En Ex Vivo vev kultur modell for Fibrovascular komplikasjoner i proliferativ diabetisk retinopati
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å studere i Patofysiologien ved proliferativ diabetisk retinopati med pasient-avledede, inngrep forbrukeravgift, fibrovascular vev for tredimensjonale innfødt vev karakterisering og ex vivo kultur. Dette ex vivo kultur modell er også mottakelig for testing eller utvikle nye behandlinger.
Abstract
En av årsakene til blindhet i yrkesaktiv alder voksne diabetisk retinopati (DR) er den vanligste mikrovaskulær komplikasjonen av diabetes. Ingen gjeldende dyr modeller av diabetes og oksygen-indusert retinopati utvikle fulltone progressive endringer manifestert i menneskelig proliferativ diabetisk retinopati (PDR). Derfor forståelse av sykdommen patogenesen og patofysiologi har støttet seg hovedsakelig på bruk av histologiske seksjoner og glasslegemet prøver tilnærminger som bare gir stabil informasjon på involvert sykdomsfremkallende faktorer. Økende bevis indikerer at dynamisk celle-celle og celle-ekstracellulær matrix (EFM) interaksjoner i konteksten av tredimensjonale (3D) microenvironments er avgjørende for den mekanistiske og funksjonelle studier mot utviklingen av nye behandling strategier. Derfor hypotesen vi at patologisk fibrovascular vevet inngrep forbrukeravgift fra øynene med PDR kan utnyttes til å pålitelig rakne cellulære og molekylære mekanismer for denne ødeleggende sykdommen og teste potensialet for romanen klinisk intervensjoner. Mot dette formål utviklet vi en ny metode for 3D ex vivo kultur av inngrep forbrukeravgift pasient-avledede fibrovascular vev (FT), som vil tjene som en relevant modell av menneskelig PDR patofysiologi. FTs deles opp i explants og innebygd i fibrin matrise for ex vivo kultur og 3D karakterisering. Hele-mount immunofluorescence opprinnelige FTs og sluttpunktet kulturer kan av vevssammensetning og flercellet prosesser, fremheve betydningen av 3D vev-nivå karakterisering av avdekke relevante funksjoner i PDR patofysiologi. Denne modellen tillater samtidig vurdering av molekylære mekanismer, mobilnettet/vev prosesser og behandlingstiltak i kompleks sammenheng med dynamisk biokjemiske og fysiske interaksjoner i PDR vev arkitekturen og microenvironment. Siden denne modellen viser PDR patofysiologi, vil det også være mottakelig for testing eller utvikle nye behandlinger.
Introduction
DR er en alvorlig okulær komplikasjoner av diabetes, en sykdom som har nådd enorme proporsjoner i de siste tre tiårene1. Tyve år etter diagnose, nesten hver pasient med type 1 diabetes og 60% av pasienter med type 2 diabetes stede tegn på retinopati, gjør diabetes sådan en av årsakene til blindhet i arbeider age voksne2. Ifølge nivået på mikrovaskulær degenerasjon og iskemiske skader, er DR klassifisert i ikke-proliferativ DR (ikke-PDR) og proliferativ DR (PDR). Sluttstadiet sykdommen, PDR, er preget av ischemia – og betennelse-indusert neovascularization og fibrotiske svar på vitreoretinal grensesnittet. I ubehandlet forhold, vil disse prosessene føre til blindhet glasslegemet blødning, netthinnen fibrose, tractional Netthinneavløsning og neovascular glaukom3,4. Til tross for nylige fremskritt mål gjeldende behandlingstilbud bare DR stadier, inkludert diabetiker macula ødem og PDR, retinal skade har allerede fulgte. Videre nytte en stor andel av DR pasienter ikke fra gjeldende behandling armamentarium, som angir et presserende behov for bedre behandling4,5,6.
Flere andre jegn vivo sykdom/utviklingsmessige modeller og diabetiker dyremodeller har vært utviklet ennå, men ingen av dem viser hele omfanget av patologisk funksjoner i menneskelig PDR7,8. Videre indikerer økende bevis at behandlingstiltak er tett koblet til ECM sammensetningen samt romlige arrangement og samspill mellom mobilnettet og acellular microenvironment9. Vi er derfor å utvikle en klinisk relevante modell av menneskelig PDR ved å benytte FT patologisk materialet som er vanlig forbrukeravgift fra øynene under vitrectomy som en del av kirurgisk behandling av PDR10.
Dette manuskriptet beskriver protokollen for 3D ex vivo kultur og karakterisering av de kirurgisk-forbrukeravgift, PDR pasient-avledede patologisk FT. Metoden beskrevet her har vært brukt i en fersk publikasjon som vellykket dekonstruksjon av innfødte 3D PDR vev landskapet og recapitulation av funksjonene i PDR patofysiologi inkludert angiogenic og fibrotiske svar av unormale vaskulære strukturer11. Denne modellen har også avdekket romanen funksjoner som ikke kan lett nytes fra tynne histologiske seksjoner, som romlig begrenset apoptose og spredning samt vaskulær Holme formasjon11. Glasslegemet væske har blitt brukt av andre 3D endothelial spheroid kulturer å evaluere sin angiogenic potensielle og effekten av angiostatic molekyler12. Kombinert med en i vitro 3D lymfatisk endothelial celle (LEC) spheroid spirende analysen bruker PDR glasslegemet som stimulerende, viste vår modell bidrag av både løselig vitreal faktorer så vel som lokale stikkordene i det neovascular vev som men dårlig forstått LEC engasjement i PDR patofysiologi3,11. I forvaltningen av PDR er vitreoretinal kirurgi en rutinemessig utført ennå utfordrende prosedyre. Som kirurgisk instrumentations og teknikker ser kontinuerlig utvikling og raffinement, tidsriktig og konservative fjerning av fibrovascular proliferativ ikke bare forbedrer visjon resultatet, men gir også uvurderlig vev materiale for den undersøkelse av PDR patofysiologi og behandling svar i komplekse translasjonsforskning aspekter av det levende menneskelige vev microenvironment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vurderer betydningen av relevante vev microenvironment for pålitelig funksjonelle cellen og molekylære mekanistisk resultater er det viktig å finne passende eksperimentelle modeller som gir dette vev-miljøet. Her beskrives ex vivo PDR kultur modell for fibrin-embedded FTs lar etterforskningen av mekanismer for PDR patofysiologi i innfødte, komplekse og flercellet sammenheng PDR klinisk prøvene.
Avgjørende skritt i protokollen er riktig fibrin gel dannelsen, plasseringen av FT o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er mest takknemlig til medisinsk og kirurgisk netthinnen kolleger, sykepleiere og av diabetiker enheten og Vitreoretinal kirurgi enhet ved Institutt for Oftalmologi, Helsinki University Hospital for å aktivt delta i rekrutteringen pasienter. Vi takker Biomedicum molekylær Imaging enheten for imaging anlegg. Vi takker Anastasiya Chernenko for utmerket kundestøtte. Denne studien ble støttet av tilskudd fra Academy i Finland (KL), Universitetet i Helsinki (KL), Sigrid Juselius Foundation (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), finsk Cancer Institute (KL), Karolinska Institutet (KL), finsk øye Foundation (SL), øyne og Vev Bank Foundation (SL), Mary og Georg C. Ehrnrooth Foundation (SL) og HUCH klinisk forskning tilskudd (TYH2018127 etter TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG) samt doktorgradsprogram i biomedisin (EG).
Materials
| Material | |||
| Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
| Disposable Scalpels – Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
| Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
| Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
| Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
| Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
| Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
| Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
| Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
| Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
| Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth factors | |||
| Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary antibodies | |||
| CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
| NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
| Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
| VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
| SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
| LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
| AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |
References
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years. Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).
- Loukovaara, S., et al. Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy. Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).
- Stitt, A. W., et al. The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).
- Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Gross, J. G., et al. Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).
- Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities. Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
- Sharma, T., et al. Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).
- Gucciardo, E., et al. The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization. The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).
- Rezzola, S., et al. 3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).
- Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis. Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).
- Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).
- Loukovaara, S., et al. Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).
- Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes. Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).
- Loukovaara, S., et al. Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy. Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).
- Sugiyama, N., et al. EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion. Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).
- Tatti, O., et al. MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma. Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- Senger, D. R. Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines. American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).
- Senger, D. R., Davis, G. E. Angiogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. The challenge of modeling macular degeneration in mice. Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).
- Kim, L. A., et al. Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy. Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).
- Avery, R. L., et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).
- Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy. The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).
- Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).
