Summary
Isolamento primario delle cellule acinose, modulazione di espressione o attività di proteina, cultura e applicazioni a valle sono abbondantemente utili nell'ex vivo uno studio del metaplasia acinoso--duttale (ADM), un evento iniziale nello sviluppo del cancro del pancreas.
Abstract
La differenziazione delle cellule acinose a cellule duttali durante la pancreatite e l'inizio dello sviluppo del cancro del pancreas è un processo chiave che richiede ulteriore studio. Per comprendere i meccanismi di regolazione metaplasia acinoso--duttale (ADM), ex vivo di cultura 3D e differenziazione delle cellule acinose primarie a cellule duttali offre molti vantaggi rispetto ad altri sistemi. Con la tecnica qui, modulazione dell'espressione della proteina è semplice e veloce, che richiede un solo giorno per isolare, stimolare o viralmente infettare e iniziare la coltura delle cellule acinose primarie per studiare il processo ADM. A differenza dell'utilizzo di matrice della membrana basale, la semina dei mazzi delle cellule acinose in collagene extracellulare, permette che le cellule acinose mantengono la loro identità acinose prima manipolazione. Ciò è vitale quando si verifica il contributo delle varie componenti all'induzione di ADM. Non solo sono gli effetti delle citochine o altri fattori ectopically amministrati testabile attraverso questa tecnica, ma il contributo di comuni mutazioni, proteina aumentata espressione o atterramento di espressione della proteina è verificabile tramite l'infezione virale di cellule acinose primarie, utilizzando vettori adenoviral o lentivirali. Inoltre, le cellule possono essere ri-isolate da collagene o matrice della membrana basale all'endpoint e analizzati per l'espressione della proteina.
Introduction
Acinoso-ductal metaplasia (ADM) è un meccanismo protettivo durante un processo chiave Guida di sviluppo di cancro del pancreas1 che richiede ulteriore visione meccanicistica e pancreatite. Mentre l'infiammazione indotta ADM è reversibile2, oncogeniche mutazioni di KRAS , che sono presenti nel 90% dei casi di cancro del pancreas3, impedire differenziazione torna a un fenotipo acinose4,5, 6. Culturing e differenziazione di cellule acinose primarie in cellule duttali in 3D cultura permette per lo studio dei meccanismi molecolari che regolano il processo ADM, che è difficile da studiare in vivo. Tali ex vivo studi abilitare la visualizzazione in tempo reale di ADM, i suoi piloti e suoi regolatori. Sono stati identificati diversi piloti del processo di ADM, nonché informazioni sulle loro vie di segnalazione a valle, o verificato utilizzando il qui descritto metodo. Questi includono l'induzione di ADM da TGF-α (alfa di fattore di crescita trasformante)-mediata espressione di MMP-7 (matrix metalloproteinase-7) e l'attivazione della tacca7, così come RANTES (regolato sull'attivazione, la cellula T normale espressa e secreta; anche noto come ligando chemochina 5 o CCL5) e TNFα (fattore di necrosi tumorale alfa)-indotta ADM attraverso l'attivazione di NF-KB (nuclear factor-κB)8. Un ulteriore mediatore di ADM è oncogene KRas9,10, che provoca un aumento dello stress ossidativo che migliora il processo ADM attraverso l'aumentata espressione di EGFR (recettore del fattore di crescita epidermico) e suoi ligandi, EGF ( fattore di crescita epidermico) e TGF-α11.
Mentre l'uso di linee cellulari di cancro del pancreas è comune per gli studi in vitro, colture cellulari primarie offrono molti vantaggi. Per esempio, le cellule acinose primarie da topi non transgenica o topi che harboring le mutazioni d'iniziale, ad esempio KrasG12D, sono il modello più appropriato per studiare l'evento iniziale di ADM perché le cellule hanno mutazioni pochi e controllate, che sono noti per essere presente all'inizio dello sviluppo di cancro del pancreas. Questo è in contrasto con molte linee cellulari di cancro del pancreas che hanno mutazioni multiple e varie espressione basata sul passaggio numero12. Inoltre, le vie di segnalazione identificate da tali mezzi sono state verificate da studi sugli animali. Un avvertimento di usando le cellule acinose primarie è che essi non possono essere transfected come linee cellulari del cancro tipico possono.
Il metodo qui in dettaglio le tecniche di isolamento di cellule acinose, cultura 3D che imita ADM aggiungendo stimolanti o modulazione dell'espressione di proteine tramite infezione adenoviral o lentivirale, come pure re-isolamento delle cellule presso l'endpoint per ulteriori analisi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutto il lavoro animale è stato approvato dalla Mayo Clinic IACUC.
1. preparazione dei materiali, soluzioni e basi di matrice 3-dimensionale
- Tagliare 500 µm e 105 µm in polipropilene mesh in 76 mm da 76 millimetri quadrati. Piegare ogni quadrato a metà due volte per creare un quadrato più piccolo piegato. Posto uno da 500 µm e un 105 µm maglia piazza in un sacchetto autoclavabile.
- La rete in polipropilene autoclave piazze, come pure due paia di forbici e pinze.
-
Portare a 100 mL di soluzione di Waymouth: 10x. Mescolare 1 flacone (14 g) di polvere di Waymouth in 50 mL di acqua deionizzata (DI) e, quando sciolto, aggiungere 30 mL di bicarbonato di sodio 7,5% (75 g/L). Portare il volume finale a 100 mL, utilizzo DI acqua e filtro sterilizzare.
- Media di negozio 10 x Waymouth a 4 ° C e utilizzare per preparare il gel del collagene e media di 1 x Waymouth. Quando precipita forma, scartare.
- Fai 50 mL di 1x multimediale completo di Waymouth al pancreas aggiungendo 125 µ l di inibitore della tripsina della soia 40 mg/mL, 12,5 µ l di desametasone 4 mg/mL e 500 µ l di siero bovino fetale (FBS). Sterilizzare mediante filtrazione e utilizzare entro 48h.
-
Preparare le basi di matrice 3-dimensionale utilizzando la matrice di collagene o della membrana dello scantinato (Vedi tabella materiali per informazioni sul prodotto). Quando si pipetta della base, posizionare la piastra sul ghiaccio, evitare bolle e ruotare la piastra immediatamente dopo il volume di ciascun pozzetto per garantire una copertura completa di pipettaggio.
- Creare basi di collagene mescolando i seguenti componenti sul ghiaccio in una cappa di coltura del tessuto: 5,5 mL di tipo io la spia di coda collagene, 550 µ l di 10 x Media di Waymouth e 366.6 µ l di NaOH M 0,34 (filtrato).
Nota: Si tratta di una soluzione abbastanza per fare basi di collagene per una piastra 24 pozzetti, 12-pozzetti o 6 pozzetti. Una piastra è sufficiente per acinosa isolamento da un pancreas. - Utilizzare i seguenti volumi per piastra della base di collagene: 80 µ l (8 pozzetti vetrino), 200 µ l (piastra a 24 pozzetti), 400 µ l (12-pozzetti) o 800 µ l (piastra a 6 pozzetti).
- Per la membrana dello scantinato matrice basi, dispensare la matrice senza componenti aggiuntivi. Utilizzare i seguenti volumi per ciascun pozzetto: 50 µ l (8 pozzetti vetrino), 120 µ l (piastra a 24 pozzetti), 240 µ l (12-pozzetti) o 600 µ l (piastra a 6 pozzetti).
- Lasciate che le basi solidificare per almeno 30 min in un'incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO2) prima di creare un secondo strato di matrice con celle incorporate nella parte superiore di queste basi (passaggio 4).
- Creare basi di collagene mescolando i seguenti componenti sul ghiaccio in una cappa di coltura del tessuto: 5,5 mL di tipo io la spia di coda collagene, 550 µ l di 10 x Media di Waymouth e 366.6 µ l di NaOH M 0,34 (filtrato).
- In preparazione per l'isolamento acinosa tenere un becher da 600 mL, tre provette da 50 mL, un paio in autoclave di forbici, un paio in autoclave di pinze e un secchio di ghiaccio sotto il cofano con tre barche di pesare. Quindi, apportare 30 mL di HBSS con 300 µ l di 100 x penicillina-streptomicina, mettere 10 mL in ciascuna delle due barche di pesare e mantenendo il livello finale di 10 mL in una provetta da 50 mL (per l'utilizzo nei passaggi 1.8.2 e 2.1.4).
- Fare 40 mL di HBSS + 5% FBS, 20 mL di HBSS + 30% FBS e 5 mL di collagenasi di 2 mg/mL in HBSS. Sterilizzare la collagenasi di filtrazione (0,22 µm poro) e conservare a temperatura ambiente. Mantenere ciascuna delle soluzioni HBSS sul ghiaccio.
-
Assemblare un workspace per dissezione del pancreas, che può essere fatto su un banco di laboratorio.
- Posto un tampone assorbente sul tavolo, insieme a un coperchio in polistirolo rivestito in lamina. Quindi posizionare un asciugamano di carta con 4 pin sulla parte superiore della lamina.
- Tenere i seguenti elementi alla portata dell'area di lavoro di dissezione: un sacchetto di incenerimento, un set di pinze e forbici in autoclave, un flacone spray con etanolo al 70% e un secchio di ghiaccio (con il tubo 50 mL HBSS contenente penicillina-streptomicina dal punto 1.6).
- Impostare una centrifuga a 4 ° C e un agitatore a 37 ° C.
2. acinoso cellula isolamento
-
Sacrificare il mouse tramite induzione di CO2 ed eseguire dislocazione cervicale. Scomporre immediatamente il pancreas. Per sezionare il pancreas, il primo pin le zampe del mouse al coperchio in polistirolo, orientare il mouse tale che la coda sia rivolta verso il ricercatore e spruzzare l'addome con etanolo al 70%.
Nota: il mouse utilizzato nei risultati rappresentativi era una femmina non transgenica 12 - settimana-vecchia con sfondo C57BL/6. Selezione del mouse è ulteriormente discusso nella sezione discussione.- Utilizzando un set di pinze e forbici in autoclave, sollevare la pelliccia/pelle con il forcipe al midline e utilizzare le forbici per fare un'incisione attraverso la pelliccia e pelle dall'apertura uretra per l'area di diaframma/cassa toracica.
- Fare ulteriori incisioni a sinistra e a destra, in modo che la pelliccia/pelle è tagliata via per creare una visione chiara della cavità addominale. Tagliate la fodera peritoneale (basso al centro e a destra e a sinistra), quindi estrarla dagli organi, come è stato fatto con la pelliccia/pelle.
- Sollevare l'intestino con il forcipe e metterlo sul lato sinistro del mouse creando spazio per vedere il pancreas, che è luce rosa nel colore e collegato alla milza, che è un ovale rosso scuro. Il tessuto pancreatico si distingue per la sua texture morbida e spugnosa. Tagliare il pancreas che corrono lungo lo stomaco e si intrecciano con l'intestino.
- Separare la milza da parte del pancreas. Quindi, mettere il pancreas in un tubo da 50 mL contenente 10 mL di HBSS con 1 x penicillina-streptomicina e portare questo alla cappa a flusso laminare.
Nota: I passaggi rimanenti del protocollo dovrebbero essere fatto utilizzando una tecnica sterile in una cappa a flusso laminare.
- Versare il pancreas e HBSS (con penicillina-streptomicina) in un vuoto pesare barca e, usando il forcipe, lavare il pancreas agitando esso. Quindi, spostare il pancreas con il forcipe per un secondo pesare barca contenente HBSS (con penicillina-streptomicina). Ancora una volta, è possibile lavare il pancreas agitando.
-
Spostare il pancreas il terzo HBSS (con penicillina-streptomicina)-contenente pesare in barca e iniziare a tagliare il pancreas a pezzetti di 5 mm o meno. Successivamente, versare i pezzi di pancreas e HBSS in una provetta vuota 50ml.
- Per effettuare questa operazione, utilizzare le pinze per spostare i pezzi di pancreas nel liquido, come la barca di pesare è essere capovolto. Versare una volta che tutti i pezzi non sono più attaccati alla barca di pesare. Pick up qualsiasi pezzi rimanenti con il forcipe e lavare il forcipe nel tubo 50 mL contenente il pancreas in HBSS con penicillina-streptomicina.
- Centrifugare a 931 x g per 2 min a 4 ° C e quindi rimuovere l'HBSS (e tutto il grasso che è mobile) pipettando fuori con una pipetta da 5 mL.
- Aggiungere 5 mL di collagenasi (diluito in HBSS nel passaggio 1.7) al pancreas. Garantire un coperchio sigillato avvolgendo il tubo da 50 mL in pellicola di plastica paraffina e poi metterlo in un incubatore agitazione a 220 rpm per 20 min a 37 ° C.
Nota: Il tempo di digestione della collagenosi può variare, come indicato nella discussione. Al termine dell'incubazione, non dovrebbero rimanere grossi pezzi di tessuto. - Per interrompere la dissociazione, collocare la provetta contenente pancreas sul ghiaccio e aggiungere 5 mL di freddo HBSS + 5% FBS. Centrifugare a 931 x g per 2 min a 4 ° C e quindi dispensare il sovranatante utilizzando una pipetta da 5 mL.
- Risospendere in 10 mL di HBSS + 5% di FBS e centrifugare a 931 x g per 2 min a 4 ° C. Dispensare fuori il surnatante con una pipetta da 5 mL e ripetere questo passaggio con un altro 10 mL di HBSS + 5% FBS.
- Risospendere in 5 mL di HBSS + 5% FBS e, usando un P1000, trasferire 1 mL alla volta attraverso una maglia di 500 µm in una provetta da 50 mL. Aggiungere un ulteriore 5 mL di HBSS + 5% FBS attraverso le maglie con un P1000 per lavare qualsiasi restanti cellule pancreatiche attraverso la maglia.
- Mettere la sospensione cellulare fra le maglie di 500 µm attraverso la maglia di 105 µm di pipettaggio 1ml alla volta utilizzando un P1000. Avanti, delicatamente dispensare la sospensione cellulare in una provetta contenente HBSS + 30% FBS. Uno strato di sospensione cellulare si forma nella parte superiore; Dopo centrifugazione, le cellule acinose affonderà per formare una pallina.
-
Centrifuga a 233 x g per 2 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 1 x multimediale completo di Waymouth.
- Se procedere direttamente alla infissione delle cellule nel collagene o matrice della membrana basale, risospendere in un volume di 7 mL per pancreas. Se procedendo all'infezione adenoviral o lentivirale, risospendere in 4 mL al pancreas.
3. virale infezione
-
Come un pancreas è sufficiente per due infezioni virali (controllo e sperimentale, per esempio, null e cre), dividere la sospensione cellulare tra i coperchi delle due piastre di 35 mm. Utilizzando il coperchio delle piastre consente per l'infezione in sospensione e quindi facilità di movimento sul substrato finale più tardi.
- Quando si lavora con il virus, è possibile immergere tutti i puntali usati in candeggina al 10% per almeno 15 minuti.
Nota: L'utilizzo delle piastre 35mm e il volume di 4ml funziona bene per le cellule dai topi non transgenici tra 8 e 16 settimane. La dimensione del piatto e il volume potrebbe essere necessario essere regolato per gli animali con maggiore o minore pancreata.
- Quando si lavora con il virus, è possibile immergere tutti i puntali usati in candeggina al 10% per almeno 15 minuti.
- Per l'infezione adenoviral, aggiungere il virus (con un titolo di almeno 107 TU/mL) ad una diluizione di 1:1,000 al coperchio di ogni piatto e ricciolo (Figura 2, l'adenovirus GFP). Posizionare le piastre in un'incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO2) e agitare ogni 15 minuti per 1 h. incubazione continua per altre 2 ore e poi procedere per infissione delle cellule nella matrice di collagene o della membrana dello scantinato.
- Dopo aver completato il lavoro virale nella cappa, immergere tutti i componenti nella cappa con candeggina al 10% per almeno 15 minuti e successivamente pulire a fondo la candeggina con etanolo al 70%.
4. infissione delle cellule nel collagene o matrice della membrana basale
- Marca gel di collagene su ghiaccio combinando 7ml tipo il collagene di coda di ratto (3,3 mg/mL), 700 µ l di 10 x supporti di Waymouth e 466.6 µ l di 0,34 M NaOH.
-
Assunzione di volumi uguali di sospensione di gel e delle cellule di collagene, mescolare delicatamente. Se l'aggiunta di uno stimolo o inibitore, combinare questo con la sospensione di collagene-cellulare. Piastra uno bene alla volta (piastre dal punto 1.5.3); tenendo la piastra sul ghiaccio, agitare per distribuire uniformemente lo strato di collagene-cella.
- In ciascun pozzetto, dispensare i seguenti volumi di sospensione collagene-cellulare: 200 µ l (8 pozzetti vetrino), 500 µ l (piastra a 24 pozzetti), 1000 µ l (12-pozzetti) o 2000 µ l (piastra a 6 pozzetti). Si noti che ADM è indotto tramite stimolazione con TGF-α (50 ng/mL) nella Figura 2.
- Per infissione delle cellule nella matrice della membrana basale, mescolare matrice della membrana basale di una sola parte con due parti sospensione cellulare. Come con collagene, mantenere la sospensione di cella della matrice, così come la piastra sul ghiaccio. Dispensare uno bene alla volta utilizzando gli stessi volumi notati in 4.2.1 e ricciolo per distribuzione uniforme.
- Posizionare la piastra in un'incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO2) per 30 min per solidificare e quindi aggiungere 1 x il supporto completo di Waymouth con qualsiasi stimolo o inibitore (Figure 2 usi TGF-α a 50 ng/mL). Modificare i media (con stimolo o inibitore) il giorno successivo e quindi ogni altro giorno. A seconda dello stimolo, ADM può essere osservata tra 3 e giorno 5.
5. raccolta delle cellule da collagene o matrice della membrana basale
- Raccogliere i seguenti materiali necessari per la raccolta delle cellule dal collagene: 30 mL di collagenasi di 1 mg/mL diluito in HBSS, 40 mL di freddo HBSS, 31 mL di PBS freddo, due spatole, due provette da 50 mL e ghiaccio. Se confrontare più di due condizioni di coltura (dove ogni condizione è ½ di una piastra), regolare il numero di spatole, tubi e quantità di soluzioni. Impostare la centrifuga a 4 ° C e impostare l'agitazione incubatore a 37 ° C.
- Rimuovere il supporto e utilizzare spatole per rimuovere i dischi di collagene con cellule incorporate. Per ogni condizione, mettere i dischi in un separato, svuotare il tubo da 50 mL.
- Aggiungere 10 mL di collagenasi di 1 mg/mL in HBSS per ogni provetta da 50 mL. Avvolgere i tubi con pellicola di plastica paraffina e mettere in un 37 ° C in agitazione incubatore a 225 giri/min fino a 45 minuti. Monitorare la digestione e rimuovere tubi quando c'è il collagene non è più visibile.
- Centrifugare a 233 x g a 4 ° C per 2 min con minimo rallentamento. Decollare il supernatante e risospendere in 5 mL di soluzione della collagenosi per tubo. Digerire in un 37 ° C in agitazione incubatore a 225 giri/min per 10 minuti o fino a quando non c'è nessun collagene visibili.
-
Interrompere la digestione aggiungendo 5 mL di HBSS freddo e successivamente centrifugazione a 233 x g per 2 min a 4 ° C con minimo rallentamento.
- Risospendere in 15 mL di HBSS freddo e centrifugare nuovamente a 233 x g per 2 min a 4 ° C con minimo rallentamento. Ripetere l'operazione.
- Risospendere il pellet in 1 mL di PBS e spostare in provetta da 1,5 mL. Centrifugare in un secchio di swing a 233 x g per 2 min a 4 ° C con minimo rallentamento. Rimuovere il surnatante e snap-congelamento in azoto liquido o il ghiaccio secco.
Nota: Il pellet cellulare può essere conservato a-70 ° C o utilizzato immediatamente nelle applicazioni a valle. - Per la raccolta della membrana dello scantinato incorporato matrice celle, media di dispensare da ogni pozzetto in una provetta da 50 mL su ghiaccio. Quindi, aggiungere la soluzione di recupero di matrice della membrana dello scantinato in ciascun pozzetto e raschiare la miscela di gel di cella nel tubo 50 mL.
Nota: Il volume di soluzione di recupero di matrice della membrana dello scantinato per aggiungere a ciascun pozzetto è come segue: 150 µ l (8 pozzetti vetrino), 420 µ l (piastra a 24 pozzetti), 845 µ l (12-pozzetti) e 2.000 µ l (piastra a 6 pozzetti). - Sciacquare ogni ben due volte con la soluzione di recupero della matrice della membrana dello scantinato, aggiungendo i risciacqui al tubo 50 mL.
Nota: Il volume di soluzione di recupero di matrice della membrana dello scantinato per ogni risciacquo è come segue: 150 µ l (8 pozzetti vetrino), 420 µ l (piastra a 24 pozzetti), 845 µ l (12-pozzetti) e 2.000 µ l (piastra a 6 pozzetti). - Lasciare il tubo sul ghiaccio per 1 h o fino a quando la matrice della membrana basale si dissolve e seguire con centrifugazione a 300 x g per 5 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di PBS freddo (può trasferire a provetta da 1,5 mL volendo pellet cellulare).
- Centrifuga a 3.500 x g per 3 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e uno snap congelare il pellet cellulare o aggiungere buffer di lisi e procedere direttamente alle applicazioni a valle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Completamento del protocollo nel presente documento si verifica entro un giorno e dopo stimolazione, ADM è visto in 3-5 giorni. Figura 1 illustra la sequenza del metodo, per cui i passaggi da 1 a 4 sono stati completati il primo giorno. Questo include la preparazione, isolamento acinosa, infezione virale e infissione in collagene o matrice della membrana basale. Mentre la matrice della membrana basale induce ADM, cellule acinose all'interno di collagene ho bisogno di uno stimolo, come il TGF-α, per subire la differenziazione di cellule duttali. Il giorno 1, celle nella matrice collagene o della membrana dello scantinato hanno un'apparenza rotonda di uva-come e se utilizzando l'infezione virale con un vettore che esprime una proteina fluorescente, efficienza di infezione può essere controllata. Dal giorno 5, cellule in collagene formerà condotti se dato uno stimolo al momento di infissione e come integratore nei media, che è cambiati nei giorni 1, 3 e 5. Incorporato nella matrice della membrana basale di cellule formeranno condotti in assenza di uno stimolo, ma dopo stimolazione formerà dotti più grandi, come si vede nella Figura 2.
Figura 1 : Schematico della procedura per isolare cellule acinose primarie murine, modulano l'espressione della proteina e/o stimolare acinoso--ductal metaplasia e incorporare cellule nella matrice di collagene o della membrana dello scantinato. Il flusso di lavoro include l'isolamento delle cellule acinose, che include la dissezione del pancreas, la digestione e la filtrazione delle cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Risultati rappresentativi delle cellule acinose primarie placcate all'interno della matrice di collagene o membrana basale dopo l'infezione adenoviral e stimolazione con TGF-α. Le cellule acinose primarie da un mouse non transgenici sono state infettate con GFP-adenovirus, incorporato nel collagene I o matrice della membrana basale e stimolata con o senza TGF-α (50 ng/mL). Ventiquattro ore dopo l'infezione con l'adenovirus GFP, immagini sono state catturate per mostrare l'efficienza di infezione. A cinque giorni post-infezione, le immagini denotano le differenze in cellule stimolate con o senza TGF-α in collagene o matrice della membrana basale. Condotto-come le strutture sono indicate da frecce bianche e scala rappresentano barre che 50 µm. le immagini sono state ottenute utilizzando un microscopio confocale con l'obiettivo di CE Plan-Neofluar 10 x / 0,3 M27. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La relativamente breve lasso di tempo per isolamento, infezione e placcatura primario delle cellule acinose è un vantaggio di questo metodo. Al contrario, coltura delle cellule acinose da una conseguenza di espianto richiede poco tempo hands-on, ma sono necessari sette giorni per la conseguenza di cellule acinose13. Protocollo alternativo per isolamento acinose14 note un metodo molto breve per l'ottenimento di cellule acinose; Tuttavia, l'EGF è un componente essenziale nella conservazione delle cellule acinose vivi quando isolati utilizzando tale protocollo. Poiché EGF stimola la differenziazione delle cellule acinose a cellule duttali, nel presente documento, il metodo che non richiede componenti ADM-stimolante per la cultura, è meglio per studiare i meccanismi di induzione o regolamento di ADM. In questo metodo, cellule acinose identità è mantenuta durante la coltura in collagene a meno che stimolato a differenziarsi in cellule duttali. Inoltre, difficoltà nella trasfezione le cellule primarie sono superate tramite manipolazione di espressione della proteina da un'infezione virale.
Questa procedura offre uno studio diretto di ADM, da quale visualizzazione della struttura ductal induzione può avvenire tramite microscopia in campo chiaro e/o di immunofluorescenza. Per applicazioni di imaging, diapositive di camera (indicati nella Tabella materiali) sono i migliori. Fissazione per 15 min a 37 ° C con paraformaldeide al 4% risolverà cellule incorporate nella matrice della membrana basale senza strutture ductal inquietante. Durante questa incubazione, la matrice della membrana basale si fluidifica e può essere dispensata delicatamente fuori con il paraformaldeide. Immunofluorescenza su cellule del collagene incorporato è descritto in dettaglio all'interno di protocolli aggiuntivi15,16. Ulteriori applicazioni per l'analisi dei meccanismi di segnalazione coinvolte nell'endpoint dell'esperimento includono Western blot, qPCR e fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS). Un sesto di un pancreas è sufficiente materiale per l'analisi di un campione tramite Western blot o qPCR.
Limitazioni del presente protocollo derivano dall'utilizzo della matrice di collagene o della membrana dello scantinato, dove ognuno ha i propri vantaggi e svantaggi. Mentre infissione delle cellule in collagene produrrà solo condotti se somministrati stimoli, infissione di matrice della membrana dello scantinato produrrà condotti senza ulteriori stimoli. Tuttavia, ductal dimensioni nella matrice della membrana basale sono un output misurabili. Un'ulteriore limitazione è il tempo coinvolti nelle procedure di raccolta nel passaggio 5, che potrebbero influenzare l'espressione genica. Questa limitazione può essere mitigata confermando i risultati ottenuti da Western blotting con immunofluorescenza, in cui il tempo di fissazione è notevolmente inferiore a quella dei tempi di raccolta per qPCR o analisi Western blot.
Oltre l'infezione adenoviral, infezione lentivirale può essere utilizzato in cellule primarie. Per infezione lentivirale, aggiungere 6 µ g/mL infezione virale enhancer reagente (Vedi tabella materiali) per le cellule e delicatamente le piastre di turbinio. Successivamente, aggiungere il lentivirus (con un titolo di almeno 107 TU/mL) ad una diluizione di 1:1,000 e ancora una volta, agitare delicatamente. Incubare per 3-5 h (37 ° C, 5% CO2) e poi continuare a infissione delle cellule nella matrice di collagene o della membrana dello scantinato. Per generare dei lentivirus con un plasmide di interesse, utilizzare il mix di imballaggio lentivirali indicato nella tabella dei materiali.
Ulteriori modifiche possa includere l'isolamento delle cellule dai topi che esprimono KrasG12D. In questi topi, che già hanno aree fibrotiche con lesioni ADM e PanIN, digestione della collagenosi richiede più tempo. Attento monitoraggio della digestione della collagenosi, come descritto nei passaggi critici e risoluzione dei problemi, è necessario. Il tessuto più anormale dispone di un mouse, il più a lungo la digestione prenderà (circa un'ora per un p48Cre di di dodici-settimana-vecchio; LSL-KrasG12D mouse). Poiché non ci può essere immenso variazione fra i topi della stessa età, si consiglia di isolare cellule acinose da un mouse LSL -KrasG12D ed eseguire infezione adenoviral o lentivirale utilizzando cre per ottenere oncogene KRas espressione. Inoltre dovrebbe essere notato che il nostro protocollo è ottimizzato per l'isolamento di cellule acinose per studiare il processo ADM. L'isolamento di cellule ADM e PanIN da KrasG12D-esprimendo i topi per organoid cultura richiede alterato protocolli.
Un passaggio fondamentale è la quantità di tempo che il pancreas tritato trascorre in collagenasi. Il tempo di digestione della collagenosi ideale può variare da mouse mouse e tra un sacco di collagenasi da parte della società stessa. Il tempo indicato nel protocollo è adatto per pancreata pesa circa 0,250 g. troppo molto tempo possono danneggiare e uccidere le cellule, mentre troppo poco tempo si tradurrà in digestione incompleta e pertanto meno cellule che renderà attraverso il processo di filtraggio sulla piastra finale. Controllare visivamente la dissociazione cercando per la ripartizione dei pezzi tritato-up pancreas; la soluzione dovrebbe girare nuvolosa. Inoltre, prima di arrestare la reazione di collagenasi con HBSS freddo, la soluzione può essere preso con una pipetta da 5 mL, dove la facilità con cui la soluzione può essere presa fino indicherà se è opportuno arrestare la reazione. Un'ulteriore considerazione è il numero del pancreata raccolta. Se più di un pancreas è isolato allo stesso tempo, il procedura funziona meglio quando il pancreata sono tenuti separati.
Un altro punto importante per garantire la sana cultura delle cellule acinose primarie è che si dovrebbe prestare attenzione quando si pipetta la soluzione di cellule acinose. Pipettaggio vigorosa può causare danni alle cellule e provocare una mancanza di formazione del condotto, anche con aggiunta di noti induttori ADM, quali TGF-α. Ulteriormente, se ci sono problemi di viabilità, la centrifugazione in passaggi 2.4, 2.6 e 2.7 può essere assunto fino a 300 x g per produrre una pallottola più morbida.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Quest'opera è stata sostenuta da una sovvenzione di R01 (CA200572) da NIH al PS. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale dell'Istituto nazionale del cancro o di istituti nazionali di Health.The, i finanziatori non avevano alcun ruolo in studio progettazione, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21 G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/mL solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µL | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1,000 µL | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µL | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μL | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μL | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μL | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μL | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 mL | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 mL | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 mL | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 mL, 0.22 μm filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
References
- Rooman, I., Real, F. X. Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development. Gut. 61 (3), 449-458 (2012).
- Stanger, B. Z., Hebrok, M. Control of cell identity in pancreas development and regeneration. Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).
- Caldas, C., Kern, S. E. K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma. International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Morris, J. P. t, Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).
- Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice. Cancer Research. 63 (9), 2016-2019 (2003).
- Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).
- Liou, G. Y., et al. Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs. Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).
- De La, O. J., et al. Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).
- Habbe, N., et al. Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).
- Liou, G. Y., et al. Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions. Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).
- Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need. Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).
- Gout, J., et al. Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10 Unit 10 11-20 (2010).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).
