Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

تجميع المكوكات الجزيئية مدعوم بشكل قابل للعكس يعلق كينيسينس

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/59068
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University
* These authors contributed equally

Summary

نقدم بروتوكول لبناء المكوكات الجزيئية، حيث دفع البروتينات موتور kinesin التقيد سطح الصبغ المسمى microtubules. التفاعلات الضعيفة من كينيسينس مع السطح تمكن تمسكهم عكسها له. وهذا يخلق نظام النانو الذي يسلك الجمعية دينامية، وتفكيك عناصره، مع احتفاظها بوظيفتها.

Abstract

هذا البروتوكول يصف كيفية إنشاء مدعوم kinesin المكوكات الجزيئية مع مرفق ضعيفة وعكسها كينيسينس على السطح. على النقيض من البروتوكولات السابقة، في هذا النظام، microtubules توظيف البروتينات kinesin موتور من الحل ووضعها على سطح. بدوره، سيسهل كينيسينس التزلق ميكروتوبوليس على طول السطح قبل المعزولة إلى حل الجزء الأكبر، وهكذا يجري المتاحة لتوظيف مرة أخرى. هذه الجمعية المستمر والتفكيك يؤدي إلى ضرب السلوك الديناميكي في النظام، مثل تشكيل مسارات kinesin مؤقتة مزلق microtubules.

سيتم وصف عدة طرق تجريبية في جميع أنحاء هذه التجربة: ستستخدم كانت الأشعة فوق البنفسجية بالنسبة لتحديد تركيز الحلول المخزون من المواد الكاشفة، كوفيرسليبس ستكون أولاً الأوزون والأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) معاملة ومن ثم سيلانيزيد قبل يجري تركيبة في تدفق الخلايا، والأسفار التأمل الداخلي الإجمالي ستستخدم مجهرية (TIRF) للصورة في نفس الوقت kinesin موتورز وخيوط ميكروتوبولي.

Introduction

التفاعلات تنظم سلوك نانوسيستيمس نشطة اتسمت دائماً بسندات طويلة الأمد، ولا رجعة فيه نحو1،2،3،،من45،6 ،،من78. مثال مدروسة لهذا هو نظام microtubule kinesin، حيث دفعت microtubules التزلق kinesin سطح زمنياً لا رجعة فيه للسيارات1،2،3،4، 5. النظم التي ترتبط المكونات عكسية لأحد آخر قد تم دراستها نظرياً9،10 وحققت في11،ماكروسكالي12، ولكن القياس هذه النظم وصولاً إلى وقد النانوي تحديا. واحد من الأسباب الرئيسية لذلك هو أن كسر وإصلاح الروابط بين المكونات غالباً ما يتطلب إجراء تغيير كبير في الظروف البيئية. على الرغم من أن هذه التغييرات قد نفذت في الماضي14،،من1315، أنها سوف تعتمد على تعديل النظام نفسه بدلاً من أن يتكيف مع بيئته. تصميم أنظمة الحجم الجزيئي فيها المكونات باستمرار تجميع وإعادة تنظيم الهياكل دون الإخلال بالبيئة العامة التي تجري فيها التجارب سوف تفتح الباب لاستكشاف مجموعة واسعة من السلوكيات الحيوية 16 , 17.

وهنا، يمكننا وصف وإثبات البروتوكول مفصلاً لإنشاء شكل حيوي تجميع وتفكيك نظام يعمل على النانو. وكان النظام وسلوكه العام سابق أدخل18: خيوط microtubule هي تدفعها إلى مسارات عكسية سطح زمنياً kinesin-1 المحركات. هذه البروتينات موتور kinesin يعينون من الحل للمساعدة في دفع ميكروتوبوليس إلى الأمام، قبل المعزولة بعد ذلك مرة أخرى بعد قليل. مرة واحدة مرة أخرى في الحل، يمكن أن يكون تعيينهم مرة أخرى لدفع من ميكروتوبولي جديدة. في13،الماضية14،15وكسر وإصلاح للسندات المطلوبة التعديلات البيئية؛ وفي المقابل، البيئة لدينا خلية تدفق يتغير بينما المحركات kinesin تتفاعل مع السطح.

وسيساعد هذا البروتوكول الباحثين المهتمين (1) تصور جميع الخطوات للبروتوكول، و (2) المساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها هذا النوع من التحليل. أنها استمدت من الإجراءات الوارد وصفها في هوارد et al. 199319.

Protocol

1-حل إعداد

تنبيه: ثلاثة من الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول (التولوين وديميثيلديتشلوروسيلاني وديثيوثريتول) عالية السمية. الرجاء مراجعة كشوف بيانات السلامة المادية ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. وعلاوة على ذلك، تحتاج أجزاء من هذا البروتوكول يمكن أداؤها بموجب مستوى أعلى من الحماية، وارتداء نظارات السلامة ومجموعتين من قفازات واقية كما هو مبين. إلا إذا نصح خلاف ذلك، يمكن إجراء التجارب على منضدة المختبر أثناء استخدام جميع المناسبة معدات الوقاية الشخصية (سلامة النظارات والقفازات ومعطف مختبر، وكامل طول السراويل وأحذية أغلقت تو).

ملاحظة: يمكن تعديل تركيزات ATP، kinesin، وميكروتوبوليس المستخدمة في هذا البروتوكول نظراً لاحتياجات كل تجربة. ومع ذلك، إذا عدلت، الرجاء التأكد من أن تركيزات نهائية من الكواشف الأخرى لا تزال هي نفسها كمعطى أدناه. أجريت جميع التجارب في درجة حرارة الغرفة، (~ 25 درجة مئوية).

  1. إعداد الحلول الأسهم
    ملاحظة: إعداد والكوة الحلول التالية مسبقاً. يمكن إعداد جميع مختبرين في درجة حرارة الغرفة (~ 25 درجة مئوية).
    1. المخزن المؤقت BRB80
      ملاحظة: المخزن المؤقت لمعظم الحلول المستخدمة في هذا البروتوكول هو BRB80. BRB80 يمكن إعدادها بكميات كبيرة وتخزينها في ثلاجة-20 درجة مئوية.
      1. حل ز 24.2 الببرازين-N، N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (أنابيب) وز 3.1 من هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) في 800 مل في المياه. جعل 800 مل أنابيب 100 مم. إضافة 100 مل من كلوريد الماغنسيوم 10 ملم (MgCl2) و 100 مل من حمض tetraacetic جليكول 10 ملم (اجتا) للحصول على وحدة تخزين نهائي من 1 ل. رفع درجة الحموضة إلى 8 مع هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) يمكن أن تساعد في الحل من الأنابيب واجتا.
        ملاحظة: هي تركيزات المواد الكيميائية في المخزن المؤقت BRB80 النهائي أنابيب 80 مم، 1 MgCl2، و 1 ملم عطا.
      2. ضبط الأس الهيدروجيني للمخزن المؤقت إلى 6.9 استخدام كوه، وحمض الهيدروكلوريك (HCl).
    2. ATP
      1. تعد حلاً 1 مل من 100 ملم ATP في الماء عالي النقاوة. بيبيت الحل إلى 10 ميكروليتر مختبرين. تخزين في مختبرين في ثلاجة-80 درجة مئوية.
    3. أنشئ
      1. تعد حلاً ميكروليتر 500 25 مم أنشئ في الماء عالي النقاوة. بيبيت الحل إلى 5 ميكروليتر مختبرين. تخزين في مختبرين في ثلاجة-80 درجة مئوية.
    4. مجكل2
      1. تعد حلاً 1 مل من 100 مم مجكل2 في الماء عالي النقاوة. بيبيت الحل إلى 10 ميكروليتر مختبرين. تخزين في مختبرين في ثلاجة-20 درجة مئوية.
    5. الكازين
      1. تزن 1 ز الكازين الجافة ونقلها إلى أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي. أضف 35 مل من BRB80 المخزن المؤقت إلى أنبوب لإذابة مسحوق الكازين.
      2. ضع الحل في بهلوان في غرفة باردة إلى أن يحل بين ليلة وضحاها. عند هذه النقطة، سوف ننظر الحل سميك ولزج.
      3. اترك الأنبوب تستقيم في ثلاجة 4 درجة مئوية للسماح لأي كتل أونديسولفيد كبيرة لتسوية. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد.
      4. تدور الأنبوب في أجهزة الطرد مركزي في 1,000 س ز بيليه برواسب أكثر. مرة أخرى، نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد.
      5. مرارا وتكرارا تصفية الحل باستخدام 0.2 ميكرومتر (7 بار أقصى ضغط) مرشحات. الحل يجري سميكة، العديد من مرشحات سيتم الحصول على انسداد، حتى كرر هذه الخطوة حتى يتم التصفية واضحة وأونكلوجيد.
      6. تحديد تركيز الكازين في الحل الناتجة باستخدام الأشعة فوق البنفسجية/فيما كانت، باستخدام معامل الانقراض في الكازين من 19 مم-1∙cm-1 في 280 nm20. وبافتراض وزن الجزيئي من 23 كاتشين الكازين، تمييع الحل لتركيز 20 mg∙mL-1 في BRB80.
      7. بيبيت الحل إلى 20 ميكروليتر مختبرين وتخزينها في مختبرين في ثلاجة-20 درجة مئوية.
    6. د-الجلوكوز
      1. تعد حلاً 1 مل 2 م د-الجلوكوز في الماء عالي النقاوة. بيبيت الحل إلى 10 ميكروليتر مختبرين. تخزين في مختبرين في ثلاجة-20 درجة مئوية.
    7. أوكسيديز الجلوكوز
      1. تعد حلاً 1 مل من mg∙mL 20-1 الجلوكوز أوكسيديز في BRB80. بيبيت الحل إلى 10 ميكروليتر مختبرين. تخزين في مختبرين في ثلاجة-20 درجة مئوية.
    8. الكاتلاز
      1. تعد حلاً 1 مل من mg∙mL 0.8-1 كاتالاز في BRB80. بيبيت الحل إلى 10 ميكروليتر مختبرين. تخزين في مختبرين في ثلاجة-20 درجة مئوية.
    9. ديثيوثريتول (DTT)
      ملاحظة: منذ DTT قليلاً متقلبة والسامة، الرجاء تنفيذ الخطوات التالية تحت غطاء دخان.
      1. تعد حلاً 1 مل 1 م DTT المخفف في الماء عالي النقاوة. بيبيت الحل إلى 10 ميكروليتر مختبرين. تخزين في مختبرين في ثلاجة-20 درجة مئوية.
    10. باكليتاكسيل
      1. تعد حلاً 1 مل من باكليتاكسيل 1 مم المخفف في [دمس]. بيبيت الحل إلى 10 ميكروليتر مختبرين. تخزين في مختبرين في ثلاجة-20 درجة مئوية.
    11. ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])
      ملاحظة: [دمس] المستخدمة في هذه التجارب محض.
      1. بيبيت 1 مل من محض [دمس] إلى 10 ميكروليتر مختبرين. تخزين في مختبرين في ثلاجة-20 درجة مئوية.
    12. فوسفات الكرياتين
      1. تعد حلاً 1 مل من فوسفات الكرياتين 0.2 متر في الماء عالي النقاوة. بيبيت الحل إلى 10 ميكروليتر مختبرين. تخزين في مختبرين في ثلاجة-20 درجة مئوية.
    13. Creatine phosphokinase
      1. تعد حلاً 1 مل من 200 units· لام-1 phosphokinase الكرياتين في ماء عالي النقاوة. بيبيت الحل إلى 10 ميكروليتر مختبرين. تخزين في مختبرين في ثلاجة-20 درجة مئوية.
    14. كبريتات النيكل (II)
      1. إعداد 500 مل حل كبريتات النيكل (II) 50 مم في الماء عالي النقاوة. تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة (~ 25 درجة مئوية).
    15. الحل Poly(ethylene glycol)-كتلة-poly(propylene glycol)-كتلة-poly(ethylene glycol) (شماعة-PPG--الربط)
      1. تزن من 2 مغ من شماعة-PPG-شماعة (عدد متوسط الوزن الجزيئي: 14,600 g∙mol-1)-مسحوق جاتا على وزن الورق. شماعة-PPG-شماعة-الإدارة الوطنية للسياحة هو كوبوليمر تريبلوك فونكتيوناليزيد مع مجموعة (NTA) حمض نيتروتراياكتيك. الرجوع إلى الجدول للمواد لمزيد من التفاصيل حول الوتد-PPG-شماعة-جاتا.
      2. نقل المسحوق في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. إضافة 1 مل الحل كبريتات النيكل (II) الأسهم إلى الأنبوب. وتظل دوامة حتى يذوب مسحوق ولا كتل مرئية.
      3. مخزن لمدة تصل إلى شهر واحد في درجة حرارة الغرفة.
  2. قبل البدء التجربة
    1. ملء دلو مع الجليد.
    2. تأخذ قاسمة واحد من كل من الكواشف 13 الموضحة في المقاطع 1.1.1 إلى 1-1-13 أعلاه وإضافتها إلى الدلو، ثم الحفاظ عليها على الجليد. ذوبان الجليد كل من الكواشف قبل الاستخدام.
  3. إعداد ميكروتوبولي
    ملاحظة: تم بلمرة Microtubules من قاسمة 20 ميكروغرام لصبغ المسمى tubulin المجففة بالتبريد. الطول الموجي الإثارة للصبغ من 647 شمال البحر الأبيض المتوسط.
    1. إعداد المخزن المؤقت النمو ميكروتوبولي
      1. بيبيت 21.8 أنبوب ميكروليتر من المخزن المؤقت BRB80 ميكروسينتريفوجي صغيرة (0.6 مل). إضافة ميكروليتر 1 MgCl2 الحل الأسهم وميكروليتر 1 الحل الأسهم غتب ميكروليتر 1.2 الحل الأسهم [دمس].
        ملاحظة: وهكذا تركيزات الكواشف في المخزن المؤقت BRB80 النهائية هي 4 مم مجكل2و 1 مم غتب 5% (v/v) ثنائي ميثيل سلفوكسيد.
    2. ميكروتوبولي بلمرة
      1. إضافة ميكروليتر 6.25 microtubule النمو المخزن المؤقت مباشرة في قاسمة 20 ميكروغرام من المسمى توبولين المجففة بالتبريد. دوامة قاسمة ل 5 s في 30 rps.
      2. تبرد قاسمة على الجليد لمدة 5 دقائق قبل أن تفرخ في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة وانتقل إلى الفرع 1.3.3.
    3. الاستقرار ميكروتوبولي
      1. إضافة 5 ميكروليتر من الحل باكليتاكسيل الكوتيد إلى 490 ميكروليتر من BRB80 المخزن المؤقت. دوامة الحل ل 10 ق في 30 rps.
      2. بعد 45 دقيقة الحضانة ميكروتوبوليس الأعلى، إضافة 5 ميكروليتر microtubule مبلمرة الحل إلى الحل BRB80/باكليتاكسيل.
        ملاحظة: هذا الحل 100-fold ميكروتوبولي المخفف، واستقرت، وسوف يكون يشار MT100. يمكن استخدامه لمدة تصل إلى 5 أيام، وأنها يمكن أن تضعف للحصول على كثافة ميكروتوبولي المطلوب لكل تجربة.
  4. الحل حركية
    1. أنتيفادي الانزيمية وتجديد نظام ATP ATP
      1. إضافة ميكروليتر 9.0 الحل الكازين الكوتيد إلى 291 ميكروليتر من BRB80 المخزن المؤقت.
      2. إذا كان تركيز ATP المطلوب للتجربة أقل من 1 مم، ميكروليتر بيبيت 83 الحل BRB80/الكازين في أنبوب ميكروسينتريفوجي 0.6 مل جديدة. خلاف ذلك، ميكروليتر بيبيت 85 من هذا الحل في أنبوب ميكروسينتريفوجي 0.6 مل جديدة.
      3. إضافة ميكروليتر 1 د-الجلوكوز 1 ميكروليتر من الجلوكوز أوكسيديز، 1 ميكروليتر من كتالاز وميكروليتر 1 من القيمة لهذا الأنبوب.
        ملاحظة: هذه المواد الكيميائية تشكل الانزيمية حله كوكتيل أنتيفادي21 التي سوف تقلل من فوتوبليتشينج عن طريق إزالة الجذور رد الفعل الأوكسجين وتبريد. وهذا يقلل من التفكك فوتوبليتشينج وميكروتوبولي الناجم عن الإضاءة الإثارة أثناء الأسفار التصوير22,23.
      4. للتجارب التي تركز ATP يتم اختياره ليكون أقل بكثير من 1 مم، إضافة الكواشف التالية للحل إنشاء نظام لتجديد ATP: 1 ميكروليتر من الحل الكوتيد الكرياتين فوسفات و 1 ميكروليتر الكرياتين الكوتيد فوسفوكيناسي الحل.
      5. إضافة 1 ميكروليتر من الحل ATP المخزون إلى الحل حركية. فليك أو دوامة قاسمة لتوزيع المواد الكيميائية المتجانس.
        ملاحظة: وهكذا، تركيز المواد الكيميائية في الحل النهائي هي 10 ميكرومترات باكليتاكسيل، 0.5 الكازين mg·mL1 ، 20 ملم د-الجلوكوز، μg·mL 2001 الجلوكوز أوكسيديز، الكاتلاز1 μg·mL 8، 10 مم ديثيوثريتول، فوسفات الكرياتين 2 مم (إذا أضيف)، 2 units· L1 creatine phosphokinase (إذا أضيف)، و 1 مم ATP. هذا الحل سوف يكون يشار إلى الحل حركية.
    2. Kinesin
      ملاحظة: الحل kinesin الأوراق المالية المستخدمة في هذه التجارب هو أعده زاي باتشاند في المركز "تكنولوجيات النانو المتكاملة" في "مختبرات سانديا الوطنية" والتي أتيحت في إطار اتفاق لمستخدم (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php)-المخزن المؤقت المستخدم هنا يتكون من 40 مم ايميدازول، 300 مم كلوريد الصوديوم، 0.76 g· لام-1 عطا، 37.2 مغ · لام-1 يدتا، 50 g· لام-1 السكروز و 0.2 مم تسيب 50 ميكرومتر ملغ-ATP. واستخدمت لهذه السلسلة من التجارب، التركيب kinesin rkin430eGFP. هذا هو kinesin تتكون من الأحماض الأمينية أولاً 430 الفئران kinesin الثقيلة سلسلة تنصهر فيها اجفب وطرفيه ج صاحب علامة في المجال ذيل24. وأعرب في الإشريكيّة القولونية، وتنقيتها باستخدام عمود Ni−NTA. وكان تركيز بروتينات فلورية خضراء-kinesin الحل الأسهم 1.8 ± 0.3 ميكرومتر كما يحددها كانت الأشعة فوق البنفسجية/Vis، استخدام معامل انقراض للتجارة والنقل من 55 مم-1·cm-1 في شمال البحر الأبيض المتوسط 48925، وأخذا في الاعتبار أن kinesin ديمر.
      1. تحديد كثافة التركز أو سطح kinesin المطلوب للتجربة. لفحوصات نموذجية، وهذا التركيز هو 20 نانومتر. إذا كان تركيز kinesin يحتاج إلى إضعاف أكثر من تمييع هوندريدفولد، أنها في حل BRB80 التي تحتوي على 0.5 mg·mL-1 من الكازين.
      2. إضافة 1 ميليلتر من kinesin الحل إلى الحل حركية من أجل الحصول على تركيز نهائي من 20 أبروكسيماتيفيلي شمال البحر الأبيض المتوسط.
    3. ميكروتوبوليس
      1. إضافة 10 ميكروليتر MT100 الحل أعد في الفرع 1-3 في حل حركية.
        ملاحظة: يمكن استخدام هذا الحل حركية لمدة تصل إلى 3 ساعات. بعد ذلك الوقت، يفقد النظام أنتيفادي فعاليته نظراً لنفاد الجلوكوز في الحل برد الفعل الأنزيمي.

2-تجميع الخلايا تدفق

  1. الغسيل كوفيرسليبس
    1. لتدفق الخلايا، استخدم ساترة كبيرة (البعد: 60 مم × 25 مم) وواحدة صغيرة (الأبعاد: 22 مم × 22 مم)19.
    2. شطف جميع كوفيرسليبس مرتين مع الإيثانول ومرتين بالماء عالي النقاوة. Sonicate كوفيرسليبس في الماء عالي النقاوة للحد الأدنى 5 تجفيفها في فرن عند درجة حرارة من 50-75 درجة مئوية.
    3. استخدام الأشعة فوق البنفسجية/الأوزون نظافة (انظر الجدول للمواد وإرشادات الشركة المصنعة)، معالجة جانب واحد من كل ساترة لإجراء هذه الخطوة يمكن 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (~ 25 درجة مئوية) وفي حالة الغلاف الجوي العادي (الضغط 1 atm).
    4. تشغيل بعناية كل ساترة في الجانب الآخر (باستخدام الملقط) والأشعة فوق البنفسجية/الأوزون علاج هذا الجانب كذلك.
    5. Sonicate كوفيرسليبس في الماء عالي النقاوة مرة أخرى لمدة 5 دقائق قبل التجفيف لهم مرة أخرى في فرن عند درجة حرارة من 50-75 درجة مئوية.
  2. علاج كوفيرسليبس لتمكين طلاء شماعة-PPG-شماعة
    ملاحظة: في ديميثيلديتشلوروسيلاني والتولوين المستخدمة في هذا الجزء من البروتوكول يجري عالية السمية، نفذ الخطوات التالية تحت غطاء دخان، مع أخذ الاحتياطات التالية: ارتداء مجموعتين من قفازات واقية وقميص اكمام طويلة تحت مختبر معطف. شد حواف القفازات داخل اكمام قميص حيث أن الجلد لا من السواعد يتعرض مباشرة للمواد الكيميائية في حالة انسكاب. ارتداء نظارات واقية.
    1. تمييع 25 مل ديميثيلديتشلوروسيلاني نقية في 475 مل تولوين. تزج كل ساترة في الحل ديميثيلديتشلوروسيلاني والتولوين لمدة 15 ثانية.
    2. أغسل كوفيرسليبس في التولوين مرتين وثلاث مرات في الميثانول. جاف كوفيرسليبس استخدام النتروجين المضغوط.
  3. تجميع كوفيرسليبس في تدفق الخلايا
    1. بمجرد كوفيرسليبس الجافة، قطع 2 × 2.5 سم قطعة من الشريط على الوجهين رأسياً في المشارب اثنين 1 × 2.5 سم.
    2. وضع ساترة كبيرة ممسحة مهمة حساسة وعصا المشارب الشريط طوليا على طول حواف ساترة إنشاء مساحة 1 × 2.5 سم بين قطعة الشريط.
    3. عصا ساترة الصغيرة على رأس المشارب الشريط لإنهاء تدفق الخلايا الجمعية العامة.

3-الحلول التي تتدفق إلى خلية تدفق

  1. تدفق أبروكسيماتيفيلي 20 ميكروليتر من الحل شماعة-PPG-الوتد في الخلية تدفق المجمعة. وحدة التخزين التي يتم جوا في الخلية قد تكون كبيرة بما يكفي لملء الدائرة. في الخطوات التالية، استخدم نفس وحدة التخزين عند تبادل الحلول.
  2. السماح للحل شماعة-PPG-شماعة لاستيعاب على السطح لمدة 5 دقائق. تبادل الحل شماعة-PPG-الوتد مع المخزن المؤقت BRB80 3 مرات التي تتدفق في المخزن المؤقت. تدفق الحل حركية في الخلية التدفق.
  3. ختم حواف الخلية تدفق مع الشحوم لمنع التبخر إذا كان أطول من ساعة التجربة المزمعة.
    ملاحظة: الخلية تدفق جاهز الآن ليتم أخذ صورة عنه.

4-التصوير خلية تدفق

  1. القيام التصوير باستخدام إعداد فلورية (TIRF) نوع الهدف إجمالي التأمل microtubules والمحركات kinesin (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: وهنا استخدمنا مجهر مع 100 x/1.49 عدسة الهدف الفتحة العددية، باستخدام أشعة الليزر اثنين، أحدهما مع طول موجي 642 شمال البحر الأبيض المتوسط، والحد أقصى من طاقة من 140 ميغاواط، وآخر مع الطول الموجي 488 نانومتر وأقصى قوة 150 ميغاواط.
  2. ضع قطره زيت الغمر على الهدف.
  3. ضع الخلية تدفق على منصة المجهر وتحقيق الهدف حتى يوجد اتصال بين النفط على الهدف وخلية تدفق.
  4. استخدام نظام تغطية التعشيق المجهر لحظر جميع ضوء الليزر من الفرار.
  5. قم بتشغيل الليزر وتركز على السطح السفلي للخلية تدفق. ميكروتوبوليس فلوريسسينتلي المسمى ومتحمس في موجه 647 شمال البحر الأبيض المتوسط. أنهم سوف يكون تصويرها استخدام ليزر نانومتر 642 بينما 488 نانومتر ليزر يستخدم للمحركات kinesin التجارة والنقل.
  6. تسجيل الصور أو ملفات الفيديو للفائدة. عادة ما يكون قوة الليزر لحوالي 30 ميغاواط ووقت تعرض 50 مللي ثانية على حد سواء بالليزر القنوات. يمكن تسجيل الصور لطالما هناك حركية في الخلية التدفق.
    ملاحظة: الإضاءة الليزر مضر للعين المجردة، ويمكن أن يسبب ضررا لا يمكن إصلاحه. الرجاء التأكد من أن المنطقة المضاءة مغطاة غطاء معتم تماما.

Representative Results

في هذه التجارب، استخدمنا 1,000 مرات إضعاف microtubules أعدت في قسم 1.3.2. وكان تركيز kinesin 20 نانومتر، وتركيز ATP كان 1 مم. تم إجراء التصوير باستخدام الفحص المجهري TIRF. Microtubules التزلق تم تصويرها بشكل منفصل من المحركات kinesin: microtubules مرئية عند الإثارة مع ليزر نانومتر 647 (الشكل 1، الأحمر)، والتجارة والنقل-kinesin مرئية عندما متحمس مع 488 نانومتر ليزر (الشكل 1، الأخضر). الوقت بين الإثارة مع الضوء الأحمر والأخضر وكان أقل من 1 ثانية. وكان الوقت بين إطارات Microtubules س. 10 عرض التزلق مستقرة. وكان microtubule متوسط سرعة الانزلاق أبروكسيماتيفيلي 800 نيوتن متر/ثانية. وكانت الكثافة السطحية microtubule مم 400-2. مسارات kinesin (الأخضر) يبدو أن تمتد إلى ما بعد نهاية ميكروتوبوليس (أحمر) لعدة ميكرومتر زائدة.

Figure 1
رقم 1: مزلق microtubules تدفعها المحركات ضعيفة سطح زمنياً kinesin. ميكروتوبوليس نتحرك إلى الأمام، تتراكم kinesin موتورز من الحل. هذه المحركات بالتناوب بين دولتين: واحدة-ملزمون ميكروتوبولي، والمزدوجة-ملزمون ميكروتوبولي والسطح. عندما يصل مزدوجة محرك منضم إلى نهاية ميكروتوبولي، المحرك هو تركها وديسوربس ببطء من على سطح الأرض بمعدل حوالي 0.1 s-1قبالة. كنتيجة لذلك، تبقى مسارات المحركات kinesin خلف ميكروتوبوليس. الصف العلوي: قناة الأحمر (ميكروتوبولي). الصف الأوسط: قناة الأخضر (kinesin). الصف السفلي: جنبا إلى جنب الأحمر (ميكروتوبولي) والخضراء (بروتينات فلورية خضراء-kinesin) القناة. شريط الحجم: 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

في هذا العمل، نحن نقدم نظام النانو نشطة التي ذاتية تجمع ضعيف ملزمة اللبنات الأساسية لبناء المسار الخاص به. كما هو مبين في الشكل 1، microtubules التزلق تتراكم kinesin موتورز من الحل وإيداعها على السطح. تبقى المحركات kinesin في أعقاب microtubule فترة قصيرة من الزمن قبل العودة إلى الحل. وهكذا، في هذه التجربة، kinesin موتورز بديلة بين 3 دول:

(1) دولة واحدة زمنياً ميكروتوبولي: هذا عندما تربط kinesin أولاً ميكروتوبولي. فإنه يوجد في حالة توازن مع الدولة (2).

(2) دولة مزدوجة زمنياً: وفي هذه الحالة، kinesin واحدة زمنياً microtubule أيضا بربط السطح عبر به صاحب العلامة. يسمح هذه الدولة مزدوجة زمنياً للدفع ميكروتوبولي.

(3) دولة زمنياً على سطح واحد: kinesin مزدوجة زمنياً قد خرج من نهاية ميكروتوبولي، وقد لا ديسوربيد حتى الآن من على سطح الأرض في هذه الحالة. ويمكن ملاحظة هذه المحركات في الشكل 1 (قنوات مجتمعة والخضراء): أنها تمتد خلف ذيل microtubule لعدة ميكرومتر وتشكل على درب تقليص.

أن الخطوة الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هو تشكيل السطح مسعور على الشريحة. أنها تستخدم المواد الكيميائية الخطرة، بل أنها تسمح أيضا شماعة-PPG-شماعة فونكتيوناليزيد مع فريق الإدارة الوطنية للسياحة على معطف السطح، ثم يسمح kinesin لربط عكسية إلى السطح. خطوة هامة أخرى هي ختم الخلية تدفق مع الشحوم. وهذا يسمح للتصوير المطول بدون السائل في التبخر خلية تدفق.

التعديلات الرئيسية لهذه التقنية تتكون من تغيير تركيز ميكروتوبولي وتركيز kinesin وتركيز ATP. تغيير تركيز microtubule سيغير عدد microtubules الانزلاق على السطح. تغيير تركيز kinesin سيغير عدد جزيئات kinesin الذي يمكن ربطه ميكروتوبولي. ومع ذلك، يمكن زيادة زيادة تركيز kinesin أعلاه المبالغ التي سبق تعريفها في هذه التجربة fluorescence الخلفية، مما يجعل من الصعب أكثر راجع مسارات kinesin خلفها مزلق microtubules. وفي الوقت نفسه، خفض تركيزات ATP أدناه 10 ميكرون ستنخفض إلى حد كبير microtubule مزلق السرعة. إذا كان المطلوب هو هذا التأثير، من الضروري استخدام ATP تجديد نظام يتكون من الفوسفاتيز الكرياتين وفوسفوكيناسي.

حد ممكن من هذا الأسلوب هو أنه، بسبب محتوى kinesin نشاطا كبيرا للنظام، يمكن أن تستهلك ATP سرعة، والتجارب قد تستغرق أقل من ساعة في ظروف معينة. وهذا على سبيل المثال سيكون عليه الحال إذا أحد تستخدم ذات شقين kinesin أعلى تركيز وخمسة إضعاف تركيز microtubule أعلى من ما تم عرضه في هذا البروتوكول.

لدينا عمل السابقة18، درسنا التوزيع المكاني للمحركات kinesin على طول microtubules، تثبت أن تتراكم microtubules التزلق موتورز kinesin من الحل، أدى إلى زيادة في كثافة السيارات على الطول microtubule. كما وجدنا أن تثبت التزلق الاستقرار microtubules من اعتماد غير خطية على سرعة التركيز و microtubule kinesin الحل.

عرض البروتوكول يمهد الطريق لاستخدام أكثر كفاءة للبروتين للسيارات في نظم النانومترية الحجم هندسيا لإجراء مزيد من التحقيقات في التصميم نانوسيستيمس النشطة الموجودة في توازن دينامي. وعلاوة على ذلك، الطابع الدينامي لهذا النظام يسمح لها بالعمل كنظام نموذجي لدراسة استبدال المكونات الجزيئية، سد جزء من الفجوة بين الهياكل الطبيعية وهندستها الشفاء الذاتي ودينامية.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

الكتاب الاعتراف بامتنان الدعم المالي في إطار جبهة الخلاص الوطني منحة 1807514 جبهة الخلاص الوطني-هيئة الهجرة واللاجئين. يشكر المؤلفون غ. باتشاند وفانديليندير ف لتوفير البروتين kinesin التجارة والنقل. هذا العمل قد أنجز، في جزء منه، في مركز "تكنولوجيات النانو المتكاملة"، وتشغيل "مرفق المستخدم التابع" لمكتب العلوم "مكتب العلوم لنا الطاقة" (وزارة) من "مختبر لوس ألاموس الوطني" (العقد لا. DE-AC52-06NA25396) و "سانديا الوطنية" (يخدع المسالك رقم 97 دي-AC04-94AL85000). يشكر المؤلفون الدكتورة جنيفر نيف والأوعية الدموية اللفيفو للهدية من شماعة-PPG-شماعة فونكتيوناليزيد مع الإدارة الوطنية للسياحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
488 nm laser Omicron Laserage LuxX 488-150
642 nm laser Omicron Laserage LuxX 642
Casein Sigma C7078-500G
Catalase from bovine liver Sigma C40-500MG
Creatine Phosphate Sigma P-7936
Creatine Phosphokinase Sigma C3755-500UN
D-Glucose Sigma G2133-50KU
Dichlorodimethylsilane solution Sigma 40140-25ML Toxic
Dimethyl Sulfoxide Sigma 34869-100ML
Dithiothreitol Sigma D0632-5G Toxic
Eclipse TI Nikon Instruments
eGFP rkin430 Provided by George Bachand
EGTA Sigma E4378-25G
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49A
Glucose Oxidase Sigma G0543-10KU
Guanosine Triphosphate Sigma G8877-10MG
Kimwipes Delicate Task Wipers Sigma Pharmaceuticals 8089
Magnesium Chloride Sigma M1028-100ML
Methanol Fisher Chemical A412 Toxic
Milli-Q Water Purification System Millipore Corporation
Nickel Sulfate Sigma 656895-50G
Paclitaxel Sigma T1912-5MG
PIPES Sigma P-6757
Pluronic F108-NTA Provided by Jennifer Neff and AllVivo Vascular PEG-PPG-PEG-NTA
Pluronic F-108 Sigma 542342-250G PEG-PPG-PEG
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 21-403-190
Toluene Fisher Chemical T324 Toxic
Tubulin, HiLyte647-labeled Cytoskeleton, Inc. TL670M
UV Ozone Procleaner BioForce Nanosciences PC440
Whatman Puradisc syringe filters Sigma WHA67840402
Zyla 4.2 sCMOS Camera Andor Technology sCMOS 4.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vale, R. D., Reese, T. S., Sheetz, M. P. Identification of a Novel Force-Generating Protein, Kinesin, Involved in Microtubule-Based Motility. Cell. 42, 39-50 (1985).
  2. Ray, S., Meyhofer, E., Milligan, R. A., Howard, J. Kinesin Follows the Microtubule's Protofilament Axis. Journal of Cell Biology. 121, 1083-1093 (1993).
  3. Dennis, J. R., Howard, J., Vogel, V. Molecular shuttles: directed motion of microtubules along nanoscale kinesin tracks. Nanotechnology. 10, 232-236 (1999).
  4. Kawamura, R., Kakugo, A., Osada, Y., Gong, J. P. Microtubule bundle formation driven by ATP: the effect of concentrations of kinesin, streptavidin and microtubules. Nanotechnology. 21, 145603 (2010).
  5. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in Insect Cells Improves Microtubule in Vitro Gliding Performance, Long-Term Stability and Guiding Efficiency in Nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15, 62-69 (2016).
  6. Whitesides, G. M., Grzybowski, B. Self-assembly at all scales. Science. 295, 2418-2421 (2002).
  7. Ringler, P., Schulz, G. E. Self-assembly of proteins into designed networks. Science. 302, 106-109 (2003).
  8. Boncheva, M., et al. Magnetic self-assembly of three-dimensional surfaces from planar sheets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 3924-3929 (2005).
  9. England, J. L. Dissipative adaptation in driven self-assembly. Nature Nanotechnology. 10, 919 (2015).
  10. Fialkowski, M., et al. Principles and Implementations of Dissipative (Dynamic) Self-Assembly. The Journal of Physical Chemistry B. 110, 2482-2496 (2006).
  11. Boncheva, M., Whitesides, G. M. Self-healing systems having a design stimulated by the vertebrate spine. Angewandte Chemie-International Edition. 42, 2644-2647 (2003).
  12. Rubenstein, M., Cornejo, A., Nagpal, R. Programmable self-assembly in a thousand-robot swarm. Science. 345, 795-799 (2014).
  13. Plaisted, T. A., Vakil Amirkhizi, A., Arbelaez, D., Nemat-Nasser, S. C., Nemat-Nasser, S. Self-healing structural composites with electromagnetic functionality. Proceedings of the Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. 5054, 372-381 (2003).
  14. Ghosh, S. K. Self-Healing Materials. Ghosh, S. K. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim. 1-28 (2009).
  15. Burnworth, M., et al. Optically healable supramolecular polymers. Nature. 472, (2011).
  16. Bachand, G. D., Spoerke, E. D., Stevens, M. J. Microtubule-Based Nanomaterials: Exploiting Nature's Dynamic Biopolymers. Biotechnology and Bioengineering. 112, 1065-1073 (2015).
  17. Gao, Y. W., Lei, F. M. Small scale effects on the mechanical behaviors of protein microtubules based on the nonlocal elasticity theory. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387, 467-471 (2009).
  18. Lam, A. T. -C., Tsitkov, S., Zhang, Y., Hess, H. Reversibly Bound Kinesin-1 Motor Proteins Propelling Microtubules Demonstrate Dynamic Recruitment of Active Building Blocks. Nano Letters. 18, 1530-1534 (2018).
  19. Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods in Cell Biology. 39, 137-147 (1993).
  20. Huppertz, T., Fox, P. F., Kelly, A. L. Proteins in Food Processing (Second Edition). Yada, R. Y. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 49-92 (2018).
  21. Wettermark, G., Borglund, E., Brolin, S. E. A regenerating system for studies of phosphoryl transfer from ATP. Analytical Biochemistry. 22, 211-218 (1968).
  22. Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. Journal of Cell Biology. 107, 1011-1024 (1988).
  23. Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15, S540-S548 (2004).
  24. Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. EMBO Journal. 20, 5101-5113 (2001).
  25. Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 73, 2782-2790 (1997).

Tags

الهندسية، العدد 143، النانوية، والمكوكات الجزيئية، ميكروتوبوليس، kinesin موتورز، عكسها ملزمة، دينامية التجميع الذاتي
تجميع المكوكات الجزيئية مدعوم بشكل قابل للعكس يعلق كينيسينس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bassir Kazeruni, N. M., Tsitkov, S., … More

Bassir Kazeruni, N. M., Tsitkov, S., Hess, H. Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins. J. Vis. Exp. (143), e59068, doi:10.3791/59068 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter