प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण आधारित डीएनए किनारा विनिमय प्रतिक्रिया Rad51 द्वारा मध्यस्थता की वास्तविक समय प्रेक्षण प्रणालियों विकसित किए गए थे. यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग कर, हम प्रतिक्रिया मध्यवर्ती और उत्पादों में उनके रूपांतरण के गठन का पता लगाने में सक्षम हैं, जबकि भी प्रतिक्रिया के एंजाइमी कैनेटीक्स का विश्लेषण ।
डीएनए किनारा विनिमय प्रतिक्रिया Rad51 द्वारा मध्यस्थता मुताबिक़ पुनर्संयोजन का एक महत्वपूर्ण कदम है. इस प्रतिक्रिया में, Rad51 एकल-कतरा डीएनए पर एक nucleoprotein रेशा रूपों (ssDNA) और कब्जा डबल-असहाय डीएनए (dsDNA) गैर विशेष रूप से यह एक मुताबिक़ अनुक्रम के लिए पूछताछ करने के लिए । समरूपता मुठभेड़ के बाद, Rad51 catalyzes डीएनए किनारा विनिमय dsDNA के पूरक किनारा के साथ ssDNA के बाँधना मध्यस्थता करने के लिए. यह प्रतिक्रिया बहुत vivo मेंकई accesser प्रोटीन द्वारा विनियमित है । हालांकि पारंपरिक जैव रासायनिक परख सफलतापूर्वक इन विट्रो मेंइस तरह के गौण प्रोटीन की भूमिका की जांच करने के लिए नियोजित किया गया है, मध्यवर्ती गठन के काइनेटिक विश्लेषण और एक अंतिम उत्पाद में अपनी प्रगति के कारण चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है प्रतिक्रिया मध्यवर्ती की अस्थिर और क्षणिक प्रकृति. समाधान में इन प्रतिक्रिया कदम सीधे निरीक्षण करने के लिए, प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट)-इस प्रतिक्रिया के वास्तविक समय प्रेक्षण प्रणालियों आधारित स्थापित किए गए थे । वास्तविक समय टिप्पणियों के काइनेटिक विश्लेषण से पता चलता है कि डीएनए किनारा विनिमय प्रतिक्रिया Rad51 द्वारा मध्यस्थता एक तीन कदम प्रतिक्रिया एक तीन-किनारा डीएनए मध्यवर्ती, इस मध्यवर्ती की परिपक्वता, और ssDNA की रिहाई से जुड़े मॉडल का पालन करता है परिपक्व मध्यवर्ती । Swi5-Sfr1 परिसर, एक accessed प्रोटीन eukaryotes में संरक्षित, दृढ़ता से इस प्रतिक्रिया के दूसरे और तीसरे कदम को बढ़ाता है । झल्लाहट आधारित परख यहां प्रस्तुत हमें आणविक तंत्र है जो के माध्यम से पुनर्संयोजन पहुंच प्रोटीन Rad51 के डीएनए किनारा विनिमय गतिविधि को उत्तेजित उजागर करने के लिए सक्षम करें । इस प्रोटोकॉल का प्राथमिक लक्ष्य मुताबिक़ पुनर्संयोजन, विशेष रूप से Schizosaccharomyces pombeके अलावा अंय प्रजातियों से प्रोटीन के साथ काम कर रहे लोगों के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध तकनीकों की प्रदर्शनियों को बढ़ाने के लिए है, ताकि यहां प्रस्तुत निष्कर्षों के विकासवादी संरक्षण का निर्धारण किया जा सकता है ।
मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन) दो अलग डीएनए अणुओं के बीच आनुवंशिक जानकारी के फेरबदल की सुविधा । मानव संसाधन दो मौलिक जैविक घटना के लिए आवश्यक है: gametogenesis1 के दौरान आनुवंशिक विविधता की पीढ़ी और डीएनए की मरंमत डबल-किनारा टूटता है (DSBs)2 बँटवारा के दौरान । DSBs डीएनए क्षति का सबसे गंभीर रूप है और गुणसूत्र में एक टूटना गठन । DSBs की गलत मरंमत व्यापक गुणसूत्र पुनर्व्यवस्था और जीनोमिक अस्थिरता, जो दोनों कैंसर3की पहचान कर रहे है कारण हो सकता है ।
डीएनए किनारा विनिमय प्रतिक्रिया एचआर के मध्य चरण है । Rad51 प्रोटीन, जो recombinases के अत्यधिक संरक्षित RecA-प्रकार के परिवार का सदस्य है, प्रमुख प्रोटीन है जो eukaryotes4,5में इस प्रतिक्रिया को catalyzes है । इस प्रतिक्रिया में, Rad51 DSB अंत के nucleolytic प्रसंस्करण द्वारा उत्पन्न एकल-असहाय डीएनए (ssDNA) करने के लिए बांधता है और एक पेचदार nucleoprotein जटिल presynaptic रेशा के रूप में शब्द । यह रेशा बरकरार डबल फंसे डीएनए (dsDNA) विशेष रूप से एक मुताबिक़ अनुक्रम के लिए खोज करने के लिए । जब रेशा एक मुताबिक़ अनुक्रम पाता है, एक रिएक्शन मध्यवर्ती युक्त तीन-असहाय डीएनए बनता है और इस संरचना के भीतर Rad51 रेशा मध्यस्थता कतरा विनिमय6,7,8. इस प्रतिक्रिया कुशलता से पूरा करने के लिए, Rad51 BRCA1 और BRCA2 जैसे गौण प्रोटीन के कई प्रकार की आवश्यकता है, स्तन कैंसर झेलते जीन के उत्पादों9,10.
समझ कैसे गौण कारकों Rad51 विनियमित tumorigenesis के दौरान जीनोमिक अस्थिरता के कारणों को उजागर करने में एक अभिंन कदम है । हालांकि बहुत अनुसंधान presynaptic रेशा गठन और स्थिरता पर इन कारकों के प्रभाव के साथ संबंध है11,12,13,14,15,16, इन कारकों में से तीन-किनारा मध्यवर्ती और अंतिम उत्पाद में अपनी प्रोसेसिंग के गठन के लिए योगदान अभी भी अस्पष्ट है । पारंपरिक जैव रासायनिक प्रयोगों के माध्यम से इन प्रतिक्रिया कदम देख बहुत मुश्किल है क्योंकि तीन-कतरा मध्यवर्ती अस्थिर है और इस तरह के नमूनों की deproteinization के रूप में आम प्रयोगात्मक जोड़तोड़ से पतन की संभावना है या वैद्युतकणसंचलन.
इस समस्या को दूर करने के लिए, हम दो पहले से विकसित डीएनए किनारा विनिमय प्रतिक्रिया के वास्तविक समय प्रेक्षण प्रणालियों प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) का उपयोग कर अनुकूलित: डीएनए किनारा बाँधना और डीएनए किनारा विस्थापन परख17, 18 (चित्रा 1). डीएनए किनारा बाँधना परख में, Rad51 रूपों fluorescein amidite (FAM) के साथ एक presynaptic रेशा-लेबल ssDNA और फिर मुताबिक़ carboxy-x-rhodamine (ROX)-लेबल dsDNA कतरा विनिमय प्रतिक्रिया आरंभ करने के लिए जोड़ा गया है. जब रेशा ROX-लेबल dsDNA को पकड़ता है और तीन-कतरा मध्यवर्ती रूपों, दो fluorophores के करीब निकटता और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में आ FAM ROX (चित्रा 1a) द्वारा बुझती है । डीएनए किनारा विस्थापन परख में, unlabelेड ssDNA पर गठित एक presynaptic रेशा FAM और ROX डबल लेबल dsDNA के साथ मशीन है । जब किनारा विनिमय पूरा हो गया है और FAM लेबल ssDNA तीन से जारी है-किनारा मध्यवर्ती, FAM के उत्सर्जन बढ़ जाती है क्योंकि FAM अब करीब निकटता में ROX (आंकड़ा 1b) के लिए नहीं है । इन परख हमें वास्तविक समय में अंतिम उत्पादों में तीन-कतरा मध्यवर्ती और उनके प्रसंस्करण के गठन का निरीक्षण करने के लिए सक्षम प्रतिक्रिया के लिए किसी भी गड़बड़ी के बिना ।
इस वास्तविक समय अवलोकन प्रणाली का प्रयोग, हमने पाया है कि डीएनए किनारा विनिमय प्रतिक्रिया तीन चरणों में Rad51 आय द्वारा मध्यस्थता की पहली प्रतिक्रिया मध्यवर्ती (C1) के गठन सहित कदम, पहली मध्यवर्ती के एक दूसरे मध्यवर्ती में संक्रमण (c2), और c2 से ssDNA की रिलीज़19. हम यह भी पाया कि विखंडन खमीर (एस pombe) Swi5-Sfr1, जो एक evolutionarily संरक्षित Rad51 गौण प्रोटीन जटिल13,16,20,21,22, उत्तेजित करता है C1-c2 संक्रमण और ssDNA की रिलीज़ C2 से जो एटीपी-hydrolysis पर निर्भर है एक तरीके से Rad5119.
क्या इन निष्कर्षों evolutionarily संरक्षित कर रहे है अज्ञात रहता है । इस प्रोटोकॉल आशा है कि मानव संसाधन के क्षेत्र में शोधकर्ताओं, विशेष रूप से एस pombeके अलावा अन्य जीवों से प्रोटीन के साथ काम करने वालों के साथ प्रदान की जाती है, इन तकनीकों को लागू करने के लिए किस हद तक Rad51 के आणविक तंत्र को निर्धारित कर सकते हैं-संचालित किनारा विनिमय संरक्षित है । इसके अलावा, इन तकनीकों एस pombe Swi5-Sfr1 की भूमिका का निर्धारण करने में अत्यधिक सफल साबित कर दिया है । इस प्रकार, यह एक तर्कसंगत भविष्यवाणी है कि इन तकनीकों अंय मानव संसाधन गौण कारकों की सटीक भूमिकाओं को उजागर करने में अमूल्य होगा ।
यहाँ, हम वास्तविक समय में Rad51 संचालित डीएनए कतरा विनिमय को मापने के लिए झल्लाहट का उपयोग करता है कि एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया है. महत्वपूर्ण बात, इन माप प्रतिक्रिया कैनेटीक्स के निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं । जबकि ऊपर दिए गए विवरण हमारे प्रकाशित परिणामों को पुन: उत्पंन करने के लिए पर्याप्त हैं, वहां कई महत्वपूर्ण बताते है कि इस खंड में वर्णित किया जाएगा रहे हैं । इसके अलावा, लाभ और झल्लाहट के नुकसान-डीएनए किनारा विनिमय के अध्ययन के लिए आधारित तरीकों पर चर्चा की जाएगी, इस तरह की तकनीक के आवेदन के साथ साथ डीएनए चयापचय के अंय पहलुओं का अध्ययन ।
सभी जैव रासायनिक पुनर्गठन के साथ के रूप में, सुनिश्चित करना है कि सभी प्रतिक्रिया सब्सट्रेट उच्च शुद्धता के हैं आवश्यक है । यह लापरवाही है एक प्रोटीन Coomassie धुंधला द्वारा ंयाय की तैयारी की स्पष्ट शुद्धता पर आधारित प्रदूषित गतिविधियों के अभाव ग्रहण । विशेष रूप से, nucleases या helicases की मात्रा का पता लगाने की उपस्थिति काफी बाँधना और विस्थापन परख के परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं । इस प्रकार, हम दृढ़ता से इस तरह की गतिविधियों के लिए हर बार प्रोटीन का एक नया बैच शुद्ध है परीक्षण प्रोत्साहित करते हैं । इसके अलावा, यह देशी polyacrylamide जेल ट्रो द्वारा संश्लेषित डीएनए सब्सट्रेट की शुद्धता की जांच करने के लिए विवेकपूर्ण है । कई कंपनियों oligonucleotides की शुद्धता की गारंटी के बावजूद, हम अक्सर हमारे अपने परीक्षण के माध्यम से पाया है कि संश्लेषित डीएनए की शुद्धता बैचों के बीच भिंन हो सकते हैं ।
यह महत्वपूर्ण है कि निंनलिखित दो बिंदुओं पर विचार जब क्वार्ट्ज cuvettes के साथ प्रयोगों का आयोजन । सबसे पहले, कुछ प्रोटीन से बाइंड क्वार्ट्ज cuvettes का खतरा है । इस काउंटर करने के लिए, BSA और polyoxyethylenesorbitan monolaurate प्रतिक्रिया बफ़र्स में शामिल हैं । दूसरे, तापमान प्रतिक्रिया की गति और प्रतिदीप्ति तीव्रता पर एक कठोर प्रभाव पड़ता है । इस प्रभाव को कम करने के लिए, क्वार्ट्ज cuvette का उपयोग करने से पहले ३७ ° c पर पूर्व-मशीन होना चाहिए ।
हालांकि पारंपरिक जैव रासायनिक परख है डीएनए कतरा विनिमय अध्ययन में बेहद उपयोगी है, वे कई कमियां है । एक ठेठ समय पाठ्यक्रम प्रयोग में, एक प्रतिक्रिया एक निश्चित तापमान पर मशीन है और aliquots वांछित timepoints पर वापस ले लिया और डिटर्जेंट और प्रतिक्रिया समाप्त करने के लिए चिढ़ाने के साथ उपचार द्वारा किया जाता है । समय-पाठ्यक्रम के पूरा होने पर, नमूने तो उत्पादों से डीएनए सब्सट्रेट अलग करने के लिए ट्रो के अधीन हैं. यहां वर्णित विधि का प्रमुख लाभ यह है कि यह बिना किसी गड़बड़ी के प्रतिक्रिया के वास्तविक समय अवलोकन के लिए अनुमति देता है । प्रतिक्रिया के दौरान किसी भी timepoint प्रतिक्रिया ही व्यवधान के बिना निरीक्षण किया जा सकता है और कोई नमूने deproteinize या उंहें ट्रो की संभावित विघटनकारी बलों के अधीन करने की आवश्यकता है । यह विशेष रूप से प्रासंगिक है जब निगरानी labile डीएनए संरचनाओं ।
पारंपरिक परख पर इन शक्तियों के बावजूद, विधि यहां वर्णित कुछ नुकसान है । जबकि कतरा विनिमय के लिए oligonucleotide डीएनए सब्सट्रेट के उपयोग के परिणामों की व्याख्या को सरल करता है, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि ऐसे सब्सट्रेट डीएनए में कोशिका में शामिल मानव संसाधन के समान नहीं है । कुछ पारंपरिक परख प्लाज्मिड का उपयोग डीएनए सब्सट्रेट, जो और अधिक आधार की संख्या को प्रतिबिंबित करने की संभावना है आकार-जोड़े कि vivo मेंविमर्श कर रहे हैं । इसके अलावा, पारंपरिक परख के एक सबसेट में topologically के लिए विवश परिपत्र dsDNA सब्सट्रेट का उपयोग कर सकते है कम से आंशिक शारीरिक डीएनए में तनाव विश्राम ।
विधि के आवेदन यहां वर्णित Rad51 के आणविक तंत्र-डीएनए किनारा विनिमय संचालित सुलझाना शुरू कर दिया है । इसके बावजूद, कई दिलचस्प सवाल है कि रहने के लिए जवाब दिया जाता है । वहां स्पष्ट सबूत है कि अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान मानव संसाधन दोनों Rad51 और Dmc1, RecA24में अर्धसूत्रीविभाजन-विशिष्ट recombinase प्रकार eukaryotes की आवश्यकता है । हालांकि, इन दो recombinases के बीच प्रमुख जैव रासायनिक मतभेदों की कमी के क्षेत्र में वर्षों के लिए शोधकर्ताओं चकित है । इसके अलावा, संयोजन गौण कारकों के कई अलग समूहों की भूमिका मानव संसाधन के क्षेत्र में एक अनुसंधान का केंद्र विषय रहा है । Rad51 और Dmc1 के बीच जैव रासायनिक मतभेदों को elucidating के अलावा, हम तत्काल भविष्य में डीएनए किनारा विनिमय के कैनेटीक्स पर अलग पुनर्संयोजन गौण कारकों के प्रभाव की जांच और तुलना करने का लक्ष्य है । अंत में, यह तनाव महत्वपूर्ण है कि झल्लाहट आधारित पद्धति यहां वर्णित डीएनए कतरा विनिमय के अध्ययन तक ही सीमित नहीं है । अपेक्षाकृत मामूली संशोधनों के साथ, हम कार्यात्मक विविध डीएनए चयापचय25,26,27,28में शामिल प्रोटीन की जांच में इस तकनीक के लिए आवेदनों के कई प्रकार कल्पना । हमें उंमीद है कि यहां वर्णित घटनाओं के कई विभिंन विषयों से संबंधित शोधकर्ताओं को और अधिक विकल्प प्रदान करेगा ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम अनुदान के द्वारा वित्त पोषित किया गया था वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता (क) (18H03985) और अभिनव क्षेत्रों पर (15H05974) के लिए हाय, युवा वैज्ञानिकों (बी) (17K15061) के लिए बीए, और वैज्ञानिक अनुसंधान (बी) (18H02371) के लिए जापान सोसायटी से एचटी को विज्ञान के संवर्धन के लिए ( JSPS) ।
0.2 x 1.0 cm quartz cuvette | Hellma Analytics | 105-250-15-40 | |
1.0 x 1.0 cm quartz cuvette | Hellma Analytics | 101-10-40 | |
adenosine triphosphate (ATP) | Sigma | A2383 | |
DynaFit | BioKin, Ldt. | DynaFit is a program to analyze kinetics of biochemical reactions. | |
Fluorescent labeled and non-labeled oligonucleotides | Eurofins Genomics | The sequences of oligos are listed in Table. 1. | |
Magnetic stirrer | Aisis (Japan) | CM1609 | |
PCR machine | TAKARA (Japan) | TP600 | TAKARA PCR Thermal Cycler Dice |
Spectrofluorometer | JASCO | FP8300 | Contains a peltier temperature controller and magnetic stirrer system |
Syringe | HAMILTON | 1702RN 25ul SYR (22s/2"/2) |