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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Levadura como chasis para el desarrollo de ensayos funcionales para estudiar P53 humanos

Published: August 4, 2019 doi: 10.3791/59071
Automatic Translation
1, 2, 3, *3, *1, *2
1Mutagenesis and Cancer Prevention Unit, Ospedale Policlinico San Martino, 2Department CIBIO, University of Trento, 3LAQV/REQUIMTE, Laboratory of Microbiology, Faculty of Pharmacy, University of Porto
* These authors contributed equally

Summary

Aquí se presentan cuatro protocolos para construir y explotar cepas de reporteros de Saccharomyces cerevisiae para estudiar el potencial de transactivación P53 humano, los impactos de sus diversas mutaciones asociadas al cáncer, las proteínas interexpresas que interactúan y las proteínas interexpresas que interactúan, y los efectos de moléculas pequeñas específicas.

Abstract

La constatación de que la conocida proteína P53 de mamíferopuede actuar como un factor de transcripción (TF) en la levadura S. cerevisiae ha permitido el desarrollo de diferentes ensayos funcionales para estudiar los impactos de 1) sitio de unión [es decir, elemento de respuesta (RE)] variantes de secuencia en la especificidad de la transactivación P53 o 2) mutaciones TP53, cofactores co-expresados o moléculas pequeñas en la actividad de transactivación P53. Se han desarrollado diferentes aplicaciones de investigación básica straslacional. Experimentalmente, estos enfoques aprovechan dos grandes ventajas del modelo de levadura. Por un lado, la facilidad de edición del genoma permite la construcción rápida de sistemas de reporteros cualitativos o cuantitativos mediante la explotación de cepas isogénicas que difieren sólo a nivel de un P53-RE específico para investigar la especificidad de la secuencia de P53 dependiente transactivación. Por otro lado, la disponibilidad de sistemas regulados para la expresión ectópica P53 permite la evaluación de la transactivación en una amplia gama de expresión proteica. En este informe se revisan sistemas ampliamente utilizados que se basan en genes de reporteros de color, luciferasa, y el crecimiento de la levadura para ilustrar sus principales pasos metodológicos y evaluar críticamente su poder predictivo. Además, la versatilidad extrema de estos enfoques se puede explotar fácilmente para estudiar diferentes TF, incluyendo P63 y P73, que son otros miembros de la familia de genes TP53.

Introduction

La transcripción es un proceso extremadamente complejo que implica la organización dinámica, espacial y temporal de factores de transcripción (TF) y cofactores para el reclutamiento y modulación de arnmerasas en regiones de cromatina en respuesta a estímulos específicos1 . La mayoría de los TF, incluido el supresor de tumores P53 humano, reconocen elementos específicos de acción cis en forma de secuencias de ADN llamadas elementos de respuesta (RE), que consisten en motivos únicos (o múltiples) únicos de 6-10 de largo. Dentro de estos motivos, las posicionesindividuales pueden mostrar varios grados de variabilidad 2, generalmente resumidos por matrices de peso de posición (PWM) o logotipos3,4.

La levadura S. cerevisiae es un sistema modelo adecuado para el estudio de diferentes aspectos de las proteínas humanas a través de ensayos de complementación, expresión ectópica y ensayos funcionales, incluso cuando un gen de levadura ortopélogono no está presente5, 6 , 7. Debido a la conservación evolutivade los componentes basales del sistema transcripcional 8, muchos TF humanos (cuando se expresan ectopticamente en células de levadura) pueden modular la expresión de un gen reportero actuando a través de promotores contienen REE apropiados. El sistema de modelo de transcripción presentado aquí para P53 humano se caracteriza por tres variables principales cuyos efectos pueden ser modulados: 1) la modalidad de expresión y el tipo de P53, 2) la secuencia RE que controla la transcripción dependiente de P53, y 3) el tipo de gen del reportero (Figura1A).

En cuanto a la modalidad de expresión P53, S. cerevisiae permite la elección de promotores inducibles, represibles o constitutivos9,10,11. En particular, el promotor inducible GAL1 permite la expresión basal (usando la rafinosa como fuente de carbono) o variable (cambiando la cantidad de galactosa en los medios) de un TF en la levadura. De hecho, la expresión finamente ajustable representa un desarrollo crítico para el estudio no sólo P53 sí mismo, sino también otras proteínas de la familia P5312,13.

En cuanto al tipo de RE que controlan la expresión dependiente de P53, S. cerevisiae permite la construcción de diferentes cepas de reportero que poseen diferencias únicas en el RE de interés en un fondo isogénico. Este objetivo se alcanza mediante una adaptación de un enfoque de edición del genoma particularmente versátil desarrollado en S. cerevisiae,llamado delitto perfetto12,14,15,16.

Además, se pueden utilizar diferentes genes de reportero (es decir, URA3, HIS3 y ADE2) para evaluar cualitativa y cuantitativamente las actividades transcripcionales de los FE humanos en S. cerevisiae,cada uno con características específicas que pueden adaptarse a las necesidades experimentales17,18,19,20,21. La expresión de estos genes reportero confiere uracilo, histidina y protrotrofia de adenina, respectivamente. El reportero de URA3 no permite el crecimiento de células en presencia de 5-FOA también, y por lo tanto puede ser contraseleccionado. El sistema de reporteros ADE2 tiene la ventaja de que, además de la selección nutricional, permite la identificación de células de levadura que expresan tipo salvaje (es decir, funcional en expresión ADE2) o mutantes (es decir,no funcionales en ADE2 ) P53 del color de la colonia.

Por ejemplo, las células de levadura que expresan el gen ADE2 generan colonias blancas de tamaño normal en placas que contienen cantidades limitantes de adenina (2,5-5,0 mg/L), mientras que las que pobremente o no transcriben aparecen en la misma placa que el rojo más pequeño (o rosa) Colonias. Esto se debe a la acumulación de un intermedio en la vía biosintética de adenina (es decir, P-ribosylamino-imidazol, que anteriormente se ha llamado amino-imidazol ribotida o AIR), que se convierte para formar un pigmento rojo. El gen cualitativo reportero ADE2 basado en color ha sido reemplazado por el cuantitativo Firefly Photinus pyralis (LUC1)12,22. Más recientemente, el reportero de ADE2 se ha combinado con el reportero de lacZ en un ensayo de reportero doble, semicuantitativo y fácil de obtener que puede ser explotado para subclasificar mutantes P53 de acuerdo con su nivel residual de funcionalidad 23.

También se han utilizado reporteros fluorescentes como EGFP (proteína fluorescente verde mejorada) o DsRed (Discosoma sp. proteína fluorescente roja) para la evaluación cuantitativa de la actividad de transactivación asociada con todas las posibles mutaciones de SECUENCIA de codificación TP5324. Por último, la posibilidad de combinar promotores ajustables para la expresión de alelo P53 con cepas de levadura isogénicas diferentes para el gen RE y/o reportero ha llevado al desarrollo de una matriz de datos que genera una clasificación refinada de las cepas de mutantes P53 alelos25,26,27.

Los enfoques descritos anteriormente se utilizan para medir la actividad transcripcional de la proteína P53. Sin embargo, la expresión de tipo salvaje P53 en la levadura S. cerevisiae28 y Schizosaccharomyces pombe29 puede causar retraso en el crecimiento, que se ha asociado con la detención del ciclo celular28,30 o muerte celular31. En ambos casos, la inhibición del crecimiento de la levadura se desencadena por una alta expresión de P53 y se ha correlacionado con la posible modulación transcripcional de genes de levadura endógenos implicados en el crecimiento celular. Apoyando esta hipótesis, el mutante de pérdida de función P53 R273H no interfirió con el crecimiento de las células de levadura cuando se expresa en niveles similares a P5332de tipo salvaje. Por el contrario, la expresión en levadura del mutante tóxico P53 V122A (conocido por una mayor actividad transcripcional en comparación con el tipo salvaje P53) causó un efecto inhibidor del crecimiento más fuerte que el tipo salvaje P5332.

Además, se demostró que el MDM2 humano fue capaz de inhibir la actividad transcripcional humana P53 en la levadura, promoviendo su ubiquitinación y posterior degradación33. En consecuencia, se demostró la capacidad de MDM2 humano y MDMX para inhibir la inhibición del crecimiento de levadura inducida por P5332,34. En un estudio adicional, se estableció una correlación entre la actividad transcripcional P53 y los niveles de expresión de actina, con la identificación de un putativo P53 RE aguas arriba en el gen ACT1 en la levadura32. Consistentemente, la expresión de actina fue mejorada por P53 de tipo salvaje y aún más por P53 V122A, pero no por el mutante P53 R273H. Por el contrario, la expresión de actina por P53 disminuyó en la copresencia de inhibidores de P53 MDM2, MDMX o pifithrin-o (un inhibidor de molécula pequeña de la actividad transcripcional P53), consistente con resultados basados en el ensayo de crecimiento de levadura. Es importante destacar que estos resultados establecieron una correlación entre la inhibición del crecimiento inducida por P53 y el grado de su actividad en la levadura, que también ha sido explotada para identificar y estudiar moléculas pequeñas que modulan las funciones P5328,34 , 35.

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Protocol

1. Construcción de cepas de levadura de reportero ADE2 o LUC1 que contengan un RE específico (yAFM-RE o yLFM-RE)

  1. Racha una cepa yAFM-ICORE o yLFM-ICORE12,14 (ICORE - I, ISce-I endonucleasa bajo el promotor GAL1; CO - contador seleccionable URA3; RE - reportero KanMX4 que confiere resistencia a la kanamicina; Tabla 1) de un stock de glicerol del 15% almacenado a -80 oC en una placa de agar YPDA (Tabla 2). Dejar crecer durante 2-3 días a 30oC.
  2. Tome una colonia de levaduras de la placa fresca (no más de 3 semanas de edad) y colóquela en un pequeño matraz que contenga 5 ml de YPDA (Tabla2). Incubar a 30oC durante la noche, agitando a 150-200 rpm.
  3. Al día siguiente, para eliminar todos los restos de dextrosa, pellet las células durante 2 min a 3.000 x g y desechar el sobrenadante por inversión del tubo.
    NOTA: Realice todas las centrifugaciones de este protocolo a temperatura ambiente (RT).
  4. Resuspender el pellet celular en 30-50 ml de CM precalentado (medios completos) que contenga galactosa (Tabla 2) e incubar durante 4 h a 30 oC, agitando a 150-200 rpm (necesario para la inducción de I-SceI).
  5. Centrifugar las células durante 2 min a 3.000 x g y desechar el sobrenadante por inversión del tubo.
  6. Resuspenda el pellet celular en 30-50 ml de agua estéril. Repita el paso 1.5.
  7. Resuspenda el pellet celular en 10 ml de agua estéril. Repita el paso 1.5.
  8. Resuspender el pellet celular en 5 mlde LiAcTE estéril (Tabla 3), una solución iónica que favorece la admisión de ADN. Repita el paso 1.5.
  9. Resuspenda el gránulo celular en 250 ml de LiAcTE estéril y transfiera las células a un tubo de 1,5 ml. Repita el paso 1.5 y resuspenda el pellet celular en 300-500 l de LiAcTE estéril.
  10. Durante los lavados, desnaturalice una solución de 10 mg/ml de portador de ADN de esperma de salmón durante 10 minutos a 100 oC y enfríe inmediatamente en hielo para mantenerlo como ADN de una sola cadena.
  11. En un tubo separado de 1,5 ml, añadir 500 picomolas del oligonucleótido deseado (Tabla3), 5 l del ADN portador de espermatozoides de salmón hervido, 300 ml de LiAcTE PEG estéril (Tabla3) y 50 ml de la suspensión de la célula de levadura (del paso 1.9).
  12. Vortex los tubos durante 10 s para mezclar e incubar durante 30 min a 30 oC, agitando a 150-200 rpm. Coloque los tubos de 1,5 ml en el lateral para favorecer el temblor.
  13. Choque por calor de las células de levadura durante 15 min a 42 oC en un bloque de calentamiento, luego centrifugar las células durante 20 s a 10.000 xg. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 ml de agua estéril.
  14. Esparza 100 s de la suspensión celular en la placa de agar YPDA e incuba (al revés) durante 1 día a 30oC. Para asegurar que se obtengan colonias bien separadas, también se extienden 100 l de una dilución de 1:10.
  15. Al día siguiente, placa réplica utilizando terciopelos estériles en placa de agar CM que contiene dextrosa y 5-FOA (Tabla2). Considere una segunda placa de réplica en una placa nueva si se transfieren muchas celdas (es decir, algún crecimiento de células URA3).
  16. Tres días más tarde, placa de réplica en YPDA no selectivo y YPDA que contiene placas de agar G418 (un antibiótico aminoglucósido similar a la kanamicina) (Tabla2), marcando cada placa para facilitar su posterior comparación. Incubar las placas durante la noche a 30oC.
  17. Al día siguiente, identifique las cepas de reporteros candidatos de colonias que son sensibles al G418 pero crecen en placas YPDA (por ejemplo, colonias yLFM- o yAFM-RE). Rayar las colonias identificadas (3-6 colonias) en una nueva placa YPDA para obtener aislados de una sola colonia y dejarlas crecer durante 2 días a 30 oC.
  18. Parche las colonias de levadura única en una placa YPDA para aislar las colonias para análisis posteriores. Después de 24 h a 30 oC, pruébelos replicando en una placa de agar YPGA (Tabla 2) que impiden el crecimiento de pequeños mutantes (es decir, mutantes con deficiencia respiratoria). Al mismo tiempo, placa de réplica en una nueva placa de agar YPDA.
  19. Pruebe los parches correctos (es decir, el crecimiento en placas de agar YPDA e YPGA; 1-3 colonias) del paso 1.18 para la presencia de la integración correcta de oligonucleótidos por la PCR de colonia. Ensamble una mezcla de reacción añadiendo 5 ml de tampón de PCR de 10x (1,5 mM MgCl2), 2 ml de 10 picomoles/imprimaciones de L (Tabla3),4 ml de dNTPs de 2,5 ml, 0,25 ml de 5 U/L de polimerasa Taq y agua a un volumen final de 50 ml. Multiplique la mezcla de reacción para el número de colonias de levadura que necesitan ser examinadas y alícuota s50 l en cada tubo de PCR. Usando una pipeta, agregue una cantidad muy pequeña de células de levadura de la placa de agar YPDA en una sola mezcla de reacción de PCR.
  20. Realizar la reacción de PCR con el siguiente programa: 94 oC durante 8 min seguido de 35 ciclos de desnaturalización durante 1 min a 94 oC, recocido de imprimaciones durante 1 min a 55 oC y extensión de 2 min a 72 oC.
  21. Una vez completada la reacción, cargue una alícuota de la reacción de PCR (aproximadamente una décima parte del volumen) en un gel de agarosa para comprobar el tamaño correcto (500 bp).
  22. Secuenciar el producto PCR después de la purificación con un kit comercial para confirmar la integración de la secuencia RE deseada utilizando las mismas imprimaciones del paso 1.19.
  23. Después de la validación de la secuencia correcta, haga un stock de glicerol del 15% de cultivo de cepas yAFM-RE o yLFM-RE (en YPDA) y guárdelo a -80 oC.

2. Evaluación de la capacidad de transactivación de proteínas P53 utilizando el ensayo cualitativo de levadura ADE2 basado en color

  1. Repita los pasos 1.1 y 1.2 utilizando la cepa yAFM-RE (Tabla1).
  2. Al día siguiente, diluir el cultivo celular (1:10) en 30-50 mL de YPDA precalentado y continuar incubando a 30 oC agitando hasta que el OD600nm alcance 0.8-1.0 (2 h).
  3. Repita los pasos 1.5-1.10.
  4. En un tubo separado de 1,5 ml, añadir 300-500 ng de vector de expresión de levadura P53 (o control) (Tabla4), 5 l del portador de ADN espermino de salmón hervido, 300 ml de LIAcTE PEG estéril y 50 ml de suspensión de células de levadura.
  5. Repita los pasos 1.12 y 1.13, pero resuspenda el gránulo celular en 300 ml de agua estéril.
  6. Esparza 100 sde la suspensión celular en placas sintéticas selectivas (para expresión P53 ovector de control) que contengan dextrosa como fuente de carbono y alta cantidad de adenina (Tabla 2), luego incubar (al revés) a 30 oC durante 2-3 días.
  7. Las colonias transformadoras de levadura única de racha (2-6 rayas por plato) en una nueva placa selectiva y las dejan crecer durante la noche a 30 oC.
  8. Al día siguiente, utilizando la placa de réplica de terciopelos estériles en nuevas placas selectivas que permiten la evaluación del fenotipo de color (es decir, placas que contienen dextrosa como fuente de carbono pero limitando la cantidad de adenina; Tabla 2). Incubar las placas boca abajo a 30oC durante 3 días. Opcionalmente, para evaluar la sensibilidad a la temperatura de la proteína P53, incubar a tres temperaturas diferentes durante 3 días: 24 oC, 30 oC y 37 oC.
    NOTA: La misma raya se puede replicar varias veces.
  9. Para evaluar la capacidad de transactivación de proteínas P53, compruebe el fenotipo basado en color de las colonias de levadura y compare el fenotipo de proteína P53 con respecto a los fenotipos vectoriales vacíos y de tipo salvaje P53.

3. Evaluación de la capacidad de transactivación de proteínas P53 utilizando el ensayo cuantitativo de levadura LUC1 basado en luminiscencia

  1. Transforme las células de levadura con vectores de expresión P53 (o de control) (Tabla 4) utilizando el método basado en LiAc descrito en el protocolo 2. Utilice la cepa yLFM-RE (Tabla 1).
  2. Parche los transformadores individuales en una nueva placa selectiva con la alta cantidad de adenina que contiene glucosa como fuente de carbono y los deja crecer a 30 oC durante la noche. Para cada tipo de transformación, haga 5-7 parches diferentes.
  3. Después del crecimiento nocturno, resuspenda una pequeña cantidad de células de levadura usando un palillo estéril o una punta de pipeta de la placa en un medio selectivo sintético que contenga dextrosa o rafinosa como fuente de carbono (200 oL de volumen final en una placa transparente de 96 pocillos, con una placa de pozo redonda de 96, con una placa redonda de 96 pocillos, con una placa redonda de 96 pocillos, con una placa de pozo redonda, con una o fondo plano). Si el experimento requiere una expresión P53 inductible, añada galactosa al medio de la rafinosa para modular el nivel de inducción (Tabla 2).
    NOTA: Estas suspensiones celulares deben tener un OD de600 nm de aproximadamente 0,4 y no superior a 1.
  4. Mida la absorbancia de cada pocal a OD600nm después de la expresión P53 inducible (4-8 h a 30oC con agitación de 150-200 rpm) utilizando un lector de placas multietiqueta. Asegúrese de que las suspensiones celulares sean homogéneas mezclando cada una de ellas con una pipeta multicanal.
  5. Transfiera 10-20 l de suspensión celular de la placa transparente 96 well a una placa blanca de 384 (o 96) y mezcle con un volumen igual (10-20 l) de tampón de lisis. Incubar durante 10-15 minutos a RT en una coctelera (150-200 rpm) para lograr la permeabilización de la célula al sustrato de luciferasa.
  6. Añadir 10-20 l de sustrato de Luciferasa de Luciérnaga y medir las unidades de luz (LU) por un lector de placas multi-etiqueta.
  7. Para determinar la capacidad de transactivación de proteínas P53, normalice las LU de cada pocal a la OD correspondientede 600 nm (unidad de luz relativa, RLU). Calcular la RLU promedio y la desviación estándar de 3-4 parches de colonias transformadoras de levadura.
  8. Compare los datos de transactivación de proteínas P53 con respecto al tipo salvaje P53 y al vector vacío, ya sea restando los valores obtenidos con el vector vacío o dividiendo entre los valores obtenidos con el vector vacío (es decir, el pliegue informático de inducción).
    NOTA: La actividad de transactivación de P53 también se puede evaluar utilizando la misma configuración experimental en presencia de proteínas que interactúan con P53 (es decir, MDM2 y MDMX) y/o incluido el tratamiento farmacológico.

4. Evaluación de la inhibición del crecimiento de proteínas P53 utilizando el ensayo fenotípico de levadura

  1. Transforme las células de levadura con vectores de expresión P53/MDM2/MDMX (o control) (Tabla4) utilizando el método basado en LiAc descrito en la sección 2. Utilice la cepa CG379 (Tabla 1) y extienda los transformadores de levadura en placas selectivas mínimas (Tabla 2).
  2. Cultivar células transformadas en un medio selectivo mínimo (Tabla2) a aproximadamente 1 OD600nm.
  3. Diluir las células de levadura a 0,05 OD600 nm en el medio de inducción selectiva (Tabla2), y, opcionalmente, añadir una molécula pequeña elegida a la concentración adecuada (o solo disolvente) para probar su eficacia en la reactivación del mutante P53 o en la inhibición de MDM2- /MDMX-P53 interacciones.
  4. Incubar células a 30 oC bajo agitación orbital continua (200 rpm) durante aproximadamente 42 h (tiempo requerido por la levadura de control negativo para alcanzar la fase de registro medio, aproximadamente 0,45 OD600nm).
  5. Detectar alícuotas de 100 ol de cultivos de células de levadura en placas selectivas mínimas (Tabla 2).
  6. Incubar durante 2 días a 30oC.
  7. Mida el crecimiento de la levadura contando el número de colonias obtenidas en las gotas de cultivo de 100 l (unidad formadoras de colonias, recuento de UFC). Por ejemplo, calcular el efecto de reactivación mutante de los compuestos teniendo en cuenta el crecimiento de la levadura de tipo salvaje P53 que expresa como el efecto máximo posible (establecido en 100%), mientras que el crecimiento de células que expresan mutante P53 (pero expuesto al control de disolvente) representa el nivel cero de reactivación.

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Representative Results

Construcción de ADE2 o LUC1 reportero tensións de levadura

Eldelitto perfettoapproach12,14,15,16 ha sido adaptado para permitir la construcción de cepas de levadura de reportero P53 (Figura1B). El método emplea oligonucleótidos de una o dos líneas que contienen, en ambos extremos, al menos 30 nucleótidos homólogos al locus de integración elegido. Específicamente, la homología corresponde a secuencias que flanquean el sitio de integración del casete de doble marcador ICORE, que contiene el KlURA3 y kanMX4 (gen reportero que proporciona resistencia a Geneticin, G418) previamente posicionado en el sitio de destino deseado15,16. Este casete también contiene la secuencia de codificación de endonucleasa I-SceI de levadura, bajo el promotor INducible GAL1 y su sitio de destino cognado. Por lo tanto, un interruptor en el medio que contiene galactosa justo antes de la transformación de las células de levadura con los resultados de secuencia deseados en la expresión I-SceI y la consiguiente generación de una sola rotura de doble cadena (DSB) en el sitio de la integración ICORE. La presencia de un DSB estimula en gran medida la frecuencia de los eventos de segmentación, con más de 1.000 sustituciones obtenidas con una sola transformación.

Al final del proceso de selección y focalización basado en la resistencia adquirida a 5-FOA y la sensibilidad al G418, los clones candidatos son confirmados por la amplificación basada en PCR de colonia del locus modificado y la secuenciación de Sanger para verificar la correcta integración de la P53 RE deseado (Figura 1C). Al final del protocolo de construcción de cepas, que se puede completar en aproximadamente una semana, se obtiene un panel de cepas de levadura de reportero isogénico que se pueden utilizar para evaluar cómo las diferencias en la secuencia de los RE influyen en la capacidad de transactivación del P53 Proteína.

P53 mutantes funcionalmente heterogéneos

En los tumores humanos, el gen TP53 se ve afectado principalmente por mutaciones de un solo sentido que generalmente implican seis residuos principales de puntos críticos (R175, G245, R248, R249, R273 y R282) ubicados en el dominio central de unión al ADN (DBD) de la proteína P53. Sin embargo, se han registrado más de 2.000 sustituciones únicas de aminoácidos P53, incluidas algunas que se observan con poca frecuencia27. Los P53 mutantes pueden clasificarse como contactos de ADN o mutantes estructurales, dependiendo de los efectos de la sustitución de aminoácidos en el contacto ADN-proteína (por ejemplo, R273H) o en la estructura proteica (por ejemplo, R175H)36. Las mutaciones simples de TP53 afectan a las funciones P53, generando una amplia gama de diversidad funcional, que puede influir en características clínicas importantes como la agresividad tumoral, la quimio-resistencia y el potencial metastásico37, 38 , 39.

El concepto de que los mutantes P53 son funcionalmente heterogéneos ha surgido claramente en los últimos 15 años a través de una gran cantidad de datos experimentales disponibles en las bases de datos de mutación TP53 (por ejemplo, )27. Se han desarrollado diferentes ensayos funcionales basados en sistemas de reporteros de levaduras y/o mamíferos, destacando las diferentes propiedades de los mutantes P53 (es decir, transactivación, sensibilidad a la temperatura, potencial dominante negativo, interferencia con la miembros de la familia P53 e interacciones con otros TF)13,24,40,41,42,43,44. El estudio funcional más completo examinó a más de 2.300 mutantes en un ensayo basado en levaduras al caracterizar su actividad de transactivación hacia ocho Rees P5324diferentes.

Los datos confirmaron que casi todos los P53 mutantes que involucran residuos de puntos críticos son pérdida de función (es decir, perdieron por completo la actividad de transactivación). Por el contrario, los P53 mutantes que golpean otras posiciones de la proteína P53 y generalmente se encuentran a frecuencia moderada a baja en el cáncer45 son mutantes de función parcial, que conservan cierto nivel de actividad de transactivación en P53 REs13, 17. Un ejemplo del uso del ensayo ADE2 para estudiar la heterogeneidad funcional de las proteínas P53 descritas se presenta en la Figura 2A. De hecho, mientras que R175H es un mutante de pérdida de función que produce colonias rojas en todas las condiciones probadas, R282W mostró sensibilidad a la temperatura que era más evidente utilizando la expresión P53 dependiente de galactosa (es decir, el sector rojo a 37 oC en la cepa P21-5' RE en la cepa P21-5' RE en la cepa P21-5' RE en la cepa P21-5' RE en la cepa P21-5' RE en la cepa P21-5' RE en la cepa P21-5' RE en la cepa P21-5' RE en la cepa P21-5' RE en la cepa P21-5' RE en la cepa P21-5' RE en la cepa P21-5' RE en la cepa P21-5' RE en la cepa P21-5' RE en la cep que contiene galactosa inferior, que se vuelve rosa en la placa de galactosa más alta). La Figura 2B presenta un resumen de los resultados de un panel extendido de mutantes P53 y cepas de reporteros.

La existencia de esta heterogeneidad funcional P53 motivó la exploración de si tal heterogeneidad era paralela a la heterogeneidad observada a nivel clínico en sujetos con mutaciones germinales TP53. Las mutaciones germinales TP53 subyacen a la base molecular de un grupo de trastornos de predisposición al cáncer, incluidos los síndromes lifraumeni (LFS) y Li-Fraumeni(LFL) menos graves, y las predisposiciones no sindrómicas menos graves con (FH) o sin (sin HF) historia familiar46.

El protocolo destacó las correlaciones genotipo-fenotipo al hacer coincidir las capacidades de transactivación basadas en ensayos de levadura de todos los alelos mutantes de línea germinal TP53 con los datos clínicos correspondientes de la base de datos IARC . Los mutantes P53 de pérdida de función se han encontrado en síndromes de propensas al cáncer más graves, mientras que los mutantes P53 de función parcial se han encontrado en condiciones menos graves de propensión al cáncer. Esto indica que la capacidad de transactivación residual P53 influye en el fenotipo clínico en pacientes que heredaron mutaciones de TP53 y desarrollaron cáncer25,26.

Las variaciones de secuencias de nucleótidos dentro de los RE rigen P53 potencial de transactivación

Human P53 es un TF tetrameric (dimer of dimers). Cada dimer P53 reconoce un RE que consta de 10 nucleótidos (RRRCWWGYYY, R a A o G; W - A o T; Y a C o T)47,48. Dos de estos semi-sitios pueden ser adyacentes o separados por hasta 13-20 nucleótidos, constituyendo un P53 RE funcional. Sin embargo, p53 RE con un espaciador se caracterizan por menor afinidad P53 y transactivación que P53 REs sin un espaciador49,50, en diferentes ensayos funcionales de varios sistemas.

Recientemente se demostró que los semisitios pueden reclutar tetrámeros P53 que están vinculados hemiespecíficamente51, junto con ensayos funcionales y estudios de inmunoprecipitación de cromatina, estos hallazgos indican que P53 también puede actuar en RE no canónicas, comprende la mitad de los sitios y los sitios de tres cuartos48,52. Además, el hecho de que el motivo P53 RE de consenso completo sea muy degenerado (RRRCWWGYYY)2 prefigura la posibilidad de que los RE individuales puedan diferir sustancialmente en la secuencia y la afinidad vinculante. Teniendo en cuenta que se han identificado cientos de genes diana P53 en el genoma humano41,48, prácticamente todas las ERe P53 mostraron una secuencia no idéntica entre sí. Además, se ha planteado la hipótesis de que las RE con una afinidad de unión al ADN distintas se seleccionan en los promotores de genes diana P53 implicados en la detención del ciclo celular o la apoptosis53.

El análisis en levadura de muchas variantes del P53 RE en una ubicación genómica constante estableció el impacto de las variantes de nucleótidos, el espaciador y la organización de los semisitios RE en la capacidad de transactivación49. Incluso condujo al descubrimiento de rete sormórficos P53 con los dos alelos marcadamente diferentes en la capacidad de respuesta de un promotor asociado a P5314,54,55. Recientemente, la información derivada de las características de secuencia P53 RE y el potencial de transactivación basada en levaduras se ha codificado en p53 Retriever, un algoritmo de búsqueda de patrones que es capaz de localizar y clasificar tanto las RE canónicas como las no canónicas, de acuerdo con sus potenciales de transactivación previstos a lo largo de todo el genoma humano52.

Como ejemplo del uso del ensayo para estudiar el potencial de transactivación P53 específico de la secuencia, se presenta aquí una comparación entre el ser salvaje P53 y la proteína P53 evolutivamente distante de Caenorhabditis elegans (Figura 3). Estos resultados son un seguimiento de un estudio reciente en el que se exploró la divergencia evolutiva de la especificidad de la transactivación entre las proteínas P5356. Las cepas isogénicas de reporteros yLFM-RE se desarrollaron como se describe en el protocolo. Concretamente, se comparó el Cep-1 P53 RE derivado del gen ced13 57y cuatro variantes (V1-V4) (Figura3A). Las variantes RE se construyeron para examinar el impacto de variar la longitud del espaciador que separa los dos motivos demóricos (que en ced13, es de 28 nucleótidos) y para examinar los cambios en los nucleótidos que flanquean el motivo central de la CWWG (que en ced13, son ricos en A/T; mientras que en la más alta afinidad humana P53 RE, son ricos en G/C)58. Los resultados muestran claramente cómo El Cep1 y el P53 humano difieren en términos de especificidad de transactivación. De hecho, mientras que la transactivación humana mediada por P53 está fuertemente inhibida por la presencia de un espaciador (Figura3B),la actividad Cep-1 se inhibe mediante la eliminación del espaciador (Figura3C). Además, la transactivación mediada por Cep-1 se suprime cuando el RE se modifica de A/T- a G/C-rich. Ni el P53 humano ni el Cep-1 pueden transactivarse desde un solo descamer derivado del ced13 RE.

Búsqueda de pequeños disruptores de moléculas de interacciones P53-MDM2/MDMX y reactivadores de la actividad mutante P53

La correlación establecida entre el efecto inhibitorio del crecimiento de P53 humano y el grado de su actividad en la levadura dio lugar a un ensayo de cribado simplificado basado en mediciones del crecimiento de las células de levadura para analizar el impacto de los factores de interferencia en la actividad De53 (Figura4 ). La eficacia del ensayo fenotípico de levadura para detectar posibles agentes anticancerígenos se ha demostrado en varios trabajos. Utilizando células de levadura que expresan co-expresando P53 y sus inhibidores MDM2 y/o MDMX, se identificaron nuevos disruptores de estas interacciones por su capacidad para inhibir el efecto negativo de los MMD en P53, restableciendo así la inhibición del crecimiento de levadura inducida por P53 de tipo salvaje ( Figura 4A). En particular, este ensayo condujo al descubrimiento de 1) piranoxantona 1 como el primer inhibidor de la interacción P53-MDM2 con un andamio de xantono34 y 2) inhibidores de la oxazoloisoindolinona de la interacción P53-MDM259. Además, con este ensayo, se describió por primera vez a la bacteria-mangostin y al ácido gambogic como inhibidores potenciales de la interacción P53-MDM230.

Más tarde, el mismo ensayo demostró que la prenilación de los chalcones mejoró su capacidad para interrumpir la interacción P53-MDM260. Curiosamente, este ensayo de levadura también condujo al descubrimiento de dos inhibidores de las interacciones P53-MDM2/MDMX: el oxazolopiperidona de derivado de triptófalool lactam OXAZ-161 y oxazoloisoindolinona derivada del triptófano-162.

También se ha explorado el impacto reducido de la pérdida de función mutante P53 en el crecimiento de células de levadura para detectar fármacos mutantes P53 que reactivan, caracterizados por la capacidad de restaurar la actividad inhibidora del crecimiento similar a tipo salvaje a P53 mutante (Figura4B). Con este ensayo de levadura, se identificó un reactivador del mutante P53 R280K, el oxazoloisoinona enantiopure derivado del triptófano SLMP53-163. Figura 4C,D muestra resultados representativos obtenidos en levadura con la expresión de P53 o tratamientos con el inhibidor de la interacción P53-MDM2 Nutlin-3a o con el reactivador del p53 mutante Y220C PhiKan083.

Validación del mecanismo molecular de acción de estos compuestos como agentes activadores P53, así como de su actividad antitumoral, tanto en las líneas celulares tumorales humanas34,60,61,62,63 y modelos animales62,63, atestigua el gran potencial del ensayo fenotípico de levadura en el descubrimiento de fármacos.

Figure 1
Figura 1 : Características de los ensayos de transactivación P53 basados en levaduras y flujo de trabajo para la construcción de cepas de levadura de reportero P53. A) La facilidad de manipulación del genoma y la expresión génica ectópica controlada hace que la levadura sea similar a un "tubo de ensayo in vivo", en el que se exploran rigurosamente varias variables relevantes para examinar las funciones de transactivación P53. Estas variables incluyen los niveles de expresión de una proteína P53 de tipo salvaje o mutante, la secuencia del RE y el tipo de gen reportero [cualitativo/semicuantitativo (por ejemplo, ADE2 y LACZ)o cuantitativo (por ejemplo, LUC1)]. La secuencia RE de consenso es altamente degenerada (RE - RRRCWWGYYY-n-RRRCWWGYYY; R - purina; W - A/T; Y - pirimidina; CWWG - Secuencia CORE, n á espaciador de 0-13 bps). El número de discrepancias con respecto al consenso, la secuencia CORE y el número de espaciadores de pares base influirá en la actividad de transactivación. Este panel ha sido modificado de una publicación anterior64. (B) Esquema del enfoque delitto perfetto para introducir un P53 RE deseado aguas arriba del promotor mínimo que impulsa la expresión génica del reportero ADE2 o LUC1. El protocolo fue adaptado de las publicaciones anteriores12,15,16. (C) Ejemplo de los resultados de la amplificación de PCR de colonia de levadura de la región que rodea el sitio de integración oligo RE. La imagen de la electroforesis presenta el resultado de amplificación de dos colonias positivas putativas (URA3 menos y sensible según G418) con el control negativo de PCR correspondiente junto a la escalera de ADN de 1 kb (Promega). La banda de 500 nt que se espera utilizando los imprimadores descritos en la Tabla 3 se puede secuenciar para confirmar la correcta edición del promotor, como se muestra en el electroferograma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Las proteínas P53 muestran un potencial de transactivación específico de RE y sensible a la temperatura. Las mutaciones de error de TP53 de tipo salvaje y TP53 indicadas se probaron utilizando el ensayo cualitativo de reportero basado en color en levaduras y explotando cepas de reporteros que albergan diferentes REs P53 que controlan la expresión génica ADE2. (A) Se muestra un ejemplo del fenotipo de color de colonia para P53 de tipo salvaje, R175H y R282W con el PUMA (BBC3) y los RE P21-5' a 30 oC y 37 oC. Se compara la expresión P53 moderada (0,008% galactosa) y alta (0,12% galactosa). (B) Resultados obtenidos con un conjunto extendido de mutantes P53 y cepas de reporteros de levadura examinados para el fenotipo de color de colonia dependiente de P53 a tres temperaturas (24 oC, 30 oC y 37 oC). Los resultados ejemplifican la heterogeneidad funcional de los alelos mutantes P53 y se resumen en un formato de tabla. Por ejemplo, R175H es un mutante de pérdida de función, mientras que G199H es de tipo salvaje P53.como un P53. K139E y R282W conservan la función parcial y presentan sensibilidad al frío y sensibilidad al calor, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : El P53 humano y el ortolog cep-1 acreditado exhiben especificidad de transactivación altamente divergente. (A) Secuencias de: secuencia de consenso humana P53 RE, Cep-1 P53 RE derivada del gen ced13, y cuatro variantes (V1-V4) que se probaron en los ensayos funcionales. (B) La transactivación se midió después de inducir la expresión humana de P53 durante 8 h utilizando tres fuentes de carbono diferentes para lograr una expresión baja, moderada y alta (0,008%, 0,032%, 0,12% de galactosa añadida al medio selectivo que contiene 2% de rafinosa). Los resultados se expresan como unidades de luz relativa medias (RLU) y error estándar de cuatro réplicas. Se restó la actividad de reportera para la celda transformada con un vector de expresión vacío. (C) Especificidad de la transactivación de Cep1 medida en (B). Para ambas proteínas, los niveles de transactivación fueron proporcionales a la cantidad de galactosa. Las unidades de luz más altas medidas cuando se expresa P53 humano pueden depender de diferentes niveles de cantidades de proteínas producidas, debido a la diferencia en la longitud de la proteína y potencialmente también en el uso de codón. Las dos proteínas se caracterizan por una diferente especificidad de transactivación hacia las diferentes REA analizadas y esta propiedad no se ve afectada por posibles diferencias en la cantidad relativa de proteínas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Pequeños activadores de moléculas de P53 identificados mediante el ensayo fenotípico de levadura. (A) Las células de levadura que co-expresan el tipo salvaje humano P53 y MDM2 o MDMX se han utilizado para buscar inhibidores de las interacciones P53-MDM2 y P53-MDMX. En este sistema, los inhibidores de interacción restauran la inhibición del crecimiento de levadura inducida por P53 en células de levadura que co-expresan P53 y MDM2 o MDMX. Este enfoque ha permitido identificar los inhibidores de la interacción P53-MDM2 y la identificación de inhibidores duales de las interacciones P53-MDM2 y P53-MDMX. (B) Las células de levadura que expresan el mutante humano P53 se han utilizado para buscar reactivadores Mutantes P53 y son capaces de restaurar la inhibición del crecimiento de levadura inducida por P53 similar al tipo salvaje en células de levadura mutantes que expresan P53. (C) Imágenes representativas del ensayo de punto de placa que muestra n.o de impacto de P53 de tipo salvaje o Y220C mutante en el crecimiento de la colonia de levadura en comparación con el vector vacío (ver paso 4.5). (D) Resultados cuantitativos del ensayo de crecimiento: 10 m nutlinlin-3a restaura la inhibición del crecimiento de levadura inducida por P53 en células que co-expresan MDM2; 50 M PhiKan083 restaura la inhibición del crecimiento de levadura inducida por P53 similar a tipo salvaje a la inhibición mutante P53 Y220C. Ambos efectos se trazan en relación con el efecto inhibidor del crecimiento de la levadura de tipo salvaje P53, que se estableció como uno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre de la cepa y genotipo Uso específico Número de protocolo
yAFM-ICORE: MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE::pCyc1::ADE2 Se utiliza para la construcción de la cepa yAFM-RE (MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE::pCyc1::ADE2) que se explota en el ensayo además cualitativo basado en color. Protocolos 1,2
yLFM-ICORE: MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE::pCyc1::LUC1 Se utiliza para la construcción de la cepa yLFM-RE (MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; RE::pCyc1::LUC1) que se explota en el ensayo lucíscencia cuantitativa basado en luminiscencia LUC1. Protocolos 1,3
CG379: MATa, ade5 his7-2 leu2-112 trp1-289aura3-52 [Kil-O] Se utiliza para el ensayo de crecimiento fenotípico. Protocolo 4

Tabla 1: Cepas de levadura.

Nombre y receta de los medios Uso específico Número de protocolo
YPDA (2% extracto de levadura, 2% peptona, 2% dextrosa, 200 mg/L adenina) + 2% de agar YPDA sin agar se esteriliza preferentemente por filtración. YPDA + agar se esteriliza mediante autoclave; es posible omitir la dextrosa de la receta y añadir dextrosa de una solución esterilizada de filtro del 20% en agua antes de verter las placas. Protocolos 1-4
CM [0.17% Base de nitrógeno de levadura sin AA y sulfato de amonio, 0,5% sulfato de amonio, 5% (volumen/volumen, v/v) solución no esencial de aminoácidos, 20 mg/L de histidina, 20 mg/L de triptófano, 20 mg/L de uracilo, 30 mg/L de lisina, 100 mg/L de leucina, 200 mg/L de lininina+ 2% galactosa El medio se esteriliza filtra mediante el filtrado. Las siguientes soluciones de stock estéril se preparan en agua (con la excepción del uracilo, que se disuelve en 0,1M NaOH) filtrando: solución no esencial de aminoácidos (0,04% arginina, 0,04% de metionina, 0,06% isoleucina, 0,1% fenilalanina, 0,2% de glutamicina ácido, 0,2% ácido aspártico, 0,3% valina, 0,4% de trionina, 0,8% de serina), 1% histidina, 1% triptófano, 1% uracilo, 1% lisina, 1% leucina, 0,5% adenina, 20% galactosa. La solución de adenina no debe almacenarse en el frigorífico debido a la formación y sedimentación de cristales. La solución de stock de triptófano debe almacenarse en la oscuridad. Protocolo 1
CM (ver arriba) + 2% Dextrosa + 1g/L 5-FOA + 2% agar Los medios (que contienen base de nitrógeno de levadura sin AA y sulfato de amonio, sulfato de amonio y agar) se esterilizan mediante autoclave. Los otros componentes se añaden después de autoclave para preservar los ingredientes de calor-lábil; el polvo 5-FOA se puede añadir directamente en el medio una vez que se ha enfriado a unos 55 oC. Protocolo 1
YPDA + 400 g/mL G418 + 2% de agar G418 debe añadirse después de autoclave una vez que el soporte se haya enfriado a unos 55 oC. Si a partir de polvo, una solución de 50 mg/ml G418 se puede preparar en agua y esterilizar por filtración. Protocolo 1
YPGA [2% extracto de levadura, 2% peptona, 2% glicerol (v/v), 200 mg/L adenina] + 2% de agar Los medios de comunicación se esterilizan mediante autoclave. Protocolo 1
Placa selectiva sintética: [0.17% Base de nitrógeno de levadura sin AA y sulfato de amonio, 0.5% Sulfato de amonio, 5% (v/v) solución de aminoácidos no esenciales (0.04% arginina, 0.04% metionina, 0.06% isoleucina, 0.1% fenilalanina, 0.2% ácido glutámico, 0.2% ácido aspártico, 0.3% valina, 0.4% trionina, 0,8% de serina), 20 mg/L de histidina, 20 mg/L uracile, 20 mg/L triptófano (dependiendo del marcador de selección vectorial), 30 mg/L de lisina, 100 mg/ml de leucina (dependiendo del marcador de selección vectorial), 5 mg/L o 200 mg/L de adenina] + 2% dextrosa + 2% de agarrosa + 2% agarrosa + 2% agarrosa + 2% agarrosa + 2% agarrosa + 2% agarrosa + 2% agarrosa + 2% agarrosa + 2% agarrosa + 2% agarrosa + 2% agarrosa + 2% agarrosa + 2% agarrosa + 2% agarrosa + 2% agarrosa + 2% agarrosa + 2% agarrosa + 2% Los medios (que contienen base de nitrógeno de levadura sin AA y sulfato de amonio, sulfato de amonio y agar) se esterilizan mediante autoclave. Los otros componentes se añaden después del autoclave para preservar los ingredientes de calor-lábil. Cuando se utilizan vectores basados en pLS y pLSG, las placas preparan sin leucina. Cuando se utilizan vectores basados en pTS y pTSG, preparar placas sin triptófano. Protocolos 2-3
Medios selectivos sintéticos: [0.17% Base de nitrógeno de levadura sin AA y sulfato de amonio, 0.5% Sulfato de amonio, 5% (v/v) solución no esencial de aminoácidos (0.04% arginina, 0.04% metionina, 0.06% isoleucina, 0.1% fenilalanina, 0.2% ácido glutámico, 0.2% ácido aspártico, 0.3% valina, 0.4% trionina, 0,8% de serina), 20 mg/L de histidina, 20 mg/L uracile, 20 mg/L triptófano (dependiendo del marcador de selección vectorial), 30 mg/L de lisina, 100 mg/ml de leucina (dependiendo del marcador de selección vectorial), 200 mg/L de adenina] + 2% dextrosa o rafinosa + 0-2% de gaucina + 0-2% de gaucina + 0-2% de gaucina + 0-2% de gaucina + 0-2% de gafino  El medio se esteriliza por filtración. Cuando se utilizan vectores basados en pLS o pTS en el tratamiento de medicamentos, preparar medios sin leucina o triptófano, respectivamente pero que contengan 2% de dextrosa. Cuando se utiliza vector basado en pLSG o pTSG en la expresión P53 inducible con o sin tratamiento farmacológico, prepare medios sin leucina o triptófano, respectivamente pero que contengan un 2% de rafinosa y una cantidad variable de galactosa para modular la expresión P53. La extensión de la inducción de P53 también se puede modular variando el tiempo de incubación. Protocolo 3
Placas selectivas mínimas: 2% glucosa, 0,7% base de nitrógeno de levadura (sin aminoácidos y sulfato de amonio), 50 mg/L de adenina, 50 mg/L uracilo, 50 mg/L de histidina, 50 mg/L de triptófano (dependiendo del marcador de selección vectorial), 50 mg/L de leucina (dependiendo de la marcador de selección de vectores), 2% agar El medio se esteriliza mediante autoclave. Cuando se utilizan vectores basados en pLS89 preparar medio sin triptófano. Utilice pLS89-empty vector (no expresando ninguna proteína) como control negativo. Cuando utilice vectores pLS89 y pGADT7-MDM2 (co-expresión de P53 y MDM2), prepare el medio sin leucina y triptófano. Utilice pLS89-vacío y pGADT7 (ambos no expresan ninguna proteína) como controles negativos. Cuando se utilizan vectores basados en pLS76, preparar medio sin leucina. Utilice el vector pRS315 (sin expresar ninguna proteína) como control negativo. Protocolo 4
Medio selectivo mínimo: como placas selectivas mínimas pero sin agar El medio se esteriliza por filtración. Protocolo 4
Medio de inducción selectiva: como medio selectivo mínimo pero que contiene 2% de galactosa en lugar de glucosa El medio se esteriliza por filtración. Protocolo 4

Tabla 2:Medios de levadura.

Nombre de la solución y receta o nombre de imprimación y secuencia Características específicas y uso Número de protocolo
LiAc/TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, con 1 mM EDTA y 0,1M de acetato de litio Las siguientes soluciones de stock estéril en agua se preparan mediante autoclave: 1M acetato de litio pH 7.5, 1 M Tris-HCl / 0.1 M EDTA pH 8.0 (TE buffer 10X). Protocolos 1-4
PEG/LiAc/TE: 40% Polietilenglicol (PEG) en 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, con 1 mM EDTA y 0,1 M de acetato de litio Las siguientes soluciones de stock estéril en agua se preparan mediante autoclave: 1 M de acetato de litio pH 7.5, 1 M Tris-HCl / 0.1 M EDTA pH 8.0 (TE buffer 10X), 50% PEG (peso molecular .3350). Protocolos 1-4
Colas de homología para los oligonucleótidos RE:
5'-gcggaattgacttttcttgaataatacat-RE-gcagatccgcgcgcgtatatagcggg-3'		 Se proporciona la secuencia de las colas homológicas, correspondiente a las secuencias cromosómicas que flanquean el casete ICORE integrado; RE- RE secuencia. Protocolo 1
Primers: Ade2 Fw: 5'-AAGTTGCCTAGTTTCATGAA-3';
Ade2 Rv: 5'-GGAGCCATTAACGTGGTCAT-3';
Luc1-Rv: 5'-CATAGCTTCTGCCAACCGAA-3'		 Para la cepa yAFM-RE (PCR y secuenciación) combine Ade2 Fw con la imprimación Ade2 Rv. Para la cepa yLFM-RE (PCR y secuenciación) combine Ade2 Fw con imprimación Luc1-Rv. Protocolo 1

Tabla 3: Soluciones y oligonucleótidos.

Tipos de vectores Controles positivos y negativos Número de protocolo
P53 (o control) vectores.
basado en pLS o pLSG: expresión de proteína P53 bajo el promotor constitutivo ADH1 o promotor GAL1 inducible de galactosa, respectivamente (LEU2 como marcador de selección).
PTS- o pTSG-basado: Expresión de proteína P53 bajo el promotor constitutivo ADH1 o promotor GAL1 inducible de galactosa, respectivamente (TRP1 como marcador de selección)		 Basados en pLS y pLSG: utilizar como control positivo los vectores pLS76 y pLSG-P53 (que expresan el tipo salvaje P53), respectivamente; como vector pRS315 de control negativo (no expresa ninguna proteína).
basados en pTS y pTSG: utilizar como control positivo los vectores pTS76 y pTSG-P53 (que expresan el tipo salvaje P53), respectivamente; como vector pRS314 de control negativo (sin expresar ninguna proteína).		 Protocolo 2,3
P53 y MDM2 (o control).
Basado en pLS89: expresión de proteína P53 de tipo silvestre bajo el promotor GAL1 inducible de galactosa (TRP1 como marcador de selección).
Basado en pLS76: expresión de proteína P53 mutada bajo el promotor constitutivo de ADH1 (LEU2 como marcador de selección).
Basado en pGADT7: Expresión de proteína MDM2 bajo el promotor constitutivo de ADH1 (LEU2 como marcador de selección)		 Basado en pLS89: utilizar como control positivo el vector pLS89-P53 (que expresa el tipo salvaje P53); como control negativo pLS89-vacío (sin expresar ninguna proteína).
Basado en pLS76: utilizar como control positivo el vector P53 pLS76-mutante (que expresa el mutante P53); como vector pRS315 de control negativo (no expresa ninguna proteína).
Basado en pGADT7: utilizar como control positivo el vector pGADT7-MDM2 (expresando el tipo de comodín MDM2); como vector pGADT7 de control negativo (no expresa ninguna proteína).		 Protocolo 4

Tabla 4: Vectores de expresión de levadura.

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Discussion

Los ensayos a base de levadura han demostrado ser útiles para investigar varios aspectos de las funciones de la proteína P53. Estos ensayos son particularmente sensibles para evaluar el potencial de transactivación De53 hacia variantes de sitios objetivo RE, incluida la evaluación de polimorfismos funcionales. El uso de reporteros de color, así como la miniaturización del ensayo de luciferasa resultan en ensayos rentables y relativamente escalables. Además, la prueba de inhibición del crecimiento es potencialmente susceptible de ser utilizada en el cribado de la biblioteca química, automatizando la cuantificación de la viabilidad de las células de levadura a través de la medición de la absorbancia. Si bien la permeabilidad limitada debido a la pared celular y la acción de los transportadores ABC se ha considerado una limitación en el uso de levaduras para el cribado de drogas, las modificaciones genéticas para mejorar la adopción se han desarrollado con éxito22,65.

En comparación con los ensayos basados en células de mamíferos, el ensayo P53 basado en levaduras puede mejorar la identificación de impactos directos, dado que p53 está aislado de la increíble complejidad de los cofactores y la señalización de vías en cascada que modulan sus funciones en eucariotas más altas. Los ensayos funcionales basados en levaduras también han tenido un éxito parcial en el seguimiento de la interacción de P53 con cofactores proteicos (a saber, MDM2 y MDMX 22, 32, 33 , 34) y el impacto de pequeños cofactores de proteínas (a saber, MDM2 y MDMX22,32,33,34)y el impacto de pequeños moléculas (como Nutlin-3a) en esas interacciones. Sin embargo, la sensibilidad y el poder predictivo de los ensayos a base de levadura para investigar el interhablaentrenamiento entre P53 y las proteínas que interactúan puede ser algo limitado, dependiendo de cómo esas interacciones in vivo dependen de modificaciones post-traduccionales y cascadas de señalización específicas de especies.

Los sistemas descritos aquí se pueden adaptar fácilmente a otros TF. De hecho, se han desarrollado ensayos funcionales de levadura para las proteínas P63 y P73 relacionadas con P5342,49, así como para los miembros de la familia NF-B66,67 [o incluso para alguna homeobox y hélice-bucle-bucle básico (bHLH) TFs68,69]. Los receptores nucleares humanos también se han expresado en levadura y seha demostrado que funcionan como tF 70 dependientes de ligandoy y específicos de secuencia. Se ha identificado un factor limitante en la débil capacidad de algún dominio de transactivación de mamíferos (TAD) para interactuar con la maquinaria de transcripción basal de levadura8, una deficiencia que se puede superar mediante el uso de construcciones quiméricas, incluyendo un TAD68heteroteo,69.

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Disclosures

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Acknowledgments

Agradecemos a la Unión Europea (Fondos FEDER POCI/01/0145/FEDER/007728 a través del Programa Operacion Factores de Competitividade - COMPETE) y fondos nacionales (FCT/MEC, Fundación para la Ciencia y la Tecnología y El Ministério de la Educación y la Ciencia) en el marco de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología y el Ministério de la Educación y la Ciencia) en el marco de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología y el Ministério da Educación y La Ciéncia) en el marco de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología y el Ministério de la Educación y la Ciencia) en el marco de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología y el Ministério de la Educación y la Ciencia) en el marco de la Acuerdo de Asociación PT2020 UID/QUI/50006/2019 y los proyectos (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. Becas FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Este trabajo fue apoyado por la Compagnia S. Paolo, Turín, Italia (Proyecto 2017.0526) y el Ministerio de Salud, (Proyecto 5x1000, 2015 y 2016; investigación actual 2016). Agradecemos profundamente a la Dra. Teresa López-Arias Montenegro (Universidad de Trento, laboratorios de enseñanza de ciencias experimentales) por su ayuda con la grabación de vídeo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Cancer Research Número 150 P53 levadura elemento de respuesta ensayo funcional transcripción inhibición del crecimiento
Levadura como chasis para el desarrollo de ensayos funcionales para estudiar P53 humanos
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Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).

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