Summary
وقد وضعت الأسفار الرنين الطاقة المستندة إلى نقل في الوقت الحقيقي مراقبة نظم من الحمض النووي حبلا تبادل رد فعل توسط Rad51. استخدام البروتوكولات المقدمة هنا، نحن قادرون على الكشف عن تشكيل رد فعل المواد الوسيطة وتحويلها إلى منتجات، بينما أيضا تحليل الحركية الانزيمية من رد فعل.
Abstract
تفاعل تبادل حبلا الحمض النووي توسط Rad51 خطوة حاسمة جزئ مثلى. في رد الفعل هذا، يشكل خيوط البروتين النووي على واحد--الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (سدنا) Rad51 ويلتقط مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (dsDNA) غير خصيصا لاستجواب ذلك لتسلسل مثلى. بعد أن واجهت التماثل، يحفز Rad51 تبادل حبلا الحمض النووي للتوسط في إقران حبلا مكملة دسدنا سدنى. هذا رد فعل جداً ينظم البروتينات أكسيساري عديدة في فيفو. على الرغم من أن فحوصات الكيمياء الحيوية التقليدية قد استخدمت بنجاح دراسة دور هذا البروتين التبعي في المختبر، تحليل الحركية لتشكيل الوسيطة والتقدم به إلى منتج نهائي ثبت صعبة نظراً وسيطة طبيعة رد فعل عابر وغير مستقر. لمراقبة هذه الخطوات رد فعل مباشرة في الحل، نقل الطاقة صدى الأسفار (الحنق)-على أساس المراقبة في الوقت الحقيقي وأنشئت نظم لرد الفعل هذا. ويبين تحليل الحركية للملاحظات في الوقت الحقيقي أن يطيع حبلا الحمض النووي تبادل رد فعل توسط Rad51 نموذج رد فعل الخطوات الثلاث التي تشمل تشكيل ثلاثة-حبلا الحمض النووي المتوسطة، ونضج هذا المتوسط، والإفراج عن سدنى من متوسطة ناضجة. مجمع Swi5-Sfr1، بروتين أكسيساري في حقيقيات النوى، يعزز بقوة الخطوات الثانية والثالثة من رد الفعل هذا. فحوصات المستندة إلى الحنق المعروضة هنا تمكننا من الكشف عن الآليات الجزيئية عن طريق أي جزئ تحفيز البروتينات accessary نشاط تبادل حبلا الحمض النووي Rad51. والهدف الأساسي من هذا البروتوكول تعزيز مرجع التقنيات المتاحة للباحثين في ميدان جزئ مثلى، لا سيما أولئك الذين يعملون مع البروتينات من الأنواع الأخرى شيزوساكتشاروميسيس بومبي، حيث ويمكن تحديد الحفظ التطوري للنتائج المعروضة هنا.
Introduction
جزئ المتجانسة (HR) يسهل خلط المعلومات الوراثية بين اثنين من جزيئات الحمض النووي مختلفة. الموارد البشرية ضروري للظواهر البيولوجية الأساسية هما: توليد التنوع الوراثي خلال الجاميطات1 وإصلاح الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل (دسبس)2 أثناء الانقسام. دسبس أشد أشكال الضرر الحمض النووي وتشكل على كسر في الكروموسوم. يمكن أن يسبب غير صحيحة إصلاح دسبس ترتيبات جديدة الصبغية واسعة النطاق وعدم الاستقرار المجيني، التي هي كل السمات المميزة للسرطان3.
هو رد فعل تبادل حبلا الحمض النووي المرحلة الوسطى من الموارد البشرية. بروتين Rad51، وعضو في الأسرة RecA-نوع يحافظ على درجة عالية من ريكومبيناسيس، هو البروتين الرئيسي الذي يحفز رد الفعل هذا في حقيقيات النوى4،5. في رد الفعل هذا، Rad51 بربط واحد-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (سدنى) التي تم إنشاؤها عن طريق تجهيز نوكليوليتيك من نهاية جهاز تسوية المنازعات، وأشكال البروتين النووي حلزونية معقدة تسمى خيوط presynaptic. هذه الشعيرة المصيد سليمة من الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل (dsDNA) نونسبيسيفيكالي للبحث عن تسلسل مثلى. عندما يعثر خيوط تسلسل مثلى، يتم تشكيل رد فعل وسيطة تحتوي على الحمض النووي الثلاثة--الذين تقطعت بهم السبل وخيوط Rad51 يتوسط تبادل حبلا داخل هذا الهيكل6،،من78. ولتحقيق هذا التفاعل كفاءة، يتطلب Rad51 عدة أنواع من البروتينات التبعي مثل BRCA1 و BRCA2، منتجات من الثدي السرطان قابلية الجينات9،10.
فهم كيفية تنظيم عوامل ملحق Rad51 خطوة متكاملة في الكشف عن أسباب عدم الاستقرار المجيني أثناء توموريجينيسيس. على الرغم من أن الكثير من البحوث يهتم بآثار هذه العوامل على تكوين خيوط presynaptic والاستقرار11،،من1213،14،،من1516، مساهمة هذه العوامل في تشكيل متوسطة ثلاث حبلا وتجهيزها في المنتج النهائي لا يزال غير واضح. مراقبة رد فعل الخطوات من خلال تجارب الكيمياء الحيوية التقليدية صعب جداً لأن متوسط ثلاثة ستراند غير مستقرة وعرضه للانهيار بالتلاعب التجريبية المشتركة مثل ديبروتينيزيشن عينات أو التفريد.
للتغلب على هذه المشكلة، ونحن تكييفها نظامين المتقدمة سابقا المراقبة في الوقت الحقيقي من الحمض النووي حبلا رد فعل تبادل استخدام نقل الطاقة صدى الأسفار (الحنق): الأقران حبلا الحمض النووي والحمض النووي حبلا التشرد فحوصات17، 18 (الشكل 1). في حبلا الحمض النووي الأقران المقايسة، أشكال Rad51 خيوط بريسينابتيك مع فلوريسسين أميديتي (الاتحاد الماليزي)-المسمى سدنى والمتجانسة ثم كاربوكسي-س-والرودامين (روكس)-المسمى دسدنا يضاف إلى الشروع في رد فعل تبادل حبلا. عندما يمسك دسدنا المسمى بلول خيوط وأشكال المتوسطة ثلاثة ستراند، فلوروفوريس اثنين حيز مقربة والأسفار انبعاث الاتحاد الماليزي هو مروي روكس (الشكل 1A). في مقايسة التشرد حبلا الحمض النووي، هو المحتضنة خيوط presynaptic شكلت في سدنى غير مسمى مع الاتحاد الماليزي وروكس دسدنا المسمى مزدوجة. عندما يتم إكمال تبادل حبلا وهو الإفراج عن الاتحاد الماليزي المسمى سدنى من الثلاثة-حبلا وسيطة، انبعاث الزيادات الاتحاد الماليزي لأنه لم يعد الاتحاد الماليزي بالقرب من روكس (الشكل 1B). هذه فحوصات تمكننا من مراقبة تشكيل ثلاثة ستراند وسيطة وتجهيزها في المنتجات النهائية في الوقت الحقيقي دون أي اضطرابات لرد الفعل.
باستخدام هذا النظام المراقبة في الوقت الحقيقي، وجدنا أن حبلا الحمض النووي تبادل رد فعل توسط Rad51 العائدات في الخطوات الثلاث بما في ذلك تشكيل أول رد فعل الوسيطة (C1)، والانتقال من المتوسطة الأولى إلى متوسطة الثانية (C2)، والإفراج عن سدنى من C219. كما وجدنا أن انشطار الخميرة (بومبي س.) يحفز Sfr1 Swi5، وهو حفظت تقحم Rad51 بروتين التبعي معقدة13،16،20،21،22، الانتقال C1-C2 والإفراج عن سدنى من C2 بطريقة تعتمد على التحلل المائي ATP Rad5119.
إذا حفظت هذه النتائج هي تقحم لا يزال غير معروف. ويرد هذا البروتوكول مع الأمل في أن الباحثين في مجال الموارد البشرية، لا سيما أولئك الذين يعملون مع البروتين من الكائنات الحية خلاف بومبي س، يمكن تطبيق هذه التقنيات لتحديد إلى أي مدى الآلية الجزيئية ليحركها Rad51 هو يحافظ تبادل حبلا. وعلاوة على ذلك، أثبتت هذه التقنيات ناجحة للغاية في تحديد دور بومبي س. Swi5-Sfr1. وبالتالي، فمن تنبؤ رشيد أن هذه التقنيات لا تقدر بثمن في الكشف عن الأدوار الدقيقة من العوامل الأخرى التبعي في الموارد البشرية.
Protocol
1. إعداد من البروتينات والحمض النووي ركائز
- تنقية البروتينات بومبي س. Rad51 و Swi5-Sfr1 إلى التجانس (الحكم بأخذ تلطيخ)، كما ذكر سابقا13،21.
- تعد ركائز الحمض النووي اليغنوكليوتيد المدرجة في الجدول 118.
ملاحظة: تم شراؤها في النوكليوتيد (انظر الجدول للمواد)، وتوليفها في الصف [هبلك]. لحبلا الحمض النووي الأقران رد فعل، النوكليوتيد 16FA(-)، 16A _40bp (-) و 16AR (+) _40bp مطلوبة. للمقايسة تشرد الحمض النووي، النوكليوتيد 16A(-)، 16FA _40bp (-) و 16AR (+) _40bp هي المطلوبة (الشكل 1 و الجدول 1). جميع تركيزات الحمض النووي في هذا البروتوكول تشير إلى تجزئة تركيزات بدلاً من تركيزات النوكليوتيدات. - تشكيل دسدنا المانحين، يخلط مقادير اكويمولار من خيوط تكميلية في أنبوب PCR رقيقة الجدران انلينغ المخزن المؤقت (10 ملم تريس-HCl pH 7.5، 100 مم كلوريد الصوديوم، 10 مم مجكل2)، ضمان إجمالي حجم أكبر من 20 ميليلتر. إجراء هذا الاختلاط على رف معدني بريتشيليد على الجليد (بين 2 و 4 ° مئوية).
ملاحظة: هي مزيج النوكليوتيد للمقايسة الأقران 16 ألف _40bp (-) و 16AR (+) _40bp. للمقايسة التشرد، يصلب 16FA النوكليوتيد _40bp (-) و 16AR (+) _40bp. - حرارة الخليط انلينغ في 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ويبرد أكثر من 3 ح إلى 30 درجة مئوية باستخدام جهاز PCR. تخزين الحمض النووي الملدن في-20 درجة مئوية.
2. الحمض النووي حبلا الأقران وفحوصات التشرد
- أداء حبلا الحمض النووي الأقران المقايسة.
- إعداد 1.6 مل من رد فعل المخزن المؤقت A (30 ملم كوه حبيس الرقم الهيدروجيني 7.5، 1 مم ديثيوثريتول [DTT] 15 ملم مجكل2، 0.25 مم ATP، ألبومين المصل البقري 0.1 مغ/مل [جيش صرب البوسنة] و 0.0075% بوليوكسيثيلينيسوربيتان مونولوراتي) التي تحتوي على 36 شمال البحر الأبيض المتوسط 16FA(-) في مل 2.0 مايكرو--أجهزة الطرد مركزي أنبوب من البلاستيك (بولي بروبلين) واحتضان من قبل في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- على شكل خيوط Rad51-سدنى وإضافة البروتين Rad51 بتركيز 1.5 ميكرومتر في المخزن المؤقت لرد فعل المحتضنة قبل نهائي واحتضان أنه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إضافة Swi5-Sfr1 البروتين للمخلوط بتركيز نهائي من 0.15 ميكرون واحتضان أنه عند 37 درجة مئوية لدقيقة أخرى 5.
- تأخذ 1.5 مل المخلوط وتحويلها إلى ومبومو كوارتز 1.0 x 1.0 سم تتضمن محرض مغناطيسية وتعيين في ومبومو في سبيكتروفلوروميتير. تكوين وحدة تحكم درجة الحرارة بلتيير من جهاز المطياف الضوئي إلى 37 درجة مئوية ومحرض المغناطيسي إلى 450 دورة في الدقيقة لضمان خلط السريع من العينة التي تم إدراجها.
- بدء قياس الانبعاثات الأسفار من الاتحاد الماليزي في 525 نانومتر (عرض النطاق الترددي: 20 نانومتر) عند الإثارة في 493 نانومتر (عرض النطاق الترددي: 1 نانومتر). جمع بيانات كل ثانية.
- بعد البدء بقياس 100 s، حقن دسدنا المسمى روكس الجهات المانحة إلى تركيز نهائي من 36 شمال البحر الأبيض المتوسط إلى المخلوط باستخدام المحاقن وقياس التغير في الانبعاثات على فترات s 1 لزيادة 30 دقيقة.
- إجراء المقايسة التشرد حبلا الحمض النووي.
- إعداد 1.6 مل من رد فعل المخزن المؤقت A التي تحتوي على 36 أنبوب 16A(-) في بلاستيك الصغير-الطرد مركزي مل 2.0 نانومتر واحتضان من قبل في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- وتشكل خيوط Rad51-سدنا حضور Swi5-Sfr1 في 37 درجة مئوية، كما هو موضح في الخطوات 2.1.2. و 2.1.3.
- تأخذ 1.5 مل المخلوط وتحويلها إلى ومبومو الكوارتز يحتوي على محرض مغناطيسي وتعيين ومبومو في جهاز المطياف الضوئي، كما هو موضح في الخطوة 2.1.4.
- بدء قياس الانبعاثات الأسفار وبعد 100 ثانية، حقن دسدنا المانحة الاتحاد الماليزي وروكس المسمى كما هو موضح في الخطوة 2.1.6. قياس التغير في الانبعاثات fluorescence فترات s 1 لزيادة 30 دقيقة.
3-تحليل البيانات التجريبية من الأقران وفحوصات التشرد
- تقدير الحد الأقصى من الكفاءة الحنق.
- إعداد 16FA(-) تعتيق مع 16AR (+) _40bp و 16FA _40bp (-) تعتيق مع 16AR (+) _40bp باستخدام نفس الإجراء هو موضح في الخطوات 1.3 و 1.4.
- إعداد ميكروليتر 130 من رد فعل المخزن المؤقت A التي تحتوي على 36 نانومتر أما 16FA(-)، 16FA(-) تعتيق مع 16AR (+) _40bp، 16FA _40bp (-) تعتيق مع 16AR (+) _40bp أو 16FA _40bp (-) في ومبومو كوارتز 0.2 × 1.0 سم.
- تعيين في ومبومو في سبيكتروفلوروميتير واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- قياس الأطياف fluorescence من 500 إلى 600 نيوتن متر عند الإثارة في 493 شمال البحر الأبيض المتوسط.
- لاختبار تأثير Rad51 على انبعاث الاتحاد الماليزي وتبريد للاتحاد الماليزي من روكس، إضافة Rad51 إلى تركيز 1.5 ميكرومتر إلى الخليط نهائي واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- قياس الأطياف fluorescence من 500 إلى 600 نيوتن متر عند الإثارة في 493 شمال البحر الأبيض المتوسط.
- حساب الحد الأقصى الحنق الكفاءة (هكحد أقصى) باستخدام المعادلة المبينة أدناه:
هالحد الأقصى = (كثافة Fluorescence في 525 نانومتر دسدنا المسمى مع الاتحاد الماليزي وروكس)/(كثافة Fluorescence في 525 نانومتر من الاتحاد الماليزي المسمى ssDNA)
- تحليل البيانات التجريبية من مقايسة التشرد.
- لتحويل التغيير في الأسفار التي لوحظت في مقايسة التشرد إلى التغيير في كمية المنتج النهائي، تطبيع البيانات التجريبية الأولية التي تم الحصول عليها من هذا التحليل باستخدام المعادلة المبينة أدناه، والخام فيها كثافة الأسفار من البيانات الخام ووتطبيع هو التغيير في الأسفار التي تحسب بالمعادلة التالية.
وتطبيع = ([والخام في وقت س]-[والخام في وقت 0])/(([والخام في وقت 0]/هكحد أقصى)-[والخام في وقت 0])
والخام في وقت 0 هو الأسفار متوسط رصدها لل 5 الأولى s بعد الوقت الميت (أيالوقت اللازم لخلط بعد إينجيكتانت هو أدخلت ومبومو). - لاستبعاد آثار فوتوبليتشينج والتشريد عفوية، طرح وتم تسويتها دون البروتين من وتم تسويتها من العينة للحصول على ود، الذي هو التغيير في كمية المنتج النهائي في هذا التحليل.
ود = [وتم تسويتها من عينة]-[وتم تسويتها دون البروتين]
- لتحويل التغيير في الأسفار التي لوحظت في مقايسة التشرد إلى التغيير في كمية المنتج النهائي، تطبيع البيانات التجريبية الأولية التي تم الحصول عليها من هذا التحليل باستخدام المعادلة المبينة أدناه، والخام فيها كثافة الأسفار من البيانات الخام ووتطبيع هو التغيير في الأسفار التي تحسب بالمعادلة التالية.
- تحليل البيانات التجريبية من مقايسة الأقران.
- تطبيع الخام البيانات التجريبية التي تم الحصول عليها من مقايسة الأقران باستخدام المعادلة المبينة أدناه، حيث والخام كثافة الأسفار من البيانات الخام وتم تسويتها و هو التغيير في الأسفار التي تحسب بالمعادلة التالية.
وتطبيع = (والخام في وقت x)/(والخام في وقت 0)
والخام في وقت 0 هو الأسفار متوسط رصد 20 الأخير s قبل البدء في رد فعل عن طريق حقن الركيزة دسدنا. - لتحويل التغيير في الأسفار إلى تغيير في كمية الركازة واستبعاد آثار فوتوبليتشينج والاقتران العفوي، وتطبيع وتم تسويتها من العينة باستخدام المعادلة المبينة أدناه، حيث وP هو التغير في مقدار الركيزة في هذا التحليل.
وP = 1-(([وتطبيع دون البروتين]-[وتم تسويتها من عينة])/[1-هكحد أقصى]) - دراسة حركية تفاعل التبادل حبلا الحمض النووي، القيام بتحليل انحدار ساحة آخر غير الخطية من رد فعل الأقران باستخدام تحليل البرنامج23 (انظر الجدول للمواد).
- إعداد ملف بتنسيق.txt تحتوي على بيانات دورة الوقت وفف.
- بدء تشغيل البرنامج ثم لصق البرنامج النصي في ملف التعليمات البرمجية الإضافية في إطار البرنامج:
- بدء تحليل الانحدار غير الخطي مربع آخر. سيتم عرض نتائج هذا التحليل في نفس الإطار.
- تطبيع الخام البيانات التجريبية التي تم الحصول عليها من مقايسة الأقران باستخدام المعادلة المبينة أدناه، حيث والخام كثافة الأسفار من البيانات الخام وتم تسويتها و هو التغيير في الأسفار التي تحسب بالمعادلة التالية.
Representative Results
من أجل فعالية تحليل البيانات التجريبية من فحوصات الأقران والتشريد، من الضروري أن تعرف كيف تغير في الأسفار انبعاث الاتحاد الماليزي يناظر ويل ركائز الحمض النووي إلى منتجات. ولتحقيق ذلك، يجب أن تحدد مدى كثافة الأسفار ذات الصلة. للمقايسة الأقران، انبعاث الأسفار 16FA(-)، الذي يتوافق مع الركيزة سدنى، بالمقارنة مع انبعاث 16FA(-) تعتيق مع 16AR (+) _40bp، الذي يتوافق مع المنتجات النهائية لرد الفعل هذا (الشكل 2A). وهذا يعادل الحنق أقصى قدر من الكفاءة ومن ثم الحد الأقصى في كثافة الأسفار من شأنها أن يكون من المتوقع إذا تم تحويل جميع ssDNA الركيزة في المنتج دسدنا. للمقايسة التشرد، انبعاث 16FA _40bp (-) تعتيق مع 16AR (+) _40bp، الذي يتوافق مع الركازة، بالمقارنة مع انبعاث 16FA _40bp (-)، مما يتوافق مع المنتج النهائي (الشكل 2). في هذه الحالة، والزيادة القصوى في كثافة الأسفار من الاتحاد الماليزي يعرب عن سيناريو فيه كل من الركازة دسدنا يتم تحويلها إلى منتج ssDNA. بومبي س. Rad51 لا يؤثر على الانبعاثات الأسفار من الاتحاد الماليزي أو تبريد الكفاءة من الاتحاد الماليزي من روكس في كلا فحوصات (الشكل 2). ينبغي أن يكون أقصى قدر من الكفاءة الحنق إعادة قياس مع كل إعداد جديدة من النوكليوتيد كما أنها تعتمد على كفاءة النوكليوتيد التوسيم.
وترد بيانات تمثيلية من التفاعلات الأقران والتشرد حبلا الحمض النووي في الشكل 3. كانت آثار ردود فعل عفوية بين السلطات الوطنية المعينة الركيزة وفوتوبليتشينج الصغيرة في كلا فحوصات، كما كشفت عن تغيرات ضئيلة ينظر في انبعاث الاتحاد الماليزي دون Rad51 مقارنة بالتغييرات الكبيرة التي ينظر إليها مع Rad51 (الشكل 3 ألف و الشكل 3). استناداً إلى البيانات المبينة في الشكل 3 ألف أو الشكل 3B، التغيير في الأسفار تم تحويلها إلى التغيير في كمية الركازة (وف) أو المنتج النهائي (ود)، على التوالي، باستخدام المعادلات المبينة في الخطوات (3.2.2 أو 3.3.2 الشكل 3 و الشكل 3D).
تمت محاكاة رد فعل الأقران باستخدام نموذج رد فعل ثلاث خطوات متتابعة، تتألف من تشكيل المتوسطة حبلا الثلاثة الأولى (C1)، والانتقال من المتوسطة الأولى في الوسيطة الثانية (C1 إلى C2)، وإطلاق سراح ssDNA من المتوسطة الثانية لتشكيل اثنين من المنتجات (د + ه) (رقم 3E). لاختبار ما إذا كانت البواقي بين البيانات التجريبية حبلا الحمض النووي الأقران المقايسة ومنحني نظرية التي حصل عليها المحاكاة المحاكاة باستخدام تناسب نموذج رد فعل ثلاث خطوات متسلسلة البيانات التجريبية، حسبت (3F الشكل). وبالإضافة إلى ذلك، كانت البواقي بين رد فعل الأقران ومنحني نظرية التي تم إنشاؤها باستخدام نموذج رد فعل متسلسل خطوتين أيضا المحسوبة (الشكل 3). تظهر بقايا لرد فعل الأقران ونموذج خطوتين انحراف منهجي في مرحلة مبكرة، بينما لا تظهر بقايا لرد فعل الأقران ونموذج ثلاث خطوات مثل هذا انحراف. هذا يشير إلى أن هذا النموذج ثلاث خطوات تتناسب بشكل أفضل من طراز خطوتين لمحاكاة رد فعل الأقران.
لاختبار ما إذا كان النموذج ثلاث خطوات تتسق مع رد فعل التشرد التي يكشف خطوة متأخرة من تبادل حبلا الحمض النووي، ونحن إنشاء منحنى نظرية لرد فعل التشرد استخدام معلمات الحركية التي تم الحصول عليها من محاكاة للاقتران رد الفعل هو موضح في الشكل 3 ، ومقارنتها مع البيانات التجريبية لرد فعل التشرد هو موضح في الشكل 3D (ح الشكل 3). المنحنى النظري تناسب البيانات التجريبية للمقايسة التشرد. يمكننا أن نستخلص من هذه النتائج، أن المحاكاة باستخدام نموذج الخطوات الثلاث غير قادرة على تقييم معقول حبلا الحمض النووي تبادل رد فعل توسط Rad51.
وترد بيانات تمثيلية من حبلا الحمض النووي الأقران رد الفعل الذي يحتوي على Rad51 ومجمع Swi5-Sfr1، بروتين أكسيساري من Rad51، في الشكل 4A. مجمع Swi5-Sfr1 بقوة حفز النشاط الأقران من Rad51. كما رأينا في غياب Swi5-Sfr1، تناسب رد فعل الأقران أفضل نموذج الخطوات الثلاث من طراز خطوتين حضور Swi5-Sfr1 (الشكل 4 باء). عن طريق المحاكاة لرد الفعل باستخدام نموذج ثلاث خطوات، حسبت ثوابت التوازن رد فعل كل خطوة من خطوات التفاعل مع أو بدون Swi5-Sfr1. ثوابت التوازن رد فعل أشارت إلى أن المجمع Swi5 Sfr1 لا تحفز رد فعل الخطوة الأولى (الشكل 4، لوحة)، الذي متوسط ثلاثة ستراند تتشكل، ولكن بقوة يحفز C1-C2 الانتقال ( الشكل 4، ب الفريق) والإفراج عن سدنى من متوسطة C2 (الشكل 4، ج الفريق).
رقم 1: التصميم التجريبي للحمض النووي حبلا فحوصات الأقران والتشرد- الخطط للحمض النووي حبلا الأقران (A) وفحوصات التشرد (ب). تمثل الدوائر الصفراء مونومرات Rad51. الدوائر الخضراء التي تحتوي على "و" وتمثل الدوائر الحمراء التي تحتوي على "صاد" فلوريسسين أميديتي (الاتحاد الماليزي) وكاربوكسي-س-والرودامين (بلول)، على التوالي. خيوط "الحمض النووي السوداء" متطابقة في تسلسل ومكملة للأزرق خيوط الحمض النووي. خطوط سوداء رقيقة مع رؤوس الأسهم تشير إلى اسم كل اليغنوكليوتيد، كما هو مبين في الجدول 1. وهذا الرقم قد تم تكييفه من إيتو et al. 19 وتعديله. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: قياسات لأقصى قدر من الكفاءة الحنق من فحوصات الأقران والتشرد- (أ) مقارنة بين الأطياف fluorescence بين الركيزة سدنى، 16FA(-)، والمنتج دسدنا، يقترن 16FA(-) 16AR (+) _40bp، للمقايسة الأقران. خطوط زرقاء وحمراء تمثل الأطياف fluorescence من الركازة دون، ومع Rad51، على التوالي. إظهار خطوط خضراء والأرجواني الأطياف fluorescence المنتج النهائي دون، ومع Rad51، على التوالي. (ب) مقارنة بين الأطياف fluorescence بين الركيزة دسدنا، 16FA يقترن _40bp (-) 16AR (+) 16FA _40bp، والمنتج سدنا، _40bp (-)، لفحص التشرد. خطوط زرقاء وحمراء تمثل الأطياف fluorescence المنتج النهائي دون، ومع Rad51، على التوالي. إظهار خطوط خضراء والأرجواني الأطياف fluorescence من الركازة دون، ومع Rad51، على التوالي. وهذا الرقم مقتبس من إيتو et al. 19 وتعديله. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التفاعلات الأقران والتشرد حبلا الحمض النووي توسط Rad51. (أ) الوقت بالطبع من الأسفار مسواة من رد فعل الأقران مع أو بدون Rad51. (ب) الوقت بالطبع من الأسفار مسواة من رد فعل التشرد مع أو بدون Rad51. (ج) بالطبع الوقت بالتغيير كمية الركازة في رد فعل الأقران مع Rad51. (د) دورة الوقت بالتغيير كمية الركازة في رد فعل التشرد مع Rad51. (ﻫ) التخطيطي نموذج رد الفعل ثلاث خطوات متتابعة. A و B تناظر presynaptic دسدنا الشعيرة والجهات المانحة. ويناظر C1 المتوسطة ثلاثة-ستراند (غير ناضجة) الأولى. ويناظر C2 المتوسطة ثلاثة-ستراند (ناضجة) الثانية. د وه تناظر هيتيرودوبليكس وسدنى من C2. (F و G) المخلفات بين البيانات التجريبية حبلا الحمض النووي الأقران المقايسة ومنحني نظرية التي حصل عليها المحاكاة باستخدام ثلاث خطوات (F) أو نموذج خطوتين (ز). (ح) تشير النقاط الحمراء إلى البيانات التجريبية من رد فعل التشرد مع Rad51 التي تظهر في لوحة "زرقاء دال" يشير إلى الخط المنحنى النظري للمنتجات النهائية. تم إنشاء المنحنى النظري بالمحاكاة باستخدام الثوابت معدل رد الفعل التي تم الحصول عليها من مقايسة الأقران التي تظهر في لوحة ج. وهذا الرقم مقتبس من إيتو et al. 19 وتعديله. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4 الرقم: Swi5-Sfr1 يحفز الثاني والخطوات الثالثة من الحمض النووي حبلا تبادل رد فعل- (أ) دورة الوقت بالتغيير كمية الركازة في رد فعل الأقران مع أو بدون Swi5-Sfr1 (S5S1). (ب) المخلفات بين البيانات التجريبية للاقتران حبلا الحمض النووي الاعتداء مع Swi5-Sfr1 ومنحني نظرية التي حصل عليها المحاكاة باستخدام خطوتين (الخط الأزرق) أو نموذج الخطوات الثلاث (الخط الأحمر). تمت محاكاة رد فعل (ج) الأقران المبين في الشكل 4A بالطراز ثلاث خطوات باستخدام تحليل البرنامج23 (انظر الجدول للمواد). الثوابت التوازن رد فعل كل خطوة رد فعل، K1 ()، K2 (ب)، و K3 (ج)، تم الحصول عليها من المحاكاة. وهذا الرقم مقتبس من إيتو et al. 19 وتعديله. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| النوكليوتيد لحبلا الحمض النووي الاقتران بالانزيم | ||||
| 16FA(-) | 5 '-[FAM]--آآتجاكاتااجتااتاجتاتاجاتاتاكا آآتاجتااتجاتااكاتاجاااتااجتااجاتات AAA-3 ' |
|||
| 16 ألف _40bp (-) | --آآتجاكاتااجتااتاجتاتاجاتاتاكااا 5 '-3' | |||
| 16AR (+) _40bp | 5 '--تتتجتاتاتككتاتاكتاتتاكتتاتجتكاتت--[رواكس]-3' | |||
| النوكليوتيد للمقايسة التشرد حبلا الحمض النووي | ||||
| 16A(-) | 5-آآتجاكاتااجتااتاجتاتاجاتاتاكاااتا أجتااتجاتااكاتاجاااتااجتااجاتات AAA-3 ' |
|||
| 16FA _40bp (-) | 5 '-[FAM]-آآتجاكاتااجتااتاجتاتاجاتاتاكااا-3' | |||
| 16AR (+) _40bp | 5 '--تتتجتاتاتككتاتاكتاتتاكتتاتجتكاتت--[رواكس]-3' | |||
الجدول 1: قائمة النوكليوتيد المستخدمة في فحوصات الأقران والتشرد حبلا الحمض النووي- حيثما كان ذلك منطبقا، ومواقف fluorophores (fluorescein أميديتي، الاتحاد الماليزي؛ كاربوكسي-س-والرودامين، روكس) مبينة في أقواس مربعة.
Discussion
هنا، لقد قمنا بوصف بروتوكول تفصيلية التي تستخدم الحنق لقياس تبادل حبلا الحمض النووي يحركها Rad51 في الوقت الحقيقي. الأهم من ذلك، تسمح هذه القياسات لتحديد رد الفعل حركية. بينما الأوصاف المذكورة أعلاه كافية لاستخراج النتائج المنشورة، وهناك العديد من النقاط الحرجة التي سوف الموصوفة في هذا المقطع. وعلاوة على ذلك، مزايا وعيوب المنهجيات القائمة على الحنق لدراسة الحمض النووي حبلا الصرف ستناقش، جنبا إلى جنب مع تطبيق هذه التقنيات على دراسة الجوانب الأخرى من استقلاب الحمض النووي.
كما هو الحال مع جميع ريكونستيتوشنز الكيمياء الحيوية، من الضروري ضمان أن كل رد فعل ركائز درجة نقاء عالية. ومن الإهمال افتراض عدم وجود أنشطة تلويث يستند فقط إلى نقاء الظاهر من إعداد البروتين الحكم من خلال أخذ تلطيخ. على وجه الخصوص، وجود كميات ضئيلة من نوكليسيس أو هيليكاسيس يمكن أن يؤثر بشدة على نتائج فحوصات الأقران والتشرد. وهكذا، نحن نشجع بقوة إجراء التجارب لمثل هذه الأنشطة في كل مرة يتم تنقيتها دفعة جديدة من البروتين. وعلاوة على ذلك، فإنه من الحكمة لفحص نقاء تجميعي الحمض النووي ركائز بالتفريد الأصلية polyacrylamide هلام. وعلى الرغم من العديد من الشركات ضمان نقاء النوكليوتيد، غالباً ما وجدنا من خلال التجارب الخاصة بنا أن النقاء من الحمض النووي المركبة يمكن أن تختلف بين دفعات.
من المهم أن تنظر في النقطتين التاليتين عند إجراء التجارب مع الكوارتز الترعة. أولاً، أن بعض البروتينات المعرضة لربط الترعة الكوارتز نونسبيسيفيكالي. وللتصدي لذلك، يتم تضمين مونولوراتي جيش صرب البوسنة وبوليوكسيثيلينيسوربيتان في مخازن رد فعل. ثانيا، درجة الحرارة له تأثير جذري على شدة الأسفار وسرعة رد الفعل. لتقليل هذا التأثير، ينبغي أن يكون ومبومو الكوارتز المحتضنة مسبقاً في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
ورغم فائدة كبيرة في دراسة الحمض النووي حبلا تبادل فحوصات الكيمياء الحيوية التقليدية، لها عدة عيوب. في تجربة الزمن--دورة نموذجية، هي المحتضنة كرد فعل عند درجة حرارة معينة وسحب في تيميبوينتس المرجوة مختبرين وديبروتينيزيد بالمعاملة مع المنظفات ومبطلات إنهاء رد فعل. عند انتهاء الوقت-الدورة التدريبية، تخضع العينات ثم إلى التفريد لفصل ركائز الحمض النووي من المنتجات. والميزة الرئيسية للطريقة الموصوفة هنا أنه يسمح للمراقبة في الوقت الحقيقي لرد الفعل دون أي اضطراب. يمكن أن تفقد أي تيميبوينت أثناء عملية التفاعل دون انقطاع إلى رد الفعل نفسه وليس هناك حاجة ديبروتينيزي عينات أو إخضاعها لقوى يحتمل أن تكون مدمرة للتفريد. هذا ذات الصلة لا سيما عند رصد مجا هياكل الحمض النووي.
وعلى الرغم من هذه القوة عبر فحوصات التقليدية، قد الأسلوب الموصوفة هنا بعض العيوب. بينما يبسط استخدام ركائز اليغنوكليوتيد الحمض النووي لتبادل حبلا تفسير النتائج، من المهم أن نتذكر أن هذه ركائز لا تشبه ركائز الحمض النووي تشارك في الموارد البشرية في الخلية. وتستخدم بعض الاختبارات التقليدية ركائز الحجم بلازميد الحمض النووي، الذي من المرجح أن تعكس عدد الأزواج الأساسية التي يتم تبادلها فيفو. وعلاوة على ذلك، جزئيا على الأقل إعادة استخدام ركائز دسدنا التعميم توبولوجيكالي مقيدة في مجموعة فرعية فحوصات التقليدية التوترات في الحمض النووي الفسيولوجية.
بدأ تطبيق الأسلوب الموصوفة هنا لكشف آليات تبادل حبلا يحركها Rad51 الحمض النووي الجزيئي. ومع ذلك، هناك العديد من الأسئلة المثيرة للاهتمام التي لا يزال يتعين الإجابة عليها. وهناك أدلة واضحة على أن الموارد البشرية أثناء الانقسام الاختزالي يتطلب كلا من Rad51 و Dmc1، recombinase RecA-نوع الانقسام على حدة في حقيقيات النوى24. ومع ذلك، عدم وجود اختلافات البيوكيميائية بين هذه ريكومبيناسيس اثنين قد حير الباحثين في المجال لسنوات. وعلاوة على ذلك، كانت أدوار عديدة مجموعات متميزة من العوامل التبعي جزئ موضوع تنسيق البحوث في مجال الموارد البشرية. بالإضافة إلى توضيح الاختلافات البيوكيميائية بين Rad51 و Dmc1، نحن نهدف إلى التحقيق ومقارنة آثار العوامل المختلفة جزئ التبعي في حركية التبادل حبلا الحمض النووي في المستقبل القريب. أخيرا، من المهم التأكيد على أن المنهجية المستندة إلى الحنق الموصوفة هنا لا يقتصر على دراسة تبادل حبلا الحمض النووي. مع تعديلات طفيفة نسبيا، ونحن نتصور العديد من أنواع التطبيقات لهذا الأسلوب في التحقيق البروتينات الوظيفية المتنوعة المشاركة في الحمض النووي الأيض25،26،،من2728. ويحدونا الأمل أن التطورات المذكورة هنا سيوفر المزيد من خيارات للباحثين الذين ينتمون إلى العديد من التخصصات المختلفة.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من معونة للبحث العلمي (A) (ح 18 03985) وفي "مجالات مبتكرة" (15 ح 05974) مرحبا، للعلماء الشبان) ب (15061 ك 17) لمكتبة الإسكندرية، و للعلمية البحوث (ب) (ح 18 02371) إلى HT من "جمعية اليابان" (تعزيز العلوم JSPS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 x 1.0 cm quartz cuvette | Hellma Analytics | 105-250-15-40 | |
| 1.0 x 1.0 cm quartz cuvette | Hellma Analytics | 101-10-40 | |
| adenosine triphosphate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| DynaFit | BioKin, Ldt. | DynaFit is a program to analyze kinetics of biochemical reactions. | |
| Fluorescent labeled and non-labeled oligonucleotides | Eurofins Genomics | The sequences of oligos are listed in Table. 1. | |
| Magnetic stirrer | Aisis (Japan) | CM1609 | |
| PCR machine | TAKARA (Japan) | TP600 | TAKARA PCR Thermal Cycler Dice |
| Spectrofluorometer | JASCO | FP8300 | Contains a peltier temperature controller and magnetic stirrer system |
| Syringe | HAMILTON | 1702RN 25ul SYR (22s/2"/2) |
References
- Camerini-Otero, R. D., Hsieh, P. Homologous recombination proteins in prokaryotes and eukaryotes. Annual Review of Genetics. 29 (1), 509-552 (1995).
- Cromie, G. A., Connelly, J. C., Leach, D. R. Recombination at double-strand breaks and DNA ends: conserved mechanisms from phage to humans. Molecular Cell. 8 (6), 1163-1174 (2001).
- Pierce, A. J., et al. Double-strand breaks and tumorigenesis. Trends in cell biology. 11 (11), S52-S59 (2001).
- Haber, J. E. Genome Stability. , Garland Science. (2013).
- Kowalczykowski, S. C. An Overview of the Molecular Mechanisms of Recombinational DNA Repair. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (11), a016410 (2015).
- Bianco, P. R., Tracy, R. B., Kowalczykowski, S. C. DNA strand exchange proteins: a biochemical and physical comparison. Frontiers in bioscience: a journal and virtual library. 3, D570-D603 (1998).
- Renkawitz, J., Lademann, C. A., Jentsch, S. Mechanisms and principles of homology search during recombination. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 369-383 (2014).
- Greene, E. C. DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination. The Journal of biological chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).
- Sung, P., Krejci, L., Van Komen, S., Sehorn, M. G. Rad51 recombinase and recombination mediators. Journal of Biological Chemistry. 278 (44), 42729-42732 (2003).
- Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (4), a016600 (2015).
- Sung, P. Function of yeast Rad52 protein as a mediator between replication protein A and the Rad51 recombinase. Journal of Biological Chemistry. 272 (45), 28194-28197 (1997).
- Sung, P. Yeast Rad55 and Rad57 proteins form a heterodimer that functions with replication protein A to promote DNA strand exchange by Rad51 recombinase. Genes & Development. 11 (9), 1111-1121 (1997).
- Kurokawa, Y., Murayama, Y., Haruta-Takahashi, N., Urabe, I., Iwasaki, H. Reconstitution of DNA strand exchange mediated by Rhp51 recombinase and two mediators. PLoS biology. 6 (4), e88 (2008).
- Jensen, R. B., Carreira, A., Kowalczykowski, S. C. Purified human BRCA2 stimulates RAD51-mediated recombination. Nature. 467 (7316), 678-683 (2010).
- Liu, J., et al. Rad51 paralogues Rad55-Rad57 balance the antirecombinase Srs2 in Rad51 filament formation. Nature. 479 (7372), 245-248 (2011).
- Lu, C. -H., et al. Swi5-Sfr1 stimulates Rad51 recombinase filament assembly by modulating Rad51 dissociation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).
- Bazemore, L. R., Takahashi, M., Radding, C. M. Kinetic analysis of pairing and strand exchange catalyzed by RecA. Detection by fluorescence energy transfer. Journal of Biological Chemistry. 272 (23), 14672-14682 (1997).
- Gupta, R. C., Bazemore, L. R., Golub, E. I., Radding, C. M. Activities of human recombination protein Rad51. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (2), 463-468 (1997).
- Ito, K., Murayama, Y., Takahashi, M., Iwasaki, H. Two three-strand intermediates are processed during Rad51-driven DNA strand exchange. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (1), 29-36 (2018).
- Akamatsu, Y., Dziadkowiec, D., Ikeguchi, M., Shinagawa, H., Iwasaki, H. Two different Swi5-containing protein complexes are involved in mating-type switching and recombination repair in fission yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15770-15775 (2003).
- Haruta, N., et al. The Swi5-Sfr1 complex stimulates Rhp51/Rad51- and Dmc1-mediated DNA strand exchange in vitro. Nature Structural & Molecular Biology. 13 (9), 823-830 (2006).
- Argunhan, B., Murayama, Y., Iwasaki, H. The differentiated and conserved roles of Swi5-Sfr1 in homologous recombination. FEBS Letters. 591 (14), 2035-2047 (2017).
- Kuzmic, P. Program DYNAFIT for the analysis of enzyme kinetic data: application to HIV proteinase. Analytical biochemistry. 237 (2), 260-273 (1996).
- Brown, M. S., Bishop, D. K. DNA strand exchange and RecA homologs in meiosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (1), a016659 (2014).
- Rudert, W. A., et al. Double-labeled fluorescent probes for 5' nuclease assays: purification and performance evaluation. BioTechniques. 22 (6), 1140-1145 (1997).
- Xiao, J., Singleton, S. F. Elucidating a key intermediate in homologous DNA strand exchange: structural characterization of the RecA-triple-stranded DNA complex using fluorescence resonance energy transfer. Journal of Molecular Biology. 320 (3), 529-558 (2002).
- Grimme, J. M., et al. Human Rad52 binds and wraps single-stranded DNA and mediates annealing via two hRad52-ssDNA complexes. Nucleic Acids Research. 38 (9), 2917-2930 (2010).
- Algasaier, S. I., et al. DNA and Protein Requirements for Substrate Conformational Changes Necessary for Human Flap Endonuclease-1-catalyzed Reaction. The Journal of biological chemistry. 291 (15), 8258-8268 (2016).
