Summary
Primære acinar celle isolation, protein udtryk eller aktivitet graduering, kultur og down-stream programmer er særdeles nyttige i ex vivo undersøgelse af acinar til duktalt metaplasi (ADM), en tidlig begivenhed i udviklingen af kræft i bugspytkirtlen.
Abstract
Differentiering af acinar celler til duktalt celler under pancreatitis og i den tidlige udvikling af kræft i bugspytkirtlen er en vigtig proces, der kræver yderligere undersøgelse. For at forstå mekanismerne, der tilbyder regulerer acinar til duktalt metaplasi (ADM), ex vivo 3D kultur og differentiering af primær acinar celler til duktalt celler mange fordele i forhold til andre systemer. Med teknikken heri er graduering af protein udtryk enkel og hurtig, som kræver kun én dag til at isolere, stimulere eller viralt inficere og begynde, dyrkning af primære acinar celler til at undersøge ADM proces. I modsætning til ved hjælp af basalmembranen matrix, seeding af acinar celle klynger i kollagen jeg ekstracellulære matrix, giver mulighed for acinar celler til at bevare deres acinar identitet før manipulation. Dette er afgørende, når afprøvning af forskellige komponenter til induktion af ADM. bidrag Ikke alene er effekt af cytokiner eller andre ectopically administreret faktorer testbare gennem denne teknik, men bidrag af almindelige mutationer, øget protein udtryk eller knockdown ekspression af proteiner er testbare via viral infektion i primære acinar celler, ved hjælp af adenoviral eller lentiviral vektorer. Derudover celler kan isoleres igen fra kollagen eller basalmembranen matrix på slutpunktet og analyseret for protein udtryk.
Introduction
Acinar til duktalt metaplasi (ADM) er en beskyttende mekanisme under pancreatitis og en nøglen oparbejde kørsel bugspytkirtelkræft udvikling1 der kræver yderligere mekanistiske indblik. Mens betændelse-induceret ADM er reversibel2, forhindre muterede KRAS mutationer, der er til stede i 90% af kræft i bugspytkirtlen sager3, differentiering tilbage til en acinar fænotype4,5, 6. Culturing og differentiere primære acinar celler i duktalt celler i 3D kultur giver mulighed for undersøgelse af de molekylære mekanismer, der regulerer ADM proces, som er vanskelige at studere in vivo. Sådan ex vivo undersøgelser aktiverer real-time visualisering af ADM, dets drivere og dens lovgiverne. Flere drivere af ADM proces, samt mekanistiske indblik på deres downstream signaling veje, er blevet identificeret eller verificeret ved hjælp af her beskrevne metode. Disse omfatter ADM induktion af TGF-α (omdanne vækst faktor alfa)-medieret udtryk af MMP-7 (matrix metalloproteinase-7) og aktivering af Notch7, samt RANTES (reguleret på aktivering, normal T celle udtrykt og udskilles; også kendt som chemokine ligand 5 eller CCL5) og TNFα (tumor nekrose faktor alfa)-induceret ADM gennem aktivering af NF-κB (nuclear factor-κB)8. En yderligere mægler af ADM er muterede KRas9,10, som medfører en stigning i oxidativ stress, som øger ADM proces gennem øget udtryk for EGFR (epidermal vækstfaktor receptor) og dens ligander, EGF ( epidermal vækstfaktor) og TGF-α11.
Mens brugen af pancreas cancer cellelinjer er fælles for in vitro-undersøgelser, giver primære cellekulturer mange fordele. For eksempel, primære acinar celler fra ikke-Transgene mus eller mus husly igangsættende mutationer, såsom KrasG12D, er den mest hensigtsmæssige model for at studere de tidlige begivenhed af ADM fordi cellerne har par og kontrolleret mutationer, som er kendt for at være til stede tidligt i bugspytkirtelkræft udvikling. Dette er i modsætning til mange pancreas cancer cellelinjer, der har flere mutationer og varierede udtryk baseret på passage nummer12. Derudover er signaling veje identificeret af sådanne midler blevet bekræftet ved dyreforsøg. En advarsel af ved hjælp af primær acinar celler er, at de ikke kan være transfekteret, som typisk kræft cellelinjer kan.
Metoden heri detaljer teknikker til acinar celle isolation, 3D kultur, der efterligner ADM ved at tilføje stimulanser eller modulerende protein udtryk via adenoviral eller lentiviral infektion, samt fornyet dyrkning af celler på slutpunktet for yderligere analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr arbejde blev godkendt af Mayo Clinic IACUC.
1. forberedelse af materialer, løsninger og 3-dimensionel Matrix baser
- Skåret 500 µm og 105 µm polypropylen masker ind 76 mm af 76 mm firkanter. Fold hver firkant i halv to gange for at skabe en mindre foldede kvadrat. Sted en 500 µm og en 105 µm mesh square i et autoklaverbart pose.
- Autoklave polypropylen mesh pladser, samt to par af saks og pincet.
-
Gøre 100 mL 10 x Waymouths løsning. Rør 1 hætteglas (14 g) af Waymouths pulver i 50 mL deioniseret vand (DI) vand, og når opløst, tilsættes 30 mL af 7,5% (75 g/L) natriumbikarbonat. Bringe det endelige rumfang på 100 mL ved hjælp af DI vand og filter sterilisere.
- Butik 10 x Waymouth medier ved 4 ° C og brug at forberede kollagen geler og 1 x Waymouth medier. Når udfældes form, kassere.
- Gøre 50 mL af 1 x Waymouths komplet media pr. bugspytkirtlen ved at tilføje 125 µL af 40 mg/mL soja trypsin inhibitor, 12,5 µL af 4 mg/mL dexamethason og 500 µL af føtal bovint serum (FBS). Sterilisere ved filtrering og brug inden for 48 timer.
-
Forbered 3-dimensionel matrix baser ved hjælp af enten kollagen eller basalmembranen matrix (se tabel af materialer for produktinformation). Når pipettering basen, pladen anbringes på is, undgå bobler og rotere pladen umiddelbart efter pipettering hver brønd volumen for at sikre fuld dækning.
- Oprette kollagen baser ved at blande de følgende komponenter på is i vævskultur hætte: 5,5 mL af typen jeg rotte hale kollagen, 550 µL af 10 x Waymouths medier og 366.6 µL 0,34 M NaOH (filtreret).
Bemærk: Dette er nok løsning at gøre kollagen baser for en 24-godt, 12-godt eller 6-godt plade. En plade er tilstrækkeligt for acinar isoleret fra en bugspytkirtlen. - Brug de følgende mængder til plade kollagen base: 80 µL (8-godt glas dias), 200 µL (24-godt plade), 400 µL (12-godt plade) eller 800 µL (6-godt plade).
- For basalmembranen baser matrix, afpipetteres matrix uden yderligere komponenter. Brug de følgende mængder for hver brønd: 50 µL (8-godt glas dias), 120 µL (24-godt plade), 240 µL (12-godt plade) eller 600 µL (6-godt plade).
- Lad baser størkne i mindst 30 min i en celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) før du opretter et andet lag af matrix med indlejrede celler på toppen af disse baser (trin 4).
- Oprette kollagen baser ved at blande de følgende komponenter på is i vævskultur hætte: 5,5 mL af typen jeg rotte hale kollagen, 550 µL af 10 x Waymouths medier og 366.6 µL 0,34 M NaOH (filtreret).
- Holde et 600 mL bægerglas, tre 50 mL rør, en autoklaveres par saks, en autoklaveres par pincet og en isspand under kølerhjelmen med tre veje både som forberedelse til acinar isolation. Derefter gøre 30 mL af HBSS med 300 µL af 100 x penicillin-streptomycin, sætte 10 mL i hver af to veje både og holde de sidste 10 mL i en 50 mL tube (til brug i trin 1.8.2 og 2.1.4).
- Gøre 40 mL HBSS + 5% FBS, 20 mL af HBSS + 30% FBS, og 5 mL af 2 mg/mL collagenase i HBSS. Sterilisere collagenase ved filtrering (0,22 µm pore) og holde ved stuetemperatur. Holde hver af HBSS løsninger på is.
-
Saml et arbejdsområde for bugspytkirtlen dissektion, hvilket kan gøres på en lab bænk.
- Sted en absorberende puden på bordet sammen med polystyren låg dækket i folie. Placer et stykke køkkenrulle med 4 ben oven på folien.
- Holde følgende punkter inden for rækkevidde af arbejdsområdet dissektion: en forbrænding taske, et sæt autoklaveres saks og pincet, en sprayflaske med 70% ethanol og en isspand (med 50 mL tube af HBSS indeholdende penicillin-streptomycin fra trin 1,6).
- Angiv en centrifuge til 4 ° C og en shaker til 37 ° C.
2. acinar celle Isolation
-
Ofre musen via CO2 induktion, og udføre cervikal dislokation. Straks dissekere bugspytkirtlen. For at dissekere bugspytkirtlen, første pin poter mus til polystyren låget, orient musen, således at halen står forskeren, og spray maven med 70% ethanol.
Bemærk: musen bruges i de repræsentative resultater var en 12 - uger gamle ikke-transgene kvinde med C57BL/6 baggrund. Mus udvælgelse diskuteres yderligere i afsnittet diskussion.- Ved hjælp af et sæt autoklaveres saks og pincet, løft skind/hud med pincet på midterlinjen og bruge saksen til at gøre et snit gennem pels og hud fra urinrørets åbning til området membran/brystkasse.
- Gør yderligere indsnit til venstre og højre, således at skind/hud er skåret væk for at skabe en klar opfattelse af bughulen. Derefter skæres i peritoneal foring (ned i midten og til højre og venstre) og trække det væk fra organer, som det var tilfældet med skind/hud.
- Løft tarmene med pincet og sætte den til den venstre side af musen at skabe rum for at se bugspytkirtlen, som er lys pink i farven, og forbundet med milten, som er en mørk rød oval. Pancreas væv udmærker sig ved dens bløde, svampet konsistens. Skåret ud i bugspytkirtlen, som vil køre langs maven og fletter med tarmene.
- Adskille milten fra bugspytkirtlen. Derefter sætte bugspytkirtlen i en 50 mL tube indeholder 10 mL af HBSS med 1 x penicillin-streptomycin og bringe det til laminar flow hætte.
Bemærk: De resterende trin i protokollen skal gøres udnytte steril teknik i en laminar flow hætte.
- Hæld bugspytkirtlen og HBSS (med penicillin-streptomycin) i en tom vejer båden og bruge pincet, vaske bugspytkirtlen af hvirvlende det. Derefter, flytte bugspytkirtlen med pincet til en anden vejer båden indeholdende HBSS (med penicillin-streptomycin). Igen, vaske bugspytkirtlen af hvirvlende.
-
Flytte bugspytkirtlen til den tredje HBSS (med penicillin-streptomycin)-indeholdende vejer båd og begynder at skære til bugspytkirtel i små stykker af 5 mm eller mindre. Næste, hæld bugspytkirtlen stykker og HBSS i en tom 50 mL tube.
- For at gøre dette, skal du bruge pincet til at flytte bugspytkirtlen stykker i væsken, som vejer båden er ved at blive tippet. Hæld når alle brikkerne er ikke længere knyttet til vejer båden. Pick up enhver resterende stykker med pincet og vaske pincet i 50 mL tube indeholdende bugspytkirtlen i HBSS med penicillin-streptomycin.
- Der centrifugeres ved 931 x g i 2 min. ved 4 ° C og HBSS (og eventuelle fedt, der flydende) af pipettering det ud med 5 mL pipette.
- Tilsættes 5 mL af collagenase (fortyndet i HBSS i trin 1,7) på bugspytkirtlen. Sikre en lukket låget af indpakning 50 mL tube i plast paraffin film og derefter placere den i en inkubator ryster på 220 rpm i 20 min. ved 37 ° C.
Bemærk: Fordøjelsestid collagenase kan variere, som nævnt i diskussionen. I slutningen af inkubation, bør ingen store stykker af væv forblive. - For at stoppe dissociation, bugspytkirtel-holdige røret anbringes på is og tilsættes 5 mL af kolde HBSS + 5% FBS. Der centrifugeres ved 931 x g i 2 min. ved 4 ° C og derefter afpipetteres off supernatanten ved hjælp af en 5 mL pipette.
- Resuspend i 10 mL af HBSS + 5% FBS og centrifugeres ved 931 x g i 2 min. ved 4 ° C. Med pipette overfoeres fra supernatanten ved hjælp af en 5 mL pipette og Gentag dette trin med en anden 10 mL af HBSS + 5% FBS.
- Resuspend i 5 mL af HBSS + 5% FBS og ved hjælp af en P1000, overføres 1 mL ad gangen gennem en 500 µm mesh i en 50 mL tube. Tilføje en ekstra 5 mL af HBSS + 5% FBS gennem trådnet med en P1000 at vaske alle resterende pancreas celler gennem trådnet.
- Sætte cellesuspension fra 500 µm mesh gennem 105 µm masken af pipettering 1 mL ad gangen ved hjælp af en P1000. Næste, forsigtigt afpipetteres cellesuspension ind i et rør, der indeholder HBSS + 30% FBS. Et lag af cellesuspension vil danne på toppen; ved centrifugering, vil de acinar celler synke til at danne en pellet.
-
Der centrifugeres ved 233 x g i 2 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspenderes i 1 x Waymouths komplette medier.
- Hvis fortsætter direkte til nedstøbning af celler i kollagen eller basalmembranen matrix, resuspend i et volumen på 7 mL pr. bugspytkirtlen. Hvis fortsætter til adenoviral eller lentiviral infektion, resuspend i 4 mL pr. bugspytkirtlen.
3. virusinfektion
-
Som en bugspytkirtlen er tilstrækkelig til to virusinfektioner (kontrol og eksperimenterende, fx null og cre), split cellesuspension mellem låg af to 35 mm plader. Ved hjælp af låget af pladerne giver mulighed for infektion i suspension og derfor let bevægelse på den endelige substrat senere.
- Når du arbejder med virus, suge alle brugt pipette tips i 10% blegemiddel i mindst 15 minutter.
Bemærk: Udnyttelse af 35 mm plader og 4 mL volumen fungerer godt for celler fra ikke-Transgene mus mellem 8 og 16 uger gamle. Plade størrelse og volumen skal måske justeres til dyr med mindre eller større pancreata.
- Når du arbejder med virus, suge alle brugt pipette tips i 10% blegemiddel i mindst 15 minutter.
- For adenoviral infektion, tilføje virus (med en titer på mindst 107 TU/mL) i en 1:1,000 fortynding til låget på hver plade og slyng (figur 2, normal god landbrugspraksis adenovirus). Læg pladerne i en celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) og swirl hver 15 minutter til 1 h. Fortsæt inkubation i en yderligere 2 timer og derefter gå videre til nedstøbning af celler i kollagen eller basalmembranen matrix.
- Efter endt viral arbejde i hætten, suge alle komponenter i hætte med 10% blegemiddel i mindst 15 minutter og derefter grundigt ren blegemiddel ned med 70% ethanol.
4. nedstøbning af celler i kollagen eller basalmembranen Matrix
- Gøre kollagen gel på is ved at kombinere 7 mL type I-rotte hale kollagen (3,3 mg/mL), 700 µL af 10 x Waymouths medier og 466.6 µL af 0,34 M NaOH.
-
Tager lige store mængder af kollagen gel og celle suspension, forsigtigt blandes. Hvis du tilføjer en stimulus eller hæmmer, kombinere dette med kollagen-cellesuspension. Tallerken et godt på et tidspunkt (plader fra trin 1.5.3); at holde pladen på is, swirl for at jævnt distribuere kollagen-cellelag.
- I hver brønd, afpipetteres følgende mængder af kollagen-cellesuspension: 200 µL (8-godt glas dias), 500 µL (24-godt plade), 1000 µL (12-godt plade) eller 2000 µL (6-godt plade). Bemærk, at ADM er induceret via stimulation med TGF-α (50 ng/mL) i figur 2.
- Til nedstøbning af celler i basalmembranen matrix, bland en del basalmembranen matrix med to-dele cellesuspension. Som med kollagen, holde matrix-cellesuspension samt plade på is. Pipette, et godt ad gangen ved hjælp af de samme mængder bemærkede i punkt 4.2.1 og hvirvel for jævn fordeling.
- Placere plade i en celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 30 min til at størkne og derefter tilføje 1 x Waymouths komplette medier med en stimulus eller hæmmer (figur 2 bruger TGF-α på 50 ng/mL). Ændre media (med stimulus eller hæmmer), den næste dag og derefter hver anden dag. Afhængigt af stimulus, kan ADM iagttages mellem dag 3 og 5.
5. høst celler fra kollagen eller basalmembranen Matrix
- Indsamle de følgende nødvendige for høst celler fra kollagen materialer: 30 mL af 1 mg/mL collagenase fortyndet i HBSS, 40 mL koldt HBSS, 31 mL koldt PBS, to spatler, to 50 mL rør og is. Justere antallet af spatler, rør og mængden af løsninger, hvis sammenligne mere end to kultur betingelser (hvor hver betingelse er halvdelen af en plade). Skal centrifugen til 4 ° C og angive den ryster inkubator til 37 ° C.
- Fjern mediet og bruge spatler for at fjerne kollagen diske med indlejrede celler. For hver betingelse, sætte diskene i et særskilt, tømme 50 mL tube.
- Tilsættes 10 mL af 1 mg/mL collagenase i HBSS til hver 50 mL tube. Wrap rør med plast paraffin film og sættes i et 37 ° C ryster inkubator ved 225 rpm i op til 45 minutter. Overvåge fordøjelsen og fjerne rør, når der er ikke mere synlige kollagen.
- Der centrifugeres ved 233 x g ved 4 ° C i 2 min. med mindste deceleration. Take off supernatanten og resuspend i 5 mL collagenase løsning pr tube. Fordøje i et 37 ° C ryster inkubator ved 225 rpm i 10 min, eller indtil der ikke er nogen synlige kollagen.
-
Stop fordøjelsen ved at tilføje 5 mL af kolde HBSS og efterfølgende centrifugering ved 233 x g i 2 min. ved 4 ° C med mindste deceleration.
- Resuspend i 15 mL af kolde HBSS og igen centrifugeres ved 233 x g i 2 min. ved 4 ° C med mindste deceleration. Gentag.
- Resuspenderes i 1 mL PBS og flytte til 1,5 mL tube. Der centrifugeres i en swing spand ved 233 x g i 2 min. ved 4 ° C med mindste deceleration. Fjern supernatanten og snap-freeze i flydende nitrogen eller tøris.
Bemærk: Celle pellet kan opbevares ved-70 ° C eller bruges umiddelbart i down-stream programmer. - At høste basalmembranen matrix-embedded celler, afpipetteres medier fra hver brønd i en 50 mL tube på is. Derefter tilsættes basalmembranen matrix recovery løsning til hver brønd og skrabe celle-gel blandingen ind i 50 mL rør.
Bemærk: Mængden af basalmembranen matrix recovery løsning til at tilføje til hver brønd er som følger: 150 µL (8-godt glas dias), 420 µL (24-godt plade), 845 µL (12-godt plade) og 2.000 µL (6-godt plade). - Skyl hver godt to gange med basalmembranen matrix genoprettelsesløsning, tilføjer skylninger til 50 mL tube.
Bemærk: Mængden af basalmembranen matrix recovery løsning til hvert skyl er som følger: 150 µL (8-godt glas dias), 420 µL (24-godt plade), 845 µL (12-godt plade) og 2.000 µL (6-godt plade). - Forlade røret på køl i 1 time eller indtil matrixen basalmembranen opløses og følg med centrifugering ved 300 x g i 5 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspenderes i 1 mL koldt PBS (kan overføre til 1,5 mL tube hvis cellen pellet ønskes).
- Der centrifugeres ved 3.500 x g i 3 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten og enten snap fryse celle pellet eller tilføje lysisbuffer og direkte videre til downstream applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Afslutningen af protokollen heri opstår inden for en dag og efter stimulation, ADM er set i 3-5 dage. Figur 1 viser rækkefølgen af metoden, hvorved trin 1 til 4 er afsluttet på den første dag. Dette omfatter forberedelse, acinar isolation, virusinfektion og nedstøbning i kollagen eller basalmembranen matrix. Mens matrixen basalmembranen inducerer ADM, acinar celler i kollagen jeg kræver en stimulus, som TGF-α, underkastes differentiering til duktalt celler. På dag 1, celler i kollagen eller basalmembranen matrix har en drue-lignende runde udseende og hvis udnytte viral infektion med en vektor, udtrykker en fluorescerende proteiner, infektion effektivitet kan kontrolleres. Dag 5, vil celler i kollagen danne kanalerne hvis givet en stimulus på tidspunktet for nedstøbning og som et supplement i medierne, som er ændret på dag 1, 3 og 5. Celler indlejret i basalmembranen matrix vil danne kanaler i mangel af en stimulus, men efter stimulation større kanalerne vil danne, som det ses i figur 2.
Figur 1 : Skematisk af proceduren med at isolere murine primære acinar celler, modulere protein udtryk og/eller stimulere acinar til duktalt metaplasi og integrere celler i kollagen eller basalmembranen matrix. Arbejdsgangen indeholder isolationen af acinar celler, som indeholder dissektion af bugspytkirtlen, fordøjelse og filtrering af celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentative resultater af primær acinar celler forgyldt inden for kollagen eller basalmembranen matrix efter adenoviral infektion og stimulation med TGF-α. Primære acinar celler fra en ikke-Transgene mus blev smittet med normal god landbrugspraksis-adenovirus, indlejret i kollagen jeg eller basalmembranen matrix og stimuleret med eller uden TGF-α (50 ng/mL). Fireogtyve timer efter infektionen med normal god landbrugspraksis adenovirus, billeder var taget for at vise infektion effektivitet. På fem dage efter infektionen betegne billederne forskellene i celler stimuleret med eller uden TGF-α i kollagen eller basalmembranen matrix. Duct-lignende strukturer er angivet med hvidt pilespidser og skalere barer repræsenterer 50 µm. billeder blev opnået ved hjælp af en Konfokal mikroskop med EF Plan-Neofluar 10 x / 0,3 M27 mål. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den relativt korte tidsrum isolation, infektion og plating primære acinar celler er en fordel ved denne metode. Derimod dyrkning acinar celler fra en eksplantat udvækst kræver lidt hands-on tid, men det tager syv dage for udvækst af acinar celler13. En alternativ protokol for acinar isolation14 bemærker en meget kort metode til at indhente acinar celler; EGF er imidlertid et væsentligt element i at holde acinar celler i live, når isoleret ved hjælp af denne protokol. Da EGF stimulerer differentiering af acinar celler til duktalt celler, er metoden heri, som ikke kræver ADM-stimulerende komponenter for kultur, bedre til at studere mekanismer af induktion eller regulering af ADM. I denne metode bevares acinar celle identitet under dyrkning i kollagen, medmindre stimuleres til at differentiere i duktalt celler. Desuden, overvinde vanskeligheder i transfecting primærelementer via manipulere protein udtryk af virusinfektion.
Denne procedure giver direkte undersøgelse af ADM, af hvilke visualisering af duktalt struktur induktion kan opstå via brightfield og/eller immunfluorescens mikroskopi. For imaging applikationer, er kammer slides (angivet i Tabel af materialer) bedst. Fiksering i 15 min. ved 37 ° C med 4% PARAFORMALDEHYD reparerer celler indlejret i basalmembranen matrix uden forstyrrende duktalt strukturer. Under denne inkubering basalmembranen matrix vil blødgør og kan være forsigtigt pipetted ud med PARAFORMALDEHYD. Immunfluorescens på kollagen indlejret celler er beskrevet indgående i tillægsprotokollerne15,16. Yderligere anvendelser for analyser af involveret signaling mekanismer på slutpunktet af forsøget omfatter vestlige skamplet, qPCR og fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS). En sjettedel af en bugspytkirtlen er tilstrækkeligt materiale til en prøve analyse via vestlige skamplet eller qPCR.
Begrænsninger af denne protokol opstå fra brug af kollagen eller basalmembranen matrix, hvor alle har deres fordele og ulemper. Mens nedstøbning af celler i kollagen vil kun producere kanalerne givet stimuli, producere basalmembranen matrix nedstøbning kanalerne uden yderligere stimuli. Duktalt størrelse i basalmembranen matrix er imidlertid en målbar effekt. En yderligere begrænsning er tidsforbruget i høst procedurer i trin 5, og som kunne påvirke genekspression. Denne begrænsning kan afbødes ved at bekræfte resultaterne fra Western blotting med immunofluorescens, hvor fiksering tid er betydeligt mindre end for den høst tid for qPCR eller Western blot analyse.
Ud over adenoviral infektion, kan lentiviral infektion bruges i primær celler. For lentiviral infektion, tilføje 6 µg/mL virusinfektion enhancer reagens (se tabel over materialer) til cellerne og forsigtigt swirl pladerne. Efterfølgende, tilføje en lentivirus (med en titer på mindst 107 TU/mL) ved 1:1,000 og igen, forsigtigt hvirvel. Inkuber i 3-5 h (37 ° C, 5% CO2) og derefter fortsætte til nedstøbning af celler i kollagen eller basalmembranen matrix. For at generere lentivirus med et plasmid af interesse, kan bruge lentiviral emballage mix noteret i tabellen af materialer.
Yderligere ændring kan omfatte dyrkning af celler fra mus udtrykker KrasG12D. I disse mus, som allerede har fibrotisk områder med ADM og PanIN læsioner, tager collagenase fordøjelsen længere tid. Omhyggelig overvågning af collagenase fordøjelse, som beskrevet i de kritiske trin og fejlfinding, der kræves. Den mere abnormt væv en mus har, jo længere fordøjelse vil tage (omkring en time for en tolv-uge-forhenværende p48Cre; LSL-KrasG12D mus). Da der kan være enorm variation mellem mus i samme aldersgruppe, anbefaler vi at isolere acinar celler fra en LSL -KrasG12D mus og udføre adenoviral eller lentiviral infektion udnytte cre for at få muterede KRas udtryk. Også skal det bemærkes at vores protokol er optimeret til isolation af acinar celle til at undersøge ADM proces. Isolering af ADM og PanIN celler fra KrasG12D-udtryk for mus til organoid kultur kræver ændret protokoller.
Et kritisk trin er mængden af tid, hakkede bugspytkirtlen bruger i collagenase. Den ideelle collagenase fordøjelsestid kan variere fra mus til mus og mellem masser af collagenase fra samme firma. Den tid stod i protokollen er passende for pancreata vejer omkring 0,250 g. alt for meget tid kan skade og dræbe celler, mens for lidt tid vil resultere i ufuldstændig fordøjelse og derfor færre celler der vil gøre det gennem filtreringsprocessen ind på den endelige plade. Kontrollere dissociation visuelt ved at kigge efter fordeling af de hakkede op bugspytkirtlen stykker; Løsningen skal vende overskyet. Derudover før du stopper collagenase reaktion med kolde HBSS, kan løsningen tages op med en 5 mL pipette, hvor den lethed, hvormed løsningen kan tages op angiver, hvis det er hensigtsmæssigt at stoppe reaktionen. En ekstra overvejelse er antallet af pancreata høstet. Hvis mere end er én bugspytkirtlen isoleret på samme tid, proceduren virker bedst når pancreata holdes adskilt.
Et andet vigtigt punkt at sikre sund kultur af primær acinar celler er at omhu bør tages, når pipettering acinar celle løsning. Kraftig pipettering kan forårsage celleskader og resultere i en mangel på kanalen dannelse, selv med tilsætning af kendte ADM induktorer såsom TGF-α. Yderligere, hvis der er spørgsmål, levedygtighed, centrifugering i trin 2.4, 2.6 og 2.7 kan træffes ned til 300 x g til at producere en blødere pellet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en R01 tilskud (CA200572) fra NIH til PS. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Cancer Institute eller de nationale institutter Health.The finansieringskilderne spillede ingen rolle i studere design, dataindsamling og analyse, beslutning om at udgive, eller forberedelse af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21 G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/mL solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µL | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1,000 µL | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µL | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μL | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μL | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μL | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μL | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 mL | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 mL | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 mL | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 mL, 0.22 μm filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
References
- Rooman, I., Real, F. X. Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development. Gut. 61 (3), 449-458 (2012).
- Stanger, B. Z., Hebrok, M. Control of cell identity in pancreas development and regeneration. Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).
- Caldas, C., Kern, S. E. K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma. International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Morris, J. P. t, Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).
- Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice. Cancer Research. 63 (9), 2016-2019 (2003).
- Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).
- Liou, G. Y., et al. Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs. Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).
- De La, O. J., et al. Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).
- Habbe, N., et al. Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).
- Liou, G. Y., et al. Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions. Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).
- Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need. Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).
- Gout, J., et al. Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10 Unit 10 11-20 (2010).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).
