Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Moleküler mekikler Powered by geri dönülebilir olarak montaj Kinesins bağlı

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/59068
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University
* These authors contributed equally

Summary

Biz moleküler mekikler, kurmak için bir protokol nerede yüzeye yapıştırılır kinesin motor proteinler boya etiketli mikrotübüller itmek mevcut. Kinesins yüzeyi ile zayıf etkileşimler tersinir kendi eki sağlar. Bu dinamik montaj ve demontaj bir bileşen işlevselliğini korurken sergileyen bir nano sistemi oluşturur.

Abstract

Bu iletişim kuralı ile kinesins zayıf ve tersinir bağlama yüzeye moleküler mekikler kinesin destekli oluşturmayı açıklar. Bu sistemde önceki iletişim kuralları aksine mikrotübüller kinesin motor proteinler çözümden işe ve onları bir yüzeye yerleştirin. Buna karşılık, kinesins kayma yüzeyi boyunca mikrotübüller, böylece tekrar işe mevcut olan toplu çözümde desorbing önce kolaylaştıracaktır. Bu sürekli montaj ve demontaj, mikrotübüller kayma tarafından geçici kinesin yollar oluşumu gibi sisteminde dinamik davranış çarpıcı için yol açar.

Bu deney boyunca çeşitli deneysel yöntemler açıklanacaktır: UV-Vis spectrophotometry hisse senedi çözümleri reaktifler, konsantrasyonu belirlemek için kullanılan, ozon ve tedavi ultraviyole (UV) ve sonra silanized coverslips be ilk akış hücreleri ve toplam iç yansıma floresans önce monte (TIRF) mikroskopi aynı anda kinesin motorlar ve Mikrotubul filamentler görüntü için kullanılır.

Introduction

Etkin nanosystems davranışını yöneten etkileşimleri her zaman uzun ömürlü, neredeyse geri dönüşümsüz tahvil1,2,3,4,5',6 karakterize ,7,8. Bunun iyi çalışılmış bir örneği Mikrotubul kinesin sistemi nerede kayma mikrotübüller geri dönüşümsüz yüzey bağlı kinesin motorlar1,2,3,4tarafındantahrikli. 5. Hangi bileşenleri geri dönülebilir olarak bağlı olan bir başkasına sistemleri olmuştur, ama bu sistemler için aşağı ölçeklendirme teorik olarak9,10 okudu ve macroscale11,12, elde Nano zorlu olmuştur. O kırılma için bu önemli nedenlerinden biri ve sık sık bileşenleri arasındaki bağları reform çevre koşulları büyük bir değişim gerektirir. Bu tür değişiklikleri son13,14,15' te hayata geçirdik olsa bile, onun ortamına adapte yerine sistemin kendisi değiştirme güvenmek istiyorsunuz. Hangi bileşenleri sürekli araya ve yapılarına hangi deneyler gerçekleşecek genel ortamı bozmadan yeniden düzenlemek moleküler ölçekli sistemleri tasarımı dinamik davranışları bir yelpazede keşfi için kapıyı açar mısınız 16 , 17.

Burada, biz tanımlamak ve dinamik olarak montaj oluşturma ve nano işleyen sistem sökülmesi için detaylı Protokolü göstermektedir. Sistem ve genel davranışını tanıtılan önceki18olmuştur: Mikrotubul filamentler ters yüzey bağlı kinesin-1 motor parça tarafından tahrikli. Bu kinesin motor proteinler çözümden daha kısa bir süre sonra desorbing önce ileri, mikrotübüller itmek yardımcı olmak için işe aldı. Bir kez geri çözümde, onlar daha yeni Mikrotubul itmek için işe. Son13,14' te,15, son dakika ve reform tahvil çevresel değişiklik gerekli; Buna ek olarak, kinesin motorlar yüzey ile etkileşime geçtiğinizde bizim akışı hücre ortam değişmeden kalır.

Bu iletişim kuralı baktılar araştırmacılar (1) iletişim kuralının tüm adımları görselleştirmek ve (2) bu tür bir tahlil sorun giderme konusunda yardımcı olmak için yardımcı olacaktır. Howard ve ark. 199319' nda açıklanan yordamları üzerinden elde edilmiş.

Protocol

1. çözüm hazırlık

Dikkat: Bu protokol (Toluen, dimethyldichlorosilane ve dithiothreitol) için kullanılan reaktifler üçü çok zehirli. Lütfen kullanım öncesinde ilgili malzeme güvenlik bilgi formları (MSDS) başvurun. Ayrıca, bu iletişim kuralı bölümlerini koruma belirtildiği gibi koruyucu gözlük ve koruyucu eldiven iki takım giyen, daha yüksek düzeyde altında gerçekleştirilmesi gerekir. Tüm uygun kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, eldiven, önlük, tam uzunlukta pantolon ve kapalı-toe ayakkabı) kullanırken aksi tavsiye sürece deneyler laboratuvar bankların üzerinde gerçekleştirilebilir.

Not: ATP, kinesin ve bu protokol için kullanılan mikrotübüller konsantrasyonları her deney ihtiyaçlarını göz önüne alındığında değiştirilebilir. Ancak, değişikliğin yapılması durumunda, lütfen diğer reaktifleri son konsantrasyonları verilen aynı kalır aşağıdaki emin olun. Oda sıcaklığında (~ 25 ° C) tüm deneyler yapıldı.

  1. Hisse senedi çözümleri hazırlanması
    Not: Hazırlamak ve aliquot önceden aşağıdaki çözümleri. Tüm aliquots oda sıcaklığında (~ 25 ° C) hazırlanabilir.
    1. BRB80 arabellek
      Not: Bu protokol için kullanılan çözüm çoğu için arabellek BRB80 olur. BRB80 büyük miktarlarda hazır ve -20 ° C-dondurucu içinde depolanır.
      1. 24.2 g dağıtılması piperazin-N, N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (boru) ve 3.1 g potasyum hidroksit (KOH) 800 ml deiyonize su çalışma 800 mL 100 mM boru yapmak için. PH 8 potasyum hidroksit (KOH) ile boru ve EGTA dağılmasına yardımcı olabilir 1 L. Şardon son hacmi elde etmek için 10 mM magnezyum klorür (MgCl2) ve 10 mM etilen glikol tetraacetic asit (EGTA) 100 mL 100 mL ekleyin.
        Not: 80 mM borular, 1 mM MgCl2ve 1 mM EGTA kimyasallar BRB80 arabellek son konsantrasyonları vardır.
      2. PH 6,9 KOH ve hidroklorik asit (HCl) kullanarak için arabelleği ayarlayın.
    2. ATP
      1. 100 mm ATP Ultrasaf Su 1 mL solüsyon hazırlamak. Damlalıklı çözüm 10 μL aliquots içine. Aliquots-80 ° C dondurucuda saklayın.
    3. GTP
      1. 25 mM GTP Ultrasaf Su 500 μL çözeltisi hazırlamak. Damlalıklı çözüm 5 μL aliquots içine. Aliquots-80 ° C dondurucuda saklayın.
    4. MgCl2
      1. 100 mm MgCl2 Ultrasaf Su 1 mL solüsyon hazırlamak. Damlalıklı çözüm 10 μL aliquots içine. Aliquots-20 ° C dondurucuda saklayın.
    5. Kazein
      1. Kuru kazein 1 g tartmak ve 50 mL konik santrifüj tüpü aktar. BRB80 arabellek 35 mL tüp kazein toz çözülmeye ekleyin.
      2. Çözüm bir bardak soğuk bir odada gece çözülmeye yerleştirin. Bu noktada, çözüm kalın ve yapışkan bakacağız.
      3. Tüp dik yerleşmek herhangi bir büyük undissolved kümeleri için izin vermek için 4 ° C buzdolabı bırakın. Süpernatant için yeni bir tüp aktarın.
      4. Daha fazla precipitates cips için 1000 x g de bir santrifüj tüpü çevir. Bir kez daha, yeni bir tüp süpernatant aktarın.
      5. Art arda 0,2 mikron (7 bar maksimum basınç) filtreleri kullanarak çözüm filtre. Kadar kalın olduğunu çözüm, fazla filtresi tıkanmış olsun, bu yüzden filtre temizlenene kadar bu adımı yineleyin ve unclogged.
      6. Kazein konsantrasyonu 280 nm20, kazein'ın nesli 19 mM-1∙cm-1 katsayısı kullanarak UV/Vis spectrophotometry kullanarak elde edilen çözelti içinde belirlemek. Kazein için 23 kDa bir molekül ağırlığı varsayarsak, 20 mg∙mL-1 BRB80 içinde bir konsantrasyon çözümü oranında seyreltin.
      7. Damlalıklı çözüm içine 20 μL aliquots ve aliquots-20 ° C dondurucuda saklayın.
    6. D-glikoz
      1. 2 M D-glikoz Ultrasaf Su 1 mL solüsyon hazırlamak. Damlalıklı çözüm 10 μL aliquots içine. Aliquots-20 ° C dondurucuda saklayın.
    7. Glikoz oksidaz
      1. 20 mg∙mL-1 glikoz oksidaz BRB80 1 mL çözeltisi hazırlamak. Damlalıklı çözüm 10 μL aliquots içine. Aliquots-20 ° C dondurucuda saklayın.
    8. Katalaz
      1. BRB80 0.8 mg∙mL-1 katalaz, 1 mL solüsyon hazırlamak. Damlalıklı çözüm 10 μL aliquots içine. Aliquots-20 ° C dondurucuda saklayın.
    9. Dithiothreitol (DTT)
      Not: DTT biraz uçucu ve zehirli olduğu için lütfen bir duman başlık altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
      1. 1 m ultrasaf suda seyreltilmiş DTT 1 mL solüsyon hazırlamak. Damlalıklı çözüm 10 μL aliquots içine. Aliquots-20 ° C dondurucuda saklayın.
    10. Paklitaksel
      1. 1 mM paklitaksel DMSO içinde seyreltilmiş 1 mL çözeltisi hazırlamak. Damlalıklı çözüm 10 μL aliquots içine. Aliquots-20 ° C dondurucuda saklayın.
    11. Dimetil sülfoksit (DMSO)
      Not: Bu deneylerde kullanılan DMSO saftır.
      1. Saf DMSO 10 μL aliquots içine 1 mL damlalıklı. Aliquots-20 ° C dondurucuda saklayın.
    12. Kreatin fosfat
      1. 0.2 M kreatin fosfat Ultrasaf Su, 1 mL solüsyon hazırlamak. Damlalıklı çözüm 10 μL aliquots içine. Aliquots-20 ° C dondurucuda saklayın.
    13. Kreatin fosfokinaz
      1. 200 units· bir 1 mL solüsyon hazırlamak L-1 kreatin fosfokinaz Ultrasaf Su. Damlalıklı çözüm 10 μL aliquots içine. Aliquots-20 ° C dondurucuda saklayın.
    14. Nikel (II) sülfat
      1. 500 mL lik 50 mM nikel (II) sülfat Ultrasaf Su hazırlamak. Çözüm (~ 25 ° C) Oda sıcaklığında saklayın.
    15. Poly(Ethylene glycol)-blok-poly(propylene glycol)-blok-poly(ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG) çözüm
      1. PEG-PPG-PEG 2 mg tartmak (sayı ortalama molekül ağırlığı: 14.600 g∙mol-1)-NTA toz ağırlığında kağıt üzerinde. PEG-PPG-PEG-NTA nitrilotriacetic asit (NTA) grubuyla functionalized triblock kopolimer var. PEG-PPG-PEG-NTA hakkında daha fazla bilgi için Tablo reçetesi bakın.
      2. Toz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. 1 mL stok nikel (II) sülfat çözeltisi tüp ekleyin. Toz eriyene kadar girdap ve hiçbir görünür kümeleri kalır.
      3. Mağaza oda sıcaklığında en fazla bir ay.
  2. Bir deney başlamadan önce
    1. Bir kova buz ile doldurun.
    2. Her birinden 1.1.1-1.1.13 yukarıdaki bölümlerde açıklanan 13 reaktifler bir aliquot alıp onları böylece onları buza tutmak kova ekleyin. Her kullanımdan önce reaktifler bir çözülme.
  3. Mikrotubul hazırlık
    Not: Mikrotübüller liyofilize tübülin boya etiketli bir 20 μg aliquot polimerli. 647 uyarma dalga boyu boya olduğunu nm.
    1. Mikrotubul büyüme arabellek hazırlanması
      1. Damlalıklı 21,8 μL BRB80 arabelleği bir küçük (0.6 mL) microcentrifuge içine tüp. MgCl2 hisse senedi çözüm 1 μL, GTP hisse senedi çözeltinin 1 μL ve 1.2 μL DMSO hisse senedi çözüm ekleyin.
        Not: Böylece, 4 mM MgCl2, 1 mM GTP ve %5 (v/v) dimetil sülfoksit BRB80 arabellek reaktifleri son konsantrasyonları vardır.
    2. Mikrotubul polimerizasyonu
      1. 6.25 μL Mikrotubul büyüme arabelleği doğrudan bir 20 μg aliquot etiketli liyofilize tübülin in ekleyin. Girdap aliquot 5 için 30 rps s.
      2. 5 min için buzda aliquot için 45 dk 37 ° C'de kuluçka önce serin ve 1.3.3 bölümüne geçin.
    3. Mikrotubul sabitleme
      1. 5 μL bölünmemeli paklitaksel çözüm BRB80 arabellek 490 μL için ekleyin. Girdap çözüm için 10 30 rps s.
      2. Kuluçka mikrotübüller için 45 dk olduğunda, BRB80/paklitaksel 5 μL polimerli Mikrotubul çözüm ekleyin.
        Not: Bu 100-fold sulandırılmış, stabilize, Mikrotubul çözüm bundan sonra MT100 sevk edilecek. 5 gün için kullanılabilir ve her deneme için istenen Mikrotubul yoğunluğu elde etmek için seyreltilmiş.
  4. Motilite çözüm
    1. Enzimatik antifade, sistemi yeniden ATP ve ATP
      1. 9.0 μL bölünmemeli kazein çözüm BRB80 arabellek 291 μL için ekleyin.
      2. Deney için istenen ATP konsantrasyonu 1 mM, damlalıklı 83 μL yeni 0.6 mL microcentrifuge tüp içine BRB80/kazein çözümün daha düşük ise. Aksi takdirde, damlalıklı 85 μL o çözüm yeni bir 0.6 mL microcentrifuge tüp içine.
      3. D-glikoz, glikoz oksidaz 1 μL, katalaz 1 μL ve DTT 1 μL 1 μL o tüp için ekleyin.
        Not: Bu kimyasalların bir enzimatik teşkil photobleaching kaldırarak azaltır antifade kokteyl21 çözünmüş oksijen ve şoklama reaktif radikallerin. Bu photobleaching ve Mikrotubul dağılma uyarma aydınlatma floresans22,23görüntüleme sırasında neden azaltır.
      4. ATP konsantrasyonu 1 mM daha önemli ölçüde daha düşük olması için seçilen deneyler için aşağıdaki reaktifler bir ATP rejenere sistemi oluşturmak için ekleyin: 1 μL bölünmemeli kreatin fosfat çözüm ve bölünmemeli kreatin 1 μL fosfokinaz çözüm.
      5. Hisse senedi ATP çözeltinin 1 μL hareketliliği ekleyin. Flick veya girdap rastlanılmaması kimyasallar dağıtmak için aliquot.
        Not: Böylece, kimyasallar çözüm son konsantrasyonu vardır 10 mikron paklitaksel, 0.5 mg·mL– 1 kazein, 20 mM D-glikoz, 200 μg·mL– 1 glikoz oksidaz, 8 μg·mL– 1 katalaz, 10 mM dithiothreitol, 2 mM kreatin fosfat (Eğer), 2 units· (Eğer) L– 1 kreatin fosfokinaz ve 1 mM ATP. Bu çözüm bundan sonra hareketliliği çözüm olarak sevk edilecek.
    2. Kinesin
      Not: Bu deneylerde kullanılan hisse senedi kinesin çözüm için entegre Nanoteknolojide Sandia Ulusal laboratuvarları, G. Bachand Merkezi tarafından hazırlanan ve Kullanıcı Sözleşmesi (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php) kapsamında sunulan. burada kullanılan arabellek 40 mM imidazole, 300 mM NaCl, 0,76 g· oluşur. L-1 EGTA, 37,2 mg· L-1 EDTA, 50 g· L-1 sükroz, 0.2 mM TCEP ve 50 mikron Mg-ATP. Deneyler için bu dizi rkin430eGFP kinesin yapı kullanılmıştır. İlk 430 amino asitler sıçan kinesin ağır zincir eGFP ve bir C-terminal O'nun etiketi kuyruk etki alanı24erimiş oluşan bir kinesin bu. Escherichia coli ifade edildi ve Ni−NTA sütun kullanarak saf. GFP kinesin hisse senedi çözüm konsantrasyonu 1.8 ± 0,3 mikron UV/Vis spectrophotometry, GFP 489 nm25, 55 mM-1·cm-1 için bir yok olma katsayısı kullanarak tarafından belirlenen ve o kinesin dikkate alarak bir dimer.
      1. Deney için istenen kinesin konsantrasyon veya yüzey yoğunluğu belirlemek. Tipik deneyleri için bu 20 bölgedir nM. Kinesin konsantrasyon seyreltilmiş gerekiyorsa daha--dan a hundred-fold, kazein, 0.5 mg·mL-1 içeren BRB80 bir çözümde oranında seyreltin.
      2. Kinesin çözüm 1 µL hareketliliği için son bir konsantrasyon approximatively 20 almak ekleyin nM.
    3. Mikrotübüller
      1. 10 μL bölümünde 1,3 hareketliliği çözüm için hazırlanan MT100 çözüm ekleyin.
        Not: Bu hareketliliği çözüm ilâ 3 saat için kullanılabilir. Çözüm glikoz enzimatik reaksiyon tarafından tüketilmiş çünkü bu saatten sonra antifade sistem etkinliğini kaybeder.

2. montaj akışı hücreleri

  1. Coverslips yıkama
    1. Akış hücreler için büyük bir coverslip kullanın (Boyut: 60 x 25 mm) ve küçük bir (Boyutlar: 22 x 22 mm)19.
    2. Tüm coverslips etanol ile iki kez ve iki kez Ultrasaf Su ile durulayın. 5 dk. kuru için onları 50-75 ° c ısıda bir fırında coverslips Ultrasaf Su solüsyon içeren temizleyicide
    3. Bir UV/ozon temizleyici kullanarak ( Tablo malzeme ve üretici yönergelerine bakın), 15 dk. Bu adım gerçekleştirmek için her coverslip bir tarafı (~ 25 ° C) Oda sıcaklığında ve normal atmosferik durum tedavi (basınç 1 atm).
    4. Dikkatle her coverslip (Cımbız kullanarak), diğer tarafa açın ve UV/ozon tedavi de şu tarafa.
    5. Onları tekrar kurutma önce bir sıcaklık 50-75 ° c fırında 5 min için tekrar Ultrasaf Su coverslips solüsyon içeren temizleyicide
  2. PEG-PPG-PEG kaplama etkinleştirmek için coverslips tedavi
    Not: Dimethyldichlorosilane ve yüksek derecede toksik varlık protokolü bu bölümünde kullanılan Toluen gerçekleştirmek bir duman başlık altında aşağıdaki adımları aşağıdaki önlemleri alarak: iki kümesi koruyucu eldiven ve onların laboratuarına altında bir uzun kollu gömlek giymek kat. Böylece deri ön kolda üzerinden doğrudan bir dökülme durumunda kimyasallara maruz eldiven kollu gömlek içinde kenarlarını sok. Koruyucu gözlük.
    1. 25 mL Toluen 475 ml saf dimethyldichlorosilane oranında seyreltin. Her coverslip dimethyldichlorosilane ve Toluen çözüm 15 saniye boyunca bırakın.
    2. Coverslips iki kez Toluen ve üç kere metanol yıkayın. Basınçlı azot kullanarak coverslips kuru.
  3. Coverslips akışı hücrelere montaj
    1. Coverslips kuru olduğunda, Çift taraflı bant 2 cm x 2,5 cm parçası dikey olarak iki 1 cm x 2,5 cm şeritler kesin.
    2. Büyük coverslip hassas görev silecek üzerinde koymak ve teyp çizgili teyp parçaları arasında 1 cm x 2,5 cm alan oluşturmak için coverslip kenarları boyunca boyuna sopa.
    3. Küçük coverslip akışı hücre derleme bitirmek için teyp çizgiler üzerine sopa.

3. akan çözümler akış hücre

  1. Approximatively 20 μL PEG-PPG-PEG çözüm monte akışı hücre akışı. Hücrede uçakla birim odası doldurmak için yeterli büyüklükte olması gerekiyor. Sonraki adımda ne zaman çözümleri alışverişi aynı birim kullanın.
  2. 5 dakika boyunca yüzeyde emmek PEG-PPG-PEG çözüm sağlar. BRB80 arabellek PEG-PPG-PEG çözümle arabellekte akan tarafından 3 kez değişimi. Motilite çözüm akışı hücreye akışı.
  3. Planlanan deney bir saatten uzun olduğunda buharlaşma önlemek için yağ ile akış hücre kenarlarını kapatın.
    Not: Akış hücre şimdi yansıması hazırdır.

4. bir akış hücre görüntüleme

  1. Mikrotübüller ve ( Tablo malzemelerigörmek) kinesin motorlar için bir amaç-türü toplam iç yansıma Floresan (TIRF) kurulumu kullanarak görüntüleme gerçekleştirmek.
    Not: Burada, biz bir mikroskop ile 100 x kullanılan / 1,49 sayısal diyafram objektif lens, bir dalga boyu 642 ile iki lazerler kullanarak nm ve maksimum güç 140 mW ve bir dalga boyu 488 nm ve maksimum güç 150 mW.
  2. Bir damla daldırma yağı hedefte yerleştirin.
  3. Mikroskop platformunda akış yerleştirin ve kadar amacı yağlıboya ve akış hücre arasında temas amacı getir.
  4. Mikroskop'ın interlok kapak sistemi kaçan tüm Lazer ışığı engellemek için kullanın.
  5. Üzerine lazer açmak ve akış hücre alt yüzeyinde odaklan. Mikrotübüller fluorescently etiketli ve dalga boyu 647 heyecanlı nm. 488 nm lazer GFP kinesin motorlar için kullanıldığı gibi bir 642 nm lazer kullanarak yansıma.
  6. Görüntüleri veya videoları ilgi kaydedin. Tipik olarak, lazer güçtür yaklaşık 30 / mW ve 50 ms her ikisi için bir çekim hızı lazer kanalları. Orada olduğu sürece hareket akışı hücrede görüntüler için kaydedilebilir.
    Not: Lazer aydınlatma için çıplak gözle zararlıdır ve onarılamaz hasara neden olabilir. Işıklı alan tamamen opak bir kapak ile örtülü dikkat edin.

Representative Results

Bu deneylerde kullandık bir 1.000 kez 1.3.2 bölümünde hazırlanan mikrotübüller seyreltme. Kinesin konsantrasyon 20 yapıldı nM ve ATP konsantrasyon yapıldı 1 mM. Görüntüleme TIRF mikroskobu kullanılarak gerçekleştirildi. Kayma mikrotübüller ayrı ayrı kinesin motors görüntüsü: mikrotübüller üzerine uyarma ile 647 nm lazer (Şekil 1, kırmızı) görünür ve GFP kinesin 488 nm lazer (Şekil 1, yeşil) ile heyecanlı zaman görünür oldu. 1'den zamandı kırmızı ve yeşil ışıklı uyarma arasında s. Çerçeveler arasında 10 s. mikrotübüller istikrarlı kayma görüntülenen zamandı. Kayma hızı ortalama Mikrotubul approximatively 800 nm/s oldu. Mikrotubul yüzey yoğunluğu 400 mm-2oldu. Kinesin (yeşil) izleri için birkaç mikrometre mikrotübüller (kırmızı) izleyen ötesine genişletmek için ortaya çıktı.

Figure 1
Şekil 1: zayıf yüzey bağlı kinesin motors tarafından tahrikli mikrotübüller kayma. Mikrotübüller ilerledikçe kinesin motorlar çözümden birikir. Bu motorlar iki devlet arasında alternatif: tek bağlı için Mikrotubul ve çift bağlı Mikrotubul ve yüzey için. Bir çift ilişkili motor Mikrotubul sonuna ulaştığında, motor geride ve yavaş yavaş yaklaşık 0.1 s-1kapalı bir oran ile yüzeyden desorbs. Sonuç olarak, yollar kinesin motorların mikrotübüller kalır. Üst satır: kırmızı (Mikrotubul) Kanal. Orta sıra: yeşil (kinesin) Kanal. Alt satırı: kombine kırmızı (Mikrotubul) ve yeşil (GFP-kinesin) Kanal. Ölçek çubuğu: 20 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Bu çalışmada, biz hangi kendini zayıf bağlama yapı taşları kendi parça oluşturmak için birleştirir bir etkin nano sistemi mevcut. Şekil 1' de gösterildiği gibi kayma mikrotübüller kinesin motorlar çözümden birikir ve onları yüzeyde mevduat. Kinesin motorlar Mikrotubul sonrasında çözüm için dönmeden önce kısa bir süre için görüntülenmeye devam eder. Böylece, bu deneyde, kinesin alternatif 3 Devletleri arasında motorlar:

(1) bir Mikrotubul tek bağlı Devlet: Bu olduğunda bir kinesin ilk Mikrotubul için bağlar. Denge durumu (2) ile bulunmaktadır.

(2) bir çift bağlı Devlet: Bu durumda, bir Mikrotubul tek bağlı kinesin ayrıca yüzey yolu ile için O'nun onun etiketi bağlar. Bu çift bağlı devlet için Mikrotubul itici güç sağlar.

(3) bir tek yüzey bağlı Devlet: Mikrotubul ucunu gösterilerine katıldı ve henüz yüzeyden desorbed değil bir çift bağlı kinesin bu durumdadır. Bu motorlar Şekil 1 ' de (kombine ve yeşil kanal) görülebilir: Mikrotubul birkaç mikrometre için kuyruk arkasında genişletmek ve azalan onun izi oluşturur.

Bu iletişim kuralı en kritik adım slayt üzerinde hidrofobik yüzey oluşumdur. Sadece çok tehlikeli kimyasallar çetin, ama aynı zamanda PEG-PPG-PEG kinesin geri dönülebilir olarak yüzeye bağlamak izin verir yüzey kat için NTA grubu ile functionalized sağlar. Başka bir önemli adım akışı hücre yağ ile sızdırmazlık. Bu akış hücre buharlaşan sıvı olmadan uzun süreli görüntüleme sağlar.

Bu teknik için birincil yapılan değişiklikleri Mikrotubul konsantrasyon, kinesin konsantrasyon ve ATP toplama değiştirmek için oluşur. Mikrotubul konsantrasyon mikrotübüller yüzeyde kayma sayısını değiştirmek değiştirir. Kinesin konsantrasyon değiştirilmesi için Mikrotubul bağlayabilirsiniz kinesin molekülleri sayısını değiştirir. Ancak, bu deneyde önceden tanımlanmış tutarları yukarıda kinesin konsantrasyonu artan arka plan floresan, mikrotübüller kayma arkasında yaptı kinesin yollar görmek daha zor hale artırmak olabilir. Bu arada, ATP konsantrasyonları aşağıda 10 µM düşürücü Mikrotubul kayma hızı önemli ölçüde azalır. Bu etkisi isteniyorsa, bu sistemi kreatin fosfataz ve fosfokinaz oluşan yenileyici bir ATP kullanmak gereklidir.

Bir olası bu teknik büyük etkin kinesin içeriği sistemi nedeniyle ATP hızla tüketilebilir ve deneyler belirli koşullarda bir saat sürebilir, kısıtlamasıdır. Bir iki kat kinesin yoğun ve ne bu protokol için sunulan daha kat daha yüksek Mikrotubul konsantrasyon kullandıysanız bu örneğin durumda olacaktır.

Bizim önceki iş18, kinesin motorlar mikrotübüller boyunca kayma dağılımını kayma mikrotübüller kinesin motorlar çözüm, birikir motorlar uzunluğu boyunca yoğunluk artış sonuçlanan kanıtlayan okuduk Mikrotubul. Ayrıca mikrotübüller kayma istikrar çözüm kinesin konsantrasyon ve Mikrotubul hız doğrusal olmayan bir bağımlılığı göstermiştir bulduk.

Sunulan Protokolü nano mühendislik sistemleri ve ek araştırmaların tasarımı dinamik denge vardır etkin nanosystems için protein motorların daha verimli kullanmak için yol açıyor. Ayrıca, dinamik yapısı bu sistemin kendi kendini iyileştirme ve dinamik yedek parçası mühendislik ve doğal yapıları arasındaki boşluğu kapatma moleküler bileşenlerin çalışmak için bir model sistemi olarak hizmet sağlar.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar mali destek NSF grant NSF DMR 1807514 altında minnetle kabul etmiş oluyorsunuz. Yazarlar G. Bachand ve V. Vandelinder GFP kinesin protein sağlamak için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen, entegre nanoteknoloji merkezi gerçekleştirildi, bize departmanı, enerji (DOE) Office Bilim Los Alamos Ulusal Laboratuvarı tarafından için bir ofis bilim Kullanıcı tesis işletilen (sözleşme no. DE-AC52-06NA25396) ve Sandia Ulusal Laboratuvarları (con-yolu no. 97 DE-AC04-94AL85000). Yazarlar Dr Jennifer Neff ve AllVivo damar PEG-PPG-PEG functionalized NTA ile onların hediye için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
488 nm laser Omicron Laserage LuxX 488-150
642 nm laser Omicron Laserage LuxX 642
Casein Sigma C7078-500G
Catalase from bovine liver Sigma C40-500MG
Creatine Phosphate Sigma P-7936
Creatine Phosphokinase Sigma C3755-500UN
D-Glucose Sigma G2133-50KU
Dichlorodimethylsilane solution Sigma 40140-25ML Toxic
Dimethyl Sulfoxide Sigma 34869-100ML
Dithiothreitol Sigma D0632-5G Toxic
Eclipse TI Nikon Instruments
eGFP rkin430 Provided by George Bachand
EGTA Sigma E4378-25G
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49A
Glucose Oxidase Sigma G0543-10KU
Guanosine Triphosphate Sigma G8877-10MG
Kimwipes Delicate Task Wipers Sigma Pharmaceuticals 8089
Magnesium Chloride Sigma M1028-100ML
Methanol Fisher Chemical A412 Toxic
Milli-Q Water Purification System Millipore Corporation
Nickel Sulfate Sigma 656895-50G
Paclitaxel Sigma T1912-5MG
PIPES Sigma P-6757
Pluronic F108-NTA Provided by Jennifer Neff and AllVivo Vascular PEG-PPG-PEG-NTA
Pluronic F-108 Sigma 542342-250G PEG-PPG-PEG
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 21-403-190
Toluene Fisher Chemical T324 Toxic
Tubulin, HiLyte647-labeled Cytoskeleton, Inc. TL670M
UV Ozone Procleaner BioForce Nanosciences PC440
Whatman Puradisc syringe filters Sigma WHA67840402
Zyla 4.2 sCMOS Camera Andor Technology sCMOS 4.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vale, R. D., Reese, T. S., Sheetz, M. P. Identification of a Novel Force-Generating Protein, Kinesin, Involved in Microtubule-Based Motility. Cell. 42, 39-50 (1985).
  2. Ray, S., Meyhofer, E., Milligan, R. A., Howard, J. Kinesin Follows the Microtubule's Protofilament Axis. Journal of Cell Biology. 121, 1083-1093 (1993).
  3. Dennis, J. R., Howard, J., Vogel, V. Molecular shuttles: directed motion of microtubules along nanoscale kinesin tracks. Nanotechnology. 10, 232-236 (1999).
  4. Kawamura, R., Kakugo, A., Osada, Y., Gong, J. P. Microtubule bundle formation driven by ATP: the effect of concentrations of kinesin, streptavidin and microtubules. Nanotechnology. 21, 145603 (2010).
  5. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in Insect Cells Improves Microtubule in Vitro Gliding Performance, Long-Term Stability and Guiding Efficiency in Nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15, 62-69 (2016).
  6. Whitesides, G. M., Grzybowski, B. Self-assembly at all scales. Science. 295, 2418-2421 (2002).
  7. Ringler, P., Schulz, G. E. Self-assembly of proteins into designed networks. Science. 302, 106-109 (2003).
  8. Boncheva, M., et al. Magnetic self-assembly of three-dimensional surfaces from planar sheets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 3924-3929 (2005).
  9. England, J. L. Dissipative adaptation in driven self-assembly. Nature Nanotechnology. 10, 919 (2015).
  10. Fialkowski, M., et al. Principles and Implementations of Dissipative (Dynamic) Self-Assembly. The Journal of Physical Chemistry B. 110, 2482-2496 (2006).
  11. Boncheva, M., Whitesides, G. M. Self-healing systems having a design stimulated by the vertebrate spine. Angewandte Chemie-International Edition. 42, 2644-2647 (2003).
  12. Rubenstein, M., Cornejo, A., Nagpal, R. Programmable self-assembly in a thousand-robot swarm. Science. 345, 795-799 (2014).
  13. Plaisted, T. A., Vakil Amirkhizi, A., Arbelaez, D., Nemat-Nasser, S. C., Nemat-Nasser, S. Self-healing structural composites with electromagnetic functionality. Proceedings of the Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. 5054, 372-381 (2003).
  14. Ghosh, S. K. Self-Healing Materials. Ghosh, S. K. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim. 1-28 (2009).
  15. Burnworth, M., et al. Optically healable supramolecular polymers. Nature. 472, (2011).
  16. Bachand, G. D., Spoerke, E. D., Stevens, M. J. Microtubule-Based Nanomaterials: Exploiting Nature's Dynamic Biopolymers. Biotechnology and Bioengineering. 112, 1065-1073 (2015).
  17. Gao, Y. W., Lei, F. M. Small scale effects on the mechanical behaviors of protein microtubules based on the nonlocal elasticity theory. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387, 467-471 (2009).
  18. Lam, A. T. -C., Tsitkov, S., Zhang, Y., Hess, H. Reversibly Bound Kinesin-1 Motor Proteins Propelling Microtubules Demonstrate Dynamic Recruitment of Active Building Blocks. Nano Letters. 18, 1530-1534 (2018).
  19. Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods in Cell Biology. 39, 137-147 (1993).
  20. Huppertz, T., Fox, P. F., Kelly, A. L. Proteins in Food Processing (Second Edition). Yada, R. Y. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 49-92 (2018).
  21. Wettermark, G., Borglund, E., Brolin, S. E. A regenerating system for studies of phosphoryl transfer from ATP. Analytical Biochemistry. 22, 211-218 (1968).
  22. Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. Journal of Cell Biology. 107, 1011-1024 (1988).
  23. Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15, S540-S548 (2004).
  24. Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. EMBO Journal. 20, 5101-5113 (2001).
  25. Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 73, 2782-2790 (1997).

Tags

Mühendislik sayı 143 nanobiotechnology moleküler mekikler mikrotübüller kinesin motorlar bağlama kendinden montajlı dinamik tersinir
Moleküler mekikler Powered by geri dönülebilir olarak montaj Kinesins bağlı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bassir Kazeruni, N. M., Tsitkov, S., … More

Bassir Kazeruni, N. M., Tsitkov, S., Hess, H. Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins. J. Vis. Exp. (143), e59068, doi:10.3791/59068 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter