS), mas também de outras doenças, como obesidade, doenças circulatórias e autismo 3 , 9 , 10 , 11 , 12. metabólitos produzidos a partir da microbiota do intestino tem um efeito global, atingindo locais longe do intestino12,13. Por exemplo, o eixo do intestino-cérebro é associado com transtornos mentais, como ansiedade e depressão14. Portanto, estudar a microbiota do intestino é importante para vários campos de pesquisa e é aplicável a muitas doenças, mesmo aqueles não frequentemente associada com o GIT.

Enquanto é amplamente reconhecido que a microbiota do intestino a estudar é importante, é uma tarefa complicada. Vários modelos animais estão disponíveis, desde pequenos animais como o peixe-zebra, ratos e camundongos, para maiores como macacos e porcos,15-19. No entanto, a aplicação destes animais em termos da microbiota do intestino humano é não simples, desde que estes animais têm uma comunidade única bacteriana que evoluiu com base no ambiente e dieta, e eles são anatomicamente distintos dos seres humanos20 , 21. o uso de cobaias humanas, remove a questão da relevância, no entanto, apresenta um outro conjunto de desafios. Estudos em humanos são caros, consomem tempo e são eticamente restrita11. Além disso, fatores de confundimento influenciam a microbiota do intestino em estudos humanos, incluindo a idade ou grau de desenvolvimento, ambiente, dieta, medicação e fatores genéticos,2,4,22.  Também há restrições sobre o que pode ser testado em seres humanos, e que tipo de amostras pode ser colhido no qual vezes4.

Uma desvantagem crítica de usar um sistema na vivo para estudar a microbiota do intestino é a presença de componentes dos mamíferos. A microbiota do intestino e células humanas interagem um com o outro, e em um no vivo definindo, é impossível distinguir os dois. Os metabólitos produzidos pela microbiota do intestino são tomados pelas células do cólon, então as medidas não podem ser calculadas com precisão. Portanto, qualquer estudo mecanicista deve ser limitado aos pontos de extremidade medições11. Outra grande desvantagem para estudos in vivo é a incapacidade para colher amostras de diferentes regiões do GIT longitudinalmente23. Isto não permite a avaliação das mudanças que podem ocorrer no microambiente do cólon ao longo do tempo12.  Muitos na vivo estudos, incluindo os humanos, dependem de análise de amostras fecais para detectar as alterações para o intestino microbiota12. Enquanto isso é informativo, ele não fornece dados sobre a microbiota do intestino através do GIT e não faz distinção entre as comunidades luminal e mucoso5,6,7,8.

A microbiota do intestino, a aplicação de um método em vitro é necessário estudar a dinâmica da comunidade bacteriana, sem interferência dos componentes dos mamíferos. Usar um método em vitro permite o controle apertado de condições ambientais10testes de vários parâmetros simultaneamente e a capacidade de amostra longitudinalmente e em grandes volumes11. Desde que um método in vitro utiliza um dispositivo mecânico e não uma série, sem considerações são necessárias para idade, ambiente, dieta ou plano de fundo genético. Estes sistemas pode ser usado para testar de qualquer comunidade de microbiota intestino inteiro, somente selecionado organismos, ou mesmo única cepas. Importante, os resultados in vitro são reproduzíveis, ainda manter um nível de diversidade comparável para estudos in vivo11,22.

Dependendo da hipótese em questão e os resultados desejados, eun vitro estudos podem ser realizados de várias formas.  Eles podem utilizar sistemas single-navio e métodos simples, como incubar as amostras fecais homogenate24 ou executar culturas único lote ao longo de 24-48 h25. Eles também podem ser realizados usando sistemas single-navio e métodos mais complexos, como o uso de um sistema de quimiostato para produzir um intestino estável comunidade microbiana11. No entanto, o uso de um único reator over simplificar a microbiota12 desde que representa apenas uma parte do cólon, mesmo que o cólon é composto por regiões ascendentes, transversais e descendentes.

Para estudar a comunidade de microbiota do intestino que se desenvolve nas diferentes regiões do cólon (ascendentes, transversais e descendentes regiões), um sistema complexo, com vários estágio pode ser empregado. Nestes sistemas, vários navios estão constituídos para imitar as diferentes regiões do cólon, então a microbiota do intestino das regiões ascendentes, transversais e descendentes são cultivados de forma independente. Estes vasos são conectados, usando bombas para mover substratos em sequência, a partir do ascendente para o transverso às regiões do cólon descendente, imitando o fluxo de nutrientes através do GIT.

O objetivo deste estudo foi demonstrar como um sistema de cultura in vitro de 5 estágios (ver Tabela de materiais) pode ser usado para cultivar a Comunidade microbiota do intestino e para demonstrar a dinâmica da Comunidade em termos de estabilidade e composição. Neste sistema, um navio representa o estômago e um representar o intestino delgado. O cólon é dividido em três regiões (ascendente, transverso, descendente), com um navio que representa cada região26. Nesta instalação experimental, dois sistemas completos foram executados em paralelo, com 1 unidade contendo portadores de mucina que representa a superfície da mucosa e unidade 2 contendo não portadores de mucina. As comunidades que se desenvolveu nas fases de luminal e da mucosa de cada região foram comparadas entre si e para o inóculo fecal ao longo do tempo usando análise de CCPA e sequenciamento de gene 16S rRNA. Os resultados apresentados demonstram o tipo de comunidade, tanto em termos de composição e funcionalidade, que pode ser produzida a partir deste tipo de sistema in vitro.

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Protocol

1. materiais e preparações

Nota: O médio definido é comprado como um pó (ver Tabela de materiais). A composição do meio definido em g/L é o seguinte: Arabinogalactan (1.2), pectina (2.0), xilana (0,5), glicose (0,4), extrato de levedura (3.0), peptona especial (1.0), mucina (2.0), L-cisteína-HCl (0,2).

  1. Prepare o suporte definido
    1. Encha um frasco de 4L com 2 L de água destilada, deionizada dupla.
    2. Adicionar 29,2 g de pó médio definido para a água e misture a unidade completa homogeneizada.
    3. Adicionar um agitador magnético e Dane-se vagamente na tampa.
    4. Autoclave a 121 ° C por 30 min.
    5. Após arrefecimento, armazene o meio definido preparado no frigorífico a 4 ° C, com agitação constante (agitador magnético).
  2. Preparar o suco pancreático
    1. Autoclave 2L de água destilada, deionizada em um recipiente de 5L com uma barra de agitador adicionado, a 121 ° C por 30 min.
    2. Após a autoclavagem, permitir que a água arrefecer à temperatura ambiente.
    3. Adicione 12,5 g NaHCO3, 6g bílis e pancreatina 0,9 g. Colocar no agitador magnético para misturar.
      Nota: O suco pancreático deve ser preparado fresca a cada 2-3 dias e refrigerado com agitação após ele fez.
  3. Tampão fosfato
    1. Coloque um frasco de 1L contendo uma barra de agitador magnético em um agitador magnético. Adicionar 0,5 L de água destilada, deionizada e ligar a agitação.
    2. Em seguida, adicione 6,8 g KH2PO4, 8,8 g K2HPO4e tioglicolato de sódio 0,1 g. Top com água até um volume final de 1 L.
    3. Depois que os componentes completamente dissolvido, ajuste o pH a 7,0 usando NaOH.
    4. Despeje o buffer em um recipiente de 2 L com tampa de rosca tampa e autoclave a 121 ° C por 30 min. Certifique-se de que a tampa é parafusada na livremente e não fechado hermeticamente.
    5. Após retirar da autoclave, deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente. Armazene o buffer em temperatura ambiente por até 2 semanas.
  4. Preparar as transportadoras de ágar de mucina
    1. Transportadoras de plástico mucina autoclave (ver Tabela de materiais), fórceps, engranzamento plástico (forma tubular) e laços zip 131 ° c por 30 min.
    2. Autoclave 300ml de double destilada, ionizada de água a 131 ° C por 30 min. armazenar em temperatura ambiente até o uso.
    3. Em uma armário com o fluxo laminar de segurança biológica, encha os pratos de Petri estéril com as transportadoras de plástico mucina usando Pinças esterilizadas.
      Nota: Os portadores de mucina são círculos de plástico ocos que são preenchidos com ágar de mucina. Uma vez preenchido, a tampa pode ser colocada na parte superior, e estas podem ser postas de lado.
    4. Para preparar ágar de mucina, adicione 3 g de ágar bacteriana e 15 g de mucina suínos para os 300 mL de água esterilizada.
    5. Em uma coifa, ferver esta solução, retire da fonte de calor e deixe para esfriar por 1 min. repetir a ebulição e refrigeração para um total de 3 vezes.
    6. Uma vez que o recipiente de vidro contendo a solução de ágar de mucina é bastante frio ao toque, mova-o para a biossegurança do armário com fluxo laminar.
    7. Na biossegurança do armário com o fluxo laminar, despeje o ágar de mucina líquido sobre as transportadoras de plástico mucina que foram colocadas na caixa de Petri. Certifique-se de que todas as transportadoras são completamente cheias com ágar de mucina.
    8. Coloque a tampa na caixa de Petri e espere que ele esfrie sob fluxo laminar.
    9. Para montar os portadores de mucina, pegue a rede plástica esterilizada e inserir portadores de mucina contendo o ágar solidificado mucina da caixa de Petri usando Pinças esterilizadas.
    10. Use braçadeiras para fechar as extremidades da malha. Desta forma as funções de rede para conter os portadores de mucina repleto de ágar de mucina. Armazenar a 4 ° C até o uso.

2. configurar, inoculação e execução do sistema

  1. Configurar o sistema de cultivo
    Nota:     o simulador de gêmeo do ecossistema microbiano Intestinal humana foi usado para este estudo.
    1. Coloque 10 biorreatores contendo barras de agitador em Agitadores magnéticos e ligar a agitação.
      Nota: Cada unidade será composta de 5 biorreatores, então 2 unidades exigirá 10 biorreatores.
    2. 5 biorreatores Conecte uns aos outros usando tubos de silicone em sequência através da bomba peristáltica (Figura 1). Use as bombas de transversal o conteúdo líquido de um biorreator para a próxima.
    3. Rotular os biorreatores na seguinte sequência: estômago, intestino delgado, cólon ascendente, cólon transverso, descendente do cólon para representar a ordem do tracto gastrointestinal.
      Nota: Os biorreatores podem ser todos idênticos, ou biorreatores o estômago e intestino delgado podem ser menor comparados com os biorreatores de cólon desde que eles vão prender o volume menor. Configurando os biorreatores desta forma significa que a região do cólon ascendente recebe nutrientes do intestino delgado, cólon transverso região recebe nutrientes da região do cólon ascendente e região de cólon descendente recebe nutrientes do região transversal. Desta forma, o sistema está imitando o movimento sequencial de nutrientes através do trato gastrointestinal.
    4. Lugar do meio definido e suco pancreático no frigorífico a 4 ° C, com agitação constante usando Agitadores magnéticos. Usando o tubo de silicone, conectar o meio definido para o biorreator de estômago através de uma bomba peristáltica e conectar o suco pancreático para o intestino delgado através de uma bomba peristáltica.
    5. Adicione agente de solidificação de um saco de drenagem de urina. Conecte o cólon descendente para a bolsa de drenagem de urina através da bomba peristáltica. Alienar o solidificado como resíduos biológicos durante o experimento.
    6. Usando o tubo do silicone, conectar-se a camisa de água de cada navio em ordem e conecte cada extremidade para o banho de água circulante. Encher a banheira de água a circulação com água destilada (este montante irá variar dependendo do tipo de banho de água usado em circulação) e definir a 37 ° C.
    7. Com tubo de silicone, ligue o ácido e a base da tampa de cada navio por meio de bombas peristálticas. As concentrações recomendadas são 0,5 M de HCl e 0,5 M de NaOH.
    8. Inserir a sonda de pH a cada navio através do porto designado na tampa. Esta porta é projetada para manter a sonda de pH e parafuso na tampa (Figura 1). Definir o pH para cada região da seguinte forma: estômago, pH = 2; Intestino delgado, pH = 6,7-6,9; Cólon ascendente, pH = 5,6-5,9; Cólon transverso, pH = 6.15-6.4; Cólon descendente, pH = 6,6-6.9.
      Nota: Durante a fase inicial, a Comunidade irá diferenciar com base na diferença em valores de pH da região. No entanto, uma vez que os ciclos de alimentação começam, as comunidades ainda mais vencerão com base nas diferenças em entrada de nutrientes.
    9. Ligue uma linha de nitrogênio usando tubo de silicone para a tampa de cada navio usando a porta designada. A linha de nitrogênio deve fluir na seguinte sequência: estômago, intestino delgado, cólon ascendente, cólon transverso, descendente do cólon. Certifique-se de que cada unidade tem seu próprio flush para evitar a contaminação cruzada.
      Nota: O nitrogênio é usado para oxigênio removido do sistema e mantém anaerobiose durante o experimento.
    10. Inserir um tubo de metal amostra através da tampa de cada biorreator usando a porta designada. O tubo de metal se estende para baixo para o biorreator e é usado para recolher amostras de fluidos.
    11. Adicionar um pequeno pedaço de tubo de silicone para a extremidade superior do tubo de amostra e conectar um Luer Lock para permitir o uso de uma seringa durante a amostragem.
  2. Inoculação do sistema
    1. Encha as regiões do cólon com o meio definido usando os seguintes volumes: 500 mL no cólon ascendente, 800 mL no cólon transverso e o cólon descendente de 600 mL.
    2. Adicione as transportadoras de ágar de mucina para as regiões do cólon, em montante proporcional ao volume do reator. Para este experimento, foram utilizadas 60 transportadoras por reactor.
    3. Remova qualquer excesso de meio definido usando o tubo de amostra e uma seringa desde adicionar as transportadoras eleva o nível de fluido no bioreator.
    4. Ligue as pontas de prova do pH para ajustar o pH em cada reator usando o computador.
    5. Ligue o flush de nitrogênio por 20 min.
      Nota: O homogeneizado fecal utilizado para inoculação é comprado como 10% fezes homogeneizados em solução de glicerol 10% (ver Tabela de materiais). A amostra fecal é seleccionada aleatoriamente a partir de um pool de doadores com os seguintes critérios: An American consumindo uma dieta ocidental típica (não vegan ou vegetariano), entre 21-45 anos de idade, antibiótico livre pelo menos 1 ano, com um índice de massa corporal média (18,5-24,9) . Por este protocolo, é utilizado apenas um único doador. No entanto, isto pode ser alterado devido ao design experimental.
    6. Antes da inoculação, descongele o homogenate fecal, seguindo as orientações do fabricante.
    7. Inocule cada reactor de cólon adicionando o homogenate fecal um montante igual a 5% do volume do reator através da porta de amostra, utilizando uma seringa de 60 mL (25 mL para o cólon ascendente, 40 mL para o cólon transverso, 30 mL para o cólon descendente).
    8. Crescem as culturas nos biorreatores durante a noite com o controle do pH.
    9. Após o crescimento durante a noite, colha amostras do fluido luminal de cada região do cólon, conforme detalhado abaixo na seção 3. Após amostragem for concluída, ligue o programa de computador que começam a alimentar.
  3. Diário de ciclos de alimentação
    Nota:     os ciclos diários de alimentação são computador automatizado.
    1. Três vezes por dia, bomba de 140 mL do meio de definidos para o biorreator de estômago e permissão para incubar durante 1 h.
    2. Após incubação de 1 h, bomba o conteúdo do estômago para o intestino delgado. Ao mesmo tempo, bomba de 60 mL de suco pancreático no intestino delgado.
    3. No intestino delgado, ligue o ajuste do pH ao pH 6,9-6,7 e deixar a mistura incubar durante 90 minutos. Durante a incubação, ative a liberação de nitrogênio para cada sistema, para um total de 10 min cada.
    4. Após a incubação de 90 min, liga as bombas do intestino delgado para o cólon ascendente, o cólon ascendente, cólon transverso, o cólon transverso, o cólon descendente e o cólon descendente aos resíduos simultaneamente.
  4. Linha do tempo experimental
    Nota:     a in vitro sistema usado aqui é operado de forma contínua por aproximadamente 8 semanas de duração. Abaixo está um cronograma experimental recomendado, no entanto, isto pode ser modificado segundo as necessidades e o objetivo do experimento.
    1. Configure o sistema seguir as etapas listadas na etapa 2.1.
    2. Colheita de amostras de crescimento durante a noite, seguindo o protocolo abaixo. Começam os ciclos diários, alimentação três vezes ao dia, seguindo o protocolo acima.
    3. Execute o experimento para um total de 2 semanas para permitir que as bactérias para estabilizar.
      Nota: Executando o sistema significa que o pH é mantido, os ciclos diários de alimentação são seguidos três vezes por dia, e os portadores da mucosa são alterados 2 - 3 vezes cada semana.
    4. Após a estabilização, execute o experimento por 2 semanas como o período de controle.
    5. Após o período de controle, use o sistema para testar diferentes componentes ou variáveis, conhecidas como o período de tratamento.
    6. Após o período de tratamento, parar de adicionar os componentes ou variáveis e voltar às condições normais. Isto é considerado período de lavagem e é usado para determinar se ou não as alterações para a Comunidade são permanentes.

3. colheita de amostras do sistema

Nota: Durante o experimento, as amostras podem ser colhidas da fase luminal ou na mucosa de qualquer região a qualquer momento, seguindo o abaixo orientações.

  1. Colheita de amostras luminal
    1. Colheita de amostras de fluido luminal através da porta de amostra que se estende até a metade do líquido da cultura. Comece por limpar o conector Luer-Lock na porta amostra com etanol 70% ou a almofada pequena de álcool e deixe para secar.
    2. Certifique-se de que todo o ar é removido de uma seringa de 30 mL e conectá-lo à porta de amostra. Desenhar para cima e para baixo 3 - 5 vezes para garantir a mistura adequada dos componentes do navio. Depois, desenhe um total de 30 mL de cultura.
    3. Alíquota as luminal amostras como necessárias em tubos estéreis Falcão e loja no gelo. Depois que for concluída a amostragem transferi estes para um freezer-80 ° C.
    4. Para a análise do CCPA, 15 mL de amostra luminal é girado a 4 ° C, 5.000 x g durante 10 minutos. O sobrenadante é filtrada usando um filtro de 0,2 μM PES com seringa. Armazenar o sobrenadante filtrado a-80 ° C.
      1. Para análise de DNA, rotação 1 mL de fluido luminal a 4 ° C, 5.000 x g durante 10 min. descartar o sobrenadante e armazenar a pelota a-80 ° C.
      2. Como um backup, armazene 10 mL de fluido luminal a-80 ° C para a maioria dos experimentos.
  2. Colheita de amostras da mucosa
    Nota:     mudar as transportadoras da mucosa cada 2-3 dias.
    1. Remover e trazer para fora os portadores de mucina preparado na geladeira.
    2. Ligue o flush de nitrogênio e abra a tampa do reator rápido. 50% dos portadores de mucina de remover e adicionar novos.
    3. Sele a tampa rapidamente e manter o nitrogênio embutida por mais 20 minutos.
    4. Para a extração de DNA, alíquota de 0.25-0.5 g de ágar-ágar em um tubo de 2 mL e armazenado a-80 ° C até ser necessário.

4. análise, sequenciamento e extração de DNA

Nota: DNA é extraído usando o método de extração de DNA CTAB com homogeneização física em uma capa de emanações29. Após a extração, um espectrofotômetro é usado para quantificar a quantidade de DNA em cada amostra.

  1. Preparar o tampão CTAB
    1. Dissolva 4,2 g K2HPO4 e 4,09 g NaCl em 200 mL de água destilada, deionizada e, em seguida, autoclave a 121 ° C por 30 min.
    2. Deixe a solução arrefecer à temperatura ambiente.
    3. Adicione 10 g de brometo de hexadeciltrimetilamónio (CTAB) e aquecer a 60 ° C, com agitação.
    4. Depois todos o CTAB é dissolvido, remova a solução de calor e frio à temperatura ambiente.
  2. Preparar a solução de PEG-6000
    1. Dissolva 300 g de polietilenoglicol 6.000 e 93,5 g NaCl em 1 L de água destilada, deionizada.
    2. Depois de todas as partículas são dissolvidos, autoclave a solução a 121 ° C por 30 min.
    3. Após a autoclavagem, arrefecer a solução à temperatura ambiente antes do uso.
  3. Realizar a extração do ADN
    1. Adicione 500 μL de tampão CTAB e 500 μL de fenol-clorofórmio-isoamílico álcool para o tubo de amostra de 2 mL e vórtice para homogeneizar.
    2. Transferi todo o conteúdo do tubo de amostra para um 0.1 milímetros física homogeneização do tubo (ver Tabela de materiais).
    3. Homogeneizar os tubos por 20 s no ajuste mais alto duas vezes, com pausa entre eles, usando um homogenizador físico 20 s (consulte a Tabela de materiais).
    4. Centrifuga os tubos homogeneizados a 3.000 x g por 5 minutos.
    5. Transferência de 300 μL do sobrenadante para um tubo limpo, de 1,7 mL e adicionar 500 μL de tampão CTAB ao tubo original.
    6. Homogeneizar o tubo novamente usando os métodos em etapas 4.3.2-4.3.3 e centrifugação a 3.000 x g por 5 min.
    7. Após a centrifugação, transferi outro 300 μL do sobrenadante no tubo novo, que agora contém 600 μL.
    8. Adicione um total de 600 álcool de clorofórmio-isoamílico μL para o tubo contendo 600 μL do sobrenadante.
    9. Inverta os tubos para misturar e centrifugar brevemente. Transferi 500 μL da fase superior para um tubo limpo 1,7 mL. Certifique-se apenas para a fase superior.
    10. Em seguida, adicionar 1000 μL de solução de Peg-6000, inverter os tubos para misturar e então incubar a temperatura ambiente por 2 h.
    11. Após a incubação, centrifuga os tubos a 18.200 x g, 4 ° C, durante 10 minutos.
    12. Desprezar o sobrenadante e limpar a pelota com gelo frio 70% de etanol.
    13. Centrifuga os tubos novamente a 18.200 x g, 4 ° C, por 10 min. descartar o sobrenadante e permitir a pelota secar no gabinete biossegurança sob fluxo laminar.
    14. Após a pelota é seca, adicione 75 µ l de RNAse livre, livre de DNAse, água estéril para cada tubo.
    15. Quantificar o DNA de ressuspensão por um espectrofotômetro e então enviá-lo para o sequenciamento de gene 16S rRNA.

5. curta cadeia de ácidos gordos (CCPA) deteção e da análise

  1. Descongelar as amostras congeladas a 40° C por 30 min e extrato de ácidos graxos de cadeia curta usando éter etílico na proporção de 2:1 (v: v).
  2. Transferir a fase orgânica para uma GC/MS (ver Tabela de materiais), equipada com uma coluna, 30 m, 0.25 mm ID, 0,25 µm, (ver Tabela de materiais) onde 10 µ l é injetado.
  3. Defina a temperatura de Porto de injeção e temperatura inicial da coluna a 260 ° C e 125 ° C respectivamente. Mantenha a temperatura inicial por 1 min e então este aumento para 250 ° C, mais 11,5 min com uma taxa de fluxo de coluna de 1 mL/min.
    Nota: A temperatura de MS para a fonte de íon é 220° C e 250° C para a interface.
  4. Quantificar a quantidade de cada CCPA usando curvas padrão e ácido 2-methylhexanoic como padrão interno.

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Representative Results

O protocolo acima descreve o conjunto acima, inoculação e execução de um sistema in vitro de 5 estágios para estudar o intestino microbiota do cólon. Para gerar os dados apresentados a seguir, após a extração de DNA, sequenciamento de DNA de gene 16S rRNA marcador da região V1V2 foi realizado utilizando a taxa de transferência alta sequenciamento (por exemplo,, MiSeq Illumina plataforma) pelo centro Microbiome no Hospital infantil de Philadelphia,27. QIIME (visão quantitativa sobre ecologia microbiana) versão 1.928 foi usado para processar os dados de sequenciamento e análise estatística foi realizada no ambiente R para computação estatística29. Atribuições taxonômicas foram geradas usando o banco de dados de referência do Greengenes 16S30,31. Valores de abundância relativa de OTU foram calculados dividindo que o OTU ler a contagem pelo número total de leituras na amostra. Níveis de CCPA foram quantificados usando o protocolo descrito.

O em vitro comunidades de alcançar um estado constante de equilíbrio

A capacidade de estudar a microbiota do intestino e cadeia curta de ácidos gordos (CCPA) produção em vitro com um sistema de múltiplos estágio requer que as comunidades microbianas atingem um estado estável. Isso ocorre após a inoculação, quando os táxons se estabeleceram em seus nichos, e a composição da Comunidade e dos seus metabolitos já não estão flutuando. Em um estado estacionário, a Comunidade e os seus produtos permanecem os mesmos ao longo do tempo. Estudos in vitro intestino microbiota, estabilidade é um requisito-chave; sem estabilidade, é impossível determinar se ou não as mudanças observadas estão ocorrendo devido as condições experimentais, ou se eles são devido à variação. De acordo com o que tem sido proposto na literatura, uma comunidade pode ser considerada estável quando há 80% de similaridade entre tempo pontos32.

Usando os resultados do sequenciamento de gene 16S rRNA marcador, parcelas de análise de coordenadas principais (PCoA) com base em distâncias de UniFrac não ponderadas e ponderadas foram geradas para as comunidades que se desenvolveram em cada região do sistema ao longo do tempo (Figura 2). Não ponderada análise compara as comunidades em termos de presença/ausência de espécies. A análise ponderada compara-los com base não apenas sobre a presença ou ausência de espécies, mas também considera sua abundância. Para 1 unidade, isto incluiu ambas as fases luminal e da mucosa e para a unidade 2 apenas a fase luminal. Com base nesta análise, observou-se que a Comunidade mudou sensivelmente entre os dias 1 e 7. No entanto, devido a inoculação de post dia 11 até o final do experimento, as amostras ocuparam uma pequena região do espaço PCoA. Isto era verdade para os escores de amostra-sample distância baseadas na OTU presença-ausência (Figura 2A) ou na abundância OTU (Figura 2B). Assim, observou-se que, depois de 11 dias, a abundância e os tipos de bactérias foram estáveis do ponto de uma amostra para a próxima. Este padrão foi observado por ambas as fases luminal e mucosas de todas as regiões do cólon três da unidade 1 e a fase luminal da unidade 2. Estes resultados ilustrados que ambas as fases luminal e mucosas alcancem estabilidade e que isto ocorreu ao mesmo tempo.

A estabilidade do sistema também foi sondada, analisando a produção de ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs) ao longo do tempo. As três mais proeminentes SCFAs (ácido propiônico, ácido butanoico e ácido acético)38 foram medidos em cada amostra ao longo do experimento usando cromatografia gasosa GC/MS. Essas medições revelaram que o ácido propiônico, ácido butanoico e ácido acético flutuaram desde o início do experimento até a inoculação de post do dia 15 (Figura 3A-C). Após o dia 15, os montantes destes SCFAs produziram em cada região do cólon permanecido constante, com apenas mínimas alterações ocorrem até o final do experimento (Figura 3A-C). A diferença entre pontos de tempo foi uma média de 6,8% para o ácido propiônico, 7,2% de ácido acético e 8.02% para o ácido butanoico. Isto sugere que semelhante para a composição da Comunidade, as propriedades metabólicas da Comunidade entraram em um estado estacionário, conforme indicado pela produção de quantidades estáveis de SCFAs ao longo do tempo. Tanto a unidade 1 e unidade 2 produziram quantidades semelhantes de SCFAs, sem diferenças significativas entre os dois (p > 0,05). Isto indica que a produção de SCFAs não foi afetada pela presença ou ausência da Comunidade da mucosa. Note-se que o ponto de estabilidade determinada neste experimento é semelhante ao relatado anteriormente, no qual afirmava-se que a estabilização da Comunidade num sistema in vitro de 5 estágios ocorreu aproximadamente 2 semanas pós inoculação33, 34,35.

As comunidades desenvolveram na em vitro sistema são semelhantes do inóculo

O segundo necessário elemento para um experimento de microbiota do intestino in-vitro é que a Comunidade desenvolvida-se no modelo preserva a diversidade microbiana do inóculo fecal. Desde que o sistema utilizado neste experimento fornece para três regiões distintas do cólon não pode presumir-se que qualquer uma região ser exatamente o mesmo como o inóculo fecal. No entanto, espera-se que os membros de cada comunidade são derivados de inóculo fecal e todos juntos, manter um nível similar de diversidade como inóculo.

Com base nos resultados do sequenciamento de gene 16S rRNA marcador, a Comunidade estável, média para fase luminal e da mucosa de cada região do cólon foi determinado (dias 15-28 post inoculação) e comparado à comunidade do inóculo fecal (Figura 4A). Estes resultados demonstram que as comunidades que se desenvolveu nas regiões do cólon individuais do sistema in vitro foram semelhantes para o inóculo fecal na composição. As duas ordens mais proeminentes no reator, Clostridiales e Bacteroidales, comparados com aqueles observados com o inóculo. No entanto, várias ordens de bacterianas baixa abundância nas regiões do cólon eram diferentes do inóculo, com as diferenças mais importantes entre as ordens Burkholderiales e Synergistales (Figura 4A).

A diversidade alfa para sistema in vitro foi comparada com o inóculo, como outra medida da estrutura da Comunidade após a estabilização. O índice de Shannon, calculado para cada região ao longo do tempo, atingiu um nível similar de diversidade como inóculo para todas as regiões, exceto para amostras luminal da região ascendente (Figura 4B). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que o sistema de cultura in vitro foi capaz de produzir uma comunidade comparável ao inóculo fecal, tanto em termos de composição e diversidade (Figura 4A-B).

Usando um em vitro sistema permite o desenvolvimento da região e as comunidades específicas de fase

As regiões do cólon três representadas neste sistema são mantidas em valores de pH diferentes e recebem diferentes fontes de nutrientes. (Isto foi mencionado na seção de protocolo). Com base nisso, espera-se que as comunidades nestas regiões irão diferenciar 33. As comunidades de luminal estáveis (dias 15-28) em unidade 1 e unidade 2 foram determinadas a nível familiar e plotadas de acordo com a abundância relativa (Figura 5). A divergência entre as regiões do cólon três em termos de abundância de táxons específicos, demonstra que cada região desenvolve-se uma comunidade única. Isto também é suportado pelos resultados da Figura 2 e Figura 4A. Na Figura 2, as comunidades maduras que se desenvolveram em cada região cluster em diferentes locais no quadro PCoA. Na Figura 4A, as comunidades em cada região do cólon diferiam nas percentagens dos membros da ordem dominante.

Para este experimento, unidade 1 foi fornecido com as transportadoras da mucosa, enquanto unidade 2 tinha não portadores de mucina. Baseado neste projeto experimental, poderá examinar a contribuição da superfície da mucosa. Para fins de comparação, as comunidades estáveis do luminal e da mucosa (dias 15-28) para 1 unidade, a nível familiar, foram plotadas juntos de acordo com a abundância relativa (Figura 6). É claro que a composição das comunidades da mucosa e luminal para todos os três pontos diferentes na abundância de alguns táxons, sendo o mais proeminente, Lachnospiraceae e Bacteroidaceae. Estes resultados demonstram também que as comunidades da mucosa nas três regiões são diferentes uns dos outros. Por exemplo, Clostridiaceae é enriquecido nas comunidades das regiões descendentes e transversais da mucosa, e Veillonellaceae é mais elevada na fase da mucosa do cólon ascendente, mas não na transversal ou decrescente regiões do cólon. Tomados em conjunto, os resultados apresentados estes números mostram que há uma clara diferença entre as comunidades em cada fase e cada região para alguns táxons, ilustrando que a composição entre as regiões é semelhante e que há uma diferença em abundância.

Embora a análise de sequenciação de ADN revela o desenvolvimento de uma comunidade de regiões específicas, não há nenhuma diferença aparente na produção de SCFAs entre as regiões. A taxa média de ácido acético: ácido propiônico: ácido butanoico, para a Comunidade estável (dia 15-28) foi calculado para cada região (Figura 7A). Enquanto os rácios do CCPA diferente permaneceram bastante semelhantes, há um aumento dos montantes totais de SCFAs produzidas entre as regiões ascendentes, transversais e descendentes, com os mais altos níveis encontrados na região descendente (Figura 7B). Isto era verdade para unidade 1 e unidade 2.

Figure 1
Figura 1: ilustração do estágio 5, in vitro experimental design. O sistema completo consiste dos seguintes componentes: uma circulação de água banho, fluxo de nitrogênio, um conjunto de biorreatores de vidro, um conjunto de barras de agitador magnético e Agitadores magnéticos, sondas de pH, um console controlado por computador contendo 40 bombas peristálticas, um monitor de computador e um frigorífico. O sistema principal é composto de um conjunto de biorreatores imitando o estômago, intestino delgado e as regiões de cólon ascendente, transverso e descendente. Duas unidades completas são configuradas para executar em paralelo, fornecendo para um experimental e um grupo de controle. Isso significa que 10 biorreatores, 10 sondas de pH e 10 Agitadores magnéticos são necessários para este experimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: A Comunidade in-vitro estabiliza por inoculação de post do dia 11. Análise de PCoA baseado em distâncias Unweighted (A) e (B) ponderada Unifrac para a fase luminal e da mucosa de cada região ao longo do tempo para 1 unidade e para a fase luminal da unidade 2. O enredo é lapidado em componentes após o cálculo dos eixos de PCoA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: A produção de SCFAs pelo sistema in vitro estabilizar por inoculação de post do dia 15. Medições de ácido propiônico, ácido butanoico e ácido acético ao longo do tempo para o cólon de transversal Ascending (A) do cólon (B) e (C) descendente do cólon. O experimento foi realizado em triplicata. Os resultados representam uma média de três medições independentes, com barras de erro retratando o desvio-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: comparação das comunidades estáveis do sistema in vitro para o inóculo fecal. Comunidades de (A), estábulo (D15-28), a nível de ordem foram em média e formatadas em gráficos de pizza para a fase da mucosa e luminal de cada região do cólon e para o inóculo fecal. (B) a Shannon diversidade para a fase da mucosa e luminal de cada região do cólon em comparação com o inóculo fecal (tracejado preto). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: fase luminal e mucoso em cada região do cólon promover o crescimento das comunidades distintas. A abundância relativa média, a nível familiar, para as comunidades estáveis (D15-28) para a fase de luminal e da mucosa e o inóculo, foram calculados e plotados juntos para cada região do cólon. Barras de erro representam o desvio-padrão entre momentos. AC1 = ascendente cólon unidade 1; TC1 = 1 de unidade de cólon transverso; DC1 = decrescente 1 unidade de cólon; AC2 = ascendente cólon unidade 2; Tc2 = 2 de unidade de cólon transverso; DC2 = decrescente cólon unidade 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: cada região de cólon do sistema in vitro desenvolve uma comunidade única. A abundância relativa média, a nível familiar, para as comunidades estáveis (D15-28) em cada região do cólon e o inóculo fecal, foram calculados e plotados juntos. O experimento foi realizado em triplicata. Os resultados representam uma média de três medições independentes, com barras de erro retratando o desvio-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: A proporção de ácido acético: ácido propiônico: ácido butanoico é semelhante para cada região do cólon. (A) as quantidades de ácido acético, ácido propiônico e ácido butanoico para as comunidades estáveis (D15-28) de cada região do cólon foram calculadas e convertidas em uma relação. (B) os rácios foram plotados como porcentagens para cada região do cólon. Barras de erro representam o desvio-padrão entre momentos. AC1 = ascendente cólon unidade 1; TC1 = 1 de unidade de cólon transverso; DC1 = decrescente 1 unidade de cólon; AC2 = ascendente cólon unidade 2; Tc2 = 2 de unidade de cólon transverso; DC2 = decrescente cólon unidade 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Sistemas de cultivo in vitro foram desenvolvidos para estudar a microbiota do intestino do intestino grosso. Eles usam aparelhos projetados para simular as condições fisiológicas do tracto gastro intestinal, promovendo o crescimento de uma comunidade microbiana do intestino maduro para cada região do cólon33. Enquanto o conceito é lógico e compreensível, o funcionamento real dos sistemas de cultivo in vitro para o estudo da microbiota do intestino exige precisão e uma compreensão do que é exigido e esperado para produzir resultados fiáveis.

Os elementos necessários para uma experiência de microbiota do intestino in vitro são que a Comunidade deve atingir a estabilidade após a inoculação e que ele deve manter a diversidade microbiana do inóculo fecal. Se o experimento for executado corretamente, estes dois elementos necessários são alcançados facilmente e previsível. Passos críticos no protocolo que irá afectar a estabilidade do sistema e diversidade são os seguintes: A preparação do meio definido e suco pancreático deve ser exactos, e entrega destes substratos deve ser consistente. Condições anaeróbias devem ser mantidas durante o experimento. O pH de cada região intestinal deve ser mantido com precisão ao longo do tempo. Alterações nestes três parâmetros durante o experimento podem resultar em flutuações de população e produção de metabólito variável.

Usar este tipo de sistema in vitro de vários estágio tem várias vantagens. Notavelmente, eles simulam as diferentes regiões do cólon. Eles também podem ser projetados para simular a digestão in vitro dos alimentos na GIT superior, incluindo os componentes enzimáticos da saliva e a adição de pancreatina e bile. Uma fase da mucosa pode ser incorporada em cada reator de dois pontos, adicionando ainda mais complexidade8. Isso resulta no desenvolvimento da região e as comunidades microbianas específicas fase que podem ser analisadas e comparadas individualmente. Estes tipos de sistemas podem ser manipulados facilmente, dependendo do delineamento experimental através da reconfiguração física, alterações dos parâmetros fisiológicos como pH, temperatura ou tempo de trânsito, ou inoculação com específicos fecal samples26 . Importante, pesquisa demonstrou que as comunidades desenvolvidas nestes sistemas in vitro representam o intestino comunidade microbiana11,26,34.

Embora o uso de vários estágios de sistemas in vitro pode ser usado para estudar mecanicamente a microbiota do intestino, eles têm limitações. Em primeiro lugar, enquanto as condições fisiológicas são programáveis, são reparados usando valores médios específicos, representando assim a pessoa média. Esta é uma simplificação, uma vez que existe considerável inter-individual variatiability12,23. Em segundo lugar, embora a falta de componentes dos mamíferos é uma razão para usar um sistema in vitro, também deve-se considerar uma limitação. A falta de certos componentes de mamíferos, como o sistema imunológico, pode resultar em diferenças entre o modelo in vitro e a correspondente microambiente vivo em12,23. No entanto, estas limitações não retira o valor e percepção que pode ser adquirida a partir usando sistemas in vitro para estudar mecanicamente a microbiota do intestino. Finalmente, as culturas são cultivadas em biorreatores de vidro com a não absorção de água ou metabólitos. Esta é uma diferença importante, e o efeito pode ser visto na medição de SCFAs onde as quantidades totais de SCFAs estão aumentando desde o ascendente de transversal para decrescente regiões do cólon (Figura 7). Isto é o oposto do que é observado na vivo, , onde as concentrações mais elevadas de SCFAs encontram-se proximalmente, na região ascendente, e as menores concentrações encontraram distalmente36. No entanto, quando a produção líquida de SCFAs é considerada para cada região, então que seja determinado que a maioria dos produção de CCPA está ocorrendo no cólon ascendente. Deve também ser mencionado aqui que a carga bacteriana não foi medida neste experimento. Diferenças na carga bacteriana entre as regiões neste sistema podem ter um efeito sobre o montante global de SCFAs produzidos.

Em conclusão, é sabido que a microbiota do intestino desempenha um papel na saúde e na doença, e considera-se a funcionar como um mediador entre dieta e saúde metabólica37,38. Aqui, discutiu-se a aplicação de um sistema in vitro para o estudo da microbiota do intestino, e foram apresentados os resultados de um experimento demonstrando o desenvolvimento de uma comunidade estável. Um in vitro sistema tem muitas vantagens e promove o desenvolvimento de uma comunidade complexa e dinâmica, que é ilustrado no experimento descrito. Este tipo de sistema é melhor usado para estudar as interações e as mudanças no interior da comunidade de microbiota do intestino em resposta a factores externos, tais como componentes de alimentos e medicamentos. Os resultados destes estudos in-vitro podem então ser complementados com estudos in vivo, a ganhar uma compreensão profunda da função e contribuição da microbiota do intestino para a saúde e doença.

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Disclosures

Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes. Menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é exclusivamente com o propósito de fornecer informações específicas e não implica em recomendação ou endosso pelo departamento E.U. da agricultura. USDA é um provedor de igualdade de oportunidades e o empregador.

Acknowledgments

Sra. Audrey Thomas-Gahring é reconhecido por seus GC/MS de trabalho. Gostaríamos também de agradecer Massimo Marzorati para editar o manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TWINSHIME Prodigest NA
Defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch) Prodigest NA
Masterflex tubing cole Parmer NA
Urine Drainage bag Bard NA
Labsorb Sigma-Aldrich NA
Fecal sample Openbiome NA
Syringes Becton Dickson NA
Defined medium Prodigest NA
Oxgall Bile Becton Dickson NA
Pancreatin Sigma-Aldrich NA
Glass ware Ace Glass NA
Porcine mucin Sigma-Aldrich NA
Bacteriological agar Sigma-Aldrich NA
Sterilization pouches VWR NA
BeadBug Benchmark Scientific NA
Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1 mm Bead beater tube Benchmark Scientific NA
RNAse free, DNAse free, sterile water Roche NA
Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS Shimadzu NA
Stabilwax-DA column, 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 µm Restek NA
plastic mucin carriers Prodigest NA

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References

  1. Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).
  2. Xu, J., Gordon, J. Honor thy symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).
  3. Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. Role of the normal gut microbiota. World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).
  4. Macfarlane, G., Macfarlane, S. Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).
  5. McDonald, J., et al. Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).
  6. Van den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model. NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016 (2016).
  7. Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept. FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).
  8. Van den Abbeele, P., et al. Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli. Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).
  9. Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. Gut microbiome-host interactions in health and disease. Genome Medicine. 3 (3), 14 (2011).
  10. Wissenbach, D., et al. Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems. International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).
  11. McDonald, J., et al. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).
  12. Venema, K., van den Abbeele, P. Experimental models of the gut microbiome. Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).
  13. Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology. Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).
  14. Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides. Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).
  15. Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota. Zebrafish. 00 (00), (2017).
  16. Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats. Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).
  17. Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
  18. Hale, V., et al. Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species. Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).
  19. Lu, D., et al. Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth. Microbiome. 6 (1), 4 (2018).
  20. Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling. Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).
  21. Muegge, B., et al. Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans. Science. 332 (6032), 970-974 (2011).
  22. Santiago-Rodriguez, T., et al. Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces. Microbiome. 9 (3), 58 (2015).
  23. Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).
  24. Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract. Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).
  25. Cueva, C., et al. In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites. FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).
  26. Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem. Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).
  27. Wang, M., et al. Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus. Molecules. 22 (8), (2017).
  28. Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  29. Edgar, R. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
  30. Cole, J., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).
  31. McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).
  32. Liu, L. S., et al. Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator. PLoS ONE. 13 (7), e0197692 (2018).
  33. Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M. Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME ®). The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health. Verhoeckx, K., et al. , Springer Link. (2015).
  34. Van den Abbeele, P., et al. Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model. The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).
  35. Possemiers, S., Verthé, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem. FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).
  36. Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. The role of short-chain fatty acids in health and disease. Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).
  37. Yang, J., Kweon, M. The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases. BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).
  38. Sonnenburg, J., Bäckhed, F. Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism. Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).

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Firrman, J., Liu, L., Van den Abbeele, P., Tanes, C., Bittinger, K., Tomasula, P. Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota. J. Vis. Exp. (144), e59054, doi:10.3791/59054 (2019).

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