Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Montering av molekylär skyttlar drivs av reversibelt bifogas Kinesins

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/59068
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att bygga molekylär skyttlar, där ytan-följs kinesin motorproteiner driva dye-märkt mikrotubuli. Svag växelverkan mellan kinesins med ytan gör deras reversibla bilaga. Detta skapar ett nanoskala system som uppvisar dynamiska montering och demontering av dess komponenter samtidigt behålla dess funktionalitet.

Abstract

Detta protokoll beskriver hur du skapar kinesin-drivna molekylär transfer med en svag och reversibel fastsättning av kinesins ytan. I motsats till föregående protokoll, i detta system, mikrotubuli rekrytera kinesin motorproteiner från lösningen och placera dem på en yta. Kinesins, i sin tur underlättar glida av mitotiska längs ytan innan desorbing tillbaka till den bulk lösningen, således är tillgängliga ska rekryteras igen. Denna kontinuerlig montering och demontering leder till slående dynamiska beteende i systemet, såsom bildandet av tillfälliga kinesin spår av segelflyg mikrotubuli.

Flera experimentella metoder kommer att beskrivas i hela detta experiment: UV-Vis spektrofotometri används för att bestämma koncentrationen av stamlösningar av reagenser, coverslips kommer först att ozon och ultraviolett (UV) behandlas och sedan silaniserad innan monteras i flödesceller och Totalreflexion fluorescens används (Frida) mikroskopi till samtidigt bild kinesin motorer och mikrotubuli filament.

Introduction

De interaktioner som styr beteendet hos aktiva nanosystem har alltid präglats av långlivat, nästan oåterkalleliga obligationer1,2,3,4,5,6 ,7,8. En väl studerat exempel på detta är det mikrotubulära-kinesin systemet, där glidförmåga mikrotubuli framdrivas av irreversibelt yta-bundna kinesin motorer1,2,3,4, 5. System där komponenterna är reversibelt anslutna till varandra har varit studerade teoretiskt9,10 och uppnås på macroscale11,12, men skalning dessa system ner till den nanoskala har varit utmanande. En av de främsta orsakerna till detta är att bryta och reformera obligationer mellan komponenterna ofta kräver en stor förändring under miljöförhållandena. Även om sådana förändringar har genomförts i den senaste13,14,15, skulle de förlitar sig på ändra själva systemet i stället för att anpassa sig till sin miljö. Utforma molekylär skala system där komponenter kontinuerligt montera och omorganisera i strukturer utan att störa den totala miljön där experimenten äger rum kommer att öppna dörren till utforskning av ett brett utbud av dynamiska beteenden 16 , 17.

Här, vi beskriver och visar det detaljerade protokollet för att skapa ett dynamiskt montering och demontering system fungerar på nanonivå. Systemet och dess allmänna beteende har varit introducerade tidigare18: mikrotubuli filament framdrivas av spår av reversibelt yta-bundna kinesin-1 motorer. Dessa kinesin motorproteiner rekryteras från lösningen för att hjälpa driva mikrotubuli framåt, innan desorbing igen strax efteråt. När tillbaka i lösningen, kan vara rekryterade de igen för att driva en ny mikrotubuli. I den tidigare13,14,krävs15, breaking och reformera obligationer miljömässiga ändringar; Däremot förblir miljön i vårt flöde cell oförändrat medan kinesin motorerna samverkar med ytan.

Detta protokoll kommer att hjälpa intresserade forskare att (1) visualisera alla steg i protokollet, och (2) hjälpa till med felsökning av denna typ av analys. Det har hämtats från de förfaranden som beskrivs i Howard et al. 199319.

Protocol

1. lösningen förberedelse

FÖRSIKTIGHET: Tre av de reagens som används i detta protokoll (toluen, dimetyldiklorosilan och Ditiotreitol) är mycket giftiga. Kontakta de relevanta säkerhetsdatablad (MSDS) före användning. Dessutom behöver delar av detta protokoll utföras under en högre skyddsnivå, bär skyddsglasögon och två uppsättningar av skyddshandskar som anges. Om inte annars rådde, kan experimenten utföras på lab bänkar medan du använder alla de lämplig personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, handskar, labbrock, full längd byxor och stängd tå skor).

Obs: Koncentrationerna av ATP, kinesin och mikrotubuli som används i detta protokoll kan ändras med tanke på behoven hos varje experiment. Dock om ändras, se till att de slutliga koncentrationerna av andra reagenser förblir detsamma som anges nedan. Alla experimenten utfördes vid rumstemperatur, (~ 25 ° C).

  1. Beredning av stamlösningar
    Obs: Förbereda och alikvotens följande lösningar i förväg. Alla portioner kan tillagas vid rumstemperatur (~ 25 ° C).
    1. BRB80 buffert
      Obs: Bufferten för de flesta av de lösningar som används i detta protokoll är BRB80. BRB80 kan förberedas i stora mängder och lagras i-20 ° C frys.
      1. Lös 24,2 g piperazin-N, N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (rör) och 3,1 g kaliumhydroxid (KOH) i 800 mL avjoniserat vatten för att göra 800 mL 100 mM rör. Tillsätt 100 mL 10 mM magnesiumklorid (MgCl2) och 100 mL 10 mM etylenglykol tetraacetic acid (EGTA) för att få en slutlig volym av 1 L. att lyfta pH till 8 med kaliumhydroxid (KOH) kan hjälpa i upplösningen av rör och EGTA.
        Obs: De slutliga koncentrationerna av kemikalier i BRB80 bufferten är 80 mM rör, 1 mM MgCl2och 1 mM EGTA.
      2. Justera pH-värdet i bufferten till 6,9 använder KOH och saltsyra (HCl).
    2. ATP
      1. Bered en 1 mL 100 mm ATP i ultrarent vatten. Pipettera lösningen till 10 μL alikvoter. Förvaras i alikvoter i-80 ° C frys.
    3. GTP
      1. Bered en 500 μL av 25 mM GTP i ultrarent vatten. Pipettera lösningen till 5 μL alikvoter. Förvaras i alikvoter i-80 ° C frys.
    4. MgCl2
      1. Bered en 1 mL 100 mm MgCl2 i ultrarent vatten. Pipettera lösningen till 10 μL alikvoter. Förvaras i alikvoter i-20 ° C frys.
    5. Kasein
      1. Väg 1 g kasein, torr och överföra den till en 50 mL konisk centrifugrör. Tillsätt 35 mL BRB80 buffert till röret till kasein-Pulvret löses upp.
      2. Lägg lösningen i en torktumlare i ett kallt rum att upplösa över natten. Vid denna punkt, ser lösningen tjockt och trögflytande.
      3. Lämna tuben upprätt i kylskåp 4 ° C för alla stora oupplösta klumpar sedimentera. Överför supernatanten till en ny tub.
      4. Snurra röret i en centrifug vid 1 000 x g till pellet ut mer fällningar. Återigen, överför supernatanten till en ny tub.
      5. Upprepade gånger filtrera lösningen med 0,2 μm (7 bar maxtryck) filter. Lösningen att vara tjock, många filter är kommer att bli igensatta, så upprepa detta steg tills filtret är klart och unclogged.
      6. Bestämma kasein koncentration i den färdiga lösningen använder UV/Vis spektrofotometri, använda kaseins extinktionskoefficient 19 mM-1∙cm-1 vid 280 nm20. Förutsatt att en molekylvikt av 23 kDa för kasein, späd lösningen till en koncentration av 20 mg∙mL-1 i BRB80.
      7. Pipettera lösningen till 20 μL alikvoter och förvaras i alikvoter i-20 ° C frys.
    6. D-glukos
      1. Bered en 1 mL 2 M D-glukos i ultrarent vatten. Pipettera lösningen till 10 μL alikvoter. Förvaras i alikvoter i-20 ° C frys.
    7. Glukosoxidas
      1. Bered en 1 mL av 20 mg∙mL-1 glukosoxidas i BRB80. Pipettera lösningen till 10 μL alikvoter. Förvaras i alikvoter i-20 ° C frys.
    8. Katalas
      1. Bered en 1 mL av 0.8 mg∙mL-1 katalas i BRB80. Pipettera lösningen till 10 μL alikvoter. Förvaras i alikvoter i-20 ° C frys.
    9. Ditiotreitol (DTT)
      Obs: Eftersom DTT är något volatil och giftiga, vänligen gör följande under ett dragskåp.
      1. Bered en 1 mL 1 m DTT utspätt i ultrarent vatten. Pipettera lösningen till 10 μL alikvoter. Förvaras i alikvoter i-20 ° C frys.
    10. Paklitaxel
      1. Bered en 1 mL av 1 mM paklitaxel utspätt i DMSO. Pipettera lösningen till 10 μL alikvoter. Förvaras i alikvoter i-20 ° C frys.
    11. Dimetyl sulfoxid (DMSO)
      Obs: Den DMSO används i dessa experiment är ren.
      1. Pipettera 1 mL ren DMSO till 10 μL alikvoter. Förvaras i alikvoter i-20 ° C frys.
    12. Kreatinfosfat
      1. Bered en 1 mL av 0,2 M kreatinfosfat i ultrarent vatten. Pipettera lösningen till 10 μL alikvoter. Förvaras i alikvoter i-20 ° C frys.
    13. Kreatinfosfokinas
      1. Förbereda en 1 mL lösning av 200 units· L-1 kreatinfosfokinas i ultrarent vatten. Pipettera lösningen till 10 μL alikvoter. Förvaras i alikvoter i-20 ° C frys.
    14. Nickel (II) sulfat
      1. Förbereda 500 mL av en lösning av 50 mM nickel (II) sulfat i ultrarent vatten. Förvara lösningen i rumstemperatur (~ 25 ° C).
    15. Poly(ethylene glycol)-block-poly(propylene glycol)-block-poly(ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG) lösning
      1. Väg upp 2 mg PEG-PPG-PEG (antal genomsnittlig molekylvikt: 14,600 g∙mol-1)-NTA pulver på väger papper. PEG-PPG-PEG-NTA är den triblock sampolymer functionalized med en nitrilotriacetic syra (NTA) grupp. Se Tabell för material för mer detaljer om PEG-PPG-PEG-NTA.
      2. Överföra pulvret i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Tillsätt 1 mL stamlösning nickel (II) sulfat till röret. Vortex tills pulvret är upplöst och utan synliga klumpar kvar.
      3. Butik för upp till en månad i rumstemperatur.
  2. Innan du börjar ett experiment
    1. Fyll en hink med is.
    2. Ta en alikvot från vart och ett av de 13 reagens som beskrivs i avsnitt 1.1.1 till 1.1.13 ovan och lägga till dem i hinken, därmed hålla dem på isen. Tina var och en av reagenser före användning.
  3. Mikrotubuli förberedelse
    Obs: Mikrotubuli var polymeriserat från en 20 μg alikvot av färgämne-märkt frystorkade tubulin. Magnetiseringen våglängd färgämnet är av 647 nm.
    1. Beredning av mikrotubuli tillväxt bufferten
      1. Pipettera 21,8 μL BRB80 buffert i en liten (0,6 mL) mikrocentrifug rör. Tillsätt 1 μL MgCl2 stamlösning, 1 μL av GTP stamlösning och 1,2 μl av DMSO stamlösning.
        Obs: Således de slutliga koncentrationerna av reagenserna i BRB80 bufferten är 4 mM MgCl2, 1 mM GTP och 5% (v/v) dimetyl sulfoxid.
    2. Mikrotubuli polymerisation
      1. Lägg till 6,25 μL av mikrotubuli tillväxt buffert direkt i en 20 μg alikvot av märkt frystorkade tubulin. Vortex alikvoten för 5 s vid 30 rps.
      2. Cool alikvoten på is för 5 min innan ruvning det vid 37 ° C i 45 min och gå vidare till avsnitt 1.3.3.
    3. Mikrotubuli stabilisering
      1. Tillsätt 5 μL av aliquoted paklitaxel lösningen till 490 μL BRB80 buffert. Vortex lösningen för 10 s vid 30 rps.
      2. När den 45 min inkubering för mikrotubuli är upp, lägger till i BRB80/paklitaxel lösningen 5 μL av polymeriserat mikrotubulära lösningen.
        Obs: Denna 100-faldig utspädning, stabiliserad, mikrotubuli lösning kommer att vara hädanefter MT100. Det kan användas för upp till 5 dagar, och det kan spädas för att erhålla önskad mikrotubulära densiteten för varje experiment.
  4. Motilitet lösning
    1. Enzymatisk antifade, ATP regenererande system och ATP
      1. Lägga till 9,0 μL av aliquoted kasein lösningen till 291 μL BRB80 buffert.
      2. Om önskad ATP koncentrationen för experimentet är lägre än 1 mM, Pipettera 83 μL av BRB80/kasein lösningen till en ny 0,6 mL mikrocentrifug rör. Annars, Pipettera 85 μL av lösningen till en ny 0,6 mL mikrocentrifug rör.
      3. Tillsätt 1 μL av D-glukos, 1 μL av glukosoxidas, 1 μL av katalas och 1 μL av DTT till att röret.
        Obs: Dessa kemikalier utgör en enzymatisk antifade cocktail21 som kommer att minska fotoblekning genom att avlägsna upplöst syre och snabbkylning reaktiva radikaler. Detta minskar fotoblekning och mikrotubuli sönderfall som orsakas av magnetiseringen belysningen under fluorescens imaging22,23.
      4. För experiment som ATP koncentrationen är valt att vara betydligt lägre än 1 mM, lägga till följande reagenser till lösning för att skapa en ATP-regenererande system: 1 μL aliquoted kreatinfosfat lösningen och 1 μL aliquoted kreatin kreatinfosfokinas lösning.
      5. Tillsätt 1 μL ATP stamlösning till motilitet lösningen. Flick eller virvel alikvoten likartad distribuera kemikalier.
        Obs: Således den slutliga koncentrationen av kemikalier i lösningen är 10 μM paklitaxel, 0,5 mg·mL−1 kasein, 20 mM D-glukos, 200 μg·mL−1 glukosoxidas, 8 μg·mL−1 katalas, 10 mM Ditiotreitol, 2 mM kreatinfosfat (om lagt), 2 units· L−1 kreatinfosfokinas (om lagt), och 1 mM ATP. Denna lösning kommer att vara hädanefter motilitet lösningen.
    2. Kinesin
      Obs: Lager kinesin lösningen används i dessa experiment är utarbetats av G. Bachand vid centrum för integrerad nanoteknik vid Sandia National Laboratories och görs tillgängliga under ett användaravtal (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php). den buffert som används här består av 40 mM Imidazol, 300 mM NaCl, 0,76 g· L-1 EGTA, 37,2 mg· L-1 EDTA, 50 g· L-1 sackaros, 0,2 mM TCEP och 50 μM Mg-ATP. För denna serie av experiment användes den rkin430eGFP kinesin konstruktion. Detta är en kinesin bestående av de första 430 aminosyrorna av råtta kinesin tung kedja smält till andra och en C-terminal hans-tagg på svans domän24. Det uttrycktes i Escherichia coli och renas med hjälp av en Ni−NTA kolumn. Koncentrationen av GFP-kinesin stamlösning var 1,8 ± 0,3 μM som bestäms av UV/Vis spektrofotometri, använder en extinktionskoefficient för GFP 55 mM-1·cm-1 489 nm25, och med hänsyn till att kinesin är en dimer.
      1. Bestämma önskad kinesin koncentration eller yta tätheten för experimentet. För typiska analyser, denna koncentration är 20 nM. Om kinesin koncentrationen behöver spädas mer än en hundrafaldigt, späda ut det i en lösning av BRB80 som innehåller 0,5 mg·mL-1 kasein.
      2. Lägga till 1 µL kinesin lösning motilitet lösningen för att få en slutlig koncentration av approximativt 20 nM.
    3. Mikrotubuli
      1. Tillsätt 10 μL av en MT100 lösning beredd enligt avsnitt 1.3 i motilitet lösningen.
        Obs: Denna motilitet lösning kan användas för upp till 3 timmar. Efter den tiden förlorar antifade systemet sin effektivitet eftersom glukos i lösningen är utarmat genom enzymatisk reaktion.

2. montering av flödesceller

  1. Tvättning av coverslips
    1. Använd ett stort täckglas för flödesceller, (dimension: 60 x 25 mm) och en liten en (dimensioner: 22 x 22 mm)19.
    2. Skölj alla coverslips två gånger med etanol och två gånger med ultrarent vatten. Sonikera coverslips i ultrarent vatten för 5 min. torka dem i ugn vid en temperatur av 50 – 75 ° C.
    3. Med hjälp av en UV/ozon renare (se Tabell för material - och tillverkarens anvisningar), behandla ena sidan av varje täckglas för 15 min. utför detta steg kan vid rumstemperatur (~ 25 ° C) och i normala förhållanden (trycket 1 atm).
    4. Slå försiktigt varje täckglas till dess andra sida (med pincett) och UV/ozon behandla denna sida också.
    5. Sonikera coverslips i ultrarent vatten igen för 5 min innan du torkar dem igen i ugn vid en temperatur på 50 – 75 ° C.
  2. Behandling av coverslips aktivera PEG-PPG-PEG beläggning
    Obs: Dimetyldiklorosilan och den toluen som används i denna del av protokollet som mycket giftiga, utför följande steg under dragskåp, medan vidtar följande försiktighetsåtgärder: bära två uppsättningar av skyddshandskar och en långärmad tröja under deras lab kappa. Tuck kanterna av handskar inuti ärmarna på skjortan så att ingen hud från underarmarna är direkt utsatt för kemikalier vid ett spill. Använd skyddsglasögon.
    1. Späd 25 mL ren dimetyldiklorosilan i 475 mL toluen. Doppa varje täckglas i dimetyldiklorosilan och toluen lösningen i 15 sekunder.
    2. Tvätta coverslips två gånger i toluen och tre gånger i metanol. Torka av coverslips med hjälp av trycksatt kväve.
  3. Montering coverslips i flödesceller
    1. När coverslips är torra, skär en 2 x 2,5 cm bit dubbelhäftande tejp vertikalt i två 1 x 2,5 cm ränder.
    2. Sätta det stora täckglaset på en delikat uppgift torkare och sticka tejp ränder på längden längs kanterna av täckglaset skapa ett 1 x 2,5 cm område mellan bitar av tejp.
    3. Sticka de små täckglaset ovanpå tejp ränder till slut flöde cell församlingen.

3. rinner lösningarna till en flöde cell

  1. Flöde approximativt 20 μL av PEG-PPG-PEG lösningen in cellen monterade flöde. Den volym som flygs i cellen måste vara tillräckligt stora för att fylla kammaren. I nästa steg, Använd samma volym när utbyte av lösningarna.
  2. Möjliggöra PEG-PPG-PEG lösningen att absorbera på ytan i 5 minuter. Utbyta PEG-PPG-PEG lösningen med BRB80 buffert 3 gånger av strömmande bufferten i. Flöde motilitet lösningen in cellen flöde.
  3. Försegla kanterna på cellen flöde med fett för att förhindra avdunstning om planerade experimentet är längre än en timme.
    Obs: Cellen flöde är nu redo att avbildas.

4. imaging en flöde cell

  1. Utföra bildtagning med en mål-typ totalreflexion fluorescens (Frida) setup för både mikrotubuli och kinesin motorerna (se Tabell för material).
    Obs: Här använde vi ett Mikroskop med en 100 x / 1,49 numerisk bländarobjektiv, med två lasrar, en med en våglängd på 642 nm och en maximal effekt på 140 mW, och en annan med våglängd av 488 nm och en maxeffekt på 150 mW.
  2. Placera en droppe nedsänkning olja på målet.
  3. Placera cellen flöde på Mikroskop plattform och föra målet tills det finns kontakt mellan oljan på målet och cellen flöde.
  4. Använda mikroskopets interlock lock system för att blockera alla laserljus från att fly.
  5. Slå på lasern och fokusera på det lägre ytbehandlar av cellen flöde. Mitotiska fluorescently märks och upphetsad vid en våglängd på 647 nm. De kommer avbildas med en 642 nm laser medan en 488 nm laser används för GFP-kinesin motorerna.
  6. Spela in de bilder eller videor av intresse. Lasereffekten är vanligtvis ca 30 mW och en exponeringstid av 50 ms för både laser kanaler. Bilder kan registreras för så länge det finns motilitet i cellen flöde.
    Obs: Laserbestrålning är skadligt för blotta ögat och kan orsaka irreparabla skador. Se till att det belysta området är helt täckt med en ogenomskinlig lock.

Representative Results

I dessa experiment, använde vi en 1.000 gånger utspädning av de mikrotubuli som förberett i avsnitt 1.3.2. Kinesin koncentrationen var 20 nM, och ATP koncentrationen var 1 mM. Imaging utfördes med hjälp av Frida mikroskopi. Glidförmåga mikrotubuli var separat avbildas från kinesin motorerna: mikrotubuli var synliga vid excitation med 647 nm laser (figur 1, röd) och den GFP-kinesin var synlig när glada med 488 nm laser (figur 1, grön). Tiden mellan excitation med röda och gröna ljuset var mindre än 1 s. Tiden mellan ramar var 10 s. mikrotubuli visas stabil glidförmåga. Den genomsnittliga mikrotubulära glider hastighet var approximativt 800 nm/s. Mikrotubuli Ytors var 400 mm-2. Spår av kinesin (grön) visades att sträcka sig utanför den avslutande änden mitotiska (röd) för flera mikrometer.

Figure 1
Figur 1: segelflyg mikrotubuli drivs av svagt yta-bundna kinesin motorer. Mikrotubuli flyttar framåt, ackumuleras de kinesin motorer från lösningen. Dessa motorer alternerar mellan två stater: singel-bundet till mikrotubuli, och dubbel-bundna till både mikrotubuli och ytan. När en dubbel bundna motor når slutet av mikrotubulära, motorn är kvar och desorbs långsamt från ytan med en off andelen ungefär 0,1 s-1. Som ett resultat, kvar spår av kinesin motorer bakom mikrotubuli. Översta raden: röd (mikrotubuli) kanal. Mellersta raden: grön (kinesin) kanal. Nedersta raden: kombinerad röd (mikrotubuli) och grön (GFP-kinesin) kanal. Skalstapeln: 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

I detta arbete presenterar vi en aktiv nanoskala system som själv monterar svagt bindande byggstenar för att bygga sina egna spår. I figur 1visas glidförmåga mikrotubuli ackumuleras kinesin motorer från lösningen och sätta in dem på ytan. Kinesin motorerna kvar i kölvattnet av mikrotubulära under en kort tid innan han återvände till lösning. Således, i detta experiment, kinesin motorer alternativt mellan 3 stater:

(1) ett mikrotubulära singel-bundna tillstånd: Detta är när en kinesin först binder till en mikrotubuli. Den finns i jämvikt med staten (2).

(2) ett dubbel-bundna tillstånd: i det här fallet en mikrotubulära singel-bundna kinesin binder också till den ytan via dess His-tag. Detta dubbel-bundna tillstånd tillåter mikrotubulära framdrivning.

(3) en enda yta-bundna stat: en dubbel-bundna kinesin som har gått bort i slutet av mikrotubulära och har inte ännu desorberats ur ytan är i detta tillstånd. Dessa motorer kan observeras i figur 1 (kombinerade och gröna kanaler): de förlänga bakom svansen av mikrotubulära för flera mikrometer och bildar dess minskande trail.

Det mest kritiska steget i detta protokoll är bildandet av hydrofoba ytan i bilden. Inte bara är det använda farliga kemikalier, men det gör också att PEG-PPG-PEG functionalized med NTA gruppen att belägga ytan, som sedan gör kinesin reversibelt binda till ytan. Ett annat viktigt steg tätning cellen flöde med fett. Detta möjliggör långvarig imaging utan vätskan i den flöde cell indunstning.

De primära ändringarna till denna teknik består av ändra mikrotubulära koncentration, kinesin koncentration och ATP koncentrationen. Om du ändrar mikrotubulära koncentration kommer antalet mikrotubuli glida på ytan. Om du ändrar kinesin koncentration kommer antalet kinesin molekyler som kan binda till mikrotubuli. Dock kunde öka kinesin koncentrationen överstiger de belopp som redan definierats i detta experiment öka bakgrunden fluorescens, vilket gör det svårare att se kinesin spår kvar glida mikrotubuli. Samtidigt kommer att sänka ATP koncentrationerna under 10 µM signifikant sänka mikrotubulära glider hastighet. Om denna effekt önskas, är det nödvändigt att utnyttja en ATP regenererande system bestående av kreatin fosfatas och kreatinfosfokinas.

En möjlig begränsning av denna teknik är att, på grund av stora aktiva kinesin innehållet i systemet, ATP kan konsumeras snabbt, och experiment kan vara mindre än en timme under vissa förhållanden. Detta skulle exempelvis vara fallet om ett används en tvåfaldigt högre kinesin koncentration och fem gånger högre mikrotubulära koncentration än vad som presenteras i detta protokoll.

I vårt tidigare arbete18, vi studerat den rumsliga fördelningen av kinesin motorer längs mikrotubuli, bevisar att gliding mikrotubuli ackumulera kinesin motorer från lösning, vilket ger en ökning av tätheten av motorer längs längden av den mikrotubuli. Vi fann också att den mitotiska glidförmåga stabilitet visat en ickelinjär beroende på lösning kinesin koncentration och mikrotubuli hastigheten.

Presenterade protokollet banar väg för en mer effektiv användning av protein motorer i nanoskala engineered systems och för vidare utredning i utformningen av aktiva nanosystem som finns i dynamisk jämvikt. Dessutom tillåter den dynamiska karaktären av detta system för att tjäna som modellsystem för att studera självläkande och dynamiskt utbyte av molekylära komponenter, stänga en del av klyftan mellan utvecklade och naturliga strukturer.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna erkänner tacksamt ekonomiskt stöd enligt NSF bevilja NSF-DMR 1807514. Författarna tackar G. Bachand och V. Vandelinder för att ge proteinet GFP-kinesin. Detta arbete utfördes, delvis vid centrum för integrerad nanoteknik, en Office av vetenskap användaren anläggning drivs för den oss Department of Energy (DOE) Office of Science från Los Alamos National Laboratory (kontrakt nr. DE-AC52-06NA25396) och Sandia National Laboratories (con-tarmkanalen nr 97 DE-AC04-94AL85000). Författarna tackar Dr. Jennifer Neff och AllVivo kärl för sin gåva av PEG-PPG-PEG functionalized med NTA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
488 nm laser Omicron Laserage LuxX 488-150
642 nm laser Omicron Laserage LuxX 642
Casein Sigma C7078-500G
Catalase from bovine liver Sigma C40-500MG
Creatine Phosphate Sigma P-7936
Creatine Phosphokinase Sigma C3755-500UN
D-Glucose Sigma G2133-50KU
Dichlorodimethylsilane solution Sigma 40140-25ML Toxic
Dimethyl Sulfoxide Sigma 34869-100ML
Dithiothreitol Sigma D0632-5G Toxic
Eclipse TI Nikon Instruments
eGFP rkin430 Provided by George Bachand
EGTA Sigma E4378-25G
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49A
Glucose Oxidase Sigma G0543-10KU
Guanosine Triphosphate Sigma G8877-10MG
Kimwipes Delicate Task Wipers Sigma Pharmaceuticals 8089
Magnesium Chloride Sigma M1028-100ML
Methanol Fisher Chemical A412 Toxic
Milli-Q Water Purification System Millipore Corporation
Nickel Sulfate Sigma 656895-50G
Paclitaxel Sigma T1912-5MG
PIPES Sigma P-6757
Pluronic F108-NTA Provided by Jennifer Neff and AllVivo Vascular PEG-PPG-PEG-NTA
Pluronic F-108 Sigma 542342-250G PEG-PPG-PEG
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 21-403-190
Toluene Fisher Chemical T324 Toxic
Tubulin, HiLyte647-labeled Cytoskeleton, Inc. TL670M
UV Ozone Procleaner BioForce Nanosciences PC440
Whatman Puradisc syringe filters Sigma WHA67840402
Zyla 4.2 sCMOS Camera Andor Technology sCMOS 4.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vale, R. D., Reese, T. S., Sheetz, M. P. Identification of a Novel Force-Generating Protein, Kinesin, Involved in Microtubule-Based Motility. Cell. 42, 39-50 (1985).
  2. Ray, S., Meyhofer, E., Milligan, R. A., Howard, J. Kinesin Follows the Microtubule's Protofilament Axis. Journal of Cell Biology. 121, 1083-1093 (1993).
  3. Dennis, J. R., Howard, J., Vogel, V. Molecular shuttles: directed motion of microtubules along nanoscale kinesin tracks. Nanotechnology. 10, 232-236 (1999).
  4. Kawamura, R., Kakugo, A., Osada, Y., Gong, J. P. Microtubule bundle formation driven by ATP: the effect of concentrations of kinesin, streptavidin and microtubules. Nanotechnology. 21, 145603 (2010).
  5. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in Insect Cells Improves Microtubule in Vitro Gliding Performance, Long-Term Stability and Guiding Efficiency in Nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15, 62-69 (2016).
  6. Whitesides, G. M., Grzybowski, B. Self-assembly at all scales. Science. 295, 2418-2421 (2002).
  7. Ringler, P., Schulz, G. E. Self-assembly of proteins into designed networks. Science. 302, 106-109 (2003).
  8. Boncheva, M., et al. Magnetic self-assembly of three-dimensional surfaces from planar sheets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 3924-3929 (2005).
  9. England, J. L. Dissipative adaptation in driven self-assembly. Nature Nanotechnology. 10, 919 (2015).
  10. Fialkowski, M., et al. Principles and Implementations of Dissipative (Dynamic) Self-Assembly. The Journal of Physical Chemistry B. 110, 2482-2496 (2006).
  11. Boncheva, M., Whitesides, G. M. Self-healing systems having a design stimulated by the vertebrate spine. Angewandte Chemie-International Edition. 42, 2644-2647 (2003).
  12. Rubenstein, M., Cornejo, A., Nagpal, R. Programmable self-assembly in a thousand-robot swarm. Science. 345, 795-799 (2014).
  13. Plaisted, T. A., Vakil Amirkhizi, A., Arbelaez, D., Nemat-Nasser, S. C., Nemat-Nasser, S. Self-healing structural composites with electromagnetic functionality. Proceedings of the Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. 5054, 372-381 (2003).
  14. Ghosh, S. K. Self-Healing Materials. Ghosh, S. K. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim. 1-28 (2009).
  15. Burnworth, M., et al. Optically healable supramolecular polymers. Nature. 472, (2011).
  16. Bachand, G. D., Spoerke, E. D., Stevens, M. J. Microtubule-Based Nanomaterials: Exploiting Nature's Dynamic Biopolymers. Biotechnology and Bioengineering. 112, 1065-1073 (2015).
  17. Gao, Y. W., Lei, F. M. Small scale effects on the mechanical behaviors of protein microtubules based on the nonlocal elasticity theory. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387, 467-471 (2009).
  18. Lam, A. T. -C., Tsitkov, S., Zhang, Y., Hess, H. Reversibly Bound Kinesin-1 Motor Proteins Propelling Microtubules Demonstrate Dynamic Recruitment of Active Building Blocks. Nano Letters. 18, 1530-1534 (2018).
  19. Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods in Cell Biology. 39, 137-147 (1993).
  20. Huppertz, T., Fox, P. F., Kelly, A. L. Proteins in Food Processing (Second Edition). Yada, R. Y. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 49-92 (2018).
  21. Wettermark, G., Borglund, E., Brolin, S. E. A regenerating system for studies of phosphoryl transfer from ATP. Analytical Biochemistry. 22, 211-218 (1968).
  22. Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. Journal of Cell Biology. 107, 1011-1024 (1988).
  23. Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15, S540-S548 (2004).
  24. Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. EMBO Journal. 20, 5101-5113 (2001).
  25. Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 73, 2782-2790 (1997).

Tags

Ingenjörsvetenskap motorer fråga 143 nanobioteknik molekylär skyttlar mikrotubuli kinesin vändbar bindande dynamisk självmontering
Montering av molekylär skyttlar drivs av reversibelt bifogas Kinesins
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bassir Kazeruni, N. M., Tsitkov, S., … More

Bassir Kazeruni, N. M., Tsitkov, S., Hess, H. Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins. J. Vis. Exp. (143), e59068, doi:10.3791/59068 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter