Summary
原発の腺房細胞分離、蛋白質の表現や活動の変調、文化、およびダウン ストリーム アプリケーションは ex の豊富有用腺房の上皮化生 (ADM)、膵臓癌の開発の初期イベントに関する検討。
Abstract
膵炎と膵臓癌の開発の初期に腺房細胞の上皮細胞への分化は、さらなる研究を必要とする重要なプロセスです。メカニズムを理解するには、ex vivo 3次元培養とプライマリ腺房細胞上皮細胞への分化調節腺管上皮化生 (ADM) は、他のシステムに比べて多くの利点を提供しています。本技術は、タンパク質発現の調節は簡単かつ迅速、分離、刺激や、ウイルスに感染し ADM プロセスを調査するプライマリ腺房細胞の培養を開始 1 日だけを必要とします。基底膜マトリックス、播種コラーゲン腺房細胞クラスターの私細胞外マトリックスを使用するとは異なり操作前に自分の腺房のアイデンティティを保持する腺房細胞ができます。これは重要な司令官の誘導するさまざまなコンポーネントの貢献をテストするときサイトカインやその他の異所萌出へ投与の要因の効果はこのテクニックを通してテストであるだけでなく、共通の突然変異や増加蛋白質の表現、蛋白質の表現のノックダウンの貢献はのウイルス感染によるテストプライマリ腺房細胞は、アデノ ウイルスやレンチ ウイルスのベクトルを使用して。さらに、細胞は、コラーゲンまたはエンドポイントで基底膜マトリックスから再分離できるので、蛋白質の表現の分析します。
Introduction
腺房の上皮化生 (ADM) は、膵炎とさらに追究する必要があります膵臓癌開発1の運転キー プロセス中に保護メカニズムです。膵臓癌の場合3の 90% に存在する発癌性のKRAS変異が戻って、腺房表現型4,5,への分化を防ぐため炎症誘起 ADM はリバーシブル2が、6。 養殖と 3 d 培養上皮細胞にプライマリ腺房細胞の差別化は、生体内で調査することは困難である ADM プロセスを制御する分子機構の研究。このような生体は、ADM、そのドライバーとその制御因子のリアルタイム可視化を有効にします。その下流のシグナル伝達経路の追究と同様、ADM プロセスのいくつかのドライバー確認されています。 またはメソッドを説明したことを確認使用するここ。ADM TGF-α 変換成長因子誘導が含まれます-mmp-7 (マトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ-7) の発現と RANTES (発現し、分泌される; また知られている正常な T 細胞活性化の制御と同様、ノッチ7の活性化を介したケモカイン リガンド 5 または CCL5) として、tnf α (腫瘍壊死因子 α)-NF-κ B (核因子 κ B)8の活性化を介して ADM を誘導します。ADM の追加調停は発癌 KRas9,10, ADM egfr (上皮成長因子受容体) 遺伝子の発現の増加過程とその配位子、EGF (強化酸化ストレスの上昇を引き起こす表皮成長因子) と TGF α11。
膵癌細胞株の in vitro 試験の共通は、一次電池文化は、多くの利点を提供しています。たとえば、非トランスジェニック マウスまたはKrasG12Dなど、開始遺伝子変異マウスからプライマリ腺房細胞は細胞数と制御遺伝子を持っているので ADM の初期イベントを研究するための最も適切なモデルを膵臓癌の開発の初期段階に存在する知られています。これは対照的に複数の変異を持つ多くの膵臓癌細胞株に通路番号12に基づく表現を変化させると。さらに、このような手段によって識別されるシグナル伝達経路は、動物実験によって検証されています。プライマリ腺房細胞を使用しての 1 つの警告は、典型的な癌細胞株はできるだけトランスフェクションできないのことです。
メソッドをここは、腺房細胞分離、覚醒剤を追加または、アデノ ウイルスやレンチ ウイルス感染だけでなく、さらなる分析のエンドポイントで細胞の再分離経由タンパク質の発現を調節することにより ADM を模した 3 D の文化の技術を詳しく説明します。
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Protocol
すべての動物の仕事は、メイヨー クリニック IACUC によって承認されました。
1. 材料、ソリューション、および 3 次元行列の準備拠点します。
- 76 の mm の正方形で 500 μ m と 76 mm 105 μ m のポリプロピレン メッシュをカットします。半分より小さい 2 つ折り正方形を作成するために各正方形を折る。場所 1 つ 500 μ m と 1 つ 105 μ m メッシュ正方形のオートクレーブ袋に。
- オートクレーブ ポリプロピレン メッシュ ハサミ、鉗子の 2 つのペアと同様、正方形。
-
10 x Waymouth の液を 100 mL を作る。(DI) の脱イオン水 50 mL に 1 バイアル (14 g) Waymouth の粉末をかき混ぜるし、解散したときは、炭酸水素ナトリウム 7.5% (75 g/L) の 30 mL を加えます。水を 100 mL の DI を使用する最終巻を持参し、フィルター殺菌します。
- 4 ° C でコラーゲン ・ ゲルを準備する使用ストア 10 x Waymouth のメディアと 1 x Waymouth。ときにフォームの沈殿物を破棄します。
- 膵臓あたり Waymouth の完全なメディア x 1 の 50 mL を 40 mg/mL 大豆トリプシンインヒビターの 125 μ L、デキサメタゾン 4 mg/mL 12.5 μ 牛胎児血清 (FBS) 500 μ L を追加してください。ろ過滅菌し、48 時間以内に使用します。
-
コラーゲンや基底膜マトリックスを用いた 3 次元行列脚を準備 (製品情報材料の表を参照)。ベースをピペッティング時氷の上プレートを置き、泡を避けるため、完全なカバレッジを確保するため各ウェルのボリュームを分注直後後、プレートを回転させます。
- ティッシュ文化フードの氷に次のコンポーネントを混合することによってコラーゲン ベースを作成: 私がラット型の 5.5 mL 尾コラーゲン、Waymouth のメディア x 10 の 550 μ L および 0.34 M NaOH (フィルタ リング) の 366.6 μ L。
注:これ 1 つ 24 ウェル、12 ウェルまたは 6 ウェル プレート用コラーゲン拠点を作るに十分なソリューションです。1 つのプレートは 1 膵臓の腺房の分離のために十分です。 - 次のボリュームを使用して、コラーゲン ベース プレート: 80 μ L (8 よくガラス スライド)、200 μ L (24 ウェル プレート)、400 μ L (12 ウェル プレート)、または 800 μ L (6 ウェル プレート)。
- 基底膜マトリックス拠点、ピペット、追加のコンポーネントなし行列。各ウェルの次のボリュームを使用: 50 μ L (8 よくガラス スライド)、120 μ L (24 ウェル プレート)、240 μ L (12 ウェル プレート)、または 600 μ L (6 ウェル プレート)。
- これらの拠点 (ステップ 4) の上に埋め込まれた細胞とマトリックスの 2 番目の層を作成する前にセル文化のインキュベーター (37 ° C、5% CO2) で少なくとも 30 分を固める拠点をしましょう。
- ティッシュ文化フードの氷に次のコンポーネントを混合することによってコラーゲン ベースを作成: 私がラット型の 5.5 mL 尾コラーゲン、Waymouth のメディア x 10 の 550 μ L および 0.34 M NaOH (フィルタ リング) の 366.6 μ L。
- 腺房の分離のための準備で 1 つ 600 mL ビーカー、3 つの 50 mL チューブ、ハサミ、鉗子、オートクレーブ ペアと 3 つの重量を量るボートとボンネットの下の氷のバケツ オートクレーブのペアを保ちます。100 x 10 mL を入れて 2 つの重量を量るボートのそれぞれと (手順 1.8.2 と 2.1.4 用) 50 mL のチューブで最終 10 mL を維持するペニシリン-ストレプトマイシンの 300 μ L で HBSS の 30 mL を加えます。
- HBSS + 5 の 40 mL を作る %fbs、HBSS の 20 mL + 30%、FBS と HBSS で 2 mg/mL コラゲナーゼの 5 mL。濾過 (0.22 μ m 孔) により、コラゲナーゼを殺菌し、室温で維持します。氷上 HBSS ソリューションのそれぞれを維持します。
-
膵臓解剖実験室ベンチで行うことがでくためのワークスペースを作成します。
- 場所ポリスチレン蓋と一緒に、テーブルの上の吸収パッドは、箔で覆われて。ペーパー タオル、箔の上に 4 ピンを入れます。
- 郭清のワークスペースの届く範囲次の各号を保つ: 焼却バッグ、オートクレーブはさみと鉗子のセット、70% エタノールをスプレー ボトル (50 mL のチューブ ステップ 1.6 からペニシリン-ストレプトマイシンを含む HBSS) と氷バケット。
- 4 ° C と 37 ° c. にシェーカーに遠心分離機を設定します。
2. 腺房細胞分離
-
CO2の誘導を介してマウスを犠牲にし、頚部転位を実行します。すぐに膵臓を解剖します。膵臓、最初ピンを解剖するには、ポリスチレン蓋にマウスの足尾は、研究者に直面しているようなマウスの方向し、70% エタノールで腹部をスプレーします。
注:代表の結果で使用されているマウスは C57BL/6 背景と 12 週間の古い非組み換え女性をだった。マウスの選択は、ディスカッション セクションで詳しく説明します。- オートクレーブ ハサミ、鉗子のセットを使用すると、正中線に鉗子で毛皮/皮膚を持ち上げ、はさみを使って、毛皮やダイヤフラム/胸部領域に尿道の開口部から皮膚切開を行います。
- 毛皮/皮膚を切りなど、左と右に追加切開をする腹腔内の明確なビューを作成する距離。(真ん中と右、左)、腹膜の内側にカットしに行われた毛皮の皮、臓器から引き抜きます。
- 鉗子、腸を持ち上げて、ピンクの色で、光である膵臓のスペースを作成するマウスの左側にそれを置くと暗い赤の楕円形は、脾臓に接続されています。膵臓の組織は柔らかいスポンジ状の風合いによって区別されます。胃に沿って実行し、腸と絡み合っている膵臓をカットします。
- 膵臓から脾臓を区切ります。1 x ペニシリン-ストレプトマイシンと HBSS の 10 mL を含む 50 mL のチューブで膵臓を置くし、層流フードにこれを持ってくださいします。
注:プロトコルの残りの手順には、層流フードの利用の滅菌技術を行う必要があります。
- 膵臓を注ぎ、空にペニシリン-ストレプトマイシン) (HBSS ボートの重さし、それを旋回で膵臓を洗って、鉗子を使用しています。その後、移動 2 番目の鉗子で膵臓 HBSS (ペニシリン-ストレプトマイシン) を含むボートの重量を量る。もう一度、旋回で膵臓を洗います。
-
(ペニシリン-ストレプトマイシン) と第 3 回 HBSS に膵臓を移動-ボートの重量を含むと 5 mm 以下の小さな断片に膵臓を切断を開始します。次に、空の 50 mL チューブに膵臓部分と HBSS を注ぐ。
- これを行うには、するのにには、重量ボートを tipped されている、液体に膵臓部分を移動するのに鉗子を使用します。すべてのピースが重量を量るボートに接続されていない一度を注ぐ。鉗子で残りの部分をピックアップし、ペニシリン-ストレプトマイシン HBSS で膵を含む 50 mL のチューブで鉗子を洗ってください。
- 4 ° C で 2 分間 931 × gで遠心分離機、5 mL のピペットでオフそれをピペッティングによる、HBSS (と浮かんでいる脂肪) を取り外します。
- 膵臓にコラゲナーゼ (1.7 の手順で HBSS で希釈) 5 mL を追加します。プラスチック パラフィン フィルムで 50 mL のチューブをラップすることによって密閉ふたを確保し、37 ° C で 20 分 220 rpm で揺れインキュベーターに配置
注:前述の議論で、コラゲナーゼの消化時間が異なる場合があります。インキュベーションの終わりには、組織の大部分が残っていないする必要があります。 - 解離を停止するには、氷の上膵臓を含むチューブを置き、冷たい HBSS + 5 %5 mL を加える FBS。4 ° C をクリックし、5 mL のピペットを使用して上澄みをピペットで 2 分間 931 × gで遠心分離機します。
- HBSS + 5 %fbs と 931 x gで 4 ° C で 2 分間遠心の 10 mL で再懸濁しますピペット 5 mL ピペットを使用して上清をオフし、HBSS + 5% の別の 10 mL でこの手順を繰り返します FBS。
- HBSS + 5 %5 mL で再懸濁します FBS と、P1000 を使用して、500 μ m メッシュ使用時に 50 mL のチューブに 1 mL を転送します。HBSS + 5% の追加 5 mL を追加メッシュを介して任意の残りの膵臓の細胞を洗浄する P1000 でメッシュを FBS。
- 細胞懸濁液 500 μ m メッシュから 105 μ m メッシュをピペット 1 ml を一度に入れる、P1000 を使用して。次に、優しく HBSS + 30% を含むチューブに細胞懸濁液をピペット FBS。その下に細胞懸濁液の層を形成します。遠心分離の時にペレットを形成、腺房細胞に沈むでしょう。
-
233 x gで 4 ° C で 2 分間遠心上澄みを除去し、Waymouth の完全なメディア × 1 でペレットを再懸濁します。
- コラーゲンまたは基底膜マトリックスのセルの埋込みに直接進む場合は、膵臓あたり 7 mL のボリュームで再懸濁します。アデノ ウイルスやレンチ ウイルス感染に進む場合は、膵臓あたり 4 mL に再懸濁します。
3. ウイルス感染
-
1 膵臓が 2 つのウイルス感染のため、(コントロールと実験により、null と cre など)、2 つの 35 mm プレートの蓋の間細胞懸濁液を分割します。プレートのふたを使用して懸濁液および後で最終的な基板上にしたがって簡単運動における感染症のことができます。
- ウイルスを操作する場合は、少なくとも 15 分間 10% の漂白剤のすべて使用されるピペット チップを浸します。
注:35 mm プレートと 4 mL ボリュームの使用率は、8 および 16 週齢の間非トランスジェニック マウスから細胞に適しています。プレート サイズとボリュームの小さいまたは大きい膵動物を調整する必要があります。
- ウイルスを操作する場合は、少なくとも 15 分間 10% の漂白剤のすべて使用されるピペット チップを浸します。
- アデノ ウイルス感染症のウイルスを追加 (少なくとも 10 の力価を持つ7 TU/mL) それぞれの蓋に縮尺希釈でプレートし、(図 2、GFP アデノ ウイルス) を渦します。細胞文化のインキュベーター (37 ° C、5% CO2) でプレートを配置し 1 h. 続行インキュベーションのさらに 2 時間 15 分ごとを旋回し、コラーゲンや基底膜マトリックス内のセルの埋込みに進みます。
- ボンネットのウイルスの作業を完了すると、少なくとも 15 分間 10% の漂白剤のフードですべてのコンポーネントを浸すし、70% のエタノールを使用して漂白剤を徹底的に掃除します。
4. コラーゲンまたは基底膜マトリックスのセルの埋込み
- 7 mL を組み合わせることで氷の上にコラーゲン ・ ゲル型ラット尾コラーゲン (3.3 mg/mL)、Waymouth のメディア x 10 の 700 μ L、0.34 μ 466.6 M NaOH。
-
コラーゲンのゲル、細胞の懸濁液の平等なボリュームを取って、軽く混ぜます。刺激または抑制剤を追加している場合、コラーゲン細胞懸濁液と組み合わせます。時 (1.5.3 のステップから板); 1 つの井戸をプレートします。氷の上プレートを維持する、コラーゲン細胞層を均等に分散させる旋回します。
- 各ウェル、ピペットで移しなさい次にコラーゲン細胞懸濁液量: 200 μ L (8 よくガラス スライド)、500 μ L (24 ウェル プレート)、1000 μ L (12 ウェル プレート)、または 2000年 μ L (6 ウェル プレート)。ADM は TGF α 刺激を介して誘導されることに注意してください (50 ng/mL)図2。
- 基底膜マトリックス内のセルの埋込み、1 つ部分基底膜マトリックス 2 パーツにミックスすると、細胞懸濁液。コラーゲンと同様氷の上プレートと同様に、マトリックス細胞懸濁液を保ちます。1 つピペット 4.2.1 配分も旋回で同じボリュームを使用する時にも。
- 30 分間を固めるし、Waymouth の刺激または抑制剤 (図 2使用 TGF α 50 ng/ml) と完全なメディア x 1 を追加する (37 ° C、5% CO2) 細胞文化のインキュベーターでプレートを配置します。次の日、一日おきに、(で刺激や阻害剤) は、メディアを変更します。刺激によって、3 日目と 5 日目の ADM を観察できます。
5. コラーゲンや基底膜マトリックスから細胞を収穫
- コラーゲンの細胞を収穫するために必要な次の資料を収集: HBSS で 40 mL の冷たい HBSS の寒さの PBS、2 つのへら、2 つの 50 mL チューブと氷の 31 mL で希釈した 1 mg/mL コラゲナーゼの 30 mL。2 つ以上の培養条件 (各条件はプレートの 1/2) を比較する場合は、ヘラ、チューブおよびソリューションの量数を調節します。遠心分離機を 4 ° C に設定し、揺れのインキュベーターを 37 ° C に設定
- メディアを取り出し、ヘラを使用して埋め込まれた細胞とコラーゲン ディスクを削除します。各条件は、ディスクを入れて、別の 50 mL のチューブを空にします。
- 各 50 mL チューブに HBSS で 1 mg/mL コラゲナーゼの 10 mL を追加します。プラスチック パラフィン フィルム チューブをラップし、37 ° C まで 45 分 225 rpm で振とうインキュベーターに入れてください。消化を監視し、これ以上目に見えるコラーゲンがあるときにチューブを削除します。
- 最小減速と 2 分のための 4 ° C で 233 × gで遠心分離機します。上清を脱ぐし、チューブあたり 5 mL コラゲナーゼ溶液で再懸濁します。225 rpm で 10 分間または目に見えるコラーゲンがなくなるまででインキュベーターを揺れ 37 ° C で消化します。
-
冷たい HBSS の 5 mL を追加し、最低限の減速で 4 ° C で 2 分間 233 × gで遠心分離後、消化を停止します。
- 冷たい HBSS の 15 mL で再懸濁します、再び最小減速 4 ° C で 2 分間 233 × gで遠心分離機します。手順を繰り返します。
- 1 mL の PBS でペレットを再懸濁します、1.5 mL チューブに移動します。最低限の減速で 4 ° C で 2 分間 233 x gでスイング バケツに遠心分離機します。上澄みとスナップ-凍結液体窒素でまたはドライアイスで削除します。
注:細胞ペレットは、-70 ° C で保存またはダウン ストリーム アプリケーションですぐに使用できます。 - 氷の上の 50 mL チューブに各ウェルからメディアをピペットで移しなさい基底膜マトリックスに埋め込まれた細胞を収穫。各ウェルに基底膜マトリックス回復ソリューションを追加し、50 mL のチューブに細胞ゲル混合物をこすり。
注:各井戸は次のように追加する基底膜マトリックス復旧ソリューションの量: 150 μ L (8 よくガラス スライド)、420 μ L (24 ウェル プレート)、845 μ L (12 ウェル プレート)、2,000 μ L (6 ウェル プレート)。 - 各 50 mL のチューブに、リンスを追加する基底膜マトリックス リカバリソリューションでよく 2 回すすいでください。
注:各リンスの基底膜マトリックス リカバリ ・ ソリューションの量は次のように: 150 μ L (8 よくガラス スライド)、420 μ L (24 ウェル プレート)、845 μ L (12 ウェル プレート)、2,000 μ L (6 ウェル プレート)。 - 基底膜マトリックスを溶解して次の 4 ° C で 5 分間 300 × gで遠心分離まで 1 h、または氷の上管をまま上澄みを除去し、冷 PBS (1.5 mL チューブに転送可能性があります細胞ペレットが必要な場合) 1 mL にペレットを再懸濁します。
- 3,500 x gで 4 ° C で 3 分間遠心上澄みを除去し、どちらかのスナップイン細胞ペレットを凍結または換散バッファーを追加し、下流のアプリケーションに直接進みます。
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Representative Results
本プロトコルの完成が 1 日内で発生し、刺激、ADM は 3-5 日で見られます。図 1は、最初の日に手順 1 ~ 4 を完了するというメソッドのシーケンスを示しています。これはコラーゲンや基底膜マトリックスの準備、腺房の分離、ウイルス感染、埋込みを含まれます。TGF-α など、受ける刺激が必要私コラーゲン内腺房細胞基底膜マトリックスは、ADM を誘導する中、管細胞への分化。1 日目、コラーゲンや基底膜マトリックス内のセルは、ブドウのような丸い外観を持っているし、感染効率をチェックすることができます蛍光蛋白質を発現ベクターを使用して、ウイルス感染を利用する場合。コラーゲンで細胞が形成時に埋込み、1、3、および 5 の日に変更されているメディアで補助食品として刺激を与えられた場合 5 日されるダクト。基底膜マトリックスに埋め込まれた細胞は、刺激のない状態でダクトを形成、図 2に見られるように刺激に大きなダクトが形成されます。
図 1: マウスのプライマリ腺房細胞を分離、タンパク質の発現を調節するおよび/または腺管上皮化生を刺激しコラーゲンや基底膜マトリックスに細胞を埋め込む手順の概略図。ワークフローには、膵臓、消化、細胞ろ過の郭清を含む腺房細胞の分離が含まれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: アデノ ウイルス感染症と TGF α 刺激後コラーゲンや基底膜マトリックス内メッキ プライマリ腺房細胞の代表の結果。非トランスジェニック マウスのプライマリ腺房細胞 GFP アデノ ウイルスに感染していたか基底膜マトリックス、コラーゲンに埋め込まれた、TGF α 有無を刺激 (50 ng/mL)。二十四時間 GFP アデノ ウイルスに感染後、撮影感染効率を表示します。感染、5 日後に、画像は、TGF α 有無コラーゲンまたは基底膜マトリックスの刺激細胞の違いを示します。ダクトのような構造は、白の矢印で示されます、スケール バーを表す x/0.3 EC 計画 Neofluar 10 M27 目的と共焦点顕微鏡を用いた 50 μ m の範囲の画像が得られました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
分離、感染、およびプライマリ腺房細胞のメッキのための時間の比較的短い時間は、この方法の利点です。対照的に、少し実践的な時間が必要ですが植副産物から腺房細胞を培養、腺房細胞13の副産物に 7 日ほどかかります。腺房分離14代替プロトコル ノート腺房細胞を取得する非常に簡単な方法しかし、EGF は、腺房細胞がそのプロトコルを使用して分離されたとき生きている維持に不可欠なコンポーネントです。EGF は、腺房細胞上皮細胞への分化を刺激する、のでメソッドはここで、文化の ADM 刺激のコンポーネントを必要としないは誘導のメカニズムや司令官の規則を勉強するほうがこの方法では腺房細胞アイデンティティ コラーゲン培養上皮細胞への分化誘導刺激しない限り維持されます。また、初代培養細胞株の難しさは、ウイルス感染によって蛋白質の表現を操作することで克服できます。
この手順では、adm、明視野観察や蛍光顕微鏡を介して発生することが誘導管構造の可視化による直接の研究を提供しています。イメージング アプリケーション、チャンバー スライド (材料の表に記載されている) が最高です。4% のパラホルムアルデヒドの 37 ° C で 15 分間固定は不穏な管構造を持たない基底膜マトリックスに埋め込まれたセルを修正します。この潜伏中に基底膜マトリックスはゆがみし、パラホルムアルデヒドをオフ優しく戻ことができます。埋め込まれたコラーゲン細胞の螢光抗体は、追加プロトコル15,16内で詳しく説明します。西部のしみ、qPCR、蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えなど実験の端点に関わるシグナル機構の解析のため他のアプリケーション。膵臓の 6 分の 1 は西部のしみまたは qPCR を介して 1 つのサンプルの分析のための十分な材料です。
このプロトコルの制限は、その長所と短所をありそれぞれコラーゲンや基底膜マトリックスの使用から生じる。刺激を与えられている場合、コラーゲンの細胞の埋込みはダクトを作り出すのみ、基底膜マトリックス埋込み追加刺激のないダクトが生成されます。しかし、基底膜マトリックスの管サイズ、測定可能な出力です。追加の制限は、遺伝子の発現に影響を与える可能性があります手順 5 で収穫の手順に必要な時間です。この制限は、固定時間が、qPCR または西部のしみの分析のための収穫時期のよりもかなり少ない蛍光抗体法を用いてウェスタンブロッティングから得られた結果を確認することによって軽減できます。
アデノ ウイルス感染症に加えてレンチ ウイルス感染は一次電池で使用できます。レンチ ウイルス感染、6 μ G/ml ウイルス感染エンハンサー試薬を追加 (材料の表参照) セルと優しく渦巻き模様のプレート。その後、レンチを追加 (少なくとも 10 の価と7 TU/mL) 縮尺希釈ともう一度、優しく渦します。3-5 h (37 ° C、5% CO2) インキュベートし、コラーゲンや基底膜マトリックス内のセルの埋込みに進みます。興味のプラスミドを持つレンチ ウイルスを生成するには、材料の表に記載されているレンチ ウイルス包装ミックスを使用します。
それ以上の変更は、 KrasG12Dを発現するマウスから細胞の分離を含めることができます。既にある ADM とパニン ・病変を有する線維化領域は、これらのマウスはコラゲナーゼの消化力がかかります。注意してください重要な手順でコラゲナーゼの消化力の監視とトラブルシューティングが必要です。異常な組織、マウス、(約 12 週古いp48Cre; のための時間が長く、消化になりますLSL-KrasG12Dマウス)。同じ年齢のマウス間の広大な変化をすることができます、ので LSL-KrasG12Dマウスから腺房細胞を分離をアデノ ウイルスやレンチ ウイルス感染発癌 KRas の式を取得する cre を活用を実行する勧めします。それはまた ADM プロセスを調査する腺房細胞の隔離のためのプロトコルが最適化されている注意する必要があります。KrasG12Dから ADM とパニン ・細胞の分離・培養を必要とするマウスを表現するプロトコルを変更します。
1 つの重要なステップは、みじん切りの膵コラゲナーゼに費やされる時間の量です。マウスと同じ会社からコラゲナーゼのたくさんの間に理想的なコラゲナーゼ消化時間はマウスから異なります。プロトコルに記載されている時刻は膵 0.250 について計量に適して g. あまりにも多くの時間をすることができます損傷し、不完全な消化力も少しの時間になります、したがって少ない細胞を殺す細胞は上にフィルタ リングのプロセスを通してそれを作る、最終的なプレート。みじん切りを膵臓の部分の内訳を捜すことによって解離を視覚的に確認します。ソリューションは、曇りにする必要があります。さらに、冷たい HBSS とコラゲナーゼの反応を停止する前にソリューションとることができる 5 mL ピペットで、解決策を取ることができる容易さがそれは反作用を停止する適切なかどうかを示すが。追加の考慮事項は、膵の収穫数です。場合よりも、同時に、最適のプロシージャ、膵、別々 のとき 1 膵臓が分離されます。
プライマリ腺房細胞の健全な文化を確保するための別の重要なポイントは、腺房細胞液を分注するときに、ケアがしなければならないことです。積極的なピペッティングが細胞損傷を引き起こすし、知られている ADM 誘導因子 TGF α などを添加してもダクト形成の不足の結果します。さらに、生存率の問題がある場合、300 x gまで柔らかいペレットを生産する 2.4、2.6 および 2.7 の手順で遠心分離を実行できます。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
この仕事に支えられ R01 グラント (CA200572)、NIH から PS へ内容は、著者の責任国立がん研究所の公式見解を必ずしも表さないまたは輸出国家機関の資金提供者の役割がなかった研究デザイン、データの収集と分析、意思決定に発行、または原稿の準備。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21 G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/mL solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µL | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1,000 µL | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µL | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μL | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μL | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μL | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μL | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 mL | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 mL | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 mL | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 mL, 0.22 μm filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
References
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- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).
