Summary
Qui, presentiamo un protocollo per studiare la fisiopatologia della retinopatia diabetica proliferativa utilizzando tessuti paziente-derivato, chirurgicamente asportato, fibrovascolare per coltura di tessuto nativo tridimensionale caratterizzazione ed ex vivo. Questo ex vivo modello di cultura è inoltre favorevole per il test o lo sviluppo di nuovi trattamenti.
Abstract
Retinopatia diabetica (Dott) è la complicazione microvascolare più comune di diabete e una delle principali cause di cecità negli adulti in età lavorativa. Nessuna correnti modelli animali di diabete e retinopatia indotta da ossigeno sviluppano i cambiamenti progressivi full range manifestati in umana retinopatia diabetica proliferative (PDR). Di conseguenza, comprensione della patogenesi della malattia e della patofisiologia si affida in gran parte l'uso di sezioni istologiche e campioni vitrosi negli approcci che forniscono solo informazioni allo steady-state sui fattori patogeni coinvolti. La prova aumentante indica che dinamico cellula-cellula e cellula matrice extracellulare (ECM) interazioni nel contesto di tridimensionale (3D) microambienti sono essenziali per gli studi meccanicistici e funzionali verso lo sviluppo di nuovi strategie di trattamento. Di conseguenza, abbiamo supposto che il tessuto fibrovascolare patologico asportato chirurgicamente da occhi con PDR poteva essere utilizzato per attendibilmente svelare i meccanismi cellulari e molecolari di questa malattia devastante e testare il potenziale per il romanzo clinica interventi. A tal fine, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per 3D ex vivo cultura di asportata chirurgicamente paziente-derivato tessuto fibrovascolare (FT), che servirà come un modello pertinente di fisiopatologia umana di PDR. La FTs sono dissecato in espianti e incorporato nella matrice di fibrina per ex vivo di cultura e 3D di caratterizzazione. Intero-monta immunofluorescenza di FTs nativo e culture End-Point permette un'indagine approfondita della composizione del tessuto e processi multicellulari, evidenziando l'importanza della caratterizzazione di tessuto-livello 3D per scoprire caratteristiche rilevanti di Patofisiologia PDR. Questo modello permetterà la valutazione simultanea di meccanismi molecolari, cellulari/tessuto processi e le risposte al trattamento nel contesto complesso di interazioni dinamiche biochimici e fisici all'interno dell'architettura tissutale PDR e microambiente. Poiché questo modello ricapitola patofisiologia PDR, anche sarà favorevole per il test o lo sviluppo di nuovi trattamenti.
Introduction
DR è una grave complicanza oculare del diabete, una malattia che ha raggiunto proporzioni enormi nell'ultimo trent'anni1. Vent'anni dopo la diagnosi, virtualmente tutti i pazienti con diabete di tipo 1 e il 60% dei pazienti con segni presenti di tipo 2 diabete di retinopatia, rendendo diabete per sé uno dei principali cause di cecità in età adulti2di lavoro. Secondo il livello di degenerazione microvascolare e danno ischemico, DR è classificata in DR non proliferativa (non-PDR) e DR proliferative (PDR). La malattia di stadio finale, PDR, è caratterizzata da neovascolarizzazione indotta da ischemia e infiammazione e fibrotiche risposte all'interfaccia vitreo-retinica. In condizioni non trattate, questi processi porterà alla cecità a causa di emorragia del vitreo, fibrosi retinica, distacco di retina trazionale e glaucoma neovascular3,4. Nonostante i recenti progressi, opzioni correnti di trattamento di destinazione solo DR tappe, tra cui edema maculare diabetico e PDR, quando già ne è danno retinico. Inoltre, una grande percentuale di pazienti DR non beneficia attuale armamentario di trattamento, che indica un urgente bisogno di terapie migliori4,5,6.
Più altri iovivo n malattia/modelli di sviluppo e modelli animali diabetici sono stati sviluppati fino ad oggi, ma nessuno di loro ricapitola l'intera gamma di caratteristiche patologiche osservate in human PDR7,8. Inoltre, la prova aumentante indica che le risposte al trattamento siano strettamente collegate nella composizione di ECM come pure la disposizione spaziale e l'interazione tra il microambiente cellulare e acellular9. Abbiamo, quindi, di sviluppare un modello clinicamente rilevante del PDR umano utilizzando materiale patologico FT che comunemente viene asportato da occhi sottoposti a vitrectomia come parte dell'amministrazione chirurgica di PDR10.
Questo manoscritto descrive il protocollo per il 3D ex vivo cultura e caratterizzazione della-asportata chirurgicamente, PDR paziente-derivato patologico FT. Il metodo qui descritto è stato utilizzato in una recente pubblicazione che ha dimostrato il successo decostruzione del nativo 3D paesaggio tessuto PDR e ricapitolazione delle caratteristiche di patofisiologia PDR inclusi angiogenici e fibrotiche risposte di anormale strutture vascolari11. Questo modello ha anche rivelato caratteristiche novelle che non possono essere facilmente apprezzati da sezioni istologiche sottili, come nello spazio limitano di apoptosi e proliferazione nonché vascolare isolotto formazione11. Liquido vitroso è stato utilizzato con successo di altri utenti su culture di sferoide endoteliale 3D per valutare il suo potenziale angiogenico e l'efficacia di angiostatic molecole12. Quando combinato con uno sferoide in vitro delle cellule endoteliali linfatiche 3D (LEC) analisi usando vitroso PDR come stimolante di germogliatura, nostro modello ha rivelato che il contributo di entrambi vitreal solubili fattori spunti anche come locale all'interno del tessuto neovascolare per as ancora capito male LEC coinvolgimento nel PDR patofisiologia3,11. Nella gestione del PDR, chirurgia vitreo-retinica è una procedura di routine eseguita ancora impegnativa. Come tecniche e strumentazioni chirurgiche sono vedendo avanzamento continuo e raffinatezza, rimozione tempestiva e conservatore di fibrovascolare proliferativa esemplare non solo migliora il risultato di visione ma fornisce anche materiale tissutale inestimabile per la indagine di risposte di patofisiologia e trattamento di PDR negli aspetti traslazionali complessi del microenvironment del tessuto umano vivo.
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Protocol
Questa ricerca è stata approvata dal comitato etico dell'ospedale dell'Università di Helsinki e Institutional Review Board. Firmato il consenso informato è stato ottenuto da ogni paziente.
1. preparazione di soluzioni, mezzi e attrezzature
- Preparare le seguenti attrezzature prima della raccolta del tessuto fibrovascolare (FT) per garantire un'elaborazione rapida.
- Pinzette di microdissection sterile-autoclave due.
- Preparare 1 x tampone fosfato salino (PBS) sciogliendo 1 compressa PBS pre-pesato (0,14 M NaCl, KCl, 0,010 M PO4-3M 0,0027) in 900 mL di acqua deionizzata e mescolare per sciogliere. Regolare il volume di acqua fino a 1 L e sterile-autoclave la soluzione pronta. Conservare a RT.
- Raccogliere la soluzione di cui sopra e attrezzature in un cestino, insieme con un bisturi sterile monouso, una piastra di coltura sterile 6 cm cella e cinque piastre per colture cellulari di 12-pozzetti sterili.
- Preparare un 6 mg/mL soluzione di fibrinogeno in matasse bilanciato sale soluzione (HBSS) sciogliendo 30 mg di fibrinogeno umano del plasminogeno-vuotati in 5 mL di HBSS, utilizzando un tubo da 50 mL, immerso in un bagno di acqua a 37 ° C, per almeno 1 h.
Nota: Questa soluzione può essere mantenuta nel bagno d'acqua (37 ° C) per 7 h (massimo 10 h) prima dell'uso. - Preparare l'ex vivo di coltura aggiungendo 5% siero fetale di vitello (FCS) o siero umano 5%, 0,4% supplemento di crescita delle cellule endoteliali, 10 ng/mL ricombinante umano fattore di crescita epidermico, 1 idrocortisone μg/mL e 50 μg/mL Gentamicina a commercialmente disponibile mezzo di crescita delle cellule endoteliali e tenere a bagnomaria a 37 ° C fino all'utilizzo. Conservare a 4 ° C per fino a un mese.
2. dissezione del tessuto fibrovascolare
- Raccogliere il tessuto fibrovascolare (FT) che è stato asportato da soggetti umani sottoposti a chirurgia vitreo-retinica microincisione trans-congiuntivale, da 23 o 20 gauge tre-orificio pars il plana vitrectomy come parte dell'amministrazione chirurgica vitreoretinica del PDR.
Nota: Il FT è asportato mediante segmentazione e delaminazione, tagliare se necessario con microforbici e rimosso dalla cavità vitrosa con Micropinze intraoculare fine-presa da chirurgo vitreo-retinica con esperienza. Estrema cura deve essere presa per rimuovere FT integro senza causare danni a strutture oculari, compreso il nervo ottico o arcade vascolare temporale in cui si trova più comunemente il tessuto patologico neovascolare. Le dimensioni del tessuto asportato è variabile, solitamente compresa tra 3 e 50 mm2. - Mantenere il FT in una piastra di coltura cellulare di 6 cm o provetta da 1,5 mL contenente 1 mL di PBS sterile posizionato su ghiaccio bagnato e trasferirlo immediatamente alla ricerca di laboratorio per l'elaborazione.
Nota: È essenziale che l'unità di ricerca (laboratori) è fisicamente vicino la sala operatoria dell'ospedale (OR) per ridurre al minimo i tempi di trasferimento delle piccole FT asportato. In questo caso il trasferimento dura meno di 5 minuti e gli espianti sono incorporati all'interno della fibrina solitamente in 1-1,5 h (massimo 2 ore) dopo la rimozione chirurgica. L'impatto dei tempi di trasferimento più lunghi sulla cultura 3D avrebbe bisogno di essere testati. - Posizionare il FT in una piastra di coltura cellulare di 6 cm contenente 1 mL di PBS a temperatura ambiente (TA, 25 ° C) e acquisire immagini del tessuto utilizzando un microscopio a epifluorescenza invertito con un obiettivo 5x.
Nota: Le immagini sono acquisite per la documentazione e valutazione qualitativa. Sarà possibile osservare la dimensione del tessuto, la densità e la composizione generale (ad es., le strutture vascolari). - Tagliate il FT ~ 1 mm a2 pezzi sotto uno stereomicroscopio di dissezione in posizione verticale, utilizzando una pinzetta sterile bisturi e microdissection. Tenere il tessuto, immerso in PBS, utilizzando una pinzetta microdissection ed eseguire tagli netti usando un bisturi sterile. Evitare di strappare FT, come ciò modificherebbe le strutture native fibrovascolare.
- Posizionare ogni singolo pezzo in un pozzetto di una piastra di coltura 12-pozzetti cella contenente 1 mL di PBS sterile.
Nota: Se necessario, diffondere delicatamente il FT sulla piastra, usando la pinzetta microdissection, prima dell'esecuzione di tagli.
3. fusione verticale fibrina Gel goccioline per la caratterizzazione di FT nativo e coltura Ex Vivo
- Filtro sterile la soluzione di fibrinogeno pronta preparata al punto 1.2, con un filtro di 0,22 μm, montato in una siringa da 10 mL.
- Preparare aliquote della soluzione di fibrinogeno (25 µ l per provetta da 1,5 mL) tenga a RT. Prepare un'aliquota per fibrina gel / ogni pezzo FT ottenuta dopo la dissezione, e un paio di aliquote supplementare per il test della fibrina gel formazione.
- Preparare una soluzione di HBSS contenente 4 unità/mL di trombina e 400 μg/mL di aprotinina, chiamato aldilà TA soluzione e tiene a RT. Prepare tanto soluzione TA come necessario, a seconda del numero di pezzi ottenuti dopo la dissezione (25 μL di soluzione di TA è utilizzato per ogni Gel di FT/fibrin) e un importo supplementare (ad es., 250 μL) per testare la formazione di gel di fibrina e garantire che la soluzione abbastanza sia disponibile in tutta colata delle gocce di gel di fibrina.
Nota: La trombina è richiesta per la polimerizzazione della fibrina mentre aprotinina è aggiunto per prevenire il degrado del gel di fibrina da proteasi cellulari espresse dalle FTs13,14. - Testare i tempi di formazione del gel di fibrina: aggiungere 25 μL di soluzione di TA per la soluzione di fibrinogeno 25 μL aliquotati preparata al punto 3.2 e, utilizzando un'altra pipetta impostato su 50 μL, mescolarvi il tubo pipettando e dispensare in una piastra di coltura cellulare di 6 cm , formando una gocciolina in posizione verticale.
Nota: La formazione del gel di fibrina dovrebbe avvenire in ~ 1 min. Se questo richiede oltre 1,5 min, la concentrazione di trombina nella soluzione TA preparata al punto 3.3 può essere aumentata aggiungendo altre soluzione stock di trombina. Può essere aggiunto un decimo del volume inizialmente usato della soluzione di riserva di trombina, ripetutamente, fino a quando la formazione di gel di fibrina si verifica entro 1,5 min. Il tempo di formazione di gel di fibrina è critico per la tridimensionalità della cultura, come gel di rapida formazione (entro 1,5 minuti) impedisce il pezzo FT da affondare fino in fondo il gel di fibrina e venendo così a contatto con la superficie di plastica 2D della cella piastra di coltura, che può condurre all'adesione cellulare 2D e di conseguenza. - Posizionare il pezzo di un FT al centro di un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti utilizzando una pinzetta sterile e rimuovere l'eccesso di PBS di pipettaggio con una pipetta di 0.5-10 μL per evitare la forza di aspirazione sulla FT. Nel caso in cui che il tessuto si attacca alla pinzetta, è necessario utilizzare una pinzetta aggiuntiva per facilitare il posizionamento del pezzo di tessuto sulla piastra.
Nota: Gel FT/fibrina può essere lanciato anche su 48 pozzetti per ridurre l'utilizzo di reagenti. Tuttavia, questo è più impegnativo come lo spazio è più limitato e fibrina si diffonderà se viene a contatto con la parete ben. - Aggiungere 25 μL di soluzione di TA per la soluzione di fibrinogeno μL 25 aliquotati in passo 3.2, e per mezzo di un'altra pipetta impostato su 50 μL mix nel tubo di pipettaggio. Dispensare sul pezzo FT ben disposto sul piatto, e pipetta su e giù per 2 - 3 volte al fine di includere il pezzo FT all'interno la goccia in posizione verticale, fornendo una matrice circostante 3D al FT.
Nota: Assicurarsi che la FT non viene aspirato durante il pipettaggio e che non si formano bolle d'aria. Assicurarsi inoltre che miscelazione, dispensa e pipettaggio vengono eseguite rapidamente come il gel di fibrina si forma entro 1,5 min, come testato al punto 3.4. Se la colata gel di fibrina su 48 pozzetti, utilizzare 20 μL di soluzione di fibrinogeno e 20 μL di soluzione di TA. - Ripetere i passaggi da 3.5 e 3.6 per tutti i pezzi FT.
- Consentire i gel di fibrina a solidificare incubando le piastre in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C in atmosfera umidificata con 5% CO2.
- Dopo 0,5-1 h, controllare che il gel di fibrina è completamente formato da attentamente inclinando la piastra. Procedere al punto 3.10 quando il gel non si muove quando la piastra viene inclinata, che indica che la formazione di gel di fibrina è stata completata.
- Sovrapporre i gel FT/fibrina con ex vivo terreno di coltura (600 μL/pozzetto in piastre da 24) o 300 μL/pozzetto in piastre da 48 completati con 100 μg/mL aprotinina. Pipettare delicatamente il mezzo di sospensione dispensazione.
Nota: Qui, aprotinina è usato per prevenire il degrado del gel di fibrina da proteasi cellulari espresse dalle FTs13,14. L'ex vivo di coltura inoltre può essere completato con fattori di crescita ricombinanti, come VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ (Vedi Tabella materiali)11. - Rimettere il FT ex vivo piastra di coltura nella 37 ° C, 5% CO2 incubatrice della coltura cellulare e la cultura per il periodo di tempo desiderato (ad esempio, 2 - 18 giorni, più cultura periodi dovrà essere testato). Sostituire il 50% del mezzo con fresco ex vivo di coltura ogni tre giorni.
4. "a matrice" Imaging
- Acquisire immagini del FT ex vivo culture nello stesso giorno (giorno 0) e a intervalli regolari (ad esempio, ogni altro giorno), utilizzando un microscopio a epifluorescenza invertito, per seguire la crescita 3D.
Nota: Le immagini ottenute utilizzabile per la quantificazione di conseguenza il FT come la lunghezza totale di due diametri perpendicolari attraverso l' espianto11.
5. nativo FT ed Ex Vivo cultura End-Point
Nota: I gel FT/fibrina possono essere coltivati ex vivo per il periodo di tempo desiderato (FT ex vivo culture) o fissati lo stesso giorno (nativo FT) per nativo di caratterizzazione FT11.
- Difficoltà il nativo o 20ft ex vivo culture sostituendo il terreno di coltura con 1 mL/bene di paraformaldeide al 4% in soluzione di PBS, per 1 h a TA. Per i nativi gel FT/fibrina, Difficoltà 0,5-1 h dopo l'aggiunta dell'ex vivo cultura medio (se i gel di fibrina non hanno stato immerso nel mezzo, fissazione li danneggia).
Nota: Eseguire questo passaggio in cappa come paraformaldeide è corrosivo, tossico e cancerogeno. - Sciacquare i gel FT/fibrina con tre min 5 lavaggi in PBS (2 mL/pozzetto).
- Sostituire il PBS con 2ml/bene di PBS contenente 0,02% di sodio azide e conservare i gel di fibrina fisso a 4 ° C fino al momento di un'ulteriore elaborazione. Sigillare le piastre con film di paraffina per garantire che i gel FT/fibrina non asciugano in deposito.
Nota: Eseguire questo passaggio in cappa come sodio azide è tossica.
6. intero-monta immunofluorescenza
Nota: Questo protocollo dura 5 giorni e può essere interrotto con le incubazioni overnight dove indicato. Non lasciare che la fibrina gel a secco in qualsiasi punto. Se non diversamente indicato, tutti i passaggi vengono eseguiti a RT.
- Preparare le seguenti soluzioni prima di iniziare il protocollo di colorazione.
- Soluzione di post-fissazione: preparare la soluzione di acetone: metanolo di 50: 50 mescolando uguali quantità di acetone e metanolo (ad es., 50 mL). Conservare a-20 ° C. Preparare questa soluzione ultima il giorno prima la colorazione. Questa soluzione può essere conservata torna a-20 ° C ed essere utilizzata per gli stainings successivi.
Nota: Preparare questa soluzione in cappa come acetone e metanolo sono infiammabili e pericolosi per la salute. - Soluzione bloccante: preparare un 15% siero fetale bovino (FBS), 0,3% ottile fenolo etossilato soluzione PBS prima aggiunta del 15% FBS di PBS. Aggiungere ottile fenolo etossilato e mescolare per sciogliere. Conservare a 4 ° C.
Nota: Questa soluzione può essere preparata in grande quantità in anticipo, memorizzati in 15ml aliquote a-20 ° C e scongelati prima dell'uso, il giorno quando viene avviato il protocollo di colorazione. Utilizzare un aliquote preparata al momento o appena scongelati per ogni protocollo di colorazione. - Soluzione di lavaggio: preparare 1 L di PBS completati con 0,45% ottile fenolo etossilato aggiungere 4,5 mL di ottile fenolo etossilato a 995,5 mL di PBS. Mescolare per sciogliere. Conservare a RT.
- Soluzione di post-fissazione: preparare la soluzione di acetone: metanolo di 50: 50 mescolando uguali quantità di acetone e metanolo (ad es., 50 mL). Conservare a-20 ° C. Preparare questa soluzione ultima il giorno prima la colorazione. Questa soluzione può essere conservata torna a-20 ° C ed essere utilizzata per gli stainings successivi.
- Sollevare le goccioline attentamente dalla piastra utilizzando una spatola in acciaio inox segati. Smontare la gocciolina prima dai bordi prima di sollevare il centro e trasferire in un pozzetto della piastra 12-pozzetti contenente 1 mL di PBS.
Nota: Eseguire post-fissazione, lavaggi e blocchi passi in questo formato di piastra. - Post-fissare le gocce con 1 mL di soluzione di acetone: metanolo ghiacciato 50: 50 per ~ 1 min (al confine delle goccioline diventeranno bianco).
Nota: Eseguire questo passaggio in cappa come acetone e metanolo sono pericolosi per la salute. - Sciacquare con 3-5 lavaggi in 2 mL di PBS (le goccioline affonderà nella soluzione PBS quando reidratazione è completa).
Nota: Evitare di toccare le goccioline con la punta della pipetta, dopo post-fissazione, essi sono appiccicose in plastica. In tutto il protocollo, evitare aspirazione Post-fix, anticorpo, blocco e soluzioni di lavaggio mediante aspirazione, poiché questo potrebbe danneggiare o distruggere completamente le goccioline. Invece, la piastra di inclinazione e rimuovere con cautela le soluzioni usando una pipetta μL di 500-5.000. - Centrifugare la soluzione bloccante per 15 min a 21.000 x g e a 4 ° C al fine di rimuovere i detriti.
Nota: La soluzione può essere aliquotata in provette da 1,5 mL per centrifugazione. La soluzione non utilizzata può essere conservata a 4 ° C e utilizzata per tutti i passaggi successivi pertinenti. - Incubare le goccioline in 500 μL ostruisce soluzione per 2 h a TA.
Nota: Per ridurre il volume di soluzione utilizzato il blocco, la piastra può essere inclinata su un supporto e appena 300 μL di soluzione/goccia può essere utilizzato. - Preparare la miscela di anticorpo primario (almeno 30 μL/gocciolina) a diluizione appropriata in blocco soluzione e centrifugare per 15 min a 21.000 x g a 4 ° C.
- Trasferire le goccioline in tondo (U)-piastra a 96 pozzetti di fondo utilizzando una spatola rotonda-orlato e incubare con almeno 30 μL/goccia della miscela anticorpo primario durante la notte a 4 ° C.
- Il giorno seguente, trasferimento le goccioline in 12-pozzetti piastra contenente 2 mL di soluzione/pozzetto, di lavaggio risciacquo con tre 5 min lava prima e poi con lavaggi di nove 30 min. Lasciare l'ultimo lavaggio (2 mL) durante la notte a 4 ° C.
- Il giorno seguente, lavare tre volte con PBS e trasferire le goccioline in tondo (U)-piastra a 96 pozzetti di fondo.
- Durante i lavaggi, preparare la miscela di anticorpo secondario coniugato fluoroforo appropriato (diluito 1: 500, almeno 30 μL/goccia) in blocco soluzione e centrifugare per 15 min a 21.000 x g e a 4 ° C.
- Trasferire le goccioline in un tondo (U)-piastra a 96 pozzetti di fondo utilizzando una spatola rotonda-orlato e incubare con almeno 30 μL di miscela di anticorpo secondario, per 4 h a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
Nota: Eseguire tutte le successive incubazioni e lavaggi al riparo dalla luce. - Trasferire le goccioline in 12 pozzetti contenenti 2 mL di soluzione/pozzetto usando una spatola di turno-orlato, risciacquo con tre lavaggi di 5 min prima del lavaggio e poi con quattro lavaggi di 30 min. Lasciare l'ultimo lavaggio (2 mL) durante la notte a 4 ° C.
- Il giorno seguente, sciacquare i gel con cinque min 30 lavaggi e quindi tre volte con PBS. Lasciare l'ultimo lavaggio (2 mL) durante la notte a 4 ° C.
- Il giorno seguente, trasferire le goccioline in un tondo (U)-piastra a 96 pozzetti di fondo utilizzando un turno-edged spatola e controcolorazione nuclei incubando con 10 μg/mL Hoechst macchia nucleare (almeno 30 μL/goccia) per 30 minuti a TA.
Nota: Montaggio supplementato con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per nuclei colorazione di contrasto può essere utilizzato in alternativa. In tal caso, questo passaggio e 6.16 vengono ignorati, procedere direttamente al passaggio 6.17. - Trasferire le goccioline in 12 pozzetti contenenti 2 mL di PBS/pozzetto usando una spatola rotonda-orlato e lavare tre volte con PBS.
- Montare le goccioline sul vetrino del microscopio come segue:
- Applicare uno strato stretto di mezzo di montaggio rapido indurimento sui bordi di un coprioggetto di forma quadrata 22 mm x 22 mm e lasciare asciugare per ~ 1 minuto. Eseguire questo passaggio per ogni goccia individualmente, per evitare eccessivo indurimento di mezzo di montaggio.
Nota: Eseguire questo passaggio in cappa come il mezzo di montaggio rapido indurimento è pericoloso per la salute. - Sciacquare la goccia mediante immersione in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti contenenti 2 mL di acqua deionizzata e trasferire su un vetrino da microscopio, usando una spatola rotonda-orlato. Rimuovere l'acqua in eccesso utilizzando un piccolo pezzo di carta assorbente.
- Dispensare 15 μL di mezzo di montaggio antifade non indurente sulla goccia.
Nota: In alternativa, se non è stato utilizzato nucleare macchia di Hoechst, mezzo di montaggio contenente 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) può essere utilizzato. - Delicatamente posizionare il vetro di copertura, con il mezzo di montaggio rapido indurimento affrontando il vetrino al microscopio, sopra la goccia e lasciar decantare.
Nota: Il mezzo rapido indurimento attaccheranno alla diapositiva microscopica e mantenere la goccia sul posto.
- Applicare uno strato stretto di mezzo di montaggio rapido indurimento sui bordi di un coprioggetto di forma quadrata 22 mm x 22 mm e lasciare asciugare per ~ 1 minuto. Eseguire questo passaggio per ogni goccia individualmente, per evitare eccessivo indurimento di mezzo di montaggio.
- Ripetere il passaggio 6.17 per tutte le goccioline. Montare due gocce su ogni vetrino da microscopio.
- Lasciate che le diapositive asciugare a temperatura ambiente per ~ 2 h e conservare a 4 ° C durante la notte. Assicurarsi che le diapositive sono posizionate orizzontalmente e protetto dalla luce.
- Immagine il nativo macchiato o end-point FT ex vivo culture utilizzando un microscopio confocale o un microscopio a epifluorescenza verticale dotato di una funzione di sezionamento ottica e 20x o obiettivo 40x. Utilizzare piastrelle funzione per acquisire una maggiore area del tessuto in una sola volta.
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Representative Results
Più profonda comprensione delle proprietà di tessuto fibrovascolare PDR e l'espressione della proteina ha fatto affidamento principalmente sui campioni vitrosi e sottile istologico FT sezioni3,15,16,17. Per sviluppare un metodo per un'indagine approfondita dell'organizzazione del tessuto 3D e pluricellulari processi fisiopatologici del PDR, abbiamo precisato per utilizzare chirurgicamente asportata, paziente-derivato patologico FTs per caratterizzazione 3D ed ex vivo di cultura. La FTs fresco sono trasferiti per il laboratorio di ricerca e trattati come illustrato nel flusso di lavoro schematico in Figura 1.
La FTs possono essere imaged prima della dissezione per la valutazione qualitativa e documentazione (Figura 2). Come mostrato nella Figura 2, la FTs visualizzare variazione inter-paziente grande in dimensioni, densità e abbondanza di strutture vascolari. In alcuni tessuti, cellule sciolte, presumibilmente infiammatoria/immunitaria cellule o globuli rossi, così come le strutture vascolari permeabile di calibro diverso possono anche essere facilmente distinto (Figura 2). Dopo la dissezione, una decisione deve essere effettuata sull'utilizzo a valle del numero limitante di espianti di ottenuti. Una porzione degli espianti è incorporata all'interno della matrice di fibrina e fissata dopo la formazione della fibrina del gel mentre gli espianti rimanenti possono essere sottoposti a ex vivo di cultura su una piastra separata (Figura 1). FTs fresco sono anche state utilizzate con successo per caratterizzazione ultrastrutturale da microscopia elettronica. I campioni possono essere trasformati per microscopia elettronica convenzionale trasmissione (TEM) di sezioni ultrasottili o per blocco seriale viso-scansione microscopia elettronica (SBF-SEM)3,11.
I gel di fibrina fisso possono essere conservati per diverse settimane e macchiati dall'immunofluorescenza intero-monta18,19. I campioni macchiati similarmente sono stabili se conservati a 4 ° C al buio. I gel FT/fibrina spessi possono essere imaged tempo-in modo efficiente con microscopio a epifluorescenza dotato di una funzione di sezionamento ottica, utile per rimuovere la luce sparsa di out-of-focus. Imaging con questo metodo è bene visualizzazione delle strutture. In alternativa, microscopia confocale, anche se più tempo-esigente, può consentire la cattura di dettagli più fini. La caratterizzazione del appena incorporato della fibrina e fisso, FTs incolto, nativo di intero-monta immunofluorescenza consente la caratterizzazione delle strutture vascolari, più tipi di cellule e la loro disposizione reciproca all'interno del tessuto PDR 3D 11del paesaggio. Ad esempio, gli anticorpi CD31 possono essere utilizzati per visualizzare l'endotelio e NG2 per visualizzare periciti (Figura 3), mentre gli anticorpi Lyve1 visualizzare appena scoperto linfatico-come le strutture endoteliali (Figura 4)11. Molteplici combinazioni di anticorpi possono essere utilizzati per visualizzare le varie strutture e tipi di cellule (Vedi Tabella materiali); ad esempio, ERG può anche visualizzare l'endotelio, che propone un modello di espressione discontinuo il neovasculature PDR anormale. Le strutture vascolari macchiate con un marker di membrana (ad es., CD31 e Lyve1) possono essere analizzate quantitativamente per conservazione e densità utilizzando Angiotool, un software gratuito-source sviluppato da NIH National Cancer Institute11, 20. Volumi 3D possono essere reso anche da dataset ottenuti (Vedi Video 1). Se un anticorpo non è adatto per intero-monta immunofluorescenza, le goccioline di fibrina possono in alternativa essere inclusi in paraffina, tagliate a sezioni sottili e analizzate da immunohistochemistry. In questo caso le goccioline beneficiano di fissazione durante la notte a 4 ° C invece di 1h a TA.
Ex vivo cultura sostiene la crescita del FTs fibrina incorporato, lo sviluppo di escrescenze cellulari già dopo due giorni (Figura 5). Il gel di fibrina in vitro è usato come la matrice per ex vivo di cultura, poiché caratterizza in vivo provvisorio ECM, formata dopo fenditura trombina di fibrinogeno del siero presso i siti di perdita vascolare, a diretto contatto con i neovasi PDR che perde nella infiammato fibrotica milieu15,21,22.
PDR è una complicazione microvascolare, caratterizzata da una risposta fibrotica e angiogenico e gli espianti FT mantengono questo repertorio cellulare in coltura, nonché rispondono efficacemente agli stimoli esogeni aggiunti alla cultura media11. I dati rappresentativi nella Figura 6 dimostrano che le culture PDR ex vivo indotta germogliatura della conservazione CD31-positiva endotelio e sistema vascolare in risposta a VEGFA, mentre TGFβ ha indotto una risposta fibrotica riflettuta l'escrescenza NG2-positivi periciti/paesi del Mediterraneo meridionale. Diversi stimoli esogeni possono essere testati e, quando informato tramite le misure del loro abbondanza vitreal in vivo, il PDR qui sviluppato ex vivo modello di cultura può rivelare romanzo microambiente e contesto dipendente PDR meccanismi patologici che non possono essere visualizzati in materiale tessuto fisso.
Figura 1. Ex vivo Modello di coltura del tessuto fibrovascolare PDR. Rappresentazione schematica del flusso di lavoro dalla chirurgia vitreo-retinica (pars il plana vitrectomy) per l'asportazione del FT sua dissezione in espianti e incorporamento in fibrina per cultura tridimensionale di caratterizzazione ed ex vivo . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Appena asportato il tessuti fibrovascolare PDR prima della dissezione. Fase contast micrografie di FTs appena asportato presa prima della dissezione. La FTs sono altamente variabile in dimensioni, densità e abbondanza di strutture vascolari. Le frecce indicano le strutture vascolari di calibro diverso. La linea rossa parzialmente trasparente evidenzia due singoli vasi di calibro diverso. Le immagini sono state scattate con un microscopio a epifluorescenza invertito con 5x, 0.15 apertura numerica (NA), obiettivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Intero-monta l'immunofluorescenza di un tessuto fibrovascolare nativo di PDR. Epifluorescenza micrografo di un nativo PDR FT macchiato dall'immunofluorescenza intero-monta. CD31 (A, verde) Visualizza l'endotelio mentre NG2 (B, rosso) Visualizza i pericytes all'interno delle strutture irregolari neovascolare. Immagini unite sono mostrati in (C). Colorante di contrasto DAPI (blu) Visualizza i nuclei. L'immagine è stata scattata utilizzando un microscopio a epifluorescenza verticale con funzione di sezionamento ottico e combinato con un comandato da calcolatore 1,3 megapixel monocromatica CCD fotocamera immagine acquisizione software e, utilizzando un 40x, 1,4 NA, obiettivo di olio. Nove sezioni ottiche sono state combinate utilizzando software di elaborazione immagine ImageJ. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Intero-monta l'immunofluorescenza di un tessuto fibrovascolare nativo di PDR. Epifluorescenza micrografo di un nativo PDR FT macchiato dall'immunofluorescenza intero-monta. CD31 (A, verde) Visualizza l'endotelio mentre Lyve1 (B, rosso) Visualizza la recente scoperte linfatico-come le strutture endoteliali. Immagini unite sono mostrati in (C). Hoechst 33342 counterstain (blu) Visualizza i nuclei. L'immagine fu preso utilizzando un microscopio a epifluorescenza verticale con funzione di sezionamento ottico e combinato con un comandato da calcolatore 1,3 megapixel monocromatica CCD telecamera e software di acquisizione immagini, utilizzando un obiettivo 20x, 0,8 NA. Quattro sezioni ottiche sono state combinate utilizzando software di elaborazione immagine ImageJ. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Ex vivo crescita dei tessuti fibrovascolari PDR. Micrografie di contrasto di fase delle culture di x vivo eFT due intervalli di tempo indicati (giorno). La FTs crescere ex vivo di cultura, lo sviluppo di escrescenze cellulari già dopo due giorni. Le immagini sono state scattate con un microscopio a epifluorescenza invertito con un obiettivo 5x, 0.15 NA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 6. Intero-monta immunofluorescenza dei tessuti fibrovascolari PDR coltivate ex vivo non trattata (CTRL), o in presenza di VEGFA o del TGFβ. Epifluorescenza micrografo di FT coltivate ex vivo non trattata (CTRL) o in presenza di VEGFA o del TGFβ per 9 giorni e successivamente macchiato dall'immunofluorescenza intero-monta. CD31 (verde) Visualizza l'endotelio mentre NG2 (rosso) Visualizza i periciti. Colorante di contrasto DAPI (blu) Visualizza i nuclei. VEGFA stabilizzato il sistema vascolare mentre TGFβ ha indotto una risposta fibrotica. Le immagini sono state scattate utilizzando un microscopio a epifluorescenza verticale con funzione di sezionamento ottico e combinate con un comandato da calcolatore 1,3 megapixel monocromatica CCD telecamera e software di acquisizione immagini, utilizzando un obiettivo 20x, 0,8 NA. Nove sezioni ottiche sono state combinate utilizzando software di elaborazione immagine ImageJ. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1. ricostruzione del volume 3D di un nativo FT macchiato dall'intero-monta immunofluorescenza. CD31 (verde), Lyve1 (rosso). Hoechst 33342 counterstain (blu) Visualizza i nuclei. L'immagine fu preso utilizzando un microscopio a epifluorescenza verticale con funzione di sezionamento ottico e combinato con un comandato da calcolatore 1,3 megapixel monocromatica CCD telecamera e software di acquisizione immagini, utilizzando un obiettivo 20x, 0,8 NA. Ricostruzione del volume 3D e rendering video è stato effettuato usando un software commerciale. Una parte del video è ristampata con il permesso da Gucciardo et al. 11. per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
Considerando l'importanza del microambiente tessuto pertinenti per affidabile e funzionale delle cellule e molecolare risultati meccanicistici, è imperativo trovare appropriati modelli sperimentali che forniscono questo ambiente di tessuto. Descritto nel presente documento ex vivo PDR cultura modello per FTs fibrina-incorporato consente l'indagine dei meccanismi della patofisiologia PDR nel contesto dei campioni clinici PDR nativo, complesso e pluricellulare.
Fasi critiche all'interno del protocollo sono la formazione di gel di fibrina corretta, il posizionamento della FT e adeguate per la pulizia durante la colorazione. Poiché la formazione della fibrina del gel dipende principalmente l'attività della trombina, risente la concentrazione e la temperatura, la quantità di trombina deve essere regolata per ogni lotto di preparazione del gel di fibrina. Formazione di fibrina gel dovrebbe essere abbastanza veloce per prevenire la crescita 2D di espianti di FT, ma anche rallentare abbastanza per consentire il posizionamento del FT al centro delle goccioline verticalmente e orizzontalmente. Nel caso che il FT accade per individuare al bordo della goccia, ulteriori pipettaggio potrebbe aiutare il posizionamento del FT al centro. FTs che rimangono ancora al bordo delle goccioline o che crescono in 2D dovrà essere escluso. Adeguate durante la macchiatura ed evitando di lavaggio asciugatura delle goccioline sono a sua volta fondamentale al fine di ottimizzare la macchiatura e ridurre al minimo segnale di fondo. Tempi di trasferimento possono anche essere critici. Noi abbiamo incorporato la FTs fino a due ore dopo vitrectomy e questo non ha pregiudicato l'ex vivo crescita. L'impatto dei tempi di trasferimento più lunghi il successo di cultura avrebbe bisogno di essere testati.
Questo protocollo può essere modificato utilizzando matrici alternative per l'incorporamento di FT. In vivo, i neovasi PDR crescono verso la corteccia vitrosa ricche di collagene23. Tuttavia, al momento di componenti del siero perdita vascolare, tra cui il fibrinogeno, sciogliere in vitroso in prossimità dei vasi per cui viene avviata la risposta fibrotica. Di conseguenza, il coagulo di fibrina in vitro è stato utilizzato qui per l'ex vivo cultura al fine di caratterizzano l'ECM provvisorio formato nel milieu fibrotico infiammato del PDR15,21,22. In alternativa, i coaguli di fibrina potrebbero essere completati con laminina e fibronectina per alterare la stabilità di germogliatura capillari o gli espianti potrebbero essere incorporati all'interno di tipo I, collagene e altre matrici miste a caratterizzano i più fibrotici microambienti in tessuti neovascolare. Queste matrici sono generalmente adatte per cultura 3D e immunofluorescenza intero-monta ma i loro effetti su FTs PDR rimangono da testare e considerazioni sui tempi di formazione matrix 3D dovrà essere effettuata al fine di rimanere entro i limiti per prevenire 2D crescita18,19. Quando la vicinanza fisica dell'unità di ricerca per l'ospedale rappresenta una limitazione, tempi più lunghi di trasferimento potrebbero essere compensati con lavoro di squadra; Preparazione soluzione TA, fibrinogeno-filtrazione sterile e test di formazione di fibrina gel può essere eseguite durante il trasferimento di FT. Se i gel di fibrina non formano anche dopo 1 ora, potrebbe essersi verificato un problema con il fibrinogeno o la preparazione di soluzione di TA. In questo caso, non può essere utilizzato il gel FT/fibrina.
Limitazioni di questo approccio, come con ogni ex vivo approccio, sono la qualità variabile del campione primario del tessuto attraverso gli individui, come pure la eterogeneità del tessuto intra- paziente e Inter-paziente. Nel caso di pazienti diabetici, parte di questa variabilità include l'entità della vascolarizzazione e fibrosi che dipendono da numerosi fattori come la durata della malattia, condizione metabolica, fattori genetici/epigenetici, tipo di diabete e terapia sistemica. La dimensione del PDR chirurgico FT recuperato è anche un fattore limitante nel determinare il numero di condizioni che possono essere studiate per ogni campione. Pur fornendo informazioni spaziali reciproci, intero-monta immunofluorescenza permette l'indagine su solo una quantità limitata di funzioni/marcatori per goccia. Come compromesso, le goccioline di fibrina in alternativa possono essere inclusi in paraffina, tagliate a sezioni sottili e analizzate da immunohistochemistry.
Esistenti topo diabetico modelli sviluppano molte caratteristiche della fase iniziale DR ma non riescono a ricapitolare completamente progressivi cambiamenti che si verificano nel PDR umano, ostacolando in tal modo gli studi del PDR malattia meccanismi7,8. Inoltre, l'occhio murino è fondamentalmente diversa dall'occhio umano, in quanto manca la macula, ulteriori sottolineando l'importanza di studiare la malattia umana24. La FTs PDR chirurgica sia precedentemente sono stati scartati, o usato per sezioni della paraffina, microscopia elettronica a trasmissione, blocco seriale viso-scansione microscopia elettronica, alla rinfusa sequenziamento di RNA o 2D cultura di cellule dissociate3,25 . Il modello qui descritto consente la caratterizzazione 3D di questo prezioso materiale chirurgico, così come l'indagine della patofisiologia PDR nel microambiente nativo tessuto malato. Quando combinato con l'uso di fluido vitreale, questo modello consente inoltre l'indagine del contributo di entrambi il microambiente cellulare e acellular PDR. Poiché le culture rispondere in modo efficiente a fattori di crescita rilevato nel vitroso, quali VEGFA, bFGF, VEGFC e TGFβ, ricapitolare così caratteristiche di patofisiologia PDR, questo PDR ex vivo modello di cultura è favorevole per il test o lo sviluppo di nuovi trattamenti PDR 11. in questo modello, anti-VEGFA impedito germogliare capillare e indotto segni di regressione capillare, le risposte che sono coerenti con i risultati clinici attesi del trattamento anti-VEGFA26,27. Pertanto, questo modello è utilizzabile anche per meglio comprendere gli effetti delle attuali terapie, compresi i trattamenti anti-VEGFA e del corticosteroide.
Con strumentazione di imaging cellule vive, qui descritto ex vivo modello di cultura potrebbe essere sottoposto al time-lapse microscopia per consentire indagini in tempo reale di processi come la regressione vascolare, plasticità di germinazione e cellulare. Quando combinato con modelli in vitro ed in vivo, così come i dati clinici, questo ex vivo modello PDR aiuterà ad istruire il paziente risposte basate su insiemi specifici di identificare marcatori, un passo più vicino al viale per la medicina personalizzata. Identificare le risposte specifiche del paziente e/o risposta specifici marcatori è particolarmente rilevante nel caso di PDR, che è una malattia multifattoriale con un complesso giuoco di microvascolare, neurodegenerative, metaboliche, genetiche ed epigenetiche, fattori immunologici e relazione con l'infiammazione, che richiede sforzi sempre più multidisciplinari per lo sviluppo di una migliore gestione terapeutica di targeting e malattia. Oltre a immunofluorescenza intero-monta, l'ex vivo coltivata FTs potrebbe anche essere estratto dalla fibrina dal trattamento di nattokinase plasmina/e sottoposti a trascrittomica e proteomica analizza28. L'idoneità del modello qui descritto per ex vivo studi dei tessuti fibrovascolari sviluppati in altre condizioni oculari, come nei casi più gravi di retinopatia di cellule di falce, potrebbe essere esplorato anche in futuro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori sono molto grati ai colleghi di retina medica e chirurgica, infermieri e tutto il personale dell'unità diabetica e unità di chirurgia vitreo-retinica presso il reparto di oftalmologia, ospedale dell'Università di Helsinki per partecipare attivamente nel reclutamento dei pazienti. Ringraziamo Biomedicum unità di Imaging molecolare per le strutture di formazione immagine. Ringraziamo Anastasiya Chernenko per l'eccellente assistenza tecnica. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da Accademia di Finlandia (KL), Università di Helsinki (KL), Sigrid Juselius Foundation (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), Istituto finlandese di cancro (KL), Karolinska Institutet (KL), finlandese Eye Foundation (SL), occhio e Fondazione Banca di tessuto (SL), Maria e Georg C. Ehrnrooth Foundation (SL) e assegni di ricerca clinica HUCH (TYH2018127 dopo TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG) così come il programma di dottorato in biomedicina (EG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
| Disposable Scalpels - Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
| Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
| Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
| Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
| Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
| Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
| Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
| Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
| Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
| Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth factors | |||
| Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary antibodies | |||
| CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
| NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
| Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
| VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
| SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
| LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
| AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |
References
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