Summary
Aplicativos de jusante, modulação de expressão ou atividade de proteína, cultura e isolamento primário de células acinares são abundantemente úteis em ex vivo estudo de metaplasia acinares-para-ductal (ADM), um evento precoce no desenvolvimento de câncer no pâncreas.
Abstract
A diferenciação de células acinares para células Ductais durante a pancreatite e no desenvolvimento precoce do câncer de pâncreas é uma chave do processo que requer um estudo mais aprofundado. Para entender os mecanismos de regulação metaplasia acinares-para-ductal (ADM), ex vivo 3D cultura e diferenciação das células acinares primárias de células Ductais oferece muitas vantagens sobre outros sistemas. Com a técnica aqui, modulação da expressão da proteína é simples e rápida, exigindo apenas um dia para isolar, estimular ou infectar Viralmente e iniciar o cultivo de células acinares primárias para investigar o processo ADM. Em contraste com usando a matriz da membrana basal, a semeadura de aglomerados de células acinares em colágeno eu matriz extracelular, permite que as células acinares reter sua identidade acinares antes de manipulação. Isto é vital ao testar a contribuição de vários componentes para a indução da ADM. Não são apenas os efeitos de citocinas ou outros fatores ectopically administrados testável por intermédio da técnica, mas a contribuição de mutações comuns, expressão aumentada da proteína ou nocaute da expressão da proteína é testável através de infecção viral de células acinares primárias, usando vetores adenovírus ou particulas de Lentivirus. Além disso, as células podem ser re-isoladas de colágeno ou matriz da membrana basal no ponto de extremidade e analisaram para a expressão da proteína.
Introduction
O metaplasia acinares-para-ductal (ADM) é um mecanismo de proteção durante a pancreatite e uma chave do processo de desenvolvimento de câncer pancreático1 que requer mais uma visão mecanicista de condução. Enquanto induzida por inflamação ADM é reversível2, oncogênicos KRAS mutações, que estão presentes em 90% dos casos de câncer no pâncreas3, evitar a diferenciação para um fenótipo acinares4,5, 6. Culturing e diferenciar as células acinares primárias em células Ductais em cultura 3D permite o estudo dos mecanismos moleculares que regulam o processo ADM, que é difícil para o estudo in vivo. Tais ex vivo estudos permitem a visualização em tempo real de ADM, seus pilotos e seus reguladores. Foram identificados vários pilotos do processo ADM, bem como uma visão mecanicista sobre suas vias de sinalização a jusante, ou verificadas usar o aqui descrito método. Estes incluem indução de ADM por TGF-α (alfa do fator de crescimento transformador)-mediada por ativação de entalhe7, bem como RANTES (regulada na ativação, normal célula T expressa e secretada; também conhecido e expressão de MMP-7 (matriz metaloproteinase-7) como ligante chemokine 5 ou CCL5) e TNFa (fator de necrose tumoral alfa)-induzida através da ativação de NF-κB (fator nuclear-κB)8de ADM. Um mediador adicional da ADM é oncogênica KRas9,10, que provoca um aumento no estresse oxidativo que aprimora o processo ADM através do aumento da expressão de EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) e seus ligantes, EGF ( fator de crescimento epidérmico) e TGF-α11.
Enquanto o uso de linhas de células de câncer de pâncreas é comum para estudos in vitro, culturas de células primárias oferecem muitas vantagens. Por exemplo, células acinares primárias de não-transgênicos ratos ou camundongos abrigando iniciando mutações, tais como KrasG12D, são o modelo mais adequado para estudar o evento precoce da ADM, porque as células têm mutações alguns e controladas, que são conhecidos para estar presente no início do desenvolvimento de câncer no pâncreas. Isso é em contraste com muitas linhas de células de câncer pancreático que têm mutações múltiplas e variadas de expressão baseada em passagem número12. Além disso, as vias de sinalização identificadas por tais meios foram verificadas por estudos em animais. Uma limitação do uso de células acinares primárias é que eles não podem ser transfectados como linhas de células de câncer típico podem.
O método neste documento detalha as técnicas de isolamento de células acinares, cultura 3D que imita ADM adicionando estimulantes ou modulando a expressão de proteínas via adenovírus ou particulas de Lentivirus de infecção, bem como re-isolamento de células no ponto de extremidade para mais análises.
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Protocol
Todo o trabalho animal foi aprovado pelo IACUC clínica de Mayo.
1. preparação de materiais, soluções e Bases de matriz 3-dimensional
- Corte de 500 µm e 105 µm polipropileno malhas em 76 mm por quadrados de 76 mm. Dobre cada quadrado ao meio duas vezes para criar um quadrado menor dobrado. Lugar uma 500 µm e uma 105 µm de malha praça em um malote autoclaváveis.
- Rede de polipropileno de autoclave, praças, bem como dois pares de tesoura e pinça.
-
Fazer 100 mL de solução de Waymouth de 10x. Misture 1 frasco (14 g) de pó de Waymouth em 50 mL de água desionizada (DI) e, quando dissolvido, adicionar 30 mL de bicarbonato de sódio 7,5% (75 g/L). Traga o volume final de 100 mL com DI água e filtro de esterilizar.
- Mídia da loja 10 x Waymouth a 4 ° C e uso para preparar o gel de colágeno e mídia do 1 x Waymouth. Quando precipita o formulário, descartar.
- Fazer 50 mL de 1x mídia completa do Waymouth por pâncreas adicionando 125 µ l de inibidor de tripsina de soja de 40 mg/mL, 12,5 µ l de dexametasona 4 mg/mL e 500 µ l de soro fetal bovino (FBS). Esterilizar por filtração e usar dentro de 48 h.
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Preparar as bases de matriz 3-dimensional usando a matriz de colágeno ou membrana basal (consulte tabela de materiais para informações sobre o produto). Quando Pipetar a base, coloque a placa no gelo, evitar bolhas e girar a placa imediatamente após a pipetagem de volume de cada poço, para assegurar uma cobertura completa.
- Criar bases de colágeno, misturando os seguintes componentes no gelo em uma capa de cultura de tecidos: 5,5 mL do tipo eu rato cauda colágeno, 550 µ l de 10 x Media do Waymouth e 366.6 µ l de 0,34 M NaOH (filtrado).
Nota: Esta é a solução suficiente para fazer bases de colágeno para uma placa de 24 poços, 12-poços ou 6-poços. Um prato é suficiente para isolamento acinares de um pâncreas. - Use os seguintes volumes para a base de colágeno da placa: 80 µ l (lâmina de vidro de 8 poços), 200 µ l (placa de 24), 400 µ l (placa de 12) ou 800 µ l (placa de 6).
- Para a membrana basal matriz bases, pipetar a matriz sem quaisquer componentes adicionais. Use os seguintes volumes para cada poço: 50 µ l (lâmina de vidro de 8 poços), 120 µ l (placa de 24), 240 µ l (placa de 12) ou 600 µ l (placa de 6).
- Deixe as bases solidificar durante pelo menos 30 min em uma incubadora de cultura celular (37 ° C, 5% CO2) antes de criar uma segunda camada de matriz com células incorporadas em cima destas bases (passo 4).
- Criar bases de colágeno, misturando os seguintes componentes no gelo em uma capa de cultura de tecidos: 5,5 mL do tipo eu rato cauda colágeno, 550 µ l de 10 x Media do Waymouth e 366.6 µ l de 0,34 M NaOH (filtrado).
- Em preparação para isolamento acinares manter um copo de 600 mL, três tubos de 50 mL, um par autoclavado de tesoura, um par autoclavado de pinça e um balde de gelo sob o capô com três barcos de pesar. Em seguida, fazer 30 mL de HBSS com 300 µ l de 100 x penicilina-estreptomicina, colocando 10 mL em cada um dos dois barcos de pesar e mantendo o final 10 mL em um tubo de 50 mL (para uso em etapas 1.8.2 e 2.1.4).
- Fazer 40 mL de HBSS + 5% FBS, 20 mL de HBSS + 30% FBS e 5 mL de colagenase 2 mg/mL em HBSS. Esterilizar a colagenase por filtração (0,22 µm poro) e manter à temperatura ambiente. Mantenha cada uma das soluções HBSS no gelo.
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Monte um espaço de trabalho para dissecação do pâncreas, que pode ser feito em uma bancada de laboratório.
- Lugar um absorvente em cima da mesa, junto com uma tampa de poliestireno coberto com papel de alumínio. Em seguida, coloque uma toalha de papel com 4 pinos na parte superior da folha.
- Mantenha os seguintes itens ao alcance o espaço de trabalho de dissecação: um saco de incineração, um conjunto de tesoura esterilizada e fórceps, um frasco de spray com 70% de etanol e um balde de gelo (com o tubo de 50 mL de HBSS contendo penicilina-estreptomicina da etapa 1.6).
- Definir uma centrífuga a 4 ° C e um agitador de 37 ° c.
2. isolamento de célula acinares
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Sacrificar o mouse através de indução de CO2 e realizar o deslocamento cervical. Imediatamente disse o pâncreas. Dissecar o pâncreas, o primeiro pino as patas do rato para a tampa de poliestireno, orientar o mouse, tal que a cauda está enfrentando o pesquisador e pulverizar o abdômen com etanol a 70%.
Nota: o mouse utilizado nos resultados representativos era uma fêmea não-transgênicas 12 - semana de idade com fundo C57BL/6. Seleção de mouse é discutida na seção de discussão.- Usando um conjunto de tesoura esterilizada e pinça, levante a pele/pele com a pinça na linha e use a tesoura para fazer uma incisão através da pele e pele da abertura uretral para a área do diafragma/caixa torácica.
- Faça incisões adicionais à esquerda e à direita, tal que a pele/pele é cortada para criar uma visão clara da cavidade abdominal. Em seguida, cortar o revestimento peritoneal (ao meio e para a direita e esquerda) e afastar os órgãos, como foi feito com a pele/pele.
- Levante os intestinos com a pinça e colocá-lo para o lado esquerdo do mouse, criando espaço para ver o pâncreas, que é luz em cor-de-rosa e anexado para o baço, que é um oval vermelho escuro. O tecido pancreático é distinguido por sua textura macia, esponjosa. Corte o pâncreas que será executada ao longo do estômago e se entrelaçam com os intestinos.
- Separe o baço pâncreas. Em seguida, colocar o pâncreas em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de HBSS com 1 x penicilina-estreptomicina e trazer isso para o capô do fluxo laminar.
Nota: As etapas restantes do protocolo devem ser feitas utilizando uma técnica estéril em uma capa de fluxo laminar.
- Despeje o pâncreas e HBSS (com penicilina-estreptomicina) em um vazio pesa o barco e, usando fórceps, lave o pâncreas agitando-lo. Em seguida, mova o pâncreas com a pinça para um segundo pesar barco contendo HBSS (com penicilina-estreptomicina). Lave novamente, o pâncreas e agitando.
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Mover o pâncreas para o terceiro HBSS (com penicilina-estreptomicina)-contendo a pesar do barco e começar cortando o pâncreas em pedaços pequenos de 5 mm ou menos. Em seguida, despeje o pâncreas peças e HBSS um tubo vazio de 50 mL.
- Para fazer isso, use a pinça para mover as peças do pâncreas para o líquido como o barco de pesagem está sendo derrubado. Despeje uma vez que todas as peças já não estão conectadas para o barco de pesar. Pegue todos os pedaços restantes com a pinça e lavar a pinça do tubo de 50 mL contendo o pâncreas em HBSS com penicilina-estreptomicina.
- Centrifugar a 931 x g por 2 min a 4 ° C e remova o HBSS (e qualquer gordura que flutua) pipetando-lo fora com uma pipeta de 5 mL.
- Adicione 5 mL de colagenase (diluído em HBSS na etapa 1.7) para o pâncreas. Certifique-se de uma tampa selada envolvendo o tubo de 50 mL em filme plástico da parafina e coloque-o em uma incubadora a tremer a 220 rpm por 20 min a 37 ° C.
Nota: O tempo de digestão de colagenase pode variar, como observado na discussão. No final da incubação, devem permanecer sem grandes peças de tecido. - Para parar a dissociação, colocar o tubo contendo pâncreas no gelo e adicionar 5 mL de frio HBSS + 5% FBS. Centrifugar a 931 x g por 2 min em 4 ° C e, em seguida, pipetar fora o sobrenadante usando uma pipeta de 5 mL.
- Resuspenda em 10 mL de HBSS + 5% FBS e centrifugar 931 x g por 2 min a 4 ° C. Pipetar o sobrenadante usando uma pipeta de 5 mL de fora e repita esta etapa com mais 10 mL de HBSS + 5% FBS.
- Resuspenda em 5 mL de HBSS + 5% FBS e, usando um P1000, transferir 1 mL de cada vez através de uma malha de 500 µm em um tubo de 50 mL. Adicionar um adicional 5 mL de HBSS + 5% FBS através da malha com um P1000 para lavar qualquer restantes células do pâncreas através da malha.
- Colocar a suspensão de células da 500 µm malha através da malha de 105 µm por pipetagem 1 mL de cada vez usando um P1000. Em seguida, delicadamente a pipeta a suspensão de células para um tubo contendo HBSS + 30% FBS. Uma camada de suspensão de células irá formar na parte superior; após centrifugação, as células acinares vão afundar para formar um pellet.
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Centrifugar 233 x g por 2 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 x mídia completa do Waymouth.
- Se proceder directamente à embedment de células em colágeno ou matriz de membrana basal, resuspenda em um volume de 7 mL por pâncreas. Se proceder à infecção adenovírus ou particulas de Lentivirus, resuspenda em 4 mL por pâncreas.
3. virose
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Como um pâncreas são suficiente para duas infecções virais (controle e experimental, por exemplo, null e cre), dividir a suspensão de células entre as tampas das duas placas de 35 mm. Usando a tampa das placas permite a infecção em suspensão e, portanto, fácil movimento sobre o substrato final mais tarde.
- Quando se trabalha com vírus, mergulhe todas as pontas de pipetas utilizado em água sanitária 10% pelo menos 15 minutos.
Nota: Utilização das placas de 35 mm e o volume de 4 mL funciona bem para células de ratos não-transgênicos entre 8 e 16 semanas de idade. O tamanho da placa e o volume podem precisar de ser ajustados para animais com menor ou maior pancreata.
- Quando se trabalha com vírus, mergulhe todas as pontas de pipetas utilizado em água sanitária 10% pelo menos 15 minutos.
- Para infecção por adenovírus, adicionar o vírus (com um título de pelo menos 107 TU/mL) a uma diluição de 1:1,000 para a tampa de cada placa e redemoinho (Figura 2, adenovírus GFP). Coloque as placas em uma incubadora de cultura celular (37 ° C, 5% CO2) e agite a cada 15 minutos para 1 h. incubação de continuar por um adicional h 2 e vá para o embedment de células na matriz de colágeno ou membrana basal.
- Depois de completar o trabalho viral no capô, molho todos os componentes do capuz com 10% de lixívia pelo menos 15 minutos e em seguida, limpe cuidadosamente a lixívia usando etanol a 70%.
4. embedment de células em colágeno ou matriz de membrana basal
- Gel de colágeno faz no gelo pela combinação de 7 mL tipo I colágeno de cauda de rato (3,3 mg/mL) e 700 µ l de 10 x mídia do Waymouth 466.6 µ l de 0,34 M NaOH.
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Tendo volumes iguais de suspensão de gel e células de colágeno, misture suavemente. Se a adição de um estímulo ou inibidor, combine isso com a suspensão de células de colágeno. Um poço da placa de cada vez (placas da etapa 1.5.3); mantendo a placa no gelo, redemoinho para distribuir uniformemente a camada de células de colágeno.
- Em cada poço, pipetar os seguintes volumes de suspensão de células de colágeno: 200 µ l (lâmina de vidro de 8 poços), 500 µ l (placa de 24), 1000 µ. L (placa de 12) ou 2000 μl (placa de 6). Observe que a ADM é induzida através de estimulação com TGF-α (50 ng/mL) na Figura 2.
- Para embedment de células na matriz da membrana basal, mistura matriz da membrana basal de uma parte com dois-peças de suspensão de células. Como com colágeno, manter a suspensão de célula-matriz, bem como a placa de gelo. Pipetar um bem cada vez usando os mesmos volumes observados no 4.2.1 e redemoinho para distribuição uniforme.
- Coloque a placa em uma incubadora de cultura celular (37 ° C, 5% CO2) por 30 min para solidificar e adicionar 1 x meios de comunicação completos do Waymouth com qualquer estímulo ou inibidor (Figura 2 usos TGF-α a 50 ng/mL). Altere os meios de comunicação (com estímulo ou inibidor) no dia seguinte e depois todos os outros dias. Dependendo do estímulo, a ADM pode ser observada entre dia 3 e dia 5.
5. colheita de células de colágeno, ou matriz de membrana basal
- Coletar os seguintes materiais necessários para a colheita de células de colágeno: 30 mL de colagenase 1 mg/mL diluído em HBSS, 40 mL de HBSS frio, 31 mL de PBS, duas espátulas, dois tubos de 50 mL e gelo frio. Ajuste o número de espátulas, tubos e quantidade de soluções se comparar mais de duas condições de cultura (onde cada condição é ½ de um prato). Definir o centrifugador a 4 ° C e definir a tremendo incubadora a 37 ° C.
- Remova a mídia e usar espátulas para remover os discos de colágeno com células incorporados. Para cada condição, colocar os discos em um separado, esvazie o tubo de 50 mL.
- Adicione 10 mL de colagenase 1 mg/mL em HBSS a cada tubo de 50 mL. Enrole os tubos com película de plástico da parafina e colocar em um 37 ° C, agitando a incubadora a 225 rpm até 45 minutos. Monitorar a digestão e remover os tubos quando há não mais visível colágeno.
- Centrifugar a 233 x g a 4 ° C por 2 min com desaceleração mínima. Tire o sobrenadante e ressuspender em 5 mL de solução de colagenase por tubo. Digerir em um 37 ° C, agitando a incubadora a 225 rpm por 10 minutos ou até que não haja nenhum colágeno visível.
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Impedir a digestão pela adição de 5 mL de HBSS frio e posteriormente a centrifugação a 233 x g por 2 min a 4 ° C, com mínima desaceleração.
- Resuspenda em 15 mL de HBSS frio e centrifugar novamente a 233 x g por 2 min a 4 ° C, com mínima desaceleração. Repita.
- Resuspenda o pellet em 1 mL de PBS e mover-se ao tubo de 1,5 mL. Centrifugue em um balde de balanço a 233 x g por 2 min a 4 ° C, com mínima desaceleração. Remova o sobrenadante e snap-congelamento em nitrogênio líquido ou em gelo seco.
Nota: O centrifugado pode ser armazenado a-70 ° C ou usado imediatamente em aplicações de jusante. - Para colher células-matriz-incorporado da membrana basal, mídia de pipeta de cada poço em um tubo de 50 mL no gelo. Em seguida, adicione a solução de recuperação de matriz de membrana basal a cada poço e raspar a mistura de célula-gel para o tubo de 50 mL.
Nota: O volume da solução de recuperação de matriz de membrana basal para adicionar a cada poço é a seguinte: 150 µ l (lâmina de vidro de 8 poços), 420 µ l (placa de 24), 845 µ l (placa de 12) e 2.000 µ l (placa de 6). - Lave bem duas vezes com a solução de recuperação de matriz da membrana basal, adicionando as lavagens para o tubo de 50 mL.
Nota: O volume da solução de recuperação de matriz de membrana basal para cada enxágue é a seguinte: 150 µ l (lâmina de vidro de 8 poços), 420 µ l (placa de 24), 845 µ l (placa de 12) e 2.000 µ l (placa de 6). - Deixar o tubo no gelo por 1h ou até que a matriz da membrana basal dissolve-se e siga com centrifugação a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 mL de PBS frio (pode transferir para tubo de 1,5 mL se centrifugado é desejado).
- Centrifugar a 3.500 x g por 3 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e qualquer snap congelar o centrifugado ou adicionar Lise e prossiga diretamente para aplicações a jusante.
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Representative Results
Conclusão do protocolo aqui ocorre dentro de um dia e após estimulação, ADM é visto em 3-5 dias. A Figura 1 descreve a sequência do método, no qual as etapas 1 a 4 são concluídas no primeiro dia. Isso inclui a preparação, isolamento acinares, infecção viral e embedment em colágeno ou matriz de membrana basal. Enquanto a matriz da membrana basal induz ADM, células acinares dentro de colágeno requerem um estímulo, como o TGF-α, submeter-se a diferenciação de células Ductais. No dia 1, as células em matriz de colágeno ou membrana basal tem uma aparência redonda de uva e se utilizando de infecção viral com um vetor de expressar uma proteína fluorescente, eficiência de infecção pode ser verificada. No dia 5, as células de colágeno formarão dutos se dado um estímulo na época do embedment e como um suplemento nos meios de comunicação, que são alterados nos dias 1, 3 e 5. Incorporado em matriz de membrana basal de células irão formar condutas na ausência de um estímulo, mas após estimulação irão formar ductos maiores, como visto na Figura 2.
Figura 1 : Esquemático do procedimento para isolar células acinares primárias murino, modular a expressão de proteínas e/ou estimular o metaplasia acinares e Ductais e incorporar células na matriz de colágeno ou membrana basal. O fluxo de trabalho inclui o isolamento de células acinares, que inclui a dissecação do pâncreas, digestão e filtração das células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Resultados representativos dos principais células acinares chapeados dentro da matriz de colágeno ou membrana basal após infecção por adenovírus e estimulação com TGF-α. Células acinares primárias de um mouse não-transgênicas foram infectadas com GFP-adenovírus, incorporado em colágeno, ou matriz de membrana basal e estimulada com ou sem TGF-α (50 ng/mL). Vinte e quatro horas pós infecção por adenovírus GFP, imagens foram capturadas para mostrar a eficiência da infecção. A pós-infecção cinco dias, as imagens denotam as diferenças nas células estimuladas com ou sem TGF-α em colágeno ou matriz de membrana basal. Duto-como estruturas são indicadas por setas brancas e escala representam barras que 50 µm. imagens foram obtidas utilizando um microscópio confocal com o objetivo de CE plano-Neofluar 10 x / 0,3 M27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A quantidade relativamente curta de tempo para isolamento, infecção e chapeamento de células acinares primárias é uma vantagem deste método. Em contraste, o cultivo de células acinares de uma consequência de explant requer pouco tempo de hands-on, mas demora sete dias para a consequência natural de células acinares13. Um protocolo alternativo para isolamento acinares14 observa um método muito curto para a obtenção de células acinares; no entanto, o EGF é um componente essencial na manutenção de células acinares vivo quando isolado usando esse protocolo. Desde que a EGF estimula a diferenciação de células acinares para células Ductais, neste documento, o método que não requer componentes ADM-estimulante para a cultura, é melhor para estudar os mecanismos de indução ou regulamento da ADM. Neste método, a identidade de células acinares é mantida durante o cultivo em colágeno, a não ser estimuladas a se diferenciar em células Ductais. Além disso, dificuldades em transfecting as células primárias são superadas através de manipular a expressão da proteína por infecção viral.
Este procedimento oferece estudo direto de ADM, pelo qual visualização de estrutura ductal indução pode ocorrer através de microscopia brightfield e/ou imunofluorescência. Para aplicativos de imagem, slides de câmara (observados na Tabela de materiais) são os melhores. Fixação por 15 min a 37 ° C com paraformaldeído 4% irá corrigir células incorporado em matriz de membrana basal sem estruturas Ductais perturbadoras. Durante esta incubação, a matriz da membrana basal vai dissolver e pode ser pipetada delicadamente fora com o paraformaldeído. Imunofluorescência em células de colágeno incorporado é descrita em detalhes no âmbito de protocolos adicionais15,16. Outras aplicações para as análises dos mecanismos de sinalização envolvidas no ponto de extremidade do experimento incluem borrão ocidental, qPCR e fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação. Um sexto de um pâncreas é material suficiente para análise de uma amostra via Western blot ou qPCR.
Limitações do presente protocolo surgem do uso da matriz de colágeno ou membrana basal, onde cada um tem suas vantagens e desvantagens. Enquanto embedment de células em colágeno só produzirá dutos se estímulos são dadas, membrana basal embedment de matriz irá produzir dutos sem estímulos adicionais. No entanto, ductal tamanho na matriz da membrana basal é uma saída mensurável. Uma limitação adicional é o tempo envolvido nos procedimentos de colheita na etapa 5, que podem afetar sua expressão gênica. Esta limitação pode ser atenuada, confirmando os resultados obtidos através da mancha ocidental com imunofluorescência, no qual o tempo de fixação é muito menor do que o tempo de colheita para qPCR ou análise ocidental do borrão.
Além de infecção por adenovírus, Lentivirus infecção pode ser usada em células primárias. Para infecção Lentivirus, adicionar 6 µ g/mL de reagente potenciador infecção viral (ver quadro de materiais) para as células e suavemente agite as placas. Posteriormente, adicionar os lentivirus (com um título de pelo menos 107 TU/mL) a uma diluição de 1:1,000 e outra vez, agite suavemente. Incubar durante 3-5 h (37 ° C, 5% CO2) e depois continuar a embedment de células na matriz de colágeno ou membrana basal. Para gerar lentivirus com um plasmídeo de interesse, use a mistura de Lentivirus embalagens observada na tabela de materiais.
Modificação adicional pode incluir isolamento de células de camundongos expressando KrasG12D. Nestes ratos, que já tem áreas fibróticas com lesões ADM e PanIN, digestão de colagenase leva mais tempo. Cuidadoso monitoramento da digestão de colagenase, conforme descrito nas etapas críticas e solução de problemas, é necessário. O tecido anormal mais um rato tem, quanto mais a digestão levará (em torno de uma hora para um p48Cre de de doze semanas de idade; LSL-KrasG12D rato). Uma vez que pode haver imensa variação entre ratos da mesma idade, aconselha-se a isolar as células acinares de um mouse de LSL -KrasG12D e executar o adenovírus ou particulas de Lentivirus infecção utilizando cre para obter a expressão de KRas oncogênica. Também note que nosso protocolo é otimizado para isolamento de células acinares para investigar o processo ADM. O isolamento de células ADM e PanIN de KrasG12D-expressar ratos para cultura de organoides exige alteradas protocolos.
Um passo crítico é a quantidade de tempo que o pâncreas picado gasta em colagenase. O tempo de digestão de colagenase ideal pode variar de rato de rato e entre lotes de colagenase da mesma empresa. O tempo indicado no protocolo é apropriado para pancreata pesando sobre 0,250 g. Too muito tempo podem danificar e matar as células, enquanto pouco tempo resultará na digestão incompleta e, portanto, menos células que irão torná-lo através do processo de filtragem para o placa final. Verifique a dissociação visualmente olhando para a avaria das peças cortada pâncreas; a solução deve virar nublada. Além disso, antes de parar a reação de colagenase com frio HBSS, a solução pode ser tomada até com uma pipeta de 5 mL, onde a facilidade com que a solução pode ser tomada até indicará se é apropriado parar a reação. Uma consideração adicional é o número de pancreata colhida. Se mais de um pâncreas é isolada ao mesmo tempo, o procedimento funciona melhor quando o pancreata são mantidos separados.
Outro ponto importante para garantir uma cultura saudável de células acinares primárias é que deve ter cuidado quando Pipetar a solução de células acinares. Pipetagem vigoroso pode causar danos nas células e resultar em uma falta de formação do ducto, mesmo com a adição de indutores ADM conhecidos, tais como TGF-α. Além disso, se houver problemas de viabilidade, a centrifugação em etapas 2.4, 2.6 e 2.7 pode ser tomada até 300 x g para produzir uma pelota mais suave.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por um grant R01 (CA200572) do NIH para PS O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de câncer ou a institutos nacionais de Health.The financiadores não tiveram nenhum papel em estudar design, coleta de dados e análise, a decisão de publicar, ou preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21 G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/mL solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µL | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1,000 µL | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µL | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μL | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μL | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μL | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μL | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 mL | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 mL | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 mL | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 mL, 0.22 μm filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
References
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- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).
