Levadura como chasis para el desarrollo de ensayos funcionales para estudiar P53 humanos

Resumen

Aquí se presentan cuatro protocolos para construir y explotar cepas de reporteros de Saccharomyces cerevisiae para estudiar el potencial de transactivación P53 humano, los impactos de sus diversas mutaciones asociadas al cáncer, las proteínas interexpresas que interactúan y las proteínas interexpresas que interactúan, y los efectos de moléculas pequeñas específicas.

Resumen

La constatación de que la conocida proteína P53 de mamíferopuede actuar como un factor de transcripción (TF) en la levadura S. cerevisiae ha permitido el desarrollo de diferentes ensayos funcionales para estudiar los impactos de 1) sitio de unión [es decir, elemento de respuesta (RE)] variantes de secuencia en la especificidad de la transactivación P53 o 2) mutaciones TP53, cofactores co-expresados o moléculas pequeñas en la actividad de transactivación P53. Se han desarrollado diferentes aplicaciones de investigación básica straslacional. Experimentalmente, estos enfoques aprovechan dos grandes ventajas del modelo de levadura. Por un lado, la facilidad de edición del genoma permite la construcción rápida de sistemas de reporteros cualitativos o cuantitativos mediante la explotación de cepas isogénicas que difieren sólo a nivel de un P53-RE específico para investigar la especificidad de la secuencia de P53 dependiente transactivación. Por otro lado, la disponibilidad de sistemas regulados para la expresión ectópica P53 permite la evaluación de la transactivación en una amplia gama de expresión proteica. En este informe se revisan sistemas ampliamente utilizados que se basan en genes de reporteros de color, luciferasa, y el crecimiento de la levadura para ilustrar sus principales pasos metodológicos y evaluar críticamente su poder predictivo. Además, la versatilidad extrema de estos enfoques se puede explotar fácilmente para estudiar diferentes TF, incluyendo P63 y P73, que son otros miembros de la familia de genes TP53.

Introducción

La transcripción es un proceso extremadamente complejo que implica la organización dinámica, espacial y temporal de factores de transcripción (TF) y cofactores para el reclutamiento y modulación de arnmerasas en regiones de cromatina en respuesta a estímulos específicos¹ . La mayoría de los TF, incluido el supresor de tumores P53 humano, reconocen elementos específicos de acción cis en forma de secuencias de ADN llamadas elementos de respuesta (RE), que consisten en motivos únicos (o múltiples) únicos de 6-10 de largo. Dentro de estos motivos, las posicionesindividuales pueden mostrar varios grados de variabilidad 2, gen....

Protocolo

1. Construcción de cepas de levadura de reportero ADE2 o LUC1 que contengan un RE específico (yAFM-RE o yLFM-RE)

1. Racha una cepa yAFM-ICORE o yLFM-ICORE^12,14 (ICORE - I, ISce-I endonucleasa bajo el promotor GAL1; CO - contador seleccionable URA3; RE - reportero KanMX4 que confiere resistencia a la kanamicina; Tabla 1) de un stock de glicerol del 15% almacenado a -80 oC en una placa de agar YPDA (Tabla 2). Dejar crecer durante 2-3 días a 30oC.
2. Tome una colonia de levaduras de la placa fresca (no más de 3 semanas de....

Resultados

Construcción de ADE2 o LUC1 reportero tensións de levadura

Eldelitto perfettoapproach^12,14,15,16 ha sido adaptado para permitir la construcción de cepas de levadura de reportero P53 (Figura

Discusión

Los ensayos a base de levadura han demostrado ser útiles para investigar varios aspectos de las funciones de la proteína P53. Estos ensayos son particularmente sensibles para evaluar el potencial de transactivación De53 hacia variantes de sitios objetivo RE, incluida la evaluación de polimorfismos funcionales. El uso de reporteros de color, así como la miniaturización del ensayo de luciferasa resultan en ensayos rentables y relativamente escalables. Además, la prueba de inhibición del crecimiento es potencialmente suscep.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido L-aspártico	SIGMA	11189
QIAquick PCR Kit de purificación	QIAGEN	28104
L-fenilalanina	SIGMA	78019
Peptona	BD Bacto	211677
Levadura ex+A2:C26tract	BD Bacto	212750
Difco Levadura Base de nitrógeno sin aminoácidos y sulfato de amonio	BDTM	233520
Acetato de litio dihidratado	SIGMA	517992
Agar bacteriológico tipo A	Biokar Diagnostics	A1010 HA
G418 sal de disulfato	SIGMA	A1720
Sulfato de amonio	SIGMA	A2939
L-arginina Monoclorhidrato	SIGMA	A5131
Sal de hemisulfato de adenina	SIGMA	A9126
Tampón de lisis pasiva 5x	PROMEGA	E1941
Sistema de ensayo de luciferasa de glo brillante	PROMEGA	E2620
5-FOA	Zymo Research	F9001
D-(+)-Galactosa	SIGMA	G0750
Ácido L-glutámico	SIGMA	G1251
Dextrosa	SIGMA	G7021
L-Histidina	SIGMA	H8125
L-Isoleucina	SIGMA	I2752
L-Lisina	SIGMA	L1262
L-Leucina	SIGMA	L8000
L-Metionina	SIGMA	M2893
PEG	SIGMA	P3640
D-(+)-Rafinosa Pentahidrato	SIGMA	R0250
L-Serina	SIGMA	S4500
L-Triptófano	SIGMA	T0271
L-Treonina	SIGMA	T8625
Uracilo	SIGMA	U0750
L-Valina	SIGMA	V0500