Fluorescens resonans energi overføring-basert sanntid observasjon systemer av DNA tråd exchange reaksjon formidlet av Rad51 ble utviklet. Bruker protokollene som presenteres her, er vi kjøpedyktig merker dannelsen av reaksjon intermediates og deres konvertering til produkter, mens også analysere den enzymatiske kinetics av reaksjonen.
DNA strand exchange reaksjonen formidlet av Rad51 er et viktig skritt i homologe rekombinasjon. I denne reaksjonen, Rad51 danner en nucleoprotein filament på enkelt-strandet DNA (ssDNA) og fanger double-strandet DNA (dsDNA) ikke-spesielt å forhøre det om en homologe sekvens. Etter homologi, gir Rad51 DNA strand exchange for å megle sammenkoblingen av ssDNA med den utfyllende stranden av dsDNA. Denne reaksjonen er sterkt regulert av mange accessary proteiner i vivo. Selv om konvensjonelle biokjemiske analyser har vært vellykket ansatt å undersøke rollen av slike tilbehør protein i vitro, kinetisk analyse av mellomliggende formasjon og dens progresjon i et sluttprodukt har bevist utfordrende grunn den ustabil og forbigående art av reaksjonen intermediater. Å observere følgende reaksjon direkte i løsningen fluorescens resonans energioverføring (bånd)-basert sanntid observasjon systemer av dette ble etablert. Kinetisk analyse av sanntids observasjoner viser at DNA strand exchange reaksjonen formidlet av Rad51 følger en tretrinns reaksjon modell med dannelsen av en tre-strand DNA mellomliggende, modning av denne middels, og utgivelsen av ssDNA fra det modne mellomliggende. Swi5-Sfr1 komplekset, en accessary protein bevart i eukaryoter, forbedrer sterkt andre og tredje trinnene i denne reaksjonen. BÅND-baserte analyser presenteres her gir oss å avdekke molekylære mekanismer gjennom hvilke rekombinasjon accessary proteiner stimulere DNA strand exchange aktiviteten til Rad51. Hovedmålet med denne protokollen er å øke repertoaret teknikker tilgjengelig for forskere innen homologe rekombinasjon, spesielt de arbeider med proteiner fra arter enn Schizosaccharomyces pombe, slik at den evolusjonær bevaring av resultatene presenteres her kan bestemmes.
Homologe rekombinasjon (HR) forenkler stokking av genetisk informasjon mellom to ulike DNA molekyler. HR er avgjørende for to grunnleggende biologisk fenomen: generasjonen av genetisk mangfold under gametogenesis1 og reparasjon av DNA dobbel-strand bryter (DSBs)2 under mitose. DSBs er den alvorligste formen for DNA skade og utgjør et brudd på kromosomet. Feil reparasjon av DSBs kan forårsake omfattende chromosomal rearrangements og genomisk ustabilitet, som er både kjennetegner kreft3.
DNA strand exchange reaksjonen er den sentrale fasen av HR. Rad51 protein, som er medlem av høyt konservert RecA-type familien til recombinases, er det viktigste proteinet som katalyserer denne reaksjonen i eukaryoter4,5. I denne reaksjonen, Rad51 binder til single-strandet DNA (ssDNA) generert av nucleolytic behandling av DSB slutten og former en spiralformede nucleoprotein kompleks kalt presynaptic filament. Dette fanger intakt double-strandet DNA (dsDNA) nonspecifically å søke etter en homologe sekvens. Når filament finner en homologe sekvens, en reaksjon mellomliggende inneholder tre-strandet DNA er dannet og Rad51 filament formidler strand exchange i denne strukturen6,7,8. For å oppnå denne reaksjonen effektivt, krever Rad51 flere typer tilbehør proteiner som BRCA1 og BRCA2, produkter av bryst kreft mottakelighet gener9,10.
Forstå er hvordan tilbehør faktorer regulere Rad51 et integrert skritt i å avdekke årsakene til genomisk ustabilitet under tumorigenesis. Selv om mye forskning er opptatt med effekten av disse faktorene på presynaptic filament dannelsen og stabiliteten11,12,13,14,15,16, den bidrag av disse faktorene å tre-strand middels og behandlingen i det endelige produktet er fortsatt uklart. Observere følgende reaksjon gjennom konvensjonelle biokjemiske eksperimenter er veldig vanskelig fordi det tre-strand mellomliggende er ustabil og utsatt for sammenbrudd av felles eksperimentelle manipulasjoner som deproteinization av prøver eller geleelektroforese.
Du løser dette problemet, vi tilpasset to tidligere utviklet sanntid observasjon systemer av DNA strand exchange reaksjonen bruker fluorescens resonans energioverføring (bånd): DNA strand sammenkoblingen og DNA tråd forskyvning analyser17, 18 (figur 1). I DNA strand sammenkobling analysen, Rad51 former en presynaptic filament med fluorescein legges amidite (FAM) – merket ssDNA og deretter homologe carboxy-x-rhodamine (ROX) – merket dsDNA for å starte strand exchange reaksjonen. Når filament fanger ROX-merket dsDNA og danner det tre-strand mellomliggende, de to fluorophores kommer i nærheten og fluorescens utslipp av FAM er slukket av ROX (figur 1A). I DNA strand forskyvning analysen, er en presynaptic filament dannet på umerket ssDNA ruges med FAM og ROX dobbel-merket dsDNA. Når strand exchange er fullført og FAM merket ssDNA frigjøres fra den tre-stranden middels, utslipp av FAM øker fordi FAM er ikke lenger i nærheten ROX (figur 1B). Disse analyser at vi skal observere dannelsen av tre-strand intermediates og deres behandling inn siste i sanntid uten forstyrrelser til reaksjonen.
Bruker denne sanntid observasjon, fant vi at DNA strand exchange reaksjonen formidlet av Rad51 fortsetter i tre-trinn inkludert dannelsen av den første reaksjonen mellomliggende (C1), overgang av første rensingen til en andre mellomliggende (C2), og utgivelsen av ssDNA C219. Vi fant også at fisjon gjær (S. pombe) Swi5-Sfr1, som er et evolusjonært bevarte Rad51 tilbehør protein kompleks13,16,20,21,22, stimulerer C1-C2 overgang og utgivelsen av ssDNA fra C2 på en måte som er avhengig av ATP-hydrolyse av Rad5119.
Om disse funnene er evolutionarily bevart er ukjent. Denne protokollen er utstyrt med håp om at forskere innen HR, spesielt de arbeider med proteiner fra organismer enn S. pombe, kan bruke disse teknikkene for å avgjøre hvilken grad molekylær mekanisme Rad51-drevet strand exchange er bevart. Videre har disse teknikkene vist svært vellykket i å bestemme rollen S. pombe Swi5-Sfr1. Dermed er det en rasjonell prediksjon at disse teknikkene vil være uvurderlig i å avdekke nøyaktig rollene til andre HR tilbehør faktorer.
Her har vi beskrev en detaljert protokoll som benytter bånd for å måle Rad51-drevet DNA strand exchange i sanntid. Viktigere, kan disse målingene for fastsettelse av reaksjon kinetics. Beskrivelsene ovenfor er tilstrekkelig til å reprodusere publiserte resultatene, finnes det flere kritiske punkter som beskrives i denne delen. Videre vil fordeler og ulemper av bånd-baserte metoder for å studere DNA strand exchange bli diskutert, sammen med anvendelse av teknikker å studere andre aspekter av DNA metabolisme.
Som med alle biokjemiske reconstitutions, er at alle reaksjon underlag er høy renhetsgrad viktig. Det er uaktsom å anta fravær av forurensende aktiviteter basert utelukkende på tilsynelatende renheten av en protein forberedelse av Coomassie flekker. Spesielt kan tilstedeværelsen av sporstoffer mengder nucleases eller helicases drastisk påvirker resultatene av sammenkoblingen og forskyvning analyser. Derfor anbefaler vi sterkt at testing for slike aktiviteter hver gang en ny gruppe med protein er renset. Videre er det klokt å sjekke renheten av syntetisk DNA underlag av innfødte polyakrylamid gel geleelektroforese. Til tross for mange selskaper garanterer renheten av oligonucleotides, har vi ofte funnet gjennom vår egen testing at renhet av syntetisk DNA kan variere mellom bunker.
Det er viktig å vurdere de følgende to punktene når gjennomføre eksperimenter med kvarts cuvettes. Først er noen proteiner liggende å binde kvarts cuvettes nonspecifically. Mot dette BSA og polyoxyethylenesorbitan monolaurate er inkludert i reaksjon bufferne. Dernest har temperatur en drastisk effekt på reaksjonen fart og fluorescens intensiteten. For å minimere denne effekten, skal kvarts-cuvette pre inkubert på 37 ° C før bruk.
Selv om konvensjonelle biokjemiske analyser har vært svært nyttig i å studere DNA strand exchange, har de flere ulemper. I et typisk tid-retters eksperiment, en reaksjon er ruges på en viss temperatur og dele er trukket på ønsket timepoints og deproteinized av behandling med vaskemiddel og protease avslutte reaksjonen. Ved ferdigstillelse av tid-kurset utsatt prøver deretter for geleelektroforese skille DNA underlag fra produkter. Den store fordelen med metoden som er beskrevet her er at det tillater for sanntids observasjon av reaksjonen uten forstyrrelser. Noen timepoint under reaksjonen kan inspiseres uten at selve reaksjonen og det er ikke nødvendig å deproteinize prøver eller gitt dem til potensielt forstyrrende styrkene til geleelektroforese. Dette gjelder særlig når du overvåker labil DNA-strukturer.
Til tross for disse styrker over konvensjonelle analyser har metoden beskrevet her noen ulemper. Mens bruken av oligonucleotide DNA underlag for strand exchange forenkler tolkning av resultatene, er det viktig å huske at slike underlag ikke ligner DNA substrater involvert i HR i cellen. Noen konvensjonelle analyser benytte plasmider størrelse DNA underlag, som er mer sannsynlig å gjenspeile antallet av base-parene som er utvekslet i vivo. Videre kan bruk av topologisk begrenset sirkulære dsDNA underlag i et delsett av konvensjonelle analyser delvis opprette spenningene i fysiologiske DNA.
Bruk av metoden beskrevet her har begynte å rakne molekylære mekanismer Rad51-drevet DNA strand Exchange. Likevel er det mange interessante spørsmål som gjenstår å bli besvart. Det er klare bevis for at HR under meiose krever både Rad51 og Dmc1, meiose-spesifikke RecA-type recombinase i eukaryoter24. Men har mangel på biokjemiske hovedforskjellene mellom disse to recombinases forvirret forskere innen i år. Videre rollene til mange forskjellige grupper av rekombinasjon tilbehør faktorer har vært et fokus emne forskning innen HR. I tillegg til Klargjørende biokjemiske forskjellene mellom Rad51 og Dmc1, vi tar sikte på å undersøke og sammenligne effekten av ulike rekombinasjon tilbehør faktorer på the kinetics av DNA strand exchange i nærmeste fremtid. Endelig, er det viktig å understreke at bånd-baserte metodikk beskrevet her ikke er begrenset til studier av DNA strand exchange. Med relativt små modifikasjoner ser vi mange typer programmer for denne teknikken i gransker funksjonelt ulike proteiner involvert i DNA, metabolisme,25,,26,,27,,28. Vi håper utviklingen beskrevet her vil gi ytterligere muligheter for forskere tilhører mange forskjellige disipliner.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av Grants-in-Aid for vitenskapelig forskning (A) (18H 03985) og nyskapende områder (15H 05974) til Hei, unge forskere (B) (17K 15061) til BA og for vitenskapelig forskning (B) (18H 02371) til HT fra Japan Society for fremme av vitenskap ( JSP).
0.2 x 1.0 cm quartz cuvette | Hellma Analytics | 105-250-15-40 | |
1.0 x 1.0 cm quartz cuvette | Hellma Analytics | 101-10-40 | |
adenosine triphosphate (ATP) | Sigma | A2383 | |
DynaFit | BioKin, Ldt. | DynaFit is a program to analyze kinetics of biochemical reactions. | |
Fluorescent labeled and non-labeled oligonucleotides | Eurofins Genomics | The sequences of oligos are listed in Table. 1. | |
Magnetic stirrer | Aisis (Japan) | CM1609 | |
PCR machine | TAKARA (Japan) | TP600 | TAKARA PCR Thermal Cycler Dice |
Spectrofluorometer | JASCO | FP8300 | Contains a peltier temperature controller and magnetic stirrer system |
Syringe | HAMILTON | 1702RN 25ul SYR (22s/2"/2) |