Summary
这份手稿描述了一种测量成年斑马鱼压力行为的简单方法。该方法利用了斑马鱼在压力状态下更喜欢鱼缸的下半部分的固有倾向。我们还描述了将检测与药理学结合的方法。
Abstract
适当地应对有压力的刺激是生物体生存所必需的。对广泛的与压力有关的疾病和精神障碍进行了广泛的研究, 但仍需进一步研究压力的遗传和神经元调节, 以开发更好的疗法。斑马鱼提供了一个强大的遗传模型来研究神经的基础的压力, 因为有大量的突变和转基因线的集合。此外, 药理可以很容易地应用于斑马鱼, 因为大多数药物可以直接添加到水中。我们在这里描述了使用 "新的坦克试验" 作为一种方法来研究斑马鱼的先天应激反应, 并演示如何使用该分析验证潜在的抗焦虑药物。该方法可以很容易地与携带基因突变的斑马鱼系, 或使用转基因方法操作精确神经电路的斑马鱼系结合在一起。该检测方法也可用于其他鱼类模型。总之, 所描述的协议应有助于其他实验室采用这种简单的检测方法。
Introduction
应激反应是潜在有害或厌恶性刺激所导致的行为和生理状态的改变。压力反应在整个动物王国是保守的, 对生物体的生存至关重要.几十年的研究极大地扩大了我们对压力状态背后的一些遗传和神经元机制的了解。今天, 大脑的区域, 如杏仁核和纹状体 2, 和遗传因素,如促肾上腺皮质激素释放激素(crh), 糖皮质激素(gr) 和矿物皮质激素受体(先生) 已经被广泛研究了3,4,5,6。尽管有这些重要发现, 但关于压力的遗传和神经元调节, 仍有许多未知数。因此, 许多与压力有关的疾病缺乏治疗方法。
遗传可修正的模型生物为研究行为的遗传和神经元控制提供了一个有用的工具。特别是鱼类模型的威力非常大: 它们是生成时间短的小生物, 在实验室环境中使用它们很容易, 它们的基因组很容易改变, 作为脊椎动物, 它们不仅具有遗传特性, 而且还具有神经解剖性同源与他们的哺乳动物同行7,8。测量压力的标准检测可以与携带基因突变的斑马鱼系搭配, 也可以与那些可以操纵精确神经元子集的斑马鱼系配对, 并且可以快速有效地评估单个基因或定义神经元的影响。
在行为上, 应激反应可以描述为活动过度活跃或长时间不活动 (类似于 "冷冻")9, 减少勘探 10, 快速呼吸, 减少食物摄入11, 和对储罐12 底部的首选。例如, 当放入一个不熟悉的鱼缸时, 成年斑马鱼和其他小鱼模型显示出对鱼缸下半部分的最初偏好, 然而, 随着时间的推移, 鱼开始以接近相等的频率12探索顶部和底部的一半。成人治疗已知的减少焦虑的药物会导致鱼类立即探索上半部分10,13.相反, 增加焦虑的药物会导致鱼类对鱼缸的下半部分表现出强烈的偏好,1 2、1 4、1 5.因此, 减少对储罐下半部分的勘探和偏好是简单可靠的应力指标。
与大多数脊椎动物一样, 鱼类的应激反应是由激活下丘脑-垂体-肾间轴 (hpi; 类似于哺乳动物的下丘脑-垂体-肾上腺轴) 14,16.下丘脑神经元表达激素促肾上腺皮质激素释放激素 (CRH) 信号的垂体, 这反过来又释放肾上腺皮质激素释放激素 (促肾上腺皮质激素)。促肾上腺皮质激素然后信号到肾间腺产生和分泌皮质醇, 它有许多下游目标 16, 其中之一是产生低温神经元 3,17的负反馈, 18,19。
在这里, 我们描述了一种评估先天压力行为度量的方法。对于这种行为, 我们详细介绍了使用新的坦克潜水试验12,14的协议。然后, 我们证明, 作为一个例子, 一个已知的抗焦虑药物, 布西酮, 减少压力的行为措施。
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Protocol
该协议已获得佛罗里达大西洋大学动物护理和使用机构委员会的批准。
1. 准备工作
- 指定一个用于进行行为研究的隔离室, 或关闭房间的一部分, 使其被隔离。
注: 房间应不受干扰, 交通流量较低, 以避免干扰鱼的正常行为。 - 将下列材料和设备移入行为室: (一) 相机和镜头, (二) 可连接镜头的红外滤光片, (三) 相机支架, (四) 带有相机采集软件的计算机, (五) 可靠而稳定的表格进行检测(vi) 红外灯 (红外灯; 850 纳米或940纳米), (vii) 白色丙烯酸扩散器, 其长度超过记录罐 (viii) 1.8 L 梯形塑料分析罐 (称为 "新型罐"; 此处使用的一个是 12 x 18 英寸)和 (九) 一桶鱼系统的水。
注: 对于新型储罐, 我们的实验室使用市售塑料容器, 这些塑料容器的形状是梯形的。坦克的尺寸大约是 6 x 9 中的尺寸 (详细尺寸见图 1a)。我们使用的扩散器板比新型储罐略大 (12 英寸 x 18 英寸)。对形状不同的坦克进行了新的坦克试验, 例如矩形或不同梯形尺寸为 20、21的坦克。通常情况下, 鱼的行为是类似的所有坦克, 无论其尺寸: 对于所有的容器, 鱼最初更喜欢下半部分, 但随着时间的推移开始探索上半部更频繁。 - 将红外滤光片连接到相机镜头。红外光带的波长通常从850纳米到940纳米不等。该滤波器是一种远传滤波器, 可限制波长小于 720 nm 的光通过传输到摄像机。
- 为相机采集软件选择合适的参数。对于大多数录制, 将相机采集设置为每秒30帧, 并将录制持续时间设置为10分钟。
注: 这些参数可能会有所不同, 具体取决于实验。例如, 要研究一个新的坦克22,23的习惯, 可能需要更长的录音。
2. 设置
注: 本节中的步骤描述了新的储罐检测的设置。图 1b给出了最终产品的示意图。
- 把新的坦克放在桌子中央。
- 将红外灯放置在储罐后面, 并将白色丙烯酸片或扩散器屏幕放置在储罐和 LED 光源之间。
- 放置扩散器, 使其最大限度地传播来自 Led 的光, 并且光的强度足以照亮新的坦克。板子离光源越近, 灯光就会越明亮, 但扩散的越少。相比之下, 将扩散器板放置在远离光源的地方, 会降低光强, 但更好地传播光。
- 用鱼系水填充大约四分之三的新型水箱。
注: 系统用水是使用自来水反渗透产生的, 然后加药, 电导率等于 900±100μs, ph 值是中性的 (7.2), 温度为27±1°c。 - 将相机连接到相机支架, 并将相机连接到计算机。打开视频采集软件, 调整相机, 面对坦克的前部, 确保整个新颖的坦克都能看到, 视频中没有模糊的区域。调整坦克和红外灯, 以便通过相机观察到整个油箱有足够的照明。
注: 在继续进行实验之前, 执行试运行通常会很有用, 在试运行中捕获鱼的视频并执行跟踪。这将确保设置足以进行行为实验。
3. 新型储罐测试装置
- 准备一个250毫升的烧杯, 预先填充鱼系统的水, 和至少两个持有槽。
- 在测试的当天上午, 将至少10个测试的成年斑马鱼从鱼类设施转移到一个保管箱, 转移到行为室, 并使它们至少适应1种小时。
注: 在实验之前应进行功率分析, 但在我们手中, n = 10 通常足以检测统计意义。此外, 储罐每升水不应超过5人。一个小时的适应就足够了, 因为斑马鱼的成虫已经被证明在新的坦克22号后30分钟内就习惯了。此外, 行为节律受生理过程的影响, 因此, 在不同日期进行的实验复制应在相同的时间内进行。我们通常在上午11点到下午6点之间进行所有实验。 - 给坦克贴上标签, 使实验者对动物的状况或基因型视而不见。
注: 实验可以很容易地通过标记坦克使用字母或数字系统 (即, 一个坦克被标记为 "A", 另一个 "B" 等) 的实验被蒙蔽。没有参与实验的一方用这样的系统给坦克贴上标签, 并在分析完成之前掩盖实验者的身份。 - 使用网, 轻轻地将单个成人从步骤3.1 开始放置在预先填充的烧杯中。让成年鱼在烧杯中适应10分钟。
注: 记录成人的性别, 因为它可能是重要的后分析, 以寻找性别特定的差异。 - 在烧杯中适应后, 将鱼引入新的鱼缸 (设置在第1节) 中, 轻轻地将水和成人从烧杯中倒出。
- 在将成人引入新的鱼缸后, 开始相机录制, 并离开设置, 以防止对鱼的额外困扰。
- 录音完成后, 将个人从新的储罐中取出, 放入新的储罐中。
注: 应使用与步骤3.2 中的固定罐不同的储罐, 以防止对同一个体重复测试。 - 对每个成年人重复3.4 至 3.7, 直到所有动物都经过测试。
注: 除了致盲条件或基因型外, 随机试验。使用随机数生成器或任何允许随机数生成器在试验之间进行随机化的工具。这应该在实验之前完成, 以便在实验开始之前确定每个试验。 - 在所有测试结束时, 将鱼送回鱼类设施。
4. 药物预处理
注: 以下步骤的目的是比较个人在使用药物前后的行为。这种比较是通过首先进行步骤3.4 至3.6 中的新的坦克测试, 然后是药物治疗, 然后是第二次新的坦克测试来实现的 (图 3a)。
- 准备药物的库存解决方案, 包括积极和消极的控制。
注: 如果该药物以前已在文献中使用, 请找到适当的工作剂量并使用此方法。例如, 对于有代表性的结果中的 buspirone, 我们制作了100x 库存溶液, 并使用 0.05 mg/ml 作为最终浓度, 如文献13、20 所述。如果建议的剂量未知, 则应通过检查几种浓度来执行剂量响应曲线。设置更多的烧杯与连续稀释的药物。如果该药物不能在水中溶解, 请使用二甲基亚硫酸 (DMSO) 作为溶剂。 - 用系统水稀释250毫升烧杯中的药物到工作浓度。例如, 如果制造了100x 溶液, 则在系统水中稀释 1: 100。设置一个烧杯, 只使用系统水作为控制。
注: 如果在步骤3.1 中使用 DMSO 作为溶剂, 请在控制烧杯中使用相同数量的 DMSO。 - 在另一位研究人员的帮助下, 掩盖药物和控制烧杯的身份, 以确保测试仪在分析后之前对治疗条件视而不见。
注: 可以使用数字或字母系统。 - 按照步骤3.1 到3.6 执行新的坦克测试, 以获得基线行为应激反应。
- 基线记录后, 如步骤4.2 所述, 使用网立即将新的鱼缸中的成年鱼取出, 并将其放入用药物或车辆剂量的烧杯中。允许成人在烧杯中停留10分钟。
注: 确保网不会接触烧杯中的水, 以防止药物交叉污染。根据所使用的药物, 确保适当的剂量和给药时间。10分钟的治疗时间可能不适用于所有药物。 - 处理后, 使用网子将成人从步骤4.5 中的烧杯中取出, 并将其放置在另一个仅充满新鲜系统水的烧杯中。这是在第二次新的储罐试验中最大限度地减少进一步剂量的冲洗期。允许成人在洗掉的烧杯中多呆10分钟。
注: 应使用单独的网的每个药物条件, 以防止任何不必要的交叉治疗与药物。如果实验者愿意, 可以跳过冲洗期。 - 通过在上一步将该成人从烧杯中取出, 将其放置在新的新储罐中, 并按照3.5 至3.6 步进行步骤, 进行第二次坦克潜水测试。
- 第二次新的储罐试验结束后, 将个人取出到单独的储罐中。将系统水倒在第二新颖的水箱中, 然后在下一次测试中灌满新鲜的系统水。此步骤可防止任何药物的交叉污染。
注: 根据药物的半衰期, 含有药物的新鲜烧杯应每3小时制作一次。对于布西龙, 每3小时制作一次新的解决方案。此外, 按照步骤3.8 的说明, 试验应随机分为对照和药物治疗。 - 在所有试验结束时, 将个人送回鱼类设施。
注: 根据所使用的药物类型, 这些治疗对个人的影响可能是长期的。因此, 不要在其他实验中使用这些个体。
5. 视频分析
- 经过所有试验后, 将视频文件加载到所选择的跟踪软件中。
注: 我们通常使用商业上可用的跟踪软件, 但可以使用几个免费提供的软件包。实现跟踪的步骤可能因使用的软件包而异。 - 使用视频中的静止不动框架, 定义 (i) 充满水的整个新颖的坦克竞技场周围的假想边界, 以及 (二) 前三分之一、(iii) 中第三和 (iv) 坦克倒数第三的边界。使用这些来确定鱼在新的坦克的每个部分花费的时间。
- 为步骤5.2 中定义的每个竞技场计算每个帧的 x-y 位移。
- 定义储罐的顶部、中间和底部区域。每个区域的面积都应相似。确定这些区域的一个简单方法是计算 y 方向的坦克长度, 并将其除以3。
注: 对常规协议的更改确实存在。例如, 有些实验室使用一半而不是三分之二14。 - 确定在每个竞技场上花费的时间、距离和速度。
注: 大多数跟踪包将自动为用户计算这些。但是, 如果跟踪软件不这样做, 则可以轻松地从 x-y 位移值计算这些值。例如, 可以使用以下公式确定距离:
速度可以按照公式确定:
- 重复步骤5.2 至 5.4, 获取所有试验的轨道和测量值。
注: 对此常规协议的更改
6. 测试正常
- 在继续计算统计差异之前, 请先执行统计信息。检查数据是否通常使用 Shapiro-Wilk 测试进行分发。
- 如果数据通常分布的零假设被拒绝 (即数据不遵循高斯分布), 则使用非参数测试执行所有测试。相反, 如果发现数据遵循正态分布, 则继续使用参数测试。
注: 我们使用商业上可用的软件来执行统计;但是, 也可以使用 R 编程语言。可以使用 R 的变形测试功能来进行 Shapiro-Wilk 分析。
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Representative Results
研究斑马鱼的应激
为了观察野生斑马鱼在一段时间内的应激行为, 我们在新的储罐试验中测试了来自 AB 菌株24的成年鱼。AB 成年人受上述协议的影响。简单地说, 鱼在行为室的水箱里有1小时的适应期。一个人被放在烧杯里 1 0分钟, 然后轻轻地放在一个不熟悉的水箱 (新的水箱) 里, 里面装满了新鲜的系统水。记录了10分钟的昏迷活动, 并使用商业上可用的软件离线进行跟踪。第一分钟和最后一分钟的运动活动比较显示出巨大的差异 (图 2a、b)。当第一次引入水箱时, 鱼大部分时间都花在底部 (图 2b), 但随着时间的推移, 成年人在顶部的时间逐渐增加 (图 2b, c)。与最后一分钟相比, 在第一分钟花费的总持续时间有显著差异 (6.29±8.21 秒与23.23±9.02 秒; 配对 t-test, p < 0.05).相比之下, 第一分钟和最后一分钟之间的总距离没有显著差异 (440.4 ±1110.3 cm vs. 405.5±49.71 cm; 配对 t-test, p = 0.375) (图 2d)。因为先天的偏好在第一分钟和最后一刻是不同的, 而不是距离的, 所以我们相信行为的改变代表的是一种应激反应, 而不仅仅是运动活动的变化。这些结果表明斑马鱼表现出一种易于测量的先天应激反应。这种方法还建立了一个基础, 以比较不同群体之间的应力差异, 并评估它们之间的压力差异。
抗焦虑药物对斑马鱼应激行为的影响
斑马鱼是一种强大的药物筛选系统, 因为药物的应用可以通过简单地在水中添加 25、26、27.为了验证斑马鱼的底部住所代表着先天应激反应, 我们比较了接触抗焦虑药物前后对成虫斑马鱼的行为;作为一种控制, 我们同样处理了一个单独的成年人, 但只应用车辆 (系统水) 而不是药物。我们使用 5HT 1a 受体激动剂 buspirone, 它不是一种受控物质, 是为患有广义焦虑症28的人类患者开出的.Buspirone 已被证实可减少各种鱼类和哺乳动物模型10、13、21、29、30 的行为应激反应。31、32、33、34 。如协议所述, 斑马鱼首先被记录在新的坦克试验中, 然后被打捞上来, 放在药物或车辆的烧杯里 1 0分钟, 然后给鱼一个 "冲洗" 期, 放在新的烧杯里 1 0分钟 ", 然后重新记录在新的储罐试验中 (图 3a)。
对运动路径的分析显示, 单独接触车辆的成年人群体在治疗前后几乎没有什么差异 (图 3b)。相比之下, 接触布西龙的成年人在接触药物前, 与同一条鱼的运动路径相比, 在顶部花费了大量时间 (图 3b, c)。对在顶部花费的时间长度进行量化后发现, 控制动物的治疗前和治疗后没有显著差异 (183.9±90四十46秒之前, 而不是第118±81.88 秒之后; 单向方差分析之后是 Sidak 的多重比较测试, p =0.4254), 但接触 buspirone 的动物在顶部的时间明显多于预处理, 并在治疗后控制个体 (Buspirone: 201.4±49.95 秒之前对55±42.97 后; 单向方差分析后, 西达克的倍数比较试验, p < 0.0001;控制与 Buspirone 治疗后: p < 0.0001)(图 3c)。为了检查这些差异是否一般是由于运动较少造成的, 我们测量了总的行驶距离。这些数据显示, 任何一组 (434±601.9 厘米前, 而3471±766厘米后的控制没有显著差异;Kruskal-Wallis 测试, p > 0.05;3904±301.3 厘米前与3644±566.3 厘米后, 为布西酮;Kruskal-Wallis 测试, p > 0.05) (图 3d)。综合来看, 这些数据表明, 在成年斑马鱼的底部居住是衡量先天压力的一个指标, 并为进一步的药理实验奠定了基础, 在成年斑马鱼。
图 1.新的坦克设置的图.(A) 从储罐记录侧看到的 1.8 l 梯形新型罐的尺寸。(B) 设置示意图, 包括红外灯、摄像机的位置以及用于最大限度地减少人为干扰的屏障。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2.检查野生斑马鱼的先天应激反应.(A) 在10分钟录音的第一分钟 (左) 和最后一分钟 (右), 代表个别成年人在新的坦克试验中的游泳道。定义坦克顶部、中间和底部区域的想象线用虚线表示。(B) 对10分钟记录的每一分钟在顶部区域花费的总时间进行量化。(C & D)比较在所有试验的第一和最后一分钟在顶部区域 (c) 花费的总持续时间和总行驶距离 (d)。配对 t-测试被用于分析, 因为数据通过了沙皮罗-威尔克测试的正常性。n = 5;*: p = 0.028。错误条表示平均值的标准错误。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3.研究抗焦虑药物对应激行为的影响.(A) 实验流程示意图。(B) 对仅用水处理的控制个体和在新的坦克试验中使用布西龙处理的另一个人进行治疗的个人进行前和后的代表性游泳道。虚线定义了坦克顶部、中间和底部区域的分离。灰色轨道代表控制个体, 蓝色轨道代表蒲式船处理的个体。(C & D)对照 (Ctrl) 和生意治疗 (busp) 试验之间在顶部区域 (c) 中花费的总持续时间和总行驶距离 (d) 的比较。首先使用沙皮罗-威尔克测试进行了正常性测试。在正常性测试失败的情况下, 使用了 Kruskal-Wallis 测试, 然后使用了 Dunn 的多次比较测试 (c);如果数据通过了正态性, 则使用单向方差分析, 然后是西达克的多次比较测试进行分析 (D)。n = 5 为每个条件;: p = 0.001。错误条表示平均值的标准错误。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
斑马鱼在一个新的鱼缸中表现出强烈的应激反应
在这里, 我们描述了一种简单的行为方法来检查成年斑马鱼的应激反应, 并验证该方法作为一个简单的测量压力的药理学。
这种新型的储罐试验是一种广泛使用的试验, 用于检查斑马鱼和其他种类的 12、14、21、35、36和斑马鱼的先天压力模型, 以检查与焦虑有关的药物的药理作用。与人类类似, 这些研究表明, 如布西酮、尼古丁、氟西汀和东波胺等药物对斑马鱼12、13、14、37 具有抗焦虑作用。此外, 通常不用于治疗人类焦虑的东波胺等药物会产生额外的抗焦虑作用.展示斑马鱼这种抗焦虑作用的药物屏幕可以促进副作用及其药理机制的研究。此外, 斑马鱼对人类有类似的应激反应途径, 因此将检测与压力源或药物治疗后皮质醇释放的定量配对, 可以用来验证行为反应 14。最后, 我们要指出, 这种检测不是特定于斑马鱼, 也已扩展到其他鱼类物种, 如墨西哥盲鱼,马西卡努斯 21。这种检测很可能可以推广到38头, 蚊子 39, 小鱼40, 和其他鱼群系统。
新型储罐试验的一个重要优点是其生态相关性;由于检测测量坦克下半部的先天偏好, 反应很可能发生在野外。除了新的坦克试验, 其他行为检测, 已用于其他模型生物体可以用来进一步验证行为应激反应, 如开放场测试或光/暗法41,42。这些检测是基于动物跟随竞技场两侧 (大腿轴) 的倾向, 以及在暴露在有压力的线索42, 43 后更倾向于在黑暗中探索 (苏格兰)。此外, 电击还被用来衡量先天或有条件的恐惧反应9,44,45, 尽管这种方法的生态相关性尚不清楚。
当人们考虑对他的研究进行分析时, 重要的是要考虑到菌株或物种中的先天偏见。除了维持和减少行为检测中的环境波动外, 保持测试成人的遗传背景一致也是至关重要的, 因为研究表明, 同一基因型41的个体内部和之间存在差异 ,46。在其他地方, 可以找到对用于研究焦虑的每一种常见行为分析的优点、缺点、有效性以及常见通配类型内行为变化的全面回顾.
斑马鱼作为研究压力的模型
斑马鱼正在成为一种流行的模型, 用于检查调节精确行为的遗传和神经元通路 47, 48, 以及最近开发的大脑地图集, 使映射神经元调节行为的精确49 ,50,51,52,53。我们在这里描述的测量先天焦虑的方法能够利用斑马鱼强大的遗传和神经回路工具。两种可预见的方法依赖于大量的突变线和转基因驱动线的集合。例如, 突变体线将有助于调查人员研究精确基因在调节压力方面的作用。此外, 转基因 Gal4/UAS 和 Gal4/UAS 系统已广泛应用于斑马鱼54,55, 当交叉到 uas 或 quas 效应线, 精确的神经元电路的功能可以操纵和行为评估。这些方法为遗传突变线提供了补充, 并允许研究精确的神经回路是如何导致压力的。
检测神经活动的新技术可以与该检测完全结合。C-fos mrna 或蛋白质的定量被广泛用于检测神经元的活性56。这个基因是一个直接的早期基因, 它的转录是由神经元活动激活。在类似方法的基础上制定了新的方法。例如, 最近开发了外信号调控激酶 (ERK), 用于检测斑马鱼50 的神经元活性。ERK 蛋白存在于中枢神经系统的几乎所有细胞中。神经元激活后, ERK 肽变为磷酸化。此外, 还开发了非磷酸化 ERK (总 ERK、tERK) 和磷酸化 ERK (Ferk) 的可靠抗体, 并在斑马鱼中工作良好。因此, 通过与泰克和 Ferk 特异性抗体的混合标记, 可以可靠地测量神经元的活动。使用这种方法, 在新的坦克测试中显著显示更多底部住宅的成年人可以在记录后被删除, 为 c-fos 或 Terk/perk 染色, 并由此产生的大脑切片成像。
总之, 这些方法应该有助于一个简单的方法来解剖遗传和神经元机制的基础上的压力斑马鱼。此外, 由于斑马鱼和哺乳动物的遗传和神经元通路的高度保护, 我们期望这些方法揭示压力行为背后的保守机制。
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Disclosures
提交人声明, 他们没有竞争或经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了佛罗里达大西洋大学木星生命科学倡议向 ERD 和 ACK 提供的资金支持。这项工作还得到了国家卫生研究院 R21NS105071 (颁发给 ACK 和 ERD) 和 R15MH118625 (颁发给 ERD) 赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics. | ||
| Infrared filter | Edmund Optics | ||
| Video Acquisition Program | Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set. | ||
| Infrared LED lights | |||
| Assay tank | Aquaneering | Part number ZT180 | Size: M3 1.8 liter |
| Stand and clamp, or standard tripod for camera | |||
| 250mL beaker | |||
| Tracking software | We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology | ||
| Buspirone chloride | Sigma-Aldrich | B7148 | |
| Randomized trial generator | We use the RANDBETWEEN function in Microsoft Excel |
References
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