Summary
Dette manuskriptet beskriver en enkel metode for å måle stress behaviorally i voksen sebrafisk. Tilnærmingen utnytter den medfødte tendensen som sebrafisk foretrekker den nederste halvdelen av en tank når du er i en stressende tilstand. Vi beskriver også metoder for kobling analysen med farmakologi.
Abstract
Å reagere hensiktsmessig på stressende stimuli er avgjørende for å overleve kroppen. Omfattende forskning er gjort på et bredt spekter av stress-relaterte sykdommer og psykiatriske lidelser, men videre studier i genetisk og neuronal regulering av stress er fortsatt nødvendig for å utvikle bedre legemiddel selskap. Den sebrafisk gir en kraftig genetisk modell for å undersøke neural grunnlaget av stress, da det finnes en stor samling av mutant og transgene linjer. Videre kan farmakologi lett bli brukt til sebrafisk, som de fleste stoffene kan legges direkte til vann. Vi beskriver her bruk av "romanen tank test" som en metode for å studere medfødt stress svar i sebrafisk, og demonstrere hvordan potensielle angstdempende medikamenter kan bli validert ved hjelp av analysen. Metoden kan enkelt kombineres med sebrafisk linjer harboring genetiske mutasjoner, eller de der transgene tilnærminger for å manipulere presise nevrale kretser brukes. Analysen kan også brukes i andre fiske modeller. Sammen bør den beskrevne protokollen forenkle innføringen av denne enkle analysen til andre laboratorier.
Introduction
Stress responsen er endret atferdsmessige og fysiologiske tilstander som følge av potensielt skadelige eller aversive stimuli. Stress responser bevares i dyreriket, og er avgjørende for overlevelse av en organisme1. Ti år med forskning har i stor grad utvidet vår kunnskap om noen av de genetiske og neuronal mekanismer underliggende stress tilstander. I dag, områder av hjernen som amygdala og striatum2, og genetiske faktorer som corticotropin slippe hormon (CRH), og glukokortikoid (gr) og mineralocorticoid reseptorer ( Mr) har blitt studert mye3,4,5,6. Til tross for disse kritiske funnene, er mye fortsatt ukjent om genetisk og neuronal regulering av stress. Som sådan, mange stress relaterte lidelser lider av en mangel på legemiddel.
Genetisk amendable modell organismer gir et nyttig verktøy i studiet av genetisk og neuronal kontroll av atferd. Fisk modeller, i særdeleshet, er ekstremt kraftig: de er små organismer med kort generasjon ganger, deres bruk i et laboratorium innstillingen er facile, deres genomer er lett endres, og som en virveldyr, deler de ikke bare genetisk, men også nevroanatomi homologi med sine pattedyr kolleger7,8. Standard analyser for måling av stress kan pares med sebrafisk linjer harboring genetiske mutasjoner, eller de der manipulering av presise neuronal delsett er mulig, og virkningene av enkelt gener eller definerte neurons kan vurderes raskt og effektivt.
Behaviorally, stress svar kan karakteriseres i fisk som perioder med Hyper-aktivitet eller lengre perioder med inaktivitet (beslektet med "frysing")9, redusert leting10, rask pusting, redusert matinntak11, og en plass-preferanse for bunnen av en tank12. For eksempel, når oppstilt i en ukjent tank, voksen sebrafisk og annet liten fisken modeller viser en initial preferanse for bunnen halvparten av akvariet, ennå, over tid, fisken begynne Utforsker topp og bunnen halvdeler med like ved-likeverdig hyppigheten12. Behandling av voksne med rusmidler kjent for å redusere angst forårsake fisk å utforske umiddelbart den øverste halvdelen10,13. Omvendt, medikamenter som øker angst forårsake fisk å vise sterke preferanse for den nederste halvdelen av tanken12,14,15. Således, nedsatte utforskningen og preferanse for bunnen halvparten av akvariet er enkel og pålitelig indikatorene av trykk.
Som de fleste virveldyr, stress svar i fisk er drevet av aktivering av hypothalamus-hypofysen-Inter-nyre aksen (HPI; analogt til hypothalamus-hypofysen-adrenal [HPA] aksen i pattedyr)14,16. Hypothalamus neurons uttrykker hormonet corticotropin-lanserer Hormone (CRH) signal til hypofysen, som igjen utgivelser adrenokortikotropt lanserer Hormone (ACTH). ACTH deretter signaler til Inter-renal kjertel å produsere og skiller ut kortisol, som har en rekke nedstrøms mål16, en av dem er negative tilbakemeldinger av CRH-produserende hypothalamus neurons3,17, 18,19.
Her beskriver vi en metode for å vurdere atferds tiltak av medfødt stress. For atferden, vi detalj protokoller ved hjelp av romanen tank Diving test12,14. Vi viser, som et eksempel, at en kjent angstdempende narkotika, Buspirone, reduserer atferdsmessige tiltak for stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committeeat Florida Atlantic University.
1. forberedelse
- Utpeke et isolert rom for å utføre atferds studier, eller stenge en del av et rom slik at det er isolert.
Merk: rommet bør være uforstyrret og har lav trafikk for å unngå å forstyrre normal oppførsel av fisken. - Flytt følgende materialer og utstyr inn i atferds rommet: (i) et kamera og objektiv, (II) en infrarød filter som kan festes til objektivet, (III) et kamera stativ, (IV) en datamaskin med kamera oppkjøpet programvare, (v) en fast og stabil tabell for å utføre analysen på, (vi) infrarødt lys (IR lys, 850 NM eller 940 NM), (VII) en hvit akryl diffuser, som er lengre enn lengden på innspillingen tank (VIII) 1,8 L trapesformet plast analysen tank (referert til som "romanen tank", den som brukes her er 12 x 18 inches) , og (IX) en bøtte med fiske system vann.
Merk: for romanen tank, vår Lab bruker kommersielt tilgjengelige plast fartøy, som er trapesformet i form. Dimensjonene av tanken er omtrent 6 i x 9 i (detaljerte dimensjoner er gitt i figur 1A). Ventilen styret vi bruker er litt større enn romanen tank (12 i x 18 i). Romanen tank eksperimenter har blitt utført med tanker som har ulike former, for eksempel de som er rektangulære eller de med ulike trapesformet dimensjoner20,21. Karakteristisk, fisken opptreden er lignende inne alle tank uten hensyn til deres dimensjoner: for alle beholdere, fisken i starten foretrekke bunnen halv, ennå over tid begynne Utforsker topp halvparten med betydelig hyppigheten. - Koble det infrarøde filteret til kameralinsen. Bølgelengdene av den infrarøde lys strimler vanligvis spenner fra 850 NM til 940 NM. Filteret er et langt pass filter som begrenser lys av bølgelengder mindre enn 720 NM fra overføring til kameraet.
- Velg egnede parametre for programvaren for kamera anskaffelse. For de fleste innspillinger, angi kamera oppkjøpet til en hastighet på 30 bilder per sekund, og opptaksvarighet til 10-min.
Merk: disse parametrene kan variere, avhengig av eksperimentet. For eksempel, for å studere tilvenning i en roman tank22,23, kan lengre innspillinger være nødvendig.
2. oppsett
Merk: trinnene i denne delen beskriver hvordan du setter opp romanen tanken analysen. Et diagram over sluttproduktet er gitt i figur 1B.
- Plasser romanen tanken i midten av bordet.
- Plasser de infrarøde lysene bak tanken og plasser den hvite akryl ark eller diffuser skjermen i mellom tanken og LED lyskilde.
- Plasser ventilen slik at det maksimalt sprer lyset som kommer fra lysdioder, og intensiteten av lyset er nok til å belyse romanen tanken. Jo nærmere styret er for lyskilden, jo lysere blir lysene, men jo mindre vil det diffuse. Derimot, plassere diffuser styret bort fra lyskilden vil redusere lysstyrke, men spre lyset bedre.
- Fyll omtrent tre fjerdedeler av romanen tank med fisk system vann.
Merk: system vann genereres ved hjelp av omvendt osmose av vann fra springen, etterfulgt av dosering slik at ledningsevne tilsvarer 900 ± 100 μS, at pH er nøytral (7,2), og at temperaturen er 27 ± 1 ° c. - Fest kameraet til kamera stativet, og koble kameraet til datamaskinen. Åpne opp video oppkjøpet programvare og justere kameraet til ansikt fronten av tanken og sikre hele romanen tanken kan sees og at det ikke er noen skjulte områder i videoen. Juster tanken og de infrarøde lysene slik at det er tilstrekkelig og til og med belysning i hele tanken når observert gjennom kameraet.
Merk: før du går videre til eksperimenter, kan det ofte være nyttig å utføre en prøvekjøring, der video av en fisk fanges opp og sporingen utføres. Dette vil sikre at oppsettet er tilstrekkelig for eksperimentering av atferd.
3. ny tank test oppsett
- Forbered en 250 mL beger forhånd fylt med fiske system vann, og minst to holde tanker.
- På morgenen av testen, overføre minst 10 test voksen sebrafisk skal brukes for hver eksperimentelle tilstand (kontroller og eksperimentelle voksne) fra fisk anlegget i en Holding tank, overføre dem til atferden rommet, og la dem acclimate for minst én Time.
Merk: en kraft analyse bør utføres før eksperimentering, men i våre hender, en n = 10 er vanligvis tilstrekkelig til å oppdage statistisk betydning. Videre bør holde tanken ikke inneholder mer enn fem personer per liter vann. En acclimation av en time er tilstrekkelig som sebrafisk voksne har vist til venne innen 30 minutter av en ny tank22. Også, atferds rytmer påvirkes av døgn prosesser, og dermed eksperimentelle replikerer gjort på forskjellige dager bør utføres i de samme timene. Vi vanligvis utfører alle eksperimenter mellom timer 11:00 am og 6:00 PM. - Merk tankene slik at tilstanden eller genotype til dyrene er blinde for eksperimentator.
Merk: eksperimenter kan lett bli blendet til eksperimentator ved å merke tanker med et bokstav eller tallsystem (dvs. en tank er merket ' A ', en annen ' B ', etc.). En part som ikke er involvert i eksperimentene etikettene tankene med et slikt system, og masker identiteten fra eksperimentator til etter post-analysen er fullført. - Ved hjelp av et nett, forsiktig plassere en enkelt voksen i pre-fylte begeret fra trinn 3,1. La den voksne fisken acclimate i begeret i 10 minutter.
Merk: ta opp sex av den voksne, som det kan være viktig post-analyse for å se etter sex-spesifikke forskjeller. - Etter acclimation i begeret, introdusere fisken inn i romanen tank (satt opp i del 1) ved å forsiktig helle ut vannet og voksen fra begeret.
- Etter introdusere det voksen inn i romanen tank, starte kameraet innspillingen, og bevege fjerne fra det setup å forhindre i tillegg nød å fisken.
- Etter innspillingen er ferdig, fjerne individet fra romanen tank og sted i en ny holder tank.
Merk: en annen holde tank fra den ene i trinn 3,2 bør brukes for å hindre gjentatt testing på samme individer. - Gjenta trinn 3,4 til 3,7 for hver voksen til alle dyrene er testet.
Merk: i tillegg til blendende forhold eller genotyper, tilfeldig forsøk. Bruk en tilfeldig tall generator eller et verktøy som tillater en å tilfeldig mellom forsøkene. Dette bør gjøres før eksperimentering, slik at hver prøve bestemmes før forsøkene begynner. - På slutten av alle testene, returnere fisken tilbake til fisken anlegget.
4. forbehandling med narkotika
Merk: Målet med følgende trinn er å sammenligne atferden til en person før og etter bruk av narkotika. Denne sammenligningen oppnås ved først å utføre en roman tank test som i trinn 3,4 til 3,6, etterfulgt av narkotikabehandling, og deretter en ny roman tank test (Figur 3a).
- Forbered en lagerløsning av stoffet, inkludert positive og negative kontroller.
Merk: Hvis stoffet har tidligere vært brukt i litteraturen, finne en passende arbeids dose og bruke dette. For Buspirone i representative resultater, lager vi for eksempel en 100-lagerløsning og bruker 0,05 mg/ml som den endelige konsentrasjonen, som beskrevet i litteraturen13,20. Hvis foreslått dose er ukjent, bør en dose respons kurve utføres ved å undersøke flere konsentrasjoner. Sett opp mer kanner med serie fortynninger av stoffet. Hvis stoffet ikke er dissolvable i vann, bruk dimethyl sulfoxide (DMSO) som et løsemiddel. - Fortynne legemidler til arbeids konsentrasjon i 250 mL kanner med system vann. For eksempel, hvis en 100-oppløsning ble gjort, fortynne 1:100 i system vann. Sett opp et beger med bare system vann som en kontroll.
Merk: Hvis DMSO ble brukt som et løsemiddel i trinn 3,1, bruk et likt volum av DMSO i kontroll begeret. - Med hjelp av en annen forsker, maskere identiteten til stoffet og kontroll kanner for å sikre at tester er blind for behandlingen forhold til post-analyse.
Merk: et tall eller et bokstav system kan brukes. - Utfør en roman tank test ved å følge trinn 3,1 til 3,6 for å få en Baseline atferdsdata stress respons.
- Etter den opprinnelige innspillingen, bruker du et nett for å umiddelbart fjerne den voksne fisken fra romanen tanken og plassere den i begeret legemidlene med narkotika eller kjøretøy, som beskrevet i trinn 4,2. Tillat den voksne å bo i begeret i 10 min.
Merk: Sørg for at nettet ikke berører vannet i kanner for å hindre krysskontaminering av legemidler. Sikre riktig dosering og administrasjonstid avhengig av stoffet som brukes. En 10 min behandling tid kan ikke fungere for alle rusmidler. - Etter behandling, bruk et nett for å fjerne den voksne fra begeret i trinn 4,5 og plasser den i et annet beger fylt med friskt system vann bare. Dette er den bleke perioden for å minimere ytterligere dosering under den andre romanen tank test. La den voksne holde seg i vaske begeret i ytterligere 10 minutter.
Merk: separate garn skal brukes for hver legemiddel tilstand for å forhindre uønsket kryss behandling med narkotika. Den bleke perioden kan hoppes over hvis eksperimentator ønsker. - Utfør romanen tank dykking test en gang til ved å fjerne den voksne fra begeret i forrige trinn, Legg den i en ny roman tank, og Følg trinn 3,5 til 3,6.
- Etter den andre romanen tank test, fjerne den enkelte i en egen Holding tank. Hell bort systemet vannet i den andre romanen tank og fyll den med friskt system vann til neste test. Dette trinnet hindrer krysskontaminering av ethvert legemiddel.
Merk: avhengig av halveringstiden av narkotika, bør friske kanner som inneholder narkotika gjøres hver 3 timer. For Buspirone, lage ferske løsninger hver 3 timer. I tillegg, etter notatet i trinn 3,8, bør forsøkene være randomisert mellom kontroller og narkotika behandlinger. - På slutten av alle forsøkene, returnere individer tilbake til fisken anlegget.
Merk: avhengig av type stoff som brukes, kan effekten av disse behandlingene på individer være langvarig. Bruk derfor ikke disse personene i andre eksperimenter.
5. video analyse
- Etter alle rettssaker, laste videofiler til sporing programvare av valget.
Merk: vi bruker vanligvis kommersielt tilgjengelig sporingsprogramvare, men flere fritt tilgjengelige programvarepakker kan brukes. Fremgangsmåten for å oppnå sporing kan variere i henhold til programvarepakken som brukes. - Ved hjelp av en stillbilde fra videoen, definere imaginære grenser rundt (i) hele romanen tanken Arena som er fylt med vann, og grenser rundt (II) den øverste tredjedel, (III) midtre tredjedel, og (IV) nederste tredjedel av tanken. Bruk disse til å etablere tid som fisken tilbrakte i hver del av romanen tank.
- Beregn x-y forskyvning per ramme for hver Arena definert i trinn 5,2.
- Definer øvre, midtre og nedre deler av tanken. Hver region bør være lik i størrelse. En kort metode for å bestemme disse regionene er å beregne lengden på tanken i y-retning, og dele dette med 3.
Merk: variasjoner til den generelle protokollen finnes. For eksempel bruker noen laboratorier halvdeler i stedet for tredjedeler14. - Bestem tiden brukt på hver Arena, avstanden, og hastigheten.
Merk: de fleste sporings pakker vil automatisk beregne disse for brukeren. Men hvis sporing programvaren ikke, disse kan beregnes enkelt fra x-y forskyvning verdier. For eksempel kan avstanden bestemmes ved hjelp av formelen:
og hastighet kan bestemmes etter formelen:
- Gjenta trinn 5,2 til 5,4 for å hente spor og målinger for alle forsøkene.
Merk: variasjoner i denne generelle protokollen
6. testing for normalitet
- Utfør statistikk før du fortsetter med å beregne statistiske forskjeller. Kontroller om dataene vanligvis distribueres ved hjelp av en Shapiro-Wilk-test.
- Hvis null hypotesen at dataene er normalt distribueres er avvist (dvs. dataene ikke følger en Gaussian distribusjon), utføre alle tester ved hjelp av ikke-parametriske tester. Hvis dataene derimot blir funnet å følge en normalfordeling, fortsetter du å bruke parametriske tester.
Merk: vi bruker kommersielt tilgjengelig programvare for å utføre statistikk; programmeringsspråket R kan imidlertid også brukes. En Shapiro-Wilk analyse kan utføres ved hjelp av R ' s Shapiro. test funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Undersøke stress i sebrafisk
For å undersøke stress atferd over tid i vill-type sebrafisk, testet vi voksen fisk fra AB belastningen24 i romanen tank test. AB voksne ble utsatt for protokollen som beskrevet ovenfor. Kort, fisken var gitt en 1-h acclimation periode inne en tank inne det opptreden rom. En person ble plassert i et beger for 10-min, og deretter plassert forsiktig i en ukjent tank (romanen tank) fylt med friskt system vann. Locomotor aktivitet ble registrert i 10-min, og sporing ble utført frakoblet ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare. Sammenligning av Locomotor aktivitet mellom første og siste minutt viste dramatiske forskjeller (figur 2A, B). Når først introdusert i tanken, fisk tilbrakte mesteparten av tiden i bunnen (figur 2B), men over tid, voksne hadde en gradvis økning i hvor mye tid brukt i toppen (figur 2B, C). Total varighet brukt på toppen i første minutt sammenlignet med siste minutt avslørte betydelige forskjeller (6,29 ± 8,21 s vs. 23,23 ± 9,02 s; sammenkoblet t-test, p < 0,05) (figur 2C). I motsetning til total distanse reist mellom første og siste minutt avslørte ingen vesentlige forskjeller (440,4 ± 110,3 cm vs. 405,5 ± 49,71 cm; sammenkoblet t-test, p = 0,375) (figur 2D). Fordi medfødt preferanse var forskjellig mellom første og siste minutt, og ikke avstand reist, tror vi at endringen i atferd representerer en stress respons, og ikke bare en endring i Locomotor aktivitet. Disse resultatene viser at sebrafisk viser en lett målbar medfødt stress respons. Denne tilnærmingen etablerer også et fundament for å sammenligne stress forskjeller mellom ulike grupper av dyr, og vurdere forskjellene i stress mellom dem.
Effekter av angstdempende narkotika på stress atferd i sebrafisk
Sebrafisk er et kraftig system for screening narkotika, siden anvendelsen av stoffet kan anvendes på ikke-invasiv måter ved å legge til vannet25,26,27. For å validere at bunnen bolig i sebrafisk representerer en medfødt stress respons, sammenlignet vi atferd i grupper av voksne sebrafisk testet før og etter eksponering for en angstdempende narkotika; som en kontroll, håndterte vi en separat av voksne på samme måte, men gjaldt bare kjøretøy (system vann) i stedet for narkotika. Vi brukte 5HT1a reseptor Agonistiske Buspirone, som ikke er et kontrollert stoff og er foreskrevet til menneskelige pasienter som lider av generalisert angst lidelse28. Buspirone har blitt validert for å forårsake reduksjon i atferds stress reaksjoner i ulike fisk og pattedyr modeller10,13,21,29,30, 31,32,33,34 . Som beskrevet i protokollen ble sebrafisk først tatt opp i romanen tank test, deretter Hentet og plassert i et beger med narkotika eller kjøretøy i 10 min. fisk ble deretter gitt en "vaske-out" periode, hvor de ble plassert i et nytt beger i 10 min , og deretter re-innspilt i romanen tank test (Figur 3A).
Analyse av Locomotor stier avslørte liten forskjell før og etter behandling for grupper av voksne eksponert for kjøretøy alene (Figur 3B). Til sammenligning tilbrakte voksne eksponert for Buspirone mye tid i toppen sammenlignet med de Locomotor banene til den samme fisken før legemiddel eksponeringen (Figur 3B, C). Kvantifisering av varigheten av tid brukt i toppen avslørte ingen vesentlige forskjeller mellom pre-og post-behandling i kontroll dyr (183,9 ± 90,46 s før kontra 113,8 ± 81,88 s etter; enveis ANOVA etterfulgt av Sidak ' s Multiple sammenligninger test, p = 0,4254), men dyr utsatt for Buspirone tilbrakte betydelig mer tid i toppen i forhold til pre-behandling, og kontrollere individer etter behandling (Buspirone: 201,4 ± 49,95 s før vs 552,2 ± 42,97 s etter; enveis ANOVA etterfulgt av Sidak flere sammenligninger test, p < 0,0001; Kontroll kontra Buspirone etter behandling: p < 0,0001.) (Figur 3C). For å undersøke om forskjellene skyldtes mindre bevegelse generelt, målte vi total tilbakelagt distanse. Disse dataene avslørte ingen signifikante forskjeller for noen av gruppene (4134 ± 601,9 cm før kontra 3471 ± 766 cm etter kontroll; Kruskal-Wallis test, p > 0,05; 3904 ± 301,3 cm før kontra 3644 ± 566,3 cm etter Buspirone; Kruskal-Wallis test, p > 0,05) (Figur 3D). Samlet disse dataene viser at bunnen bolig i voksen sebrafisk er et mål på medfødt stress, og etablere et fundament for videre farmakologiske eksperimenter i voksen sebrafisk.
Figur 1 . Diagram av romanen tank oppsett. (A) dimensjoner av 1,8 L trapesformet romanen tank sett fra innspillingen siden av tanken. (B) diagram av oppsettet, inkludert posisjoner av infrarødt lys, kamera, og barrierer som brukes for å minimere menneskelig interferens. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Undersøker medfødte stressresponser i vill-type sebrafisk. (A) representative svømme stier av en individuell voksen i romanen tank test i første minutt (venstre) og siste minutt (høyre) av en 10-min innspilling. Imaginære linjer som definerer de øverste, midterste og nederste sonene i tanken indikeres med stiplede linjer. (B) kvantifisering av total tid tilbringer i den øverste sonen for hvert minutt av 10-min innspilling. (C &Amp; D) Sammenligninger av den totale varigheten som er brukt i den øverste sonen (C) og total distanse (D) i det første og siste minuttet av alle forsøk. Sammenkoblede t-tester ble brukt til analyse siden dataene passerte Shapiro-Wilk-testen for normalitet. n = 5; *: p = 0,028. Feilfelt angir standard feil i gjennomsnittet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Undersøke virkningene av angstdempende narkotika på stress atferd. (A) skjematisk av eksperimentell flyt. (B) representative svømme stier før og etter behandling av en person fra en kontroll person behandlet med system vann bare, og en annen person behandlet med Buspirone i romanen tank test. Prikkede linjer definerer separasjon av topp, midtre og nedre soner av tanken. Grå spor representerer kontroll individet, og blå spor representerer den Buspirone personen. (C &Amp; D) Sammenligninger av total varighet brukt i øverste sone (C) og total distanse (D) mellom kontroll (Ctrl) og Buspirone (Busp) prøver. En test for normalitet ved hjelp av Shapiro-Wilk testen ble først gjort. Der testen for normalitet mislyktes, Kruskal-Wallis-test etterfulgt av Dunn ' s Multiple sammenligninger testen ble brukt (C); og hvis dataene passerte normalitet, enveis ANOVA etterfulgt av Sidak flere sammenligninger testen ble brukt til analyse (D). n = 5 for hver betingelse; : p = 0,001. Feilfelt angir standard feil i gjennomsnittet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sebrafisk viser en robust stress respons i en roman tank
Her beskriver vi en enkel atferdsdata tilnærming for å undersøke stressresponser i voksen sebrafisk, og validere tilnærmingen som et enkelt mål på stress ved hjelp av farmakologi.
Romanen tank test er en mye brukt test for å undersøke medfødte stress i sebrafisk og andre arter av fisk12,14,21,35,36, og sebrafisk har vist å være en kraftig modell for å undersøke de farmakologiske virkningene av angst-relaterte legemidler. Ligner på mennesker, disse studiene har vist at stoffer som Buspirone, nikotin, Fluoxetine, og skopolamin har angstdempende effekter i sebrafisk12,13,14,37. Videre, medikamenter som skopolamin som vanligvis ikke brukes til å behandle angst hos mennesker kan ha flere angstdempende effekter37. Drug skjermer demonstrere disse angstdempende effekter i sebrafisk kan lette studiet av bivirkninger og deres farmakologiske mekanismer. Videre har sebrafisk en sammenlignbar stress respons veien til mennesker, derav sammenkobling analysen med kvantifisering av utgivelsen av kortisol etter en stressor eller narkotikabehandling kan brukes til å validere atferdsmessige responser14. Til slutt ønsker vi å påpeke at denne analysen ikke er spesifikk for sebrafisk, og har også blitt utvidet til andre fiskearter som den meksikanske blind cavefish, Astyanax mexicanus21. Det er sannsynlig at analysen kan utvides til å cichlids38, mosquitofish39, killifish40, og andre Piscine systemer.
En viktig fordel med romanen tanken testen er dens økologiske relevans; som analysen tiltak medfødt preferanse for den nederste halvdelen av tanken, er responsen sannsynlig en som ville oppstå i naturen. Foruten romanen tank test, annet opptreden analyser det ha blitt anvendt inne annet modell organisere kan brukes å fremme godkjenne det opptreden trykk svaret, som en åpen åker test eller en lyset/mørk analysen41,42. Disse analysene er basert på tendensen for et dyr å følge sidene av arenaen (thigmotaxis), og preferanse for leting i mørket (scototaxis) etter å ha blitt utsatt for en stressende Cue42,43. I tillegg har elektrisk sjokk blitt brukt til å måle enten medfødt eller betinget frykt svar9,44,45, selv om den økologiske relevansen av denne tilnærmingen er uklart.
Når man vurderer en analyse for hans/hennes studie, er det viktig å ta hensyn til medfødte bias innen stammer eller arter. I tillegg til å opprettholde og redusere miljømessige svingninger i atferdsmessige analyser, holde den genetiske bakgrunnen av testen voksne konsistent vil være avgjørende siden forskningen har vist variasjon innenfor og mellom individer av samme genotype41 ,46. En omfattende gjennomgang av fordelene, ulemper, gyldigheten av hver felles atferdsdata analysen brukes til å studere angst, og også variasjoner i atferd innen felles wildtype linjer kan finnes andre steder41.
Sebrafisk som en modell for å undersøke stress
Sebrafisk er blitt en populær modell for å undersøke genetiske og neuronal trasé som modulere presis atferd47,48, og nylig utviklet hjernen Atlas tillate kartlegging nevroner regulere atferden med presisjon49 ,50,51,52,53. Tilnærmingen vi beskriver her for å måle medfødt angst er i stand til å utnytte kraftige genetiske og nevrale kretser verktøy i sebrafisk. To forutsigbare tilnærminger er avhengige av den store samlingen av muterte linjer og transgene driver linjer. Mutant linjer, for eksempel, vil lette etterforskere til å undersøke den rollen som presise gener har i modulerende stress. I tillegg har transgene Gal4/UAS og QF/QUAS systemet blitt mye brukt på sebrafisk54,55, og da krysset til UAS eller QUAS effektor linjer, funksjonen av presise neuronal kretser kan manipuleres og atferd Vurdert. Disse tilnærmingene gir et supplement til genetiske mutant linjer, og tillater etterforskning av hvor presise nevrale kretser bidra til stress.
Novel teknikker for å undersøke neural aktivitet kan være fullt integrert med denne analysen. Kvantifisering av c-Fos mRNA eller protein er mye brukt for å undersøke neuronal aktivitet56. Dette genet er en umiddelbar tidlig genet, hvis transkripsjon er aktivert ved neuronal aktivitet. Nyere tilnærminger basert på lignende metodikk har blitt utviklet. For eksempel ble den ekstracellulære-regulerte kinase (ERK) nylig utviklet for å undersøke neuronal aktivitet i sebrafisk50. ERK-proteinet finnes i nesten alle celler i sentralnervesystemet. Ved neuronal aktivering, ERK peptid bli fosforylert. Videre har pålitelige antistoffer for både un-fosforylert ERK (total ERK, tERK) og fosforylert ERK (pERK) blitt utviklet og fungerer bra i sebrafisk. Således, ved co-merking med antistoffer som er spesifikke for tERK og pERK, neuronal aktivitet kan måles pålitelig. Ved hjelp av denne tilnærmingen, voksne som betydelig vise mer Bottom bolig i romanen tanken testen kan fjernes etter opptak, beiset for enten c-Fos eller tERK/pERK, og resulterende hjernen seksjoner avbildet.
Til sammen bør disse tilnærmingene lette en facile tilnærming for å dissekere den genetiske og neuronal mekanismer underliggende stress i sebrafisk. Videre, på grunn av den høye bevaring av genetiske og neuronal trasé i sebrafisk og pattedyr, forventer vi at disse metodene for å avdekke bevarte mekanismer underliggende stress atferd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende eller økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Jupiter Life Science Initiative ved Florida Atlantic University til ERD og ACK. Dette arbeidet ble også støttet av tilskudd R21NS105071 (tildelt ACK og ERD) og R15MH118625 (tildelt ERD) fra National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics. | ||
| Infrared filter | Edmund Optics | ||
| Video Acquisition Program | Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set. | ||
| Infrared LED lights | |||
| Assay tank | Aquaneering | Part number ZT180 | Size: M3 1.8 liter |
| Stand and clamp, or standard tripod for camera | |||
| 250mL beaker | |||
| Tracking software | We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology | ||
| Buspirone chloride | Sigma-Aldrich | B7148 | |
| Randomized trial generator | We use the RANDBETWEEN function in Microsoft Excel |
References
- McEwen, B. S. Stress, adaptation, and disease. Allostasis and allostatic load. Annals of the New York Academy of Sciences. 840, 33-44 (1998).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Facchinello, N., et al. Nr3c1 null mutant zebrafish are viable and reveal DNA-binding-independent activities of the glucocorticoid receptor. Scientific Reports. 7 (4371), (2017).
- Ziv, L., et al. An affective disorder in zebrafish with mutation of the glucocorticoid receptor. Molecular Psychiatry. , (2013).
- Grone, B. P., Maruska, K. P. Divergent evolution of two corticotropin-releasing hormone (CRH) genes in teleost fishes. Frontiers in Neuroscience. , (2015).
- Fuller, P. J., Lim-Tio, S. S., Brennan, F. E. Specificity in mineralocorticoid versus glucocorticoid action. Kidney International. , (2000).
- Zhdanova, I. V. Sleep and its regulation in zebrafish. Reviews in the Neurosciences. 22 (1), 27-36 (2011).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. , (2001).
- Duboué, E. R. E. R., Hong, E., Eldred, K. C. K. C., Halpern, M. E. M. E. Left Habenular Activity Attenuates Fear Responses in Larval Zebrafish. Current Biology. 27 (14), 2154-2162 (2017).
- Facchin, L., Duboue, E. R., Halpern, M. E. Disruption of Epithalamic Left-Right Asymmetry Increases Anxiety in Zebrafish. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15847-15859 (2015).
- Øverli, Ø, Sørensen, C., Nilsson, G. E. Behavioral indicators of stress-coping style in rainbow trout: Do males and females react differently to novelty. Physiology and Behavior. , (2006).
- Levin, E. D., Bencan, Z., Cerutti, D. T. Anxiolytic effects of nicotine in zebrafish. Physiology & behavior. 90 (1), 54-58 (2007).
- Bencan, Z., Sledge, D., Levin, E. D. Buspirone, chlordiazepoxide and diazepam effects in a zebrafish model of anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 94 (1), 75-80 (2009).
- Cachat, J., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nature Protocols. 5 (11), 1786-1799 (2010).
- Mathuru, A. S., et al. Chondroitin fragments are odorants that trigger fear behavior in fish. Current Biology. , (2012).
- Alsop, D., Vijayan, M. The zebrafish stress axis: Molecular fallout from the teleost-specific genome duplication event. General and Comparative Endocrinology. , (2009).
- Evans, A. N., Liu, Y., MacGregor, R., Huang, V., Aguilera, G. Regulation of Hypothalamic Corticotropin-Releasing Hormone Transcription by Elevated Glucocorticoids. Molecular Endocrinology. , (2013).
- Fenoglio, K. A., Brunson, K. L., Avishai-Eliner, S., Chen, Y., Baram, T. Z. Region-specific onset of handling-induced changes in corticotropin- releasing factor and glucocorticoid receptor expression. Endocrinology. , (2004).
- Liposits, Z., et al. Ultrastructural localization of glucocorticoid receptor (GR) in hypothalamic paraventricular neurons synthesizing corticotropin releasing factor (CRF). Histochemistry. , (1987).
- Facchin, L., Duboué, E. R., Halpern, M. E. Disruption of epithalamic left-right asymmetry increases anxiety in Zebrafish. Journal of Neuroscience. 35 (48), (2015).
- Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. , (2018).
- Wong, K., et al. Analyzing habituation responses to novelty in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 208 (2), 450-457 (2010).
- Matsunaga, W., Watanabe, E. Habituation of medaka (Oryzias latipes) demonstrated by open-field testing. Behavioural Processes. 85 (2), 142-150 (2010).
- Walker, C. Chapter 3 Haploid Screens and Gamma-Ray Mutagenesis. Methods in Cell Biology. , (1998).
- Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science. 327, New York, N.Y. 348-351 (2010).
- Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. Small molecule screening in zebrafish. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2010).
- Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39 (3), 255-261 (2006).
- Gammans, R. E., et al. Use of buspirone in patients with generalized anxiety disorder and coexisting depressive symptoms. A meta-analysis of eight randomized, controlled studies. Neuropsychobiology. 25 (4), 193-201 (1992).
- Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. The immediate and the delayed effects of buspirone on zebrafish (Danio rerio) in an open field test: A 3-D approach. Behavioural Brain Research. , (2012).
- Gebauer, D. L., et al. Effects of anxiolytics in zebrafish: Similarities and differences between benzodiazepines, buspirone and ethanol. Pharmacology Biochemistry and Behavior. , (2011).
- Maximino, C., et al. Fingerprinting of psychoactive drugs in zebrafish anxiety-like behaviors. PLoS ONE. , (2014).
- Horváth, J., Barkóczi, B., Müller, G., Szegedi, V. Anxious and nonanxious mice show similar hippocampal sensory evoked oscillations under urethane anesthesia: Difference in the effect of buspirone. Neural Plasticity. , (2015).
- Costall, B., Kelly, M. E., Naylor, R. J., Onaivi, E. S. Actions of buspirone in a putative model of anxiety in the mouse. Pharm Pharmacol. 40 (7), 494-500 (1988).
- Barros, M., Mello, E. L., Huston, J. P., Tomaz, C. Behavioral effects of buspirone in the marmoset employing a predator confrontation test of fear and anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. , (2001).
- Heinen-Kay, J. L., et al. Predicting multifarious behavioural divergence in the wild. Animal Behaviour. 121, 3-10 (2016).
- Thompson, R. R. J., Paul, E. S., Radford, A. N., Purser, J., Mendl, M. Routine handling methods affect behaviour of three-spined sticklebacks in a novel test of anxiety. Behavioural Brain Research. 306, 26-35 (2016).
- Hamilton, T. J., et al. Establishing zebrafish as a model to study the anxiolytic effects of scopolamine. Scientific Reports. , (2017).
- York, R. A., Fernald, R. D. The Repeated Evolution of Behavior. Frontiers in Ecology and Evolution. 4, 143 (2017).
- Jakka, N. M., Rao, T. G., Rao, J. V. Locomotor behavioral response of mosquitofish (Gambusia affinis) to subacute mercury stress monitored by video tracking system. Drug and Chemical Toxicology. , (2007).
- Hu, C. K., Brunet, A. The African turquoise killifish: A research organism to study vertebrate aging and diapause. Aging Cell. , (2018).
- Maximino, C., et al. Measuring anxiety in zebrafish: A critical review. Behavioural Brain Research. 214 (2), 157-171 (2010).
- Maximino, C., Marques de Brito, T., Dias, C. A. G., Gouveia, A., Morato, S. Scototaxis as anxiety-like behavior in fish. Nature protocols. 5 (2), 209-216 (2010).
- Godwin, J., Sawyer, S., Perrin, F., Oxendine, S., Kezios, Z. Adapting the Open Field Test to assess anxiety related behavior in zebrafish. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. , 181-189 (2012).
- Agetsuma, M., et al. The habenula is crucial for experience-dependent modification of fear responses in zebrafish. Nature Neuroscience. 13 (11), 1354-1356 (2010).
- Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish. Learning and Memory. , (2012).
- Baker, M. R., Goodman, A. C., Santo, J. B., Wong, R. Y. Repeatability and reliability of exploratory behavior in proactive and reactive zebrafish, Danio rerio. Scientific Reports. , (2018).
- Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. , 7 (2013).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
- Marquart, G. D., et al. A 3D Searchable Database of Transgenic Zebrafish Gal4 and Cre Lines for Functional Neuroanatomy Studies. Frontiers in Neural Circuits. , (2015).
- Randlett, O., et al. Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas. Nature Methods. 12 (11), 1039-1046 (2015).
- Gupta, T., et al. Morphometric analysis and neuroanatomical mapping of the zebrafish brain. Methods. 1046 (18), 30011-30012 (2018).
- Marquart, G. D., et al. High-precision registration between zebrafish brain atlases using symmetric diffeomorphic normalization. GigaScience. , (2017).
- Ronneberger, O., et al. ViBE-Z: A framework for 3D virtual colocalization analysis in zebrafish larval brains. Nature Methods. , (2012).
- Subedi, A., et al. Adoption of the Q transcriptional regulatory system for zebrafish transgenesis. Methods. 66 (3), 433-440 (2014).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Chatterjee, D., Tran, S., Shams, S., Gerlai, R. A Simple Method for Immunohistochemical Staining of Zebrafish Brain Sections for c-fos Protein Expression. Zebrafish. , (2015).
