증식 성 당뇨 망막 증에 Fibrovascular 합병증에 대 한 전 비보 조직 문화 모델
Summary
여기, 우리는 3 차원 기본 조직 특성화 및 전 비보 문화에 대 한 환자 파생, 수술 excised, fibrovascular 직물을 사용 하 여 증식 성 당뇨 망막 증의 병 태 생리학을 공부 하는 프로토콜을 제시. Ex vivo 문화 모델이 테스트 또는 새로운 치료법 개발에 대 한 의무가 이기도 합니다.
Abstract
당뇨병 성 망막 증 (DR)은 당뇨병의 가장 일반적인 microvascular 합병증 그리고 최고의 중 하나 일 나이 성인 실명의 원인. 당뇨병과 산소 유도 된 망막의 없음 현재 동물 모델 개발 인간의 증식 당뇨 성 망막 증 (PDR)에 전체 범위의 진보적인 변화. 따라서, 질병의 병 인 및 병 태 생리학의 이해 조직학 단면도 유리 샘플만 포함 된 병원 성 요인에 정상 상태 정보를 제공 하는 방식에서의 사용에 크게 의존 했다. 증거를 증가 나타냅니다 동적 셀 및 3 차원 (3D) microenvironments의 맥락에서 세포-세포 외 기질 (ECM) 상호 작용의 개발 쪽으로 기계 및 기능 연구에 대 한 필수적인 새로운 치료 전략입니다. 따라서, 우리는 안정적으로이 치명적인 질병의 세포 및 분자 메커니즘을 해명 소설 임상에 대 한 가능성을 테스트 하 고 병 적인 fibrovascular 조직 수술 PDR와 눈에서 excised 활용할 수 가설 개입입니다. 이 끝 우리 수술 excised 환자 파생 fibrovascular 조직 (FT), 인간의 PDR 이상의 관련 모델 될 것입니다의 비보 문화 전 3D에 대 한 새로운 방법을 개발. FTs는 explants로 해 부하 고 ex vivo 문화 및 3D 특성에 대 한 섬유 소 매트릭스에 포함 된. 네이티브 FTs 및 끝점 문화 전체 마운트 면역 형광 수 조직 구성과의 잠복 관련 기능에 대 한 3 차원 조직 수준 특성의 중요성을 강조 하는 다세포 프로세스의 철저 한 조사 PDR 이상입니다. 이 모델은 동적 PDR 조직 아키텍처와 microenvironment 내 생 화 학적 및 물리적 상호 작용의 복잡 한 맥락에서 분자 메커니즘, 세포/조직 프로세스 및 치료 응답의 동시 평가 허용할 것 이다. 이후이 모델이 PDR 이상, 그것은 또한 새로운 치료법을 개발 또는 테스트에 대 한 의무가 있을 것입니다.
Introduction
박사는 당뇨병, 지난 3 년간1에서 거 대 한 비율에 도달 했습니다 질병의 심각한 안구 합병증. 20 년 후 일 나이 성인2실명의 원인 진단, 타입-1 당뇨병과 망막 질환, 당뇨병 라기보다 하나의 주요의 만들기의 유형 2 당뇨병 현재 징후와 환자의 60%와 거의 모든 환자. Microvascular 변성 및 허 혈 성 손상의 수준에 따라 박사는 비 증식 박사 (비 PDR) 및 증식 박사 (PDR)으로 분류 됩니다. 말기 질환, PDR, 허 혈 및 염증 유발 neovascularization 및 vitreoretinal 인터페이스에서 거리 응답 특징 이다. 치료 되지 않는 조건에서 이러한 프로세스는 유리 체 출혈, 망막 증, 망막 tractional 및 신생 녹 내장3,4실명 이어질 것입니다. 최근 발전에도 불구 하 고 현재 치료 옵션 대상만 박사 단계, 망막 손상에는 이미 일어 났 죠 때 당뇨 황 반 부 종 및 PDR, 포함 한. 또한, 박사 환자의 큰 비율 현재 치료 armamentarium, 향상 된 치료4,,56에 대 한 긴급 한 필요를 나타내는에서 혜택 하지 않습니다.
다른 여러 나n vivo 질병/개발 모델 및 당뇨병 동물 모델 개발 되었습니다 날짜, 하지만 그들 중 누구도 인간의 PDR7,8관찰 pathologic 기능의 전체 범위. 또한, 증거를 증가 시키는 치료 응답 ECM 구성으로 공간 배열 및 세포질이 고 acellular microenvironment9사이의 상호 작용에 밀접 하 게 연결 되어 있는지 나타냅니다. 우리는, 그러므로, 일반적으로 vitrectomy PDR10의 외과 관리의 일환으로 진행 하는 눈에서 excised 피트 병 적인 소재를 활용 하 여 인간의 PDR의 임상 관련 모델 개발에 착수.
이 원고 vivo 문화 전 3D에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 수술 excised PDR의 환자-파생 된 병 적인 피트. 여기 설명 하는 방법은 네이티브 3D PDR 조직 풍경의 성공적인 해체 하 고 재현 부 PDR 이상 신생 등의 비정상적인 거리 응답의 특징의 최근 간행물에서 사용 되었습니다. 혈관 구조11. 이 모델은 또한 소설 기능 수 없습니다 쉽게 평가 될 얇은 조직학 섹션에서와 같은 공간을 국한 apoptosis와 확산 뿐만 아니라 혈관 섬 형성11을 공개 했다. 유리 같은 액체는 성공적으로 사용 되었습니다 다른 사람에 의해 3D 내 피 회전 타원 체 문화는 신생 잠재력을 평가 하 고 angiostatic 분자12의 효능에. 생체 외에서 3D 림프 내 피 세포 (LEC) 회전 타원 체 흥분 제 PDR 유리를 사용 하 여 분석 결과 돋 아와 결합 하면, 우리의 모델 두 성 vitreal의 기여 요인 as에 신생 조직 내에서 뿐만 아니라 로컬 단서 공개 아직 불완전 하 게 이해 LEC 참여 PDR 이상3,11. PDR의 관리에 vitreoretinal 수술 정기적으로 수행이 아직 어려운 절차 이다. 수술 기기 및 기술을 볼 수 있습니다 지속적인 발전과 세련, fibrovascular 증식 견본의 보수와 적시 제거 뿐만 아니라 비전 결과 향상 하지만 또한 귀중 한 조직에 대 한 자료를 제공 합니다 살아있는 인간의 조직 microenvironment의 복잡 한 변환 측면에서 PDR 이상과 치료 응답의 조사.
Protocol
Representative Results
Discussion
신뢰할 수 있는 기능 셀 및 분자 기계 결과 대 한 관련 조직 microenvironment의 중요성을 고려 하면이 조직 환경을 제공 하는 적절 한 실험 모델을 찾을 수 필수적입니다. 여기 설명 비보 전 PDR 문화 모델을 섬유 소 포함 FTs PDR 임상 샘플의 네이티브, 복잡 하 고 다세포 컨텍스트에서 PDR 이상의 메커니즘의 조사 수 있습니다.
프로토콜 내에서 중요 한 단계는 적절 한 섬유 소 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 대부분의 의료 및 외과 망막 동료, 간호사와 당뇨병 단위 및 Vitreoretinal 수술 장치 안 과학의 부, 헬싱키 대학 병원 채용에 적극적으로 참여에서 전체 직원에 감사 환자. 영상 시설에 감사 Biomedicum 분자 이미징 장치 하 고. 우리는 우수한 기술 지원을 위한 아나 체르넨코 감사합니다. 이 연구는 핀란드 아카데미 (KL), 헬싱키의 대학 (KL), Sigrid Juselius 재단 (KL), K. 알 요한슨 재단 (KL), 핀란드 암 연구소 (KL), 카롤 린스 카 Institutet (KL), 핀란드 눈 재단 (SL), 눈에서 교부 금에 의해 지원 되었다 고 조직 은행 재단 (SL), 메리와 게오르그 C. Ehrnrooth 재단 (SL), 및 HUCH 임상 연구 보조금 (TYH2016230, SL 후 TYH2018127), 의학 (예)의 박사 프로그램 뿐 아니라 당뇨병 연구 재단 (SL, kl 기를, AK, EG).
Materials
| Material | |||
| Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
| Disposable Scalpels – Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
| Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
| Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
| Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
| Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
| Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
| Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
| Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
| Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
| Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth factors | |||
| Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary antibodies | |||
| CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
| NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
| Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
| VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
| SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
| LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
| AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |
References
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years. Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).
- Loukovaara, S., et al. Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy. Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).
- Stitt, A. W., et al. The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).
- Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Gross, J. G., et al. Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).
- Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities. Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
- Sharma, T., et al. Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).
- Gucciardo, E., et al. The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization. The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).
- Rezzola, S., et al. 3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).
- Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis. Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).
- Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).
- Loukovaara, S., et al. Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).
- Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes. Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).
- Loukovaara, S., et al. Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy. Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).
- Sugiyama, N., et al. EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion. Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).
- Tatti, O., et al. MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma. Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- Senger, D. R. Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines. American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).
- Senger, D. R., Davis, G. E. Angiogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. The challenge of modeling macular degeneration in mice. Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).
- Kim, L. A., et al. Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy. Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).
- Avery, R. L., et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).
- Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy. The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).
- Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).
