Vi presenterar ett protokoll för att bygga molekylär skyttlar, där ytan-följs kinesin motorproteiner driva dye-märkt mikrotubuli. Svag växelverkan mellan kinesins med ytan gör deras reversibla bilaga. Detta skapar ett nanoskala system som uppvisar dynamiska montering och demontering av dess komponenter samtidigt behålla dess funktionalitet.
Detta protokoll beskriver hur du skapar kinesin-drivna molekylär transfer med en svag och reversibel fastsättning av kinesins ytan. I motsats till föregående protokoll, i detta system, mikrotubuli rekrytera kinesin motorproteiner från lösningen och placera dem på en yta. Kinesins, i sin tur underlättar glida av mitotiska längs ytan innan desorbing tillbaka till den bulk lösningen, således är tillgängliga ska rekryteras igen. Denna kontinuerlig montering och demontering leder till slående dynamiska beteende i systemet, såsom bildandet av tillfälliga kinesin spår av segelflyg mikrotubuli.
Flera experimentella metoder kommer att beskrivas i hela detta experiment: UV-Vis spektrofotometri används för att bestämma koncentrationen av stamlösningar av reagenser, coverslips kommer först att ozon och ultraviolett (UV) behandlas och sedan silaniserad innan monteras i flödesceller och Totalreflexion fluorescens används (Frida) mikroskopi till samtidigt bild kinesin motorer och mikrotubuli filament.
De interaktioner som styr beteendet hos aktiva nanosystem har alltid präglats av långlivat, nästan oåterkalleliga obligationer1,2,3,4,5,6 ,7,8. En väl studerat exempel på detta är det mikrotubulära-kinesin systemet, där glidförmåga mikrotubuli framdrivas av irreversibelt yta-bundna kinesin motorer1,2,3,4, 5. System där komponenterna är reversibelt anslutna till varandra har varit studerade teoretiskt9,10 och uppnås på macroscale11,12, men skalning dessa system ner till den nanoskala har varit utmanande. En av de främsta orsakerna till detta är att bryta och reformera obligationer mellan komponenterna ofta kräver en stor förändring under miljöförhållandena. Även om sådana förändringar har genomförts i den senaste13,14,15, skulle de förlitar sig på ändra själva systemet i stället för att anpassa sig till sin miljö. Utforma molekylär skala system där komponenter kontinuerligt montera och omorganisera i strukturer utan att störa den totala miljön där experimenten äger rum kommer att öppna dörren till utforskning av ett brett utbud av dynamiska beteenden 16 , 17.
Här, vi beskriver och visar det detaljerade protokollet för att skapa ett dynamiskt montering och demontering system fungerar på nanonivå. Systemet och dess allmänna beteende har varit introducerade tidigare18: mikrotubuli filament framdrivas av spår av reversibelt yta-bundna kinesin-1 motorer. Dessa kinesin motorproteiner rekryteras från lösningen för att hjälpa driva mikrotubuli framåt, innan desorbing igen strax efteråt. När tillbaka i lösningen, kan vara rekryterade de igen för att driva en ny mikrotubuli. I den tidigare13,14,krävs15, breaking och reformera obligationer miljömässiga ändringar; Däremot förblir miljön i vårt flöde cell oförändrat medan kinesin motorerna samverkar med ytan.
Detta protokoll kommer att hjälpa intresserade forskare att (1) visualisera alla steg i protokollet, och (2) hjälpa till med felsökning av denna typ av analys. Det har hämtats från de förfaranden som beskrivs i Howard et al. 199319.
I detta arbete presenterar vi en aktiv nanoskala system som själv monterar svagt bindande byggstenar för att bygga sina egna spår. I figur 1visas glidförmåga mikrotubuli ackumuleras kinesin motorer från lösningen och sätta in dem på ytan. Kinesin motorerna kvar i kölvattnet av mikrotubulära under en kort tid innan han återvände till lösning. Således, i detta experiment, kinesin motorer alternativt mellan 3 stater:
(1) ett mikrotubulära singel-bundna tillstånd: Detta är när en kinesin först binder till en mikrotubuli. Den finns i jämvikt med staten (2).
(2) ett dubbel-bundna tillstånd: i det här fallet en mikrotubulära singel-bundna kinesin binder också till den ytan via dess His-tag. Detta dubbel-bundna tillstånd tillåter mikrotubulära framdrivning.
(3) en enda yta-bundna stat: en dubbel-bundna kinesin som har gått bort i slutet av mikrotubulära och har inte ännu desorberats ur ytan är i detta tillstånd. Dessa motorer kan observeras i figur 1 (kombinerade och gröna kanaler): de förlänga bakom svansen av mikrotubulära för flera mikrometer och bildar dess minskande trail.
Det mest kritiska steget i detta protokoll är bildandet av hydrofoba ytan i bilden. Inte bara är det använda farliga kemikalier, men det gör också att PEG-PPG-PEG functionalized med NTA gruppen att belägga ytan, som sedan gör kinesin reversibelt binda till ytan. Ett annat viktigt steg tätning cellen flöde med fett. Detta möjliggör långvarig imaging utan vätskan i den flöde cell indunstning.
De primära ändringarna till denna teknik består av ändra mikrotubulära koncentration, kinesin koncentration och ATP koncentrationen. Om du ändrar mikrotubulära koncentration kommer antalet mikrotubuli glida på ytan. Om du ändrar kinesin koncentration kommer antalet kinesin molekyler som kan binda till mikrotubuli. Dock kunde öka kinesin koncentrationen överstiger de belopp som redan definierats i detta experiment öka bakgrunden fluorescens, vilket gör det svårare att se kinesin spår kvar glida mikrotubuli. Samtidigt kommer att sänka ATP koncentrationerna under 10 µM signifikant sänka mikrotubulära glider hastighet. Om denna effekt önskas, är det nödvändigt att utnyttja en ATP regenererande system bestående av kreatin fosfatas och kreatinfosfokinas.
En möjlig begränsning av denna teknik är att, på grund av stora aktiva kinesin innehållet i systemet, ATP kan konsumeras snabbt, och experiment kan vara mindre än en timme under vissa förhållanden. Detta skulle exempelvis vara fallet om ett används en tvåfaldigt högre kinesin koncentration och fem gånger högre mikrotubulära koncentration än vad som presenteras i detta protokoll.
I vårt tidigare arbete18, vi studerat den rumsliga fördelningen av kinesin motorer längs mikrotubuli, bevisar att gliding mikrotubuli ackumulera kinesin motorer från lösning, vilket ger en ökning av tätheten av motorer längs längden av den mikrotubuli. Vi fann också att den mitotiska glidförmåga stabilitet visat en ickelinjär beroende på lösning kinesin koncentration och mikrotubuli hastigheten.
Presenterade protokollet banar väg för en mer effektiv användning av protein motorer i nanoskala engineered systems och för vidare utredning i utformningen av aktiva nanosystem som finns i dynamisk jämvikt. Dessutom tillåter den dynamiska karaktären av detta system för att tjäna som modellsystem för att studera självläkande och dynamiskt utbyte av molekylära komponenter, stänga en del av klyftan mellan utvecklade och naturliga strukturer.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner tacksamt ekonomiskt stöd enligt NSF bevilja NSF-DMR 1807514. Författarna tackar G. Bachand och V. Vandelinder för att ge proteinet GFP-kinesin. Detta arbete utfördes, delvis vid centrum för integrerad nanoteknik, en Office av vetenskap användaren anläggning drivs för den oss Department of Energy (DOE) Office of Science från Los Alamos National Laboratory (kontrakt nr. DE-AC52-06NA25396) och Sandia National Laboratories (con-tarmkanalen nr 97 DE-AC04-94AL85000). Författarna tackar Dr. Jennifer Neff och AllVivo kärl för sin gåva av PEG-PPG-PEG functionalized med NTA.
488 nm laser | Omicron Laserage | LuxX 488-150 | |
642 nm laser | Omicron Laserage | LuxX 642 | |
Casein | Sigma | C7078-500G | |
Catalase from bovine liver | Sigma | C40-500MG | |
Creatine Phosphate | Sigma | P-7936 | |
Creatine Phosphokinase | Sigma | C3755-500UN | |
D-Glucose | Sigma | G2133-50KU | |
Dichlorodimethylsilane solution | Sigma | 40140-25ML | Toxic |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma | 34869-100ML | |
Dithiothreitol | Sigma | D0632-5G | Toxic |
Eclipse TI | Nikon Instruments | ||
eGFP rkin430 | Provided by George Bachand | ||
EGTA | Sigma | E4378-25G | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
Glucose Oxidase | Sigma | G0543-10KU | |
Guanosine Triphosphate | Sigma | G8877-10MG | |
Kimwipes Delicate Task Wipers | Sigma Pharmaceuticals | 8089 | |
Magnesium Chloride | Sigma | M1028-100ML | |
Methanol | Fisher Chemical | A412 | Toxic |
Milli-Q Water Purification System | Millipore Corporation | ||
Nickel Sulfate | Sigma | 656895-50G | |
Paclitaxel | Sigma | T1912-5MG | |
PIPES | Sigma | P-6757 | |
Pluronic F108-NTA | Provided by Jennifer Neff and AllVivo Vascular | PEG-PPG-PEG-NTA | |
Pluronic F-108 | Sigma | 542342-250G | PEG-PPG-PEG |
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 21-403-190 | |
Toluene | Fisher Chemical | T324 | Toxic |
Tubulin, HiLyte647-labeled | Cytoskeleton, Inc. | TL670M | |
UV Ozone Procleaner | BioForce Nanosciences | PC440 | |
Whatman Puradisc syringe filters | Sigma | WHA67840402 | |
Zyla 4.2 sCMOS Camera | Andor Technology | sCMOS 4.2 |