Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

الخميرة كهيكل لتطوير الاختبارات الوظيفية لدراسة P53 الإنسان

Published: August 4, 2019 doi: 10.3791/59071
Automatic Translation
1, 2, 3, *3, *1, *2
1Mutagenesis and Cancer Prevention Unit, Ospedale Policlinico San Martino, 2Department CIBIO, University of Trento, 3LAQV/REQUIMTE, Laboratory of Microbiology, Faculty of Pharmacy, University of Porto
* These authors contributed equally

Summary

عرضت هنا أربعة بروتوكولات لبناء واستغلال الخميرة Saccharomyces cerevisiae سلالات مراسل لدراسة الإنسان P53 إمكانية التنشيط، والآثار من الطفرات المرتبطة بالسرطان المختلفة، والبروتينات المتفاعلة التي أعرب عنها، و آثار جزيئات صغيرة محددة.

Abstract

وقد سمح الاستنتاج بأن بروتين P53 الثدييات المعروفة بمثابة عامل النسخ (TF) في الخميرة S. سيريفيسياي لتطوير تجارب وظيفية مختلفة لدراسة آثار 1) موقع ملزم [أي عنصر الاستجابة (RE)] المتغيرات تسلسل على P53 خصوصية التنشيط أو 2) الطفرات TP53، العوامل المساعدة التي أعرب عنها، أو جزيئات صغيرة على نشاط التعطيل P53. وقد تم تطوير مختلف التطبيقات البحثية الأساسية والترجمة. تجريبيا، هذه النهج استغلال اثنين من المزايا الرئيسية لنموذج الخميرة. فمن ناحية، تتيح سهولة تحرير الجينوم البناء السريع لأنظمة المراسلين النوعية أو الكمية من خلال استغلال السلالات المسببة للسرطان التي لا تختلف إلا على مستوى P53-RE محدد للتحقيق في خصوصية التسلسل للاعتماد على P53 التفعيل. من ناحية أخرى، فإن توافر أنظمة منظمة للتعبير خارج الرحم P53 يسمح بتقييم التنشيط في مجموعة واسعة من التعبير البروتين. يتم مراجعة هذا التقرير على نطاق واسع النظم التي تستند إلى الجينات مراسل اللون، لوسيفيراز، ونمو الخميرة لتوضيح خطواتها المنهجية الرئيسية وتقييم قوة التنبؤ ية. وعلاوة على ذلك، يمكن استغلال التنوع الشديد لهذه النهج بسهولة لدراسة مختلف TFs بما في ذلك P63 و P73، وهما عضوان آخران في عائلة الجينات TP53.

Introduction

النسخ هو عملية معقدة للغاية تنطوي على تنظيم ديناميكي ومكاني وزمني لعوامل النسخ (TFs) والعوامل المساعدة لتوظيف وتعديل بوليميراز الحمض النووي الريبي في مناطق الكروماتين استجابة لمحفزات محددة1 . معظم TFs، بما في ذلك الإنسان P53 قمع الورم، تعترف عناصر محددة cis-acting في شكل تسلسل الحمض النووي تسمى عناصر الاستجابة (REs)، والتي تتكون من زخارف فريدة من نوعها واحدة (أو متعددة) ~ 6-10 النيوكليوتيدات طويلة. ضمن هذه الزخارف، قد تظهر المواقفالفردية درجات مختلفة من التباين 2، وعادة ما تلخصها مصفوفات وزن الموقف (PWM) أو الشعارات3،4.

الخميرة S. cerevisiae هو نظام نموذج مناسب لدراسة جوانب مختلفة من البروتينات البشرية من خلال الاختبارات المكملة، والتعبير خارج الرحم، والاختبارات الوظيفية، حتى عندما يكون جين الخميرة التقويمية غير موجود5، 6 , 7.نظرا للحفظ التطوري للمكونات القاعدية من نظام النسخ8، يمكن للعديد من TFs البشرية (عندما أعرب عن هافيموضعي في خلايا الخميرة) تعديل التعبير عن جين مراسل من خلال العمل من خلال المروجين هندسيا ل تحتوي على REs المناسبة. يتميز نظام نموذج النسخ المعروض هنا لP53 الإنسان بثلاثة متغيرات رئيسية يمكن تعديل آثارها: 1) طريقة التعبير ونوع P53، 2) تسلسل RE السيطرة على النسخ P53 تعتمد، و 3) نوع من [برسّري] مورثة (شكل[1ا]).

وفيما يتعلق بطريقة التعبير P53، يسمح S. cerevisiae باختيار المروجين اللاإمتزاقين أو الكبتأو التأسيسية9و10و11. على وجه الخصوص، المروج GAL1 inducible يسمح القاعدية (باستخدام raffinose كمصدر للكربون) أو متغير (عن طريق تغيير كمية الجالاكتوز في وسائل الإعلام) التعبير عن TF في الخميرة. في الواقع، يمثل التعبير القابل للضبط بدقة تطورا حاسما لدراسة ليس فقط P53 نفسها ولكن أيضا غيرها من البروتينات الأسرة P5312،13.

وفيما يتعلق بنوع REs التي تسيطر على التعبير المعتمد على P53، يسمح S. cerevisiae ببناء سلالات مراسل مختلفة تمتلك اختلافات فريدة في RE من الاهتمام في خلفية غير ذلك من السلالات المسببة للسرطان. يتم التوصل إلى هذا الهدف باستخدام التكيف مع نهج تحرير الجينوم تنوعا بشكل خاص وضعت في S. سيريفيسياي, ودعا ديليتو بيرفيتو12,14,15,16.

وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام جينات مراسل مختلفة (أي URA3، HIS3، وADE2) لتقييم نوعي او كمي للأنشطة النسخية للTFs البشرية في S. cerevisiae، ولكل منها ميزات محددة يمكن أن أن تكون مصممة لتلبية الاحتياجات التجريبية17،18،19،20،21. التعبير عن هذه الجينات مراسل يمنح uracil, الهستيدين, وprototrophy الادينين, على التوالي. مراسل URA3 لا يسمح بنمو الخلايا في وجود 5-FOA كذلك، وبالتالي يمكن أن يكون اختيار مضاد. نظام مراسل ADE2 لديه ميزة أنه، إلى جانب اختيار التغذية، فإنه يسمح بتحديد خلايا الخميرة التي تعبر عن نوع البرية (أي، وظيفية على التعبير ADE2) أو متحولة (أي، غير وظيفيةعلى ADE2 ) P53 من لون المستعمرة.

على سبيل المثال، خلايا الخميرة التي تعبر عن الجين ADE2 تولد مستعمرات بيضاء الحجم عادة على لوحات تحتوي على كميات محدودة من الأينيبين (2.5-5.0 ملغ / لتر)، في حين أن تلك التي سيئة أو لا تنسخ تظهر على نفس لوحة الأحمر الأصغر (أو الوردي) المستعمرات. ويرجع ذلك إلى تراكم وسيط ة في مسار الأدينين التركيبي الحيوي (أي P-ribosylamino-imidazole، الذي كان يسمى سابقا أمينو-إيميدازول ريبوتيد أو AIR)، والتي يتم تحويلها لتشكيل صبغة حمراء. وقد تم استبدال الجينات مراسل ADE2 على أساس اللون النوعي مع الكمية اليراعة Photinus pyralis (LUC1)12،22. في الآونة الأخيرة، تم الجمع بين مراسل ADE2 مع مراسل lacZ في سهلة لتسجيل، شبه كمية، واختراق مزدوج ة يمكن استغلالها لتصنيف المسوخ P53 وفقا لمستواهم المتبقي من الوظائف 23.

كما تم استخدام مراسلي الفلورسنت مثل EGFP (البروتين الفلورسنت الأخضر المعزز) أو DsRed (ديسكوسوما sp. بروتين الفلورسنت الأحمر) للتقييم الكمي لنشاط التنشيط المرتبط بجميع الطفرات الخاطئة المحتملة في TP53 تسلسل الترميز24. وأخيراً، أدت فرصة الجمع بين المروجين القابلة للضبط للتعبير الأليل P53 مع سلالات الخميرة المسببة للسرطان المختلفة لجين RE و/أو المراسل إلى تطوير مصفوفة بيانات تولد تصنيفاً منقحاً للربط بالسرطان وللجرثومة [ترجم جب53 قدم/الولايات-المتحدة2-و/ الولايات-المتحدة]

وتستخدم النهج المذكورة أعلاه لقياس النشاط النسخي للبروتين P53. ومع ذلك، فإن التعبير عن البرية من نوع P53 في الخميرة S. سيريفيسياي28 وSchizosaccharomyces pombe29 يمكن أن يسبب تأخر النمو، والتي ارتبطت مع خلية دورة اعتقال28،30 أو خلية الموت31. في كلتا الحالتين، يتم تشغيل تثبيط نمو الخميرة عن طريق التعبير P53 عالية، وقد تم ربط هادىر مع التشكيل النسخي المحتمل لجينات الخميرة الذاتية المشاركة في نمو الخلايا. دعم هذه الفرضية، وفقدان وظيفة متحولة P53 R273H لم تتداخل مع نمو خلية الخميرة عندما أعرب عنها في مستويات مماثلة كما البرية من نوع P5332. وعلى العكس من ذلك، تسبب التعبير في الخميرة من متحولة سامة P53 V122A (المعروف عن ارتفاع النشاط النسخي مقارنة مع البرية من نوع P53) تأثير مثبط النمو أقوى من البرية من نوع P5332.

بالإضافة إلى ذلك، ثبت أن MDM2 البشرية كانت قادرة على تثبيط النشاط النسخي P53 الإنسان في الخميرة، وتعزيز في كل مكان والتدهور اللاحق33. وبناء على ذلك، أظهرت قدرة الإنسان MDM2 وMDMX لمنع تثبيط نمو الخميرة الناجمة عن P5332،34. في دراسة إضافية، تم تحديد ارتباط بين النشاط النسخي P53 ومستويات التعبير الأكتين، مع تحديد P53 RE المفترضة في المنبع على جين ACT1 في الخميرة32. باستمرار، تم تعزيز التعبير الأكتين من قبل البرية من نوع P53 وحتى أكثر من ذلك من قبل P53 V122A، ولكن ليس من قبل متحولة P53 R273H. وعلى العكس من ذلك، انخفض تعبير الأكتين بواسطة P53 في الوجود المشترك لمثبطات P53 MDM2، MDMX، أو pifithrin-α (مثبط جزيء صغير من النشاط النسخي P53)، بما يتفق مع النتائج على أساس حقن الخميرة النمو. الأهم من ذلك، أنشأت هذه النتائج علاقة بين تثبيط النمو الناجم عن P53 ودرجة نشاطها في الخميرة، والتي تم استغلالها أيضا لتحديد ودراسة الجزيئات الصغيرة تحوير وظائف P5328،34 , 35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. بناء سلالات الخميرة مراسل ADE2 أو LUC1 التي تحتوي على RE محددة (yAFM-RE أو yLFM-RE)

  1. خط yAFM-ICORE أو yLFM-ICORE سلالة12،14 (ICORE = I ، ISce-I endonuclease تحت GAL1 المروج؛ CO = العداد اختيار URA3؛ RE = مراسل KanMX4 منح مقاومة كانامايسين; الجدول1) من مخزون الجلسرين بنسبة 15٪ المخزنة في -80 درجةمئوية على لوحة أجار YPDA (الجدول 2). دعه ينمو لمدة 2-3 أيام عند 30 درجة مئوية.
  2. تأخذ مستعمرة الخميرة واحدة من لوحة جديدة (لا يزيد عمرها عن 3 أسابيع) ووضعها في قارورة صغيرة تحتوي على 5 مل من YPDA (الجدول2). حضانة في 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها، ويهز في 150-200 دورة في الدقيقة.
  3. في اليوم التالي، لإزالة جميع آثار سكر العنب، بيليه الخلايا لمدة 2 دقيقة في 3000 × ز وتجاهل supernatant عن طريق عكس الأنبوب.
    ملاحظة: تنفيذ كافة الطرد المركزي في هذا البروتوكول في درجة حرارة الغرفة (RT).
  4. إعادة تعليق بيليه الخلية في 30-50 مل من قبل الاحماءسم (وسائل الإعلام الكاملة) التي تحتوي على الجالاكتوز (الجدول 2) وحضانة لمدة 4 ح في 30 درجة مئوية، ويهز في 150-200 دورة في الدقيقة (اللازمة للحث من I-SceI).
  5. طرد مركزي الخلايا لمدة 2 دقيقة في 3000 × ز وتجاهل supernatant عن طريق عكس الأنبوب.
  6. إعادة تعليق بيليه الخلية في 30-50 مل من الماء المعقم. كرر الخطوة 1.5.
  7. إعادة تعليق بيليه الخلية في 10 مل من الماء المعقم. كرر الخطوة 1.5.
  8. إعادة تعليق بيليه الخلية في 5 ملمن LiAcTE معقمة (الجدول 3)، وهو حل الأيونية التي تفضل تناول الحمض النووي. كرر الخطوة 1.5.
  9. إعادة تعليق بيليه الخلية في 250 درجة مئوية من LiAcTE المعقمة ونقل الخلايا إلى أنبوب 1.5 مل. كرر الخطوة 1.5 وتعليق بيليه الخلية في 300-500 درجة مئوية من LiAcTE المعقمة.
  10. خلال الغسل، تشويه حل 10 ملغ / مل من سمك السلمون الحيوانات المنوية الحمض النووي الناقل لمدة 10 دقيقة في 100 درجة مئوية والبرد على الفور على الجليد للحفاظ عليه كالحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل.
  11. في أنبوب منفصل 1.5 مل، إضافة 500 بيكومولمن oligonucleotide المطلوب (الجدول3)،5 ميكرولتر من الحمض النووي الناقل الحيوانات المنوية السلمون المسلوق، 300 ميكرولتر من PEG LiAcTE معقمة (الجدول3)،و 50 ميكرولتر من تعليق خلية الخميرة (من الخطوة 1.9).
  12. دوامة أنابيب لمدة 10 ق لخلط وحضانة لمدة 30 دقيقة في 30 درجة مئوية، ويهز في 150-200 دورة في الدقيقة. وضع أنابيب 1.5 مل على الجانب لصالح الهز.
  13. صدمة الحرارة خلايا الخميرة لمدة 15 دقيقة في 42 درجة مئوية في كتلة التدفئة، ثم الطرد المركزي الخلايا لمدة 20 s في 10،000 ×ز. إزالة supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من الماء المعقم.
  14. نشر 100 درجة مئوية من تعليق الخلية على لوحة أجار YPDA وحضانة (رأسا على عقب) لمدة يوم واحد عند 30 درجة مئوية. لضمان الحصول على مستعمرات منفصلة جيدا، وتنتشر أيضا 100 درجة مئوية من تخفيف 1:10.
  15. في اليوم التالي، لوحة النسخة المتماثلة باستخدام المخمل المعقمة على لوحةأجار CM التي تحتوي على سكر العنب و 5-FOA (الجدول 2). النظر في لوحة النسخة المتماثلة الثانية على لوحة جديدة إذا تم نقل العديد من الخلايا (أي بعض نمو خلايا URA3).
  16. بعد ثلاثة أيام، لوحة طبق الأصل على YPDA غير انتقائية وYPDA تحتوي على G418 (مضادحيوي أمينوغليكوزيمماثل مماثلة لكانامايسين) لوحات أجار (الجدول 2)، بمناسبة كل لوحة لتسهيل المقارنة اللاحقة. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
  17. في اليوم التالي، حدد سلالات المراسل المرشح من المستعمرات التي هي حساسة G418 ولكن تنمو على لوحات YPDA (على سبيل المثال، yLFM- أو yAFM-RE المستعمرات). خط المستعمرات المحددة (3-6 مستعمرات) على لوحة YPDA جديدة للحصول على عزل مستعمرة واحدة والسماح لهم بالنمو لمدة 2 أيام في 30 درجة مئوية.
  18. تصحيح مستعمرات الخميرة واحدة على لوحة YPDA لعزل المستعمرات لمزيد من التحليلات. بعد 24 ساعة عند 30 درجة مئوية، قم باختبارها عنطريق الطلاء المقلد على لوحة أجار YPGA (الجدول 2) التي تمنع نمو المتحولين صغير (أي، المسوخ التي تعاني من نقص في الجهاز التنفسي). في نفس الوقت، لوحة النسخة المتماثلة على لوحة أجار YPDA جديدة.
  19. اختبار البقع الصحيحة (أي النمو على لوحات أجار YPDA وYPGA؛ 1-3 مستعمرات) من الخطوة 1.18 لوجود التكامل القلة الصحيح من قبل PCR مستعمرة. تجميع مزيج التفاعل عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من 10X PCR العازلة (1.5 مل ملغ كل2)،2 ميكرولتر من 10 بيكومول / ميكرولتر التمهيديات (الجدول3)،4 ميكرولتر من 2.5 مليون dNTPs، 0.25 ميكرولتر من 5 U / ميكروL طاقة بولميراز، والماء إلى حجم نهائي من 50 ميكرولتر. مضاعفة مزيج رد الفعل لعدد من مستعمرات الخميرة التي تحتاج إلى فحص وaliquot 50 ميكرولتر في كل أنبوب PCR. باستخدام ماصة، إضافة كمية صغيرة جدا من خلايا الخميرة من لوحة أجار YPDA في مزيج واحد من رد فعل PCR.
  20. أداء رد فعل PCR مع البرنامج التالي: 94 درجة مئوية لمدة 8 دقائق تليها 35 دورات من denaturation لمدة 1 دقيقة في 94 درجة مئوية، التمهيديات الصلب لمدة 1 دقيقة في 55 درجة مئوية، وتمديد لمدة 2 دقيقة في 72 درجة مئوية.
  21. بعد الانتهاء من رد الفعل، تحميل aliquot من رد فعل PCR (حوالي عشر حجم) على هلام أغاروز للتحقق من الحجم الصحيح (~ 500 bp).
  22. تسلسل المنتج PCR بعد تنقية مع مجموعة تجارية لتأكيد تكامل تسلسل RE المطلوب باستخدام نفس التمهيديات من الخطوة 1.19.
  23. بعد التحقق من صحة التسلسل الصحيح، وجعل 15٪ الجلسرين الأسهم من yAFM-RE أو yLFM-RE ثقافة سلالة (في YPDA) وتخزينها في -80 درجة مئوية.

2. تقييم قدرة P53 تبديل البروتين باستخدام نوعية اللون القائم على تحليل الخميرة ADE2

  1. كرر الخطوتين 1.1 و1.2 باستخدام سلالةyAFM-RE (الجدول 1).
  2. في اليوم التالي، تمييع ثقافة الخلية (1:10) في 30-50 مل من YPDA الدافئة مسبقا والاستمرار في احتضان في 30 درجة مئوية عن طريق هز حتى OD600nm يصل 0.8-1.0 (~ 2 ح).
  3. كرر الخطوات 1.5 إلى 1.10.
  4. في أنبوب منفصل 1.5 مل، إضافة 300-500 نانوغرام من الخميرةP53 (أو السيطرة) ناقلات التعبير (الجدول 4)، 5 ميكرولتر من سلمون مسلوق الحيوانات المنوية الحمض النووي الناقل، 300 درجة مئوية من PEG LiAcTE معقمة، و 50 ميكرولتر من تعليق خلية الخميرة.
  5. كرر الخطوتين 1.12 و 1.13 ولكن إعادة تعليق بيليه الخلية في 300 درجة مئوية من الماء المعقمة.
  6. نشر 100 درجة مئوية من تعليق الخلية على انتقائية الاصطناعية (للتعبير P53 أو ناقلات التحكم) لوحاتتحتوي على سكر العنب كمصدر للكربون وكمية عالية من الأيدينين (الجدول 2)، ثم حضانة (رأسا على عقب) في 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
  7. سلسلة واحدة الخميرة تحويل المستعمرات (2-6 الشرائط لكل لوحة) على لوحة انتقائية جديدة والسماح لهم تنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
  8. في اليوم التالي، باستخدام المخملية المعقمة طبق النسخة المتماثلة على لوحات انتقائية جديدة تسمح لتقييم النمط الظاهري اللون (أي، لوحات تحتوي على سكر العنب كمصدر للكربون ولكن الحد من كمية الأيسينين ؛ الجدول2). احتضان لوحات رأسا على عقب في 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام. اختياريا، لتقييم حساسية درجة الحرارة من البروتين P53، وحضانة في ثلاث درجات حرارة مختلفة لمدة 3 أيام: 24 درجة مئوية، 30 درجة مئوية، و 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: نفس الخط يمكن أن تكون النسخة المتماثلة مطلي عدة مرات.
  9. لتقييم قدرة P53 على نقل البروتين، تحقق من النمط الظاهري القائم على اللون لمستعمرات الخميرة وقارن النمط الظاهري للبروتين P53 فيما يتعلق بالنمط الظاهري P53 والأنماط الظاهرية الفارغة للناقلات.

3. تقييم قدرة P53 على نقل البروتين باستخدام الإنارة الكمية القائمة على تحليل الخميرة LUC1

  1. تحويل خلايا الخميرة مع P53 (أوالتحكم) ناقلات التعبير (الجدول 4) باستخدام الطريقة المستندة إلى LiAc الموصوفة في البروتوكول 2. استخدام سلالة yLFM-RE (الجدول1).
  2. تصحيح تحويلات واحدة على لوحة انتقائية جديدة مع كمية عالية من الأيجنين التي تحتوي على الجلوكوز كمصدر للكربون والسماح لهم بالنمو في 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها. لكل نوع تحويل، قم بإجراء تصحيحات مختلفة 5-7.
  3. بعد النمو بين عشية وضحاها، وإعادة تعليق كمية صغيرة من خلايا الخميرة باستخدام مسواك معقمة أو تلميح ماصة من لوحة في المتوسطة الانتقائية الاصطناعية التي تحتوي على سكر العنب أو raffinose كمصدر للكربون (200 حجم نهائي ميكرولتر في لوحة شفافة 96 جيدا، مع جولة أو أسفل مسطحة). إذا كانت التجربة تتطلب تعبير P53 غير قابل للقهر، أضف جالاكتوز إلىالمتوسطة الرافينوس لتعديل مستوى الحث (الجدول 2).
    ملاحظة: يجب أن يكون تعليق الخلية هذهOD 600nm حوالي 0.4 وليس أعلى من 1.
  4. قياس امتصاص كل بئر في OD600nm بعد التعبير P53 inducible (4-8 ح في 30 درجة مئوية مع 150-200 دورة في الدقيقة يهز) باستخدام قارئ لوحة متعددة التسمية. تأكد من أن تعليق الخلايا متجانس عن طريق خلط كل بئر مع ماصة متعددة القنوات.
  5. نقل 10-20 درجة مئوية من تعليق الخلية من لوحة 96 جيدا شفافة في لوحة بيضاء 384 (أو 96) لوحة جيدة ومزيج مع حجم متساو (10-20 درجة مئوية) من العازلة lysis. حضانة لمدة 10-15 دقيقة في RT على شاكر (150-200 دورة في الدقيقة) لتحقيق نفاذية الخلية إلى الركيزة لوسيفيراز.
  6. إضافة 10-20 درجة مئوية من الركيزة لوسيفيراز اليراعة وقياس وحدات الضوء (LU) من قبل قارئ لوحة متعددة التسمية.
  7. لتحديد قدرة P53 تبديل البروتين، تطبيع LUs من كل بئر إلى OD600nm المقابلة (وحدة الضوء النسبي، RLU). حساب متوسط RLU والانحراف المعياري من 3-4 بقع من مستعمرات الخميرة التحويلية.
  8. قارن بيانات نقل البروتين P53 فيما يتعلق بالمتجه البري والفارغ من النوع P53، إما عن طريق طرح القيم التي تم الحصول عليها مع المتجه الفارغ أو بالقسمة على القيم التي تم الحصول عليها مع المتجه الفارغ (أي أضعاف الحوسبة من الحث).
    ملاحظة: يمكن أيضاتقييم نشاط التعطيل P53 باستخدام نفس الإعداد التجريبي في وجود البروتينات المتفاعلة P53 (أي MDM2 وMDMX) و / أو بما في ذلك العلاج من المخدرات.

4. تقييم تثبيط نمو البروتين P53 باستخدام تحليل الخميرة الفينوتيبيك

  1. تحويل خلايا الخميرة باستخدام متجهات التعبير P53/MDM2/MDMX (أو التحكم) (الجدول4)باستخدام الطريقة المستندة إلى LiAc الموضحة في القسم 2. استخدام سلالة CG379 (الجدول1)ونشر الخميرة التحويلية على لوحات انتقائية الحد الأدنى (الجدول2).
  2. تنمو الخلايا المحولة فيالحد الأدنى من المتوسطة الانتقائية (الجدول 2) إلى ما يقرب من 1 OD600nm.
  3. تمييع خلايا الخميرة إلى 0.05 OD600nm في وسيط الحث الانتقائي (الجدول2)،واختياريا، إضافة جزيء صغير مختار إلى التركيز المناسب (أو المذيبات فقط) لاختبار فعاليته في إعادة تنشيط متحولة P53 أو في تثبيط MDM2- /MDMX-P53 التفاعلات.
  4. حضانة الخلايا في 30 درجة مئوية تحت اهتزاز المداري المستمر (200 دورة في الدقيقة) لمدة 42 ساعة تقريبا (الوقت المطلوب من الخميرة التحكم السلبي للوصول إلى مرحلة منتصف السجل، حوالي 0.45 OD600nm).
  5. بقعة 100 ميكرولتر aliquots من الثقافات خليةالخميرة على لوحات انتقائية الحد الأدنى (الجدول 2).
  6. حضانة لمدة 2 أيام عند 30 درجة مئوية.
  7. قياس نمو الخميرة عن طريق عد عدد المستعمرات التي تم الحصول عليها في قطرات الثقافة 100 درجة مئوية (وحدة تشكيل مستعمرة، التهم CFU). على سبيل المثال، حساب تأثير إعادة تنشيط متحولة من المركبات النظر في نمو البرية من نوع P53 التعبير عن الخميرة كأقصى تأثير ممكن (تعيين إلى 100٪)، في حين أن نمو الخلايا التي تعبر عن متحولة P53 (ولكن تتعرض للسيطرة المذيبات) يمثل مستوى الصفر من إعادة التنشيط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تشييد فى الرّهة الثانية أو LUC1 مراسل سلالات الخميرة

وقد تم تكييفdelitto perfettoapproach12،14،15،16 لتمكين بناء سلالات الخميرة مراسل P53 ( الشكل1B). وتستخدم هذه الطريقة قلة القلة ذات المدة المزدوجة أو المزدوجة التي تحتوي، على كلا الطرفين، على ما لا يقل عن 30 نيوكليوتيدات متجانسة في المكان المختار للتكامل. على وجه التحديد، يتوافق الهولوجي مع تسلسل يحيط بموقع دمج كاسيت علامة مزدوجة ICORE، التي تحتوي على KlURA3 وkanMX4 (الجين مراسل توفير المقاومة لGeneticin، G418) المتمركزة سابقا في الموقع المستهدف المطلوب15،16. هذا الكاسيت يحتوي أيضا على الخميرة I-SceI تسلسل الترميز endonuclease، تحت المروج GAL1 inducible وموقعها المستهدف cognate. ولذلك، فإن التبديل في الجالاكتوز التي تحتوي على المتوسطة الحق قبل تحويل خلايا الخميرة مع النتائج التسلسل المطلوب في التعبير I-SceI والجيل المترتب على ذلك من كسر واحد مزدوج حبلا (DSB) في موقع التكامل ICORE. وجود DSB يحفز بشكل كبير وتيرة استهداف الأحداث، مع الحصول على أكثر من 1000 استبدال مع تحول واحد.

في نهاية عملية الاستهداف والاختيار على أساس المقاومة المكتسبة ل5-FOA والحساسية لG418، يتم تأكيد استنساخ المرشح من قبل مستعمرة PCR القائم على تضخيم موضع المعدلة وتسلسل Sanger للتحقق من التكامل الصحيح لل المطلوب P53 RE (الشكل1C). في نهاية بروتوكول بناء سلالة، التي يمكن أن تكتمل في حوالي أسبوع، يتم الحصول على لوحة من سلالات الخميرة مراسل isogenic التي يمكن استخدامها لتقييم كيفية تأثير الاختلافات في تسلسل REs على قدرة التنشيط من P53 البروتين.

متحولة غير متجانسة وظيفيا P53s

في الأورام البشرية، يتأثر الجين TP53 بشكل رئيسي بطفرات غير منطقية واحدة تنطوي بشكل عام على ست بقايا رئيسية للنقطة الساخنة (R175 وG245 وR248 وR249 وR273 وR282) الموجودة في المجال المركزي الملزم للحمض النووي (DBD) للبروتين P53. ومع ذلك، تم تسجيل أكثر من 2000 استبدال واحد P53 الأحماض الأمينية، بما في ذلك بعض التي نادرا ما لوحظ27. يمكن تصنيف P53s متحولة على أنها اتصال الحمض النووي أو المسوخ الهيكلية، اعتمادا على آثار استبدال الأحماض الأمينية على الاتصال الحمض النووي البروتين (على سبيل المثال، R273H) أو بنية البروتين (على سبيل المثال، R175H)36. واحد TP53 الطفرات سوء الإحساس تؤثر على وظائف P53, توليد مجموعة واسعة من التنوع الوظيفي, التي يمكن أن تؤثر على الميزات السريرية الهامة مثل عدوانية الورم, العلاج الكيميائي المقاومة, وإمكانات النقيلي37, 38 , 39.

المفهوم أن المتحولين P53 هي غير متجانسة وظيفيا ظهرت بوضوح في السنوات ال 15 الماضية من خلال كمية كبيرة من البيانات التجريبية المتاحة في قواعد بيانات الطفرة TP53 (على سبيل المثال، )27. وقد تم تطوير الاختبارات الوظيفية المختلفة على أساس الخميرة و / أو نظم مراسل الثدييات، وتسليط الضوء على الخصائص المختلفة للمتحولين P53s (أي، التنشيط، حساسية درجة الحرارة، والمحتملة المهيمنة السلبية، والتدخل في أعضاء عائلة P53 والتفاعلات مع TFs الأخرى)13،24،40،41،42،43،44. دراسة وظيفية أشمل درست أكثر من 2300 متحولة في اختبار الخميرة القائمة على من خلال وصف نشاطهم التنشيط نحو ثمانية مختلفة P53 REs24.

وأكدت البيانات أن جميع الـ P53 متحولة تقريباً التي تنطوي على بقايا نقاط ساخنة هي فقدان للوظيفة (أي أنها فقدت تماماً نشاط التنشيط). على العكس من ذلك، متحولة P53s التي ضربت مواقع أخرى من البروتين P53 وتوجد عموما في تردد معتدل إلى منخفض في السرطان45 هي متحولة وظيفة جزئية، والتي تحتفظ ببعض مستوى نشاط التنشيط على P53 REs13، 17- ويرد في الشكل 2ألفمثال على استخدام اختبار ADE2 لدراسة البروتينات P53 الموصوفة. في الواقع، في حين R175H هو فقدان وظيفة متحولة تنتج المستعمرات الحمراء في كل حالة اختبارها، وأظهرت R282W حساسية درجة الحرارة التي كانت أكثر وضوحا باستخدام التعبير P53 تعتمد على الجالاكتوز (أي، القطاع الأحمر في 37 درجة مئوية في سلالة P21-5 ' RE في لوحة تحتوي على الجالاكتوز السفلي، والذي يصبح وردي في لوحة الجالاكتوز أعلى). ويعرض الشكل 2باء ملخصا ً لنتائج مجموعة موسعة من المتحولين P53 وسلالات المراسلين.

وأدى وجود هذه التغايرية الوظيفية P53 إلى استكشاف ما إذا كان هذا التباين يوازي التباين الذي لوحظ على المستوى السريري في المواضيع ذات الطفرات الجرثومية TP53. الطفرات الجرثومية TP53 تكمن وراء الأساس الجزيئي لمجموعة من اضطرابات الاستعداد للسرطان، بما في ذلك متلازمات لي فراوميني (LFS) ومتلازمة لي فراوميني الشبيهة بـ (LFL)، والرغبة غير المتلازمية الأقل شدة مع (FH) أو دون (لا FH) تاريخ الأسرة46.

وسلط البروتوكول الضوء على الارتباطات بين النمط الجيني والفينوتاي بمطابقة قدرات التنشيط المستندة إلى اختبار الخميرة لجميع الأليلات المتحولة الجرثومية TP53 مع البيانات السريرية المقابلة من قاعدة بيانات IARC . وقد تم العثور على فقدان وظيفة P53 المسوخ في متلازمات أكثر شدة عرضة للسرطان، في حين تم العثور على وظيفة جزئية P53 المسوخ في ظروف أقل شدة عرضة للسرطان. وهذا يشير إلى أن P53 القدرة على التنشيط المتبقية يؤثر على النمط الظاهري السريري في المرضى الذين ورثوا الطفرات TP53 والسرطان وضعت25,26.

النيوكليوتيدات تسلسل الاختلافات داخل REs تحكم P53 إمكانية التنشيط

الإنسان P53 هو رباعي (ديمر من ديمر) TF. كل ّ [ب53] [ديمر] يميّز [ر] يتألّف 10 [نوكليوتيدس] ([رّروووغيي], [ر] =[ا] أو [غ]; W = A أو T؛ Y = C أو T)47،48. ويمكن أن يكون موقعان من هذه المواقع نصفهما إما متجاورين أو متباعدين بما يصل إلى 13-20 نيوكليوتيدات، مما يشكل وظيفة P53 RE. ومع ذلك، تتميز P53 REs مع فاصل بتقارب أقل P53 والتحويل من P53 REs دون فاصل49،50، في الاختبارات الوظيفية المختلفة من أنظمة مختلفة.

وقد ثبت مؤخرا أن نصف المواقع يمكن تجنيد رباعيات P53 التي ترتبط hemispecifically51، جنبا إلى جنب مع الاختبارات الوظيفية ودراسات الترسيب المناعي الكروماتين ، وتشير هذه النتائج إلى أن P53 يمكن أن تعمل أيضا في REs غير الكنسية ، تضم نصف المواقع وثلاثة أرباع المواقع48،52. وعلاوة على ذلك، فإن حقيقة أن مجموعة P53 RE التوافقية بالكامل هي منحطة جداً (RRRCWWGYYY)2 تُعَرِّب إمكانية أن تختلف فرادى الـ REs اختلافاً كبيراً من حيث التسلسل والتقارب الملزم. وبالنظر إلى أنه تم تحديد المئات من الجينات المستهدفة P53 في الجينوم البشري41،48،أظهرت جميع P53 REs تقريبا تسلسل غير متطابقة بين بعضها البعض. وعلاوة على ذلك، فقد افترض أن REs مع تقارب ربط الحمض النووي متميزة يتم اختيارها في المروجين للجينات الهدف P53 المشاركة في اعتقال دورة الخلية أو المبرمج53.

التحليل في الخميرة من العديد من المتغيرات من P53 RE في موقع الجينوم المستمر أثبتت تأثير المتغيرات النيوكليوتيدات، فاصل وتنظيم RE نصف المواقع على قدرة التنشيط49. حتى أنه أدى إلى اكتشاف REs P53 متعددة الأشكال مع الأليلات اثنين تختلف بشكل ملحوظ في استجابة المروج المرتبطة لP5314،54،55. في الآونة الأخيرة، تم ترميز المعلومات المستمدة من ميزات تسلسل P53 RE وإمكانية التنشيط القائم على الخميرة في P53 Recoverr، خوارزمية بحث نمط قادرة على توطين وترتيب كل من REs الكنسية وغير الكنسية، وفقا لهذه توقعات إمكانات التنشيط في جميع أنحاء الجينوم البشري كله52.

كمثال على استخدام المثلل لدراسة إمكانية نقل P53 محددة التسلسل، المعروضة هنا هي مقارنة بين الإنسان البرية من نوع P53 والبروتين P53 البعيد التطوري من Caenorhabditis elegans (الشكل 3). هذه النتائج هي متابعة لدراسة حديثة تم فيها استكشاف الاختلاف التطوري لخصوصية التنشيط بين بروتينات P5356. وقد تم تطوير سلالات المراسلين yLFM-RE المسببة للسرطان كما هو موضح في البروتوكول. وعلى وجه التحديد، تمت مقارنة طراز Cep-1 P53 RE المستمد من جين ced13 57،وأربعة متغيرات (V1-V4) (الشكل3A). وقد تم بناء المتغيرات RE لدراسة تأثير تغيير طول الفواصل التي تفصل بين الزخارف decameric اثنين (الذي في ced13، هو من 28 النيوكليوتيدات) ودراسة التغيرات في النيوكليوتيدات المحيطة عزر CWWG الأساسية (التي هي في ced13، هي A / T الغنية؛ بينما في ال [هيغست] تقارب إنسانيّة [ب53] [رس], [غ/ك] غنيّة)58. تظهر النتائج بوضوح كيف يختلف Cep1 وP53 الإنسان من حيث خصوصية التنشيط. في الواقع، في حين أن يتم تثبيط تنشيط الإنسان P53 بوساطة بقوة من خلال وجود فاصل (الشكل3B)،يتم تثبيط نشاط Cep-1 عن طريق إزالة فاصل (الشكل3C). وعلاوة على ذلك، يتم إلغاء التنشيط بوساطة Cep-1 عند تعديل RE من A/T إلى G/C-rich. لا الإنسان P53 ولا Cep-1 يمكن تحويل من decamer واحد مشتق من CED13 RE.

البحث عن مُعطلات الجزيئات الصغيرة لتفاعلات P53-MDM2/MDMX وأجهزة إعادة تنشيط نشاط P53 المتحولة

أدى الارتباط القائم بين التأثير المثبط للنمو من P53 البشرية ودرجة نشاطها في الخميرة إلى فحص مبسط على أساس قياسات نمو خلايا الخميرة لتحليل تأثير عوامل التداخل على نشاط P53 (الشكل4 ). وقد ثبت فعالية فحص فينوتيبيك الخميرة لفحص العوامل المضادة للسرطان المحتملة في العديد من الأعمال. باستخدام خلايا الخميرة للتعبير المشترك P53 ومثبطاتها MDM2 و / أو MDMX، تم تحديد تعطيل جديدة من هذه التفاعلات من خلال قدرتها على تثبيط التأثير السلبي للMDMs على P53، وبالتالي إعادة إنشاء البرية من نوع P53 الناجمة عن تثبيط نمو الخميرة ( الشكل 4ألف). على وجه الخصوص، أدى هذا القول إلى اكتشاف 1) بيرانوكسانثون 1 كأول مثبط اتّصال P53-MDM2 مع سقالة زانثون34 و2) مثبطات أوكسازولوسيندولينون من تفاعل P53-MDM259. بالإضافة إلى ذلك، مع هذا القول، تم وصف α-mangostin وحمض الغمبوجيك لأول مرة كمثبطات محتملة للتفاعل P53-MDM230.

في وقت لاحق، أظهر نفس القول أن prenylation من chalcones عززت قدرتها على تعطيل التفاعل P53-MDM260. ومن المثير للاهتمام, هذا فحص الخميرة أدى أيضا إلى اكتشاف اثنين من مثبطات من التفاعلات P53-MDM2/MDMX: التربتوفانول المشتقة أوكسازولوبيبريدون لاكتام OXAZ-161 وتريبتوفانول المستمدة أوكسازوليزويندولينون DIMP53-162.

كما تم استكشاف تأثير انخفاض فقدان وظيفة متحولة P53 على نمو خلايا الخميرة لفحص المخدرات متحولة P53 إعادة تنشيط، وتتميز القدرة على استعادة البرية مثل النشاط المثبط النمو إلى متحولة P53 (الشكل4B). مع هذا التمور، تم تحديد المنشط من متحولة P53 R280K، وenantiopure التربتوفانول المستمدة أوكسازولوإيزويندولينون SLMP53-163. الشكل 4C،D يظهر النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها في الخميرة مع التعبير عن P53 أو العلاجات مع مثبط التفاعل P53-MDM2 Nutlin-3a أو مع إعادة تنشيط P53 متحولة Y220C PhiKan083.

التحقق من الآلية الجزيئية لعمل هذه المركبات كعوامل تنشيط P53 وكذلك نشاطها المضاد للورم، سواء في خطوط الخلايا السرطانية البشرية34،60،61،62،63 ونماذج الحيوان62،63، يشهد على إمكانات كبيرة من اختبار الخميرة phenotypic في اكتشاف المخدرات.

Figure 1
الشكل 1 : ملامح الخميرة على أساس P53 عمليات التنشيط وتدفق العمل لبناء سلالات الخميرة مراسل P53. (أ) إن سهولة التلاعب بالجينوم والتعبير الجيني خارج الرحم الخاضع للرقابة يجعل الخميرة أقرب إلى "أنبوب اختبار في الجسم الحي"، حيث يتم استكشاف عدة متغيرات ذات صلة بفحص وظائف التنشيط P53 بدقة. وتشمل هذه المتغيرات مستويات التعبير عن بروتين P53 من النوع البري أو المتحول، وتسلسل RE، ونوع جين المراسل [النوعي/شبه الكمي (على سبيل المثال، ADE2 وLACZ)أو كمية (مثل LUC1)]. إن تسلسل RE التوافقي قد تدهور إلى حد كبير (RE = RRRCWWGYYY-n-RRRCWWGYYY; R = purine; W = A/T؛ Y = بيريميدين; CWWG = تسلسل CORE، n = 0-13 نقطة أساس فاصل). ستؤثر أعداد حالات عدم التطابق فيما يتعلق بتوافق الآراء وتسلسل CORE وعدد فواصل الزوج الأساسي على نشاط التنشيط. تم تعديل هذا الفريق من منشور سابق64. (ب) مخطط نهج الجنح perfetto لإدخال المطلوب P53 RE المنبع من المروج الحد الأدنى الذي يقود التعبير الجيني مراسل ADE2 أو LUC1. تم تكييف البروتوكول من المنشورات السابقة12و15و16. (ج) مثال على نتائج تضخيم مستعمرة الخميرة PCR في المنطقة المحيطة بموقع تكامل القلة RE. صورة الكهربائي يعرض نتيجة تضخيم اثنين من المستعمرات الإيجابية المفترضة (URA3 ناقص وG418 الحساسة) مع السيطرة السلبية PCR المقابلة بجوار سلم الحمض النووي 1 كيلو بايت (Promega). ويمكن تسلسل النطاق الذي تبلغ حوالي 500 متر nt المتوقع باستخدام المواد التمهيدية الموصوفة في الجدول 3 لتأكيد التحرير الصحيح للمروّج، كما هو مبين في الرسم البياني الكهربائي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 تظهر بروتينات P53 إمكانية نقل محددة وحساسة لدرجة الحرارة. تم اختبار الطفرات من النوع البري P53 وTP53 المشار إليها باستخدام الفحص النوعي للمراسل القائم على الألوان في الخميرة واستغلال سلالات المراسل التي تأوي مختلف P53 REs التي تسيطر على التعبير الجيني ADE2. (أ) يظهر مثال على النمط الظاهري للألوان المستعمرة للنوع البري P53، R175H، وR282W مع PUMA (BBC3) وP21-5'REs عند 30 درجة مئوية و37 درجة مئوية. معتدل (0.008٪ جالاكتوز) وارتفاع (0.12٪ جالاكتوز) يتم مقارنة التعبير P53. (ب) النتائج التي تم الحصول عليها مع مجموعة موسعة من المتحولين P53 وسلالات مراسل الخميرة فحص هاوالنمط الظاهري اللون مستعمرة تعتمد على P53 في ثلاث درجات حرارة (24 درجة مئوية، 30 درجة مئوية، و 37 درجة مئوية). وتجسد النتائج عدم التجانس الوظيفي للألايل اتل 53 متحولة وتلخص في شكل جدول. على سبيل المثال، R175H هو فقدان وظيفة متحولة، في حين أن G199H هو البرية من نوع P53 مثل. K139E و R282W الاحتفاظ وظيفة جزئية وتظهر حساسية الباردة وحساسية الحرارة، على التوالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 : الإنسان P53 والفضل ortholog Cep-1 تظهر خصوصية تبديل متباينة للغاية. (أ) تسلسلات من: الإنسان P53 RE تسلسل توافق الآراء، Cep-1 P53 RE المستمدة من الجين ced13، وأربعة متغيرات (V1-V4) التي تم اختبارها في الاختبارات الوظيفية. (ب) تم قياس التنشيط بعد تحفيز التعبير البشري P53 لمدة 8 ساعة باستخدام ثلاثة مصادر كربون مختلفة لتحقيق التعبير المنخفض والمعتدل والعالي (0.008٪، 0.032٪، 0.12٪ جالاكتوز المضافة إلى المتوسطة الانتقائية التي تحتوي على 2٪ رافينوز). يتم التعبير عن النتائج كوحدات خفيفة نسبية متوسطة (RLU) وخطأ قياسي من أربعة نسخ متماثل. تم طرح نشاط مراسل للخلية التي تم تحويلها مع متجه التعبير الفارغ. (C) خصوصية التنشيط من Cep1 كما تقاس في (B). بالنسبة لكل من البروتينات، كانت مستويات التنشيط متناسبة مع كمية الجالاكتوز. وحدات الضوء العالي تقاس عندما يتم التعبير عن P53 الإنسان يمكن أن تعتمد على مستويات مختلفة من كميات البروتين المنتجة، وذلك بسبب الفرق في طول البروتين وربما أيضا في استخدام codon. يتميز البروتينان بخصوصية مختلفة للتنشيط نحو مختلف REs التي تم اختبارها ولا تتأثر هذه الخاصية بالاختلافات المحتملة في كمية البروتين النسبية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 المنشطات جزيء صغير من P53 تحديدها باستخدام الخميرة فينوتيبيك التصاق. (أ) استخدمت خلايا الخميرة التي تشترك في التعبير عن الأفراد من النوع البري P53 وMDM2 أو MDMX للبحث عن مثبطات تفاعلات P53-MDM2 وP53-MDMX. في هذا النظام، مثبطات التفاعل استعادة تثبيط نمو الخميرة الناجمة عن P53 في خلايا الخميرة التي تعبر عن P53 و MDM2 أو MDMX. وقد سمح هذا النهج بتحديد مثبطات التفاعل P53-MDM2 وتحديد مثبطات مزدوجة من التفاعلات P53-MDM2 و P53-MDMX. (ب) وقد استخدمت خلايا الخميرة التي تعبر عن متحولة الإنسان P53 للبحث عن المُعيدات P53 المتحولة وقادرة على استعادة تثبيط نمو الخميرة الشبيهة بالنوع البري P53 في خلايا الخميرة المتحولة P53.express. (ج) صور تمثيلية للتحليل الموضعي للصفيحة تبين تأثير النوع البري P53 أو Y220C على نمو مستعمرة الخميرة مقارنة بالمتجه الفارغ (انظر الخطوة 4-5). (د) النتائج الكمية لدراسة النمو: 10 μM Nutlin-3a يستعيد تثبيط نمو الخميرة الناجم ة P53 في الخلايا التي تعبر عن MDM2؛ 50 μM PhiKan083 يستعيد البرية من نوع مثل P53 التي يسببها تثبيط نمو الخميرة إلى متحولة P53 Y220C. يتم رسم كلا الآثار بالنسبة لنمو الخميرة تأثير مثبط من البرية من نوع P53, التي تم تعيينها واحدة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اسم السلالة والنمط الجيني استخدام محدد رقم البروتوكول
yAFM-ICORE: MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE: :pCyc1::ADE2 يتم استخدامه لبناء سلالة yAFM-RE (MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE: :pCyc1::ADE2)التي يتم استغلالها في تقييم ADE2 النوعي القائم على الألوان. البروتوكولات 1،2
yLFM-ICORE: MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE: :pCyc1::LUC1 يتم استخدامه لبناء سلالة yLFM-RE (MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; RE::pCyc1::LUC1)التي يتم استغلالها في تقييم LUC1 المستند إلى الإنارة الكمية. البروتوكولات 1،3
CG379: MATa, ade5 his7-2 leu2-112 trp1-289aura3-52 [Kil-O] يتم استخدامه لحقن النمو phenotypic. البروتوكول 4

الجدول 1: سلالات الخميرة.

اسم الوسائط والوصفة استخدام محدد رقم البروتوكول
YPDA (2٪ استخراج الخميرة، 2٪ peptone، 2٪ سكر العنب، 200 ملغ / لتر أديينين) + 2٪ أجار يتم تعقيم YPDA دون أجار ويفضل عن طريق الترشيح. يتم تعقيم YPDA + أجار عن طريق الأوتوكلاف. فمن الممكن لحذف سكر العنب من وصفة وإضافة سكر العنب من 20٪ مرشح حل معقم في الماء قبل صب لوحات. البروتوكولات 1-4
CM [0.17٪ الخميرة قاعدة النيتروجين دون AA وكبريتات الأمونيوم، 0.5٪ كبريتات الأمونيوم، 5٪ (حجم / حجم، الخامس / الخامس) غير الضروريمحلول الأحماض الأمينية، 20 ملغ / لتر هيستيدين، 20 ملغ / لتر تريبتوفان، 20 ملغ / لتر uracil، 30 ملغ / لتر ليسين، 100 ملغ / لتر ليوسين، 200 ملغ / L أدينين] + 2% جالاكتوز يتم تعقيم وسائل الإعلام عن طريق التصفية. يتم إعداد حلول الأسهم المعقمة التالية في الماء (باستثناء uracil، التي يتم حلها في 0.1M هيدروكسيد الصوديوم) عن طريق تصفية: غير الضرورية محلول الأحماض الأمينية (0.04٪ أرجينين، 0.04٪ ميثيونين، 0.06٪ إيزوليوسين، 0.1٪ فينيل ألانين، 0.2٪ الجلوتاميك حمض, 0.2% حمض الاسبارتاك, 0.3% فالين, 0.4% تريونين, 0.8% سيرين), 1% هيستيدين, 1% تريبتوفان, 1% أوراسيل, 1% يسين, 1% ليوسين, 0.5% أدينين, 20% جالاكتوز. يجب عدم تخزين محلول مخزون الأيدينين في الثلاجة بسبب تشكيل ترسب البلورات. يجب تخزين محلول مخزون التربتوفان في الظلام. البروتوكول 1
سم (انظر أعلاه) + 2٪ سكر العنب + 1g / L 5-FOA + 2٪ أجار يتم تعقيم وسائل الإعلام (التي تحتوي على قاعدة النيتروجين الخميرة دون AA وكبريتات الأمونيوم، كبريتات الأمونيوم وأجار) عن طريق الأوتوكلاف. يتم إضافة المكونات الأخرى بعد الأوتوكلاف للحفاظ على المكونات الحرارة labile. يمكن إضافة مسحوق 5-FOA مباشرة في وسائل الإعلام بمجرد أن يبرد إلى حوالي 55 درجة مئوية. البروتوكول 1
YPDA + 400 ميكروغرام / مل G418 + 2٪ أجار يجب إضافة G418 بعد الأوتوكلاف مرة واحدة وقد تبريد وسائل الإعلام إلى حوالي 55 درجة مئوية. إذا بدأت من مسحوق، يمكن إعداد 50 ملغ / مل G418 حل الأسهم في الماء وتعقيمها عن طريق الترشيح. البروتوكول 1
وحدات حماية الشعب [2٪ استخراج الخميرة، 2٪ بيبتوني، 2٪ الجلسرين (V / V)، 200 ملغ / لتر أديينين] + 2٪ أجار يتم تعقيم وسائل الإعلام عن طريق الأوتوكلاف. البروتوكول 1
لوحة انتقائية الاصطناعية: [0.17٪ الخميرة قاعدة النيتروجين دون AA وكبريتات الأمونيوم، 0.5٪ كبريتات الأمونيوم، 5٪ (V / V) محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية (0.04٪ أرجينين، 0.04٪ ميثيونين، 0.06٪ إيزوليوسين، 0.1٪ فينيل ألانين، 0.2٪ حمض الجلوتاميك، 0.2٪ أسيدوسك، 0.3٪ فالين، 0.4٪ ثروونين, 0.8% سيرين), 20 ملغ /لتر الهستيدين, 20 ملغ /لتر أوراسيل, 20 ملغ / لتر التربتوفان (اعتمادا على علامة اختيار ناقلات), 30 ملغ / لتر يسين, 100 ملغ / مل ليوسين (اعتمادا على علامة اختيار ناقلات), 5 ملغ / لتر أو 200 ملغ / L أدينين] + 2% سكر العنب + 2٪ أجار يتم تعقيم وسائل الإعلام (التي تحتوي على قاعدة النيتروجين الخميرة دون AA وكبريتات الأمونيوم، كبريتات الأمونيوم وأجار) عن طريق الأوتوكلاف. يتم إضافة المكونات الأخرى بعد الأوتوكلاف للحفاظ على المكونات الحرارة labile. عند استخدام المتجهات المستندة إلى pLS وpLSG إعداد لوحات دون ليوسين. عند استخدام pTS- وpTSG القائم على ناقلات إعداد لوحات دون التربتوفان. البروتوكولات 2-3
وسائل الإعلام الانتقائية الاصطناعية: [0.17٪ الخميرة قاعدة النيتروجين دون AA وكبريتات الأمونيوم، 0.5٪ كبريتات الأمونيوم، 5٪ (V / V) غير الضروريمحلول الأحماض الأمينية (0.04٪ أرجينين، 0.04٪ ميثيونين، 0.06٪ إيزوليوسين، 0.1٪ فينيل ألانين، 0.2٪ حمض الجلوتاميك، 0.2٪ حمض الأسبارتيك، 0.3٪ فالين، 0.4٪ ثروونين, 0.8% سيرين), 20 ملغ / لتر الهيستيدين, 20 ملغ / لتر uracile, 20 ملغ / لتر التربتوفان (اعتمادا على علامة اختيار ناقلات), 30 ملغ / لتر يسين, 100 ملغ / مل ليوسين (اعتمادا على علامة اختيار ناقلات), 200 ملغ / L أدينين] + 2٪ سكر العنب أو raffinose + 0-2٪ اللاكتوز الجاه  يتم تعقيم وسائل الإعلام عن طريق الترشيح. عند استخدام ناقلات pLS- أو pTS القائم في العلاج من المخدرات إعداد وسائل الإعلام دون ليوسين أو التربتوفان, على التوالي ولكن تحتوي على 2% سكر العنب. عند استخدام pLSG- أو pTSG القائم على ناقلات في التعبير P53 inducible مع أو بدون علاج المخدرات إعداد وسائل الإعلام دون ليوسين أو التربتوفان, على التوالي ولكن تحتوي على 2% رافينوز وكمية متغيرة من الجالاكتوز لتعديل التعبير P53. ويمكن أيضا أن يتم تعديل مدى الحث P53 عن طريق تغيير وقت الحضانة. البروتوكول 3
الحد الأدنى من لوحات انتقائية: 2٪ الجلوكوز، 0.7٪ قاعدة النيتروجين الخميرة (دون الأحماض الأمينية وكبريتات الأمونيوم)، 50 ملغ / لتر أدينين، 50 ملغ / لتر uracil، 50 ملغ / لتر الهيستيدين، 50 ملغ / لتر التربتوفان (اعتمادا على علامة اختيار ناقلات)، 50 ملغ / لتر ليوسين (اعتمادا على علامة اختيار المتجهات)، 2% أجار يتم تعقيم المتوسط عن طريق الأوتوكلاف. عند استخدام ناقلات المستندة إلى pLS89 إعداد المتوسطة دون التربتوفان. استخدام ناقلات pLS89 فارغة (لا تعبر عن أي بروتين) كتحكم سلبي. عند استخدام pLS89 القائم على وpGADT7-MDM2 ناقلات (التعبير المشترك من P53 وMDM2), إعداد المتوسطة دون ليوسين والتربتوفان. استخدام pLS89 فارغة وpGADT7 (كلاهما لا يعبر عن أي بروتين) كعناصر تحكم سالبة. عند استخدام ناقلات pLS76 القائم على إعداد المتوسطة دون ليوسين. استخدام ناقلات pRS315 (لا تعبر عن أي بروتين) كسيطرة سلبية. البروتوكول 4
الحد الأدنى من المتوسطة الانتقائية: كلوحات انتقائية الحد الأدنى ولكن دون أجار يتم تعقيم المتوسط عن طريق الترشيح. البروتوكول 4
الحث الانتقائي المتوسط: كوسيلة انتقائية الحد الأدنى ولكن تحتوي على 2٪ جالاكتوز بدلا من الجلوكوز يتم تعقيم المتوسط عن طريق الترشيح. البروتوكول 4

الجدول 2: وسائل الإعلام الخميرة.

اسم الحل والوصفة أو اسم التمهيدي وتسلسل ميزات محددة واستخدام رقم البروتوكول
LiAc/TE: 10 m Tris-HCl, pH 8.0, with 1 m EDTA و 0.1M خلات الليثيوم يتم إعداد حلول الأسهم المعقمة التالية في المياه عن طريق الأوتوكلاف: 1M خلات الليثيوم درجة الحموضة 7.5، 1 M تريس-حمض الهيدروكلوريك / 0.1 M EDTA درجة الحموضة 8.0 (TE العازلة 10X). البروتوكولات 1-4
PEG/LiAc/TE: 40% البولي ايثيلين غليكول (PEG) في 10 m Tris-HCl, pH 8.0, مع 1 mEDTA و 0.1 M خلات الليثيوم يتم إعداد حلول الأسهم المعقمة التالية في المياه عن طريق الأوتوكلاف: 1 M خلات الليثيوم درجة الحموضة 7.5، 1 M تريس-حمض الهيدروكلوريك / 0.1 M EDTA درجة الحموضة 8.0 (TE العازلة 10X)، 50٪ PEG (الوزن الجزيئي ~ 3350). البروتوكولات 1-4
ذيول الهولوجيل لoligonucleotides RE:
5'-gcggaattgactttttttgaatacat-RE-gcagatccgcccgtatatagcggg-3'		 شريطة التسلسل من ال [هولوج] ذيول, يماثل إلى التسلسل كروموسوميّة يحيط ال يندمج [إيكور] كاسيت; RE = RE التسلسل. البروتوكول 1
المواد التمهيدية: Ade2 مهاجم: 5'-AAGTTGCCTAGTTTCATGAA-3';
Ade2 Rv: 5'-GGAGCCATTAACGTGTCAT-3';
Luc1-Rv: 5'-CATAGCTTCTGCCAACCGAA-3'		 لسلالة yAFM-RE (PCR والتسلسل) الجمع بين Ade2 Fw مع Ade2 Rv التمهيدي. لسلالة yLFM-RE (PCR والتسلسل) الجمع بين Ade2 Fw مع لوك1-Rv التمهيدي. البروتوكول 1

الجدول 3: الحلول واحتكار القلة.

أنواع المتجهات الضوابط الإيجابية والسلبية رقم البروتوكول
P53 (أو التحكم) المتجهات.
pLS- أو pLSG القائم: P53 التعبير البروتين تحت المروج ADH1 التأسيسية أو الجالاكتوز مروج GAL1 inducible، على التوالي (LEU2 كعلامة الاختيار).
pTS- أو pTSG القائم على: P53 التعبير البروتين تحت الشحيّج ADH1 أو الجالاكتوز غير قابل للتحمل GAL1 المروج، على التوالي (TRP1 كعلامة الاختيار)		 pLS- و pLSG المستندة: استخدام كتحكم إيجابي pLS76 وناقلات pLSG-P53 (التعبير عن النوع البري P53)، على التوالي؛ استخدام كناقلات pRS315 التحكم السلبي (لا تعبر عن أي بروتين).
pTS- وpTSG المستندة إلى: استخدام كتحكم إيجابي في pTS76 وناقلات pTSG-P53 (التعبير عن النوع البري P53)، على التوالي؛ استخدام كناقلات pRS314 السيطرة السلبية (لا تعبر عن أي بروتين).		 البروتوكول 2 و3
متجهات P53 وMDM2 (أو التحكم).
pLS89 القائم على: البرية نوع P53 التعبير البروتين تحت الجالاكتوز inducible GAL1 المروج (TRP1 كعلامة الاختيار).
[بّلس76-بسد]: متحولة [ب53] بروتين تعبير تحت تأسيسيّة [أد1] مروّج ([ليو2] كإنتقاء علامة).
pGADT7 القائم على: تعبير البروتين MDM2 تحت المروج ADH1 التأسيسية (LEU2 كعلامة الاختيار)		 pLS89-based: استخدام كتحكم إيجابي ناقلات pLS89-P53 (التعبير عن النوع البري P53)؛ استخدام pLS89-فارغة التحكم السلبية (لا تعبر عن أي بروتين).
[بلس76-بسد]: إستعمال كتحكم إيجابيّة ال [بّل76-منوع] [ب53] متجهة (عبّر عن متحولة [ب53]); استخدام كناقلات pRS315 التحكم السلبي (لا تعبر عن أي بروتين).
pGADT7 القائم على: استخدام كتحكم إيجابي ناقلات pGADT7-MDM2 (التعبير عن نوع البرية MDM2)؛ استخدام كناقلات pGADT7 التحكم السلبي (لا تعبر عن أي بروتين).		 البروتوكول 4

الجدول 4: ناقلات تعبير الخميرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد أثبتت الاختبارات القائمة على الخميرة مفيدة للتحقيق في مختلف جوانب وظائف البروتين P53. وهذه الاختبارات حساسة بشكل خاص لتقييم إمكانية نقل P53 نحو المتغيرات من المواقع المستهدفة RE، بما في ذلك تقييم تعدد الأشكال الوظيفية. استخدام الصحفيين اللون، فضلا عن تصغير من اللوسيفيراز التصاق يؤدي إلى الاختبارات فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتحجيم نسبيا. أيضا، اختبار تثبيط النمو يحتمل أن تكون قابلة لاستخدامها في فحص المكتبة الكيميائية، أتمتة القياس الكمي لصلاحية خلية الخميرة من خلال قياس الامتصاص. في حين أن نفاذية محدودة بسبب جدار الخلية وعمل الناقلين ABC وقد اعتبرت قيدا في استخدام الخميرة لفحص المخدرات، وقد وضعت بنجاح التعديلات الوراثية لتحسين التناول22،65.

بالمقارنة مع الاختبارات المستندة إلى الخلايا الثدييات، فإن اختبار P53 القائم على الخميرة قد يحسن تحديد الضربات المباشرة، نظراً لأن P53 معزول ة عن التعقيد المذهل للعوامل المساعدة وإشارات الممرات التعاقبية التي تعدل وظائفها في eukaryotes أعلى. كما نجحت الاختبارات الوظيفية القائمة على الخميرة جزئيا في رصد تفاعل P53 مع العوامل المساعدة للبروتين (وهي MDM2 وMDMX22و32و33و34)وتأثير الصغيرة جزيئات (مثل Nutlin-3a) على تلك التفاعلات. ومع ذلك، فإن الحساسية والقوة التنبؤية للاختبارات القائمة على الخميرة للتحقيق في الحديث المتبادل بين P53 والبروتينات المتفاعلة قد تكون محدودة إلى حد ما، اعتمادا على كيفية اعتماد تلك التفاعلات في الجسم الحي على التعديلات ما بعد الترجمة و سلاسل الإشارات الخاصة بالأنواع.

ويمكن تكييف النظم الموصوفة هنا بسهولة مع الصناديق الاستئمانية الأخرى. في الواقع، وقد وضعت الخميرة الاختبارات الوظيفية للP53 ذات الصلة P63 و P73 البروتينات42،49 وكذلك أعضاء الأسرة NF-יB66،67 [أو حتى لبعض homeobox والأساسية الحلزون حلقة الحلزون (bHLH) TFs68,69]. وقد تم التعبير عن المستقبلات النووية البشرية أيضا في الخميرة وثبت أن تعمل كما تعتمد على الرباط، وتسلسل محددة TFs70. وقد تم تحديد عامل واحد الحد في القدرة الضعيفة لبعض مجال تنشيط الثدييات (TAD) للتفاعل مع الخميرة الآلات النسخ القاعدية8، وهو القصور الذي يمكن التغلب عليه باستخدام البنى chimeric بما في ذلك نشط [تاد][168],69.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر الاتحاد الأوروبي (صندوق الاتحاد الأوروبي POCI/01/0145/FEDER/007728 من خلال Programa Operacional Factores de Competitividade - COMPETE) والصناديق الوطنية (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia and Ministério da Edção e Ciência) under the اتفاقية الشراكة PT2020 UID/QUI/50006/2019 والمشاريع (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. زمالات FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). وقد تم دعم هذا العمل من قبل Compagnia S. Paolo, Turin, Italy (Project 2017.0526) ووزارة الصحة (المشروع 5x1000 و 2015 و 2016; البحث الحالي 2016). ونشكر بشدة الدكتورة تيريزا لوبيز - أرياس الجبل الأسود (جامعة ترينتو، مختبرات تدريس العلوم التجريبية) على مساعدتها في تسجيل الفيديو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26 (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21 (2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41 (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231 (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3 (5), e84 (2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20 (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3 (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26 (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22 (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100 (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102 (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19 (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20 (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92 (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29 (5), E28 (2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Cancer Research. 59 (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18 (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6 (6), e20643 (2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45 (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100 (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9 (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378 (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76 (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8 (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280 (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3 (1), e1507 (2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85 (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8 (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265 (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192 (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), a001107 (2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33 (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5 (4), e10236 (2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10 (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22 (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21 (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279 (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1 (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41 (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114 (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464 (2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155 (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10 (2), e0116177 (2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12 (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109 (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11 (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7 (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16 (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74 (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10 (7), e0130170 (2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13 (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14 (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17 (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27 (8), 1875-1881 (1999).

Tags

أبحاث السرطان العدد 150 P53 الخميرة عنصر الاستجابة فحص وظيفي النسخ تثبيط النمو
الخميرة كهيكل لتطوير الاختبارات الوظيفية لدراسة P53 الإنسان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monti, P., Bosco, B., Gomes, S.,… More

Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter