Summary
여기, 선물이 멕시코 cavefish의 일련의 높은 처리량 연구 방법 행동 및 mechanosensory 시스템의 중요 한 얼룩. 이러한 방법 사용 무료 소프트웨어 및 맞춤 스크립트, 행동의 연구에 대 한 실용적이 고 비용 효율적인 방법을 제공 하.
Abstract
동굴 주거 동물 그들의 끊임없이 어둡고 음식 스파스 환경에 적응 형태학과 행동 특성의 일련을 진화 했다. 이러한 특성 중에서 채집 행동 행동 특성이 진화의 기능적 장점에 유용한 윈도우 중 하나입니다. 진동 매력 동작 분석에 대 한 업데이트 메서드는 여기에 소개 (VAB: 적응형 구하고 동작)와 동굴 적응 tetra의 관련된 mechanosensors의 이미징 Astyanax mexicanus. 또한, 메서드는 추가 cavefish 행동 과다, 수 면 감량 등의 일련의 높은 처리량 추적을 위해 제공 됩니다. Cavefish는 또한 asociality, 반복적인 동작과 높은 불안을 보여준다. 따라서, cavefish는 동물 모델 진화 동작에 대 한 역할을 합니다. 이 방법은 행동의 다른 종류에 적용 될 수 있는 무료 소프트웨어 및 맞춤 스크립트를 사용 합니다. 이러한 메서드는 상용 추적 소프트웨어에 대 한 실용적이 고 비용 효율적인 대안을 제공합니다.
Introduction
멕시코 tetra, Astyanax mexicanus (Teleostei: Characidae), 2 개의 근본적으로 다른 대체 변경해-시력, 표면-아리 스토 프 및 눈 먼, 동굴 주거 morph 여러 별개의 구성 하는 데 물고기 가운데 독특한 인구1. 비록 다른 형태학과 생리학에서 그들은 여전히 interfertile2,3입니다. 이러한 interfertile 변경해 빠르게 진화 (~ 20000 년)4, 그들에 게 빠른 적응의 연구에 대 한 이상적인 모델 시스템으로 나타납니다. Cavefish 분기 형태학과 행동 특성 입맛, mechanosensors, 꼴을 준 행동 과다, 진동 자극의 특정 한 주파수에 조정의 증가 수의 증가 밀도 등의 제품군으로 알려져 있습니다 그리고 불면증입니다. 5 를 구하고 고 어둡고 음식 스파스 환경6,7에 에너지 절약에 대 한 동굴의 어둠 속에서 유리한 것 제안 되었습니다 일부는 동시에, 진화 가능성이 이러한 행동의 많은.
많은 진화 모델 시스템에서 지식을 통합 환경에 대 한 응답에서 방법 동물 형태학 및 행동 변화에 대부분 종 복잡 한 환경에서 지속적인 그라데이션 분산 되어 있기 때문에 어렵습니다. 그러나, 동굴 및 표면 morph Astyanax 높은 대조 날카로운 ecotone에 의해 delineated 환경에서 진화 사이의 극명 한 대조 동물 진화를 이해 하 Astyanax 는 우수한 모델 급부상을 주도하 고 있다. 이 유전자 및 적응 특성과 환경에서 선택과 개발 프로세스 보다 쉽게 연결 가능 하 게. 또한, 최근 생물 조사 Astyanax 에 이러한 특성의 이러한 특성 인간의 증상8,,910병렬 수 있습니다 나타났습니다. 예를 들어 사회와 수 면, 손실과 과다, 반복적인 행동, 및 코 티 솔 수준 증가 무슨 자폐증 스펙트럼 장애8인간에서 관찰은 비슷합니다.
많은 행동과 형태학 상 특성의 복잡 한 공동 진화를 해결 하려면 기본 유전과 분자 경로 강조 하기 위해 그들의 많은 시험에 유리 하다. 여기에 소개의 Astyanax의 표면, 동굴, 그리고 하이브리드 변경해의 동굴 형 행동 고기 정도 특성화에 대 한 방법이 있습니다. 초점 동작 phenotype 특성 분석 이란 동굴 적응 꼴을 준 행동 (진동 매력 행동, 라고도 이제 VAB), 및 과다/절전 기간11,12. 또한 발표 VAB13과 관련 된 감각 시스템에 대 한 이미징 방법이 이다. 최근에, 행동 분석 실험을 실행 하기 위한 많은 오픈 소스 추적 소프트웨어는 사용할 수 있는14,15되고있다. 이 짧은 비디오, 미만 10 분 동안 잘 작동. 그러나, 그것은 비디오는 강렬한 계산/추적 시간 때문에 더 문제가 된다. 수 상용 소프트웨어는 비쌀 수 있다. 제시 하는 방법을 주로 사용 하는 프리웨어 그리고 그러므로 비용 효과적이 고 높은 처리량 방법으로 간주 됩니다. 또한 포함 된 대표적인 결과 기반으로 이러한 방법을 합니다.
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Protocol
모든 절차는 "원리의 실험실 동물 관리" (국립 건강 연구소 간행물 번호 85-23, 개정 1985) 및 대학교의 하와이 마노아 기관 동물 관리 및 사용에 의해 승인에 설명 된 지침에 따라 수행 됩니다. 위원회 동물 프로토콜 17-2560-3입니다.
1. 진동 매력 동작 (VAB) 분석 결과 (≤ 전체 녹음 절차에 대 일 분)
참고: 적외선 민감한 카메라를 사용 하거나 USB 웹캠 수정 하 여 적외선 카메라를 구축. USB 웹캠을 수정 하려면 제시한 킨 연구소 (이 A. mexicanus 문제에서), 정돈에이 cavefish 문제에 자세한 설명 또는 보충 자료에 대 한 간략 한 설명 참조.
- 녹음 설정
- 카메라 위치에 유지 되도록 아직도, 그리고 기록 되 고 과목에서 적절 한 초점에 구축 블랙 박스 프레임에서 폴 리 염화 비닐 (PVC) 파이프, 120 cm H x 45 cm L x 90 W. cm
- 프레임의 건설, 후 원하는 수경 농업 등 플라스틱 정전 커튼으로 커버.
- 프레임 위에 가변 줌 C 마운트 렌즈는 같은 직경 측정 센터에서 적외선 카메라에 대 한 창 블랙 아크릴 보드를 넣어. 이 상자 안에 VAB 시험 장비 (그림 1)을 놓습니다.
- 진동 장치
참고: 진동 작은 함수 발생기를 사용 하 여 생산 됩니다.- 다음 방법에 대 한 진동 진폭을 0.15 m m 및 40 Hz의 주파수는 매력5,16의 최대 응답을 elicits 주파수 조정.
- 수평 방향 스피커를 함수 발생기를 연결 합니다.
- 뜨거운 접착제 또는 가스 켓 접착제를 사용 하 여 스피커의 먼지 덮개 7.5 m m 직경 유리 막대 길이 14 센티미터를 연결 합니다.
- 이 막대를 아래쪽으로 향하게 수직 다른 7.5 m m 직경 유리 막대 4 cm 길이 (그림 1)에 연결 합니다.
- 행동 분석 결과
- 12/12 L/D 주기 조건된 물 (pH 6.8-7.0, 전도도 약 700 µS, 온도 약 22 ˚C 사이)로 채워진 원통형 시험 챔버에 4 일 동안 실험 A. mexicanus 를 적응. 물고기 마 초를 그들의 대기 시간을 관찰 하 여 acclimated 했습니다 여부를 확인 합니다. 그들의 가정 탱크 보다 더 긴 대기 시간 더 많은 새 환경 순응 시간이 필요 나타냅니다. 새 환경 순응, 전체 피드 라이브 Artemia nauplii와 하루에 한 번.
- (3 일 후 새 환경 순응의), 분석 결과의 하루 전날 시험 챔버에 물이 조절된 민물 바꿉니다.
- 당일 (4 일 후 새 환경 순응의) 분석 결과, 분석 결과 완료 한 후 실험 물고기까지 음식의 박탈. 포만 진동에 그들의 응답을 변경 됩니다.
- VirtualDub 프리웨어17에 녹음 매개 변수 설정: 15 프레임/s, 코덱: x264vfw, 녹음 시간: 3 분 30 s.
- 40 Hz로 튜닝 하 여 방출 하는 진동 장치 (단계 1.2 참조)를 준비 합니다. 장치 설명에 대 한 그림 1 을 참조 하십시오. 모든 수용 성 화학 물질을 제거 하는 이온된 수와 진동 유리 막대를 씻어.
- 어둠 속에서 working 분석 결과 실린더 블랙 박스에는 적외선 백라이트 조명 녹음 단계에 놓고 3 분 동안 적응 하는 물고기를 허용 합니다.
- 3 분 새 환경 순응 후 3 분 30 s의 비디오를 기록 합니다. 녹음의 발병에 물 열 (약 0.5 c m 깊이)에 진동 유리 막대를 삽입 합니다.
- 하지 마십시오 어떤 소음 또는 진동 생선으로 물에 진동 유리 막대를 배치 하는 동안 감각을 수 있습니다 심지어 가장 작은 소요를.
- 30 내에서이 절차를 완료 s 시작 되도록 비디오 녹화의 동작의 3 분 이상 기록 됩니다.
- 이 단계 중에 오류가 발생 되도록 기록 하는 동안 비디오를 모니터링 합니다.
- 녹음을 마친 후 원통형 분석 결과 약 실에서 진동 유리 막대를 제거 하 고 녹음 단계에서 시험 챔버를 제거 합니다. 1.3.5 다음 생선에서 반복 합니다.
- 비디오 분석
참고: Windows 운영 체제18 (표 1) 작동 코덱이 ImageJ 로드할 수 있는 형식으로 변환 합니다.- ImageJ를 설정된 분석 매개 변수를 읽을 수 있는 형식으로 압축 된 avi 비디오를 변환 합니다.
- AviSynth_260.exe (https://sourceforge.net/projects/avisynth2/), pfmap 빌드 178 (http://pismotec.com/pfm/ap/), 그리고 avfs ver1.0.0.5 또는 ver1.0.0.6 (https://sourceforge.net/projects/avf/)를 설치 합니다. 참고가 방법은 프로그램/버전 민감한. 제공 된 웹 사이트 링크는 적절 한 버전 (표 1)에 안내할 것입니다.
- Avs_creater.bat (보조 파일)을 두 번 클릭 하 여 배치 파일을 실행 합니다. Avs 비디오 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 분석 ( avs_creater.bat로 만든 avs 파일에서 선택).
- ImageJ의 추적기 플러그인을 사용 하 여 비디오 분석 ImageJ 매크로 추가 파일 ( Macro_VAB_moko.txt)의 로딩을 필요로, ImageJ의 GUI 셸으로 드래그 앤 드롭 하 여 매크로 로드 합니다. 이 매크로는 다음과 같은 분석에 대 한 특정 핫 키 수 있게 됩니다.
- 작업 디렉터리에 "Process_ImageJ"는 새로운 폴더를 만듭니다.
- .Avs 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 분석 ( avs_creater.bat로 만든 avs 파일에서 선택). 빠른 마운트 옵션을 선택 합니다. Avs 파일이 외장 드라이브로 탑재 후 ImageJ에서 avi 파일을 열고 (avi 파일 이름 끝에 ".avi"와 함께).
- 거리 측정의 규모를 설정 하려면 직선 선택 도구를 사용 하 여 챔버에 걸쳐 직선을 그려서 시험 챔버의 직경을 선택 클릭 분석 > 설정 규모 기능. 9.4 c m 내부 직경을 가진 원통 모양 접시를 사용 하는 경우 예를 들어 9.4 c m 를 입력 합니다. 다음 비디오 분석의 전체 규모를 표준화 하기 위하여 글로벌 의 라디오 상자를 확인 합니다.
- 이진 스택으로 변환 하 고 분석을 실행 합니다.
- 타원형 선택 도구를 사용 하 여 분석 결과 챔버 영역 복사 다음 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 합니다 이미지 > 중복. 이 시점에서 추가 분석에 대 한 예를 들어, 진동 막대 (이것은 비디오의 정확히 3 분 15 fps)에서 물을 입력 한 후 처음 2700 프레임을 유지 하는 프레임의 범위를 지정 합니다.
- 시험 챔버의 외부를 선택을 취소 하 고 키보드의 숫자 모음에 핫 키 7 바이너리 이미지를 변환 합니다.
- 배경 지우고 하 고 프롬프트가 나타나면, 이미 검정 채우기 기능 설정 타원형 선택 도구를 사용 하 여 진동 유리 막대의 위치를 나타내는 중심에 검은 점을 추가 합니다. 확인 을 클릭 합니다 임계값 조정에 이동 하 라는 메시지가 표시 됩니다.
- 물고기의 이진 (모든 흑인과 백인) 이미지를 만들기 위해 임계값을 설정 합니다. 물고기 전체 비디오 클립을에서 볼 수 선택한 다음 적용되도록 임계값을 조정 합니다.
- 숫자 모음에 핫 키 8 명 중에 의해 "추적자" 플러그인을 실행 합니다. 100 때 메시지가 표시 되 고 확인, 생성 하는 진동 로드 및 이진 영상의 모든 3 분에 대 한 프레임 당 물고기 사이의 거리를 최소 픽셀 크기를 설정 합니다.
- 비디오에서 잡음에 의해 생성 된 잘못 추적을 조정 합니다. 이렇게 하려면, 확인 그 프레임 (예: 물 또는 막대의 투명 한 팔의 그늘에서 입자)에서 개체 번호 3 또는 더 높은 나타내는 추가 개체를 반환 하는 프레임을 식별 하려면 결과 창 "막대"와 "물고기"는 프레임입니다. 페인트브러쉬 도구를 사용 하 여 추가 개체를 제거 합니다.
- 좌표와 거리 데이터 (보충 파일 CF01.xls, Threshold_CF01.tif, Trac_CF01.tif (경우에 다시 분석 해야 하는) 전체 비디오 이미지의 이진 스택을 내보내려면 번호 바는.xls 파일에 핫 키 9 명 중 ). 핫 키 9 또한 현재 비디오와 관련 된 모든 파일을 닫습니다. 모든 복제에 대 한 1.4.2.1 1.4.2.6 통해 단계를 반복 합니다.
- 하나의 스프레드시트에 여러 개의 추적 결과 파일 (.xls)를 통합 하 여 수와 막대에서 1.5 cm 지역에 접근의 기간 계산 매크로 스크립트 (보충 파일 JoVE_2cmVAB_template_15fps.xlsm) 실행 합니다. 적어도 0.5 s는 지속 되지 접근 계산 되지. 관심의 특정 질문에 따라 접근 방식으로 계산 하는 시간과 거리의 매개 변수를 변경 합니다.
- 모든 분석을 마친 후 PC의 디스크 공간을 해제. 탑재 된 파일을 디스크 공간-제거 avi.avi 및. avi.avs 파일 (확장 소프트웨어에 의해 생성 된)-실행 하 여 일괄 처리 avs_creater.bat 1.4.1.2 섹션에 실행 된 동일한 폴더에 multiunmountdel.bat 파일.
- ImageJ를 설정된 분석 매개 변수를 읽을 수 있는 형식으로 압축 된 avi 비디오를 변환 합니다.
2. 수 면 및 과다 분석 결과 (24 시간 녹음)
- 행동 분석 결과
- 5 실험 물고기 4 일 또는 10 L 아크릴 녹음 맞춤형 수족관의 각 챔버에 더 적응 (45.9 c m x 17.8 c m x 17.8 c m, 길이 x 폭 x 깊이, 각각) 조건된 물으로 가득 (1.3.1 단계 참조).
- 각 개별 챔버 챔버 88.9 측정 크기에서 동등한 만드는 검은 아크릴 보드 구분 m m × 177.8 m m × 177.8 m m (그림 2). 각 탱크 챔버 사이 점프에서 물고기를 방지 하기 위해 커버를 해야 합니다.
- 프로그래밍 가능한 전원 타이머 자동으로 백색 LED 빛 12 h에 대 한 설정 하 고 해제를 설정 12 h 새 환경 순응 기간 동안 매일 매일에 대 한 (예를 들어 7 시에 빛을 설정 하 고 해제 7 시). 이 (만약 그것이 유입에 취약) 물고기의 circadian 리듬 끌고가 다 것입니다.
- 사용 하 여 비슷한 치수의 불투명, 백색 아크릴 보드 10 L 탱크 디퓨저로 모든 탱크에 걸쳐 확산 빛도 강도 제공 통해 백색 및 적외선 빛을 통과.
- 새 환경 순응, 전체 하루 Artemia nauplii 라이브 고 각 수족관에서 스펀지 필터를 통해 통 기 통풍을 제공 피드.
참고: 일관 된 시간에 물고기 먹이 확인 (즉, 오전 9 시에 일 당 1 x) 시간을 먹이 circadian 리듬19의 유입 영향을 또한 수 있습니다. - 물고기 마 초를 그들의 대기 시간을 관찰 하 여 acclimated 되는 여부를 확인 합니다. 그들의 가정 탱크에 보다 더 긴 대기 시간이 더 많은 새 환경 순응 시간이 필요 나타냅니다.
- 이전 (3 일 이상는 새 환경 순응의), 분석 결과의 하루에 교체와 시험 챔버에 물 갓 단련 하는 날 물 (1.3.1 단계 참조).
- VirtualDub 소프트웨어17에 녹음 매개 변수 설정: 15 프레임/s, 코덱: x264vfw, 녹음 기간: 86400 s (24 시간).
- 녹음 단계 뒤에 적외선 백라이트를 켭니다 ( 그림 2참조). 관찰 함으로써 화면에서 VirtualDub 라이브 이미지, USB 카메라를 얼굴 수 있도록 각 수족관의 위치를 조정 합니다.
- 녹음, 라이브 Artemia nauplii와 각 물고기를 피드의 날에 모든 스폰지 필터를 제거 하 고 적외선 백라이트를 켭니다.
- 24 시간 아침에 녹음을 시작 (예를 들어 시작 시간 오전 9 시 이며 완료 시간 오전 9 시부터 다음 날). 비디오 캡처를 시작 하 고 소요를 피하기 위해 위치를 확보. 정기적으로 녹음 실행 되 고 있는지 확인 합니다.
- 24 시간 후 동영상 제대로 저장 되었는지 확인 합니다. 추적 하 고 물고기의 행동 분석을 PC 워크스테이션에 비디오를 전송.
- 5 실험 물고기 4 일 또는 10 L 아크릴 녹음 맞춤형 수족관의 각 챔버에 더 적응 (45.9 c m x 17.8 c m x 17.8 c m, 길이 x 폭 x 깊이, 각각) 조건된 물으로 가득 (1.3.1 단계 참조).
- 비디오 분석
- 먼저, 조명에 보고 하 여 비디오 품질을 확인 합니다. 각 섹션에서 하나의 물고기 경우 그리고 잘못 추적 어떤 외국 움직임을 일으킬 수 있는 경우 확인 하십시오.
- 수족관 밖 잘못 추적을 피하기 위해 마스크를 준비 합니다. 두 개의 마스크를 만들기: '도' 및 '이상한' 물고기는 탱크에서의 시퀀스 순서에 따라.
- "이상한"와 "도"는 마스크에 대 한 위에서 설명한 두 개의 폴더를 확인 합니다. 추적 이동이 폴더의 각 SwisTrack의 매개 변수 파일.
- 추적을 열고 SwisTrack 추적 소프트웨어 ( Tracking_odd.swistrack 또는 Tracking_even.swistrack보조 파일)의 매개 변수 파일. 비디오 파일 및 마스크 파일 경로를 지정 하 고 다음 저장 하 고 추적을 종료할 매개 변수 파일. Blob 수 및 최대 픽셀에서 매개 변수 조정 "Blob 검색" 및 "가까운 이웃 추적" 구성 요소를 각각 실험에 따르면.
- 승리-자동화 소프트웨어는 SwisTrack 소프트웨어를 자동으로 열립니다의 스크립트를 실행 하려면 두 번 클릭 (보충 파일 swistrack_1.exe, swistrack_2.exe, swistrack_3.exe 또는 swistrack_4.exe-이들은 모두 동일한 실행 파일), SwisTrack의 적응형 배경 빼기 업데이트에 에이즈.
- SwisTrack 소프트웨어를 추적 로드에서 Tracking_odd.swistrack 또는 Tracking_even.swistrack 를 열고 매개 변수 파일. 매개 변수를 로드 한 후 추적을 시작 하려면 실행된 단추를 누릅니다.
- 초기 9000 프레임 내에서 (600 s, 즉, 녹화 된 비디오의 첫 번째 10 분), 물고기 추적 적응형 배경 빼기, 이진 마스크를 보면 동작 하 고 있는지 확인 하 고 가까운 이웃 SwisTrack (참조의 구성 요소 목록에서 추적 동반 비디오)입니다. 다음 구성 요소 목록에서 적응 배경 빼기 를 선택 합니다.
- 승리-자동화를 다시 시작을 추적 하는 PC를 두고 키보드에서 R 버튼을 누르십시오. 추적 24 h 당 5-7 h 4 CPU 코어와 8GB의 메모리 데스크탑용 비디오 걸릴 것입니다. 필요에 따라, CPU에서 코어의 수 (를 포함 하 여 단일 비디오 파일의 경기장은 홀수와 짝수) 여러 개의 SwisTrack 프로세스를 실행 합니다. 예를 들어 4 코어 4 동영상을 한 번에 처리할 수 있습니다.
- 이 추적 중 승리 자동화 프로그램은 자동으로 마우스 포인터를 이동 하기 때문에 다른 목적을 위해이 PC를 사용 하지 마십시오. 다음 절차에는 초기 9000 프레임 삭제 됩니다.
- 3 Perl 스크립트 파일 (1.fillupGaps2.pl, 2.Calc_fish_id_moko_robust, 3.pl, 3.Sleep_summary_4cm_movingWindow.pl) (단계 2.2.3 참조) '도'와 '이상한' 폴더에 SwisTrack에 의해 생성 된 추적 파일이 들어 있는 폴더를 할당 합니다.
- VirtualDub을 사용 하 여 비디오 파일에서 비디오의 프레임 하나를 클립 하 고 ImageJ로 사진으로이 클립을 가져옵니다. ImageJ에 수족관 (45.9 cm)의 길이 선택 하 고 픽셀/cm 비율. 텍스트 편집기 프로그램에서 1.fillGaps2.pl 에 픽셀/cm 비율을 작성 하 고 저장 합니다.
- CygWin 프로그램, Unix 에뮬레이터를 시작 합니다. 3 Perl 스크립트는 명령줄에서 cd 를 사용 하 여 포함 된 SwisTrack 폴더를 찾습니다.
- 펄 1.fillGaps.pl를 입력 하 여 Perl 스크립트를 실행 합니다. 이 3 개의 Perl 스크립트 수족관의 독특한 챔버를 각 추적 파일을 할당 하 고 물고기는 깨어 있는 동안 수 면 시간 및 수영 거리를 분석. 분석 완료 1-2 시간 소요 됩니다.
- 프레임 분석에서 제외 수 acceptably 낮습니다; 있는지 확인 하기 위해 Summary_Sleep.txt 라는 텍스트 파일을 평가 누락 된 프레임의 15% 미만 허용으로 간주 됩니다.
- 복사 및 붙여넣기 스프레드시트 매크로 (보충 파일 Sleep_12hr12hr_TEMPLATE.xlsm)와 Summary_Sleep.txt 에서 분석 된 결과.
- 추적 파일의 요약 데이터를 추출 하는 매크로 실행 합니다.
3. DASPMI 또는 DASPEI mechanosensory neuromasts의 얼룩
참고: DASPMI 및 DASPEI은 빛에 민감한 얼룩이 지 고 어두운 조건에서 이루어져야 한다. 예를 들어 DASPMI를 사용 하 여 DASPMI 및 DASPEI은 프로토콜을 다음.
- 프로토콜을 얼룩이 지기
- 얼룩 재고 솔루션 (25 µ g/mL) 1 리터의 총, dH2O의 1 l DASPEI 또는 DASPMI 결정의 0.025 g을 추가 하 고 그것을 밤새 분해 하자. 솔루션 4 ° C에 저장 하 고 빛 으로부터 보호 유지.
- 2.5 µ g/mL DASPMI에서에서 생선을 담가 또는 조건된 물에 녹아 있는 DASPEI (단계 1.3.1 참조) 22 ° c.에 어두운 환경에서 45 분
- 45 분 후에 DASPMI 또는 DASPEI 솔루션에서 물고기를 제거 하 고 버퍼링 에틸 3-aminobenzoate 메탄 된 소금 (MS222)의 66.7 µ g/mL로 조절 물의 얼음 목욕에 침수에 의해 anesthetize.
- 페 트리 접시 접시 및 형광 현미경 사진에서 물고기를 탑재 합니다. Z-스택 이미지를 다음 분석.tif 파일로 저장 합니다.
- ImageJ를 사용 하 여 이미지 분석
- .Tif 파일이 들어 있는 폴더 안에 ImageJ 매크로 파일 (Neuromast_ImageJ.txt)의 서식 파일을 붙여 하 고 "Process_ImageJ"는 새로운 폴더를 만듭니다. ImageJ 매크로 파일에서 현재 디렉터리로 경로 설정 합니다.
- ImageJ를 시작 하 고 GUI에 매크로 파일을 드래그 하거나 클릭 하 여 매크로 열고 파일 > 열기 매크로 파일을 선택 하 고.
- 클릭 하 여 매크로 실행 매크로 > 매크로 실행. 매크로 다음 자동으로 열립니다 분석 그림 파일. 그림 파일 열리지 않으면 클릭 매크로 > 파일 데리.
- Neuromast 정량화에 대 한 다각형 도구를 사용 하 여 관심 영역을 선택 합니다.
- 뜨거운 키 5 관심 중복 영역을 누르십시오.
- 페인트 도구 를 사용 하 여 제거 또는 이전 이미지에서 추가 또는 누락 된 neuromast에 대 한 점 들을 추가 하 고 다음 6을 명 중 하. 6명 중, 후 두 개의 새로운 창이 나타날 것 이다: 번호 neuromasts 점과 계량 총 neuromasts 테이블의 계획.
- 7 두 파일을 저장 했다: 1 개의 파일은.tif 이미지 파일로 저장 하 고 다른.xls 파일로 저장 됩니다. 이러한 파일이 저장 된 후 새 그림 파일 분석을 위해 열 것 이다.
- 매크로 스크립트 (SN_Number_Diameter.xlsm)를 실행 하 여 한 스프레드시트에 각 물고기의 neuromast 수를 통합 합니다.
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Representative Results
여기에 소개 하는 결과 어떤 제시 방법으로 취득 될 수 있다의 대표적인 예입니다. 따라서, 결과 cavefish, 실험 조건에 따라 표면 생선 여기 제시 하는 것에서 약간 이탈 수 있습니다.
진동 매력 동작
VAB에 대 한 대표적인 결과 동굴, 표면 생선 그림 3 에서 찾을 수 있습니다. (그림 3A, cavefish와 공유 특성) 표면 물고기와 진동 막대 (그림 3B)에 cavefish의 강한 매력에 가장자리 다음 동작 note 피크 매력 레벨 두 변경해의 행동 고기에 키 차이 나타내는 cavefish (그림 3D) 하지만 하지 표면 물고기 (그림 3C), 35 Hz 근처 관찰 되었다. 매력이이 주파수 주위에 피크는 가장 가능성이 먹이 또는 음식 항목20,21에 의해 진동의 주파수를 나타냅니다.
수 면과 과다 분석 결과
여기 수 면을 정의 하기 위해 사용 하는 기준에 맞게 응답 임계값 이전 Astyanax11에 대 한 효과를 결정. 수 면 장시간 정지의 특징은 고의 부동으로 정의 됩니다 > 60 s와 높은 응답 임계값12,,2223. 표면 물고기에 비해 짧은 수 면 기간 발생 애벌레와 성인 cavefish11,12, 그러므로, 수 면 분석 실험은 모든 나가의 Astyanax 표현 형 행동 하는 효과적인 방법. Cavefish 덜 수 면 (그림 4B, cavefish에 짧은 수 면 기간)를 보여, 그들은 또한 활동적인 (그림 4A).
DASPMI 또는 DASPEI mechanosensory neuromasts의 얼룩
Neuromasts는 쉽게 DASPEI 또는 DASPMI로 얼룩진 고 vivo 형광 현미경에서 관찰 될 수 있는 감각 세포의 구성 됩니다. 제시 결과 DASPMI 얼룩의 결과가 이었다. 표면 neuromasts의 수는 표면 물고기 (그림 5C, D)에 비해 cavefish의 두개골 영역에 두는 크기는 프록시 mechanosensory 세포의 수의 향상-표면 neuromasts의 수는 진동 매력 행동의 수준으로 긍정적으로 상관 (수 진동 로드에 접근: 그림 5A,B).
| 소프트웨어 | 분석 | 버전 | 웹사이트 |
| avfs | 활동/수 면 | 버전 1.0.0.6 | http://turtlewar.org/avfs/ |
| Avisynth | VAB | 버전 2.6.0 | http://avisynth.nl/index.php/Main_Page |
| Cygwin | 활동/수 면 | 버전 2.11.0 | https://www.cygwin.com/ |
| ImageJ | VAB 및 DASPEI | 버전 1.52e | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| pfmap | 활동/수 면 | 빌드 178 | (하단에 "다운로드 아카이브" 링크)에서 http://pismotec.com/download/ |
| SwisTrack | 활동/수 면 | 버전 4 | https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack |
| WinAutomation | 활동/수 면 | 버전 8 | https://www.winautomation.com/ (무료 독립형 애플 리 케이 션이이 절차에 대 한) |
| Windows 운영 체제 | VAB 및 활동/수 면 | 7, 8 또는 10 | https://www.microsoft.com/en-us/windows |
| x264vfw | 모든 분석 | NA | https://sourceforge.net/projects/x264vfw/ |
표 1입니다. 이러한 분석과 소스 웹사이트에서 사용 하는 프리웨어의 목록입니다.
그림 1 : 진동 매력 행동 분석 결과 실험 장비의 도식. 스피커에 부착 된 유리 막대 40 Hz의 주파수를 조정 하 고 비디오 녹화의 발병에 약 0.5 cm의 깊이에 빠져들. 이 수치는 요 시 자와 외.5에서 수정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 수 면 분석 결과 실험 장비의 설계도. 탱크는 0.7 cm 두꺼운 투명 아크릴 보드;에서 주문 품 septa는 0.3 c m 두께 완전히 불투명 블랙 아크릴 보드. 물고기는 서로 볼 수 없도록 불투명 블랙 아크릴 보드는 탱크의이 부분에 대 한 사용 됩니다. (A) 상위 보기: 탱크의 외부 챔버에 맞게 안쪽으로 septa 기울어져 있다 참고 카메라 각도 차이. (B, C) 전면 및 측면 플레이, 각각. (D) 3의 모든 탱크에 걸쳐 빛의 강도 균질 하기 위해 기관총을 통과 하는 적외선 빛을 백라이트 탱크. Note의 각각 약 실에 있는 각 물고기의 모든 움직임 표시 되도록 각 탱크의 방향이 조정 됩니다. 패널 (C) 와 (D) 16에서 수정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 3-의 대표적인 결과 분 진동 매력 동작 분석 결과. (A, B) 수영 경로의 표면 (A) cavefish (B);의 상위 뷰 redlines 경로 물고기 3 분 비디오 중의 흔적은. 중앙에 검은 점이 진동 유리 막대의 위치를 나타냅니다. wrMtrck ImageJ 플러그인 물고기 추적24를 시각화 하기 위해 사용 되었다. (C, D) 표면 물고기 (C)와 cavefish (D) 진동의 여러 주파수에 노출에서 결과의 비교. 각 점은 각 물고기를 나타냅니다. 어두운 음영 처리 된 영역은 interquartile 범위입니다. 참고는 모든 주파수에 걸쳐 표면 물고기 표시 되지 않습니다 진동 주목할 만한 매력 반면 cavefish 매력 35 Hz. 근처에서 최대 (C, D) 16에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 대표 활동 분석에 대 한 여러 가지 측정에서 결과 - 표면 물고기와 cavefish 낮 활동 패턴. (A-B) 하루 (노란색 바) 고 거리 (10 분, A당 m), 및 수 면 시간 (1000 s/12 h, B)의 밤 (검은 막대) 점수. 각 막대의 평균 ± 표준 오류를 나타냅니다. 블루 별 표면 생선 (Sf)와 cavefish (Cf) 사이 통계적 인 비교에 대 한 레벨의 의미를 나타냅니다. Cavefish와 표면 물고기는 크게 다른 날 밤 활동. 각 표현 형에 대 한 양방향 ANOVA 통계는: 표면 생선 (Sf)와 cavefish (Cf) 사이의 거리 (A)를 수영: F1,399 185.8, P = < 0.001, 낮과 밤 사이: F1,399 26.9, P = 0.001 <, 인구 사이 상호 작용 그리고 하루 밤: F1,399 3.6, P = 0.060 = (중요 하지: n.s.); 수 면 동안 Sf와 Cf (B) : F1,399 237.9, P = < 0.001, 낮과 밤 사이: F1,399 164.1, P = < 0.001, 인구와 하루 밤 사이의 상호 작용: F1,399 26.5, P = 0.001 <. 두 분석, N = 200, 201 지상 물고기와 cavefish, 각각. 게시물-특별 한 쌍 t에 의해 테스트 활동 낮과 밤의 차이-Bonferroni 수정과 함께 테스트 하 고 검은 별표로 표시 됩니다. P는 0.001 <. * * 상징 P < 0.01. 데이터의 하위 집합을 다시 고 11에서 업데이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 대표 VAB와 neuromast 사이의 관계의 결과. (A, B) VAB와 neuromast와 cavefish, 표면 생선, 그리고 표면 물고기의 F1 하이브리드 자손에 크기 사이 관계 cavefish x. 진동 매력 (접근의 수의 제곱근)의 표준화 된 점수 neuromast 풍부와 긍정적으로 상관 참고 (피어슨 상관 계수 r = 0.62 P < 0.001) 및 neuromast 직경 (피어슨 상관 관계 계수 r = 0.31, P < 0.01). 패널 A 와 B 5에서 수정 됩니다. (C, D) DASPMI (C)는 표면 물고기와 (D)는 cavefish의 뺨 지역에서 neuromasts의 얼룩. 삽입에서 눈금 막대 (C) 와 (D)는 1.0 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이러한 제시 방법에 편리 하 게 하지만 프리웨어 기원의 특성상 수행 하는 복잡 한 될 수 있습니다. 따라서, 그것은 좋습니다 시험 분석 실험 및 분석 하기 전에 어떤 실제 실험을 수행 하.
실험 및 분석 프레임 워크 설정 되 면 데이터 생성의 속도 빠른 될 수 있습니다. 일단 설립, VAB 분석 결과 대 일 분의 기록을 두 물고기, 활동/수 면 분석 결과 대 한 24 시간에 30 물고기 및 생선 neuromast 이미징, 최종 이미지 캡처 MS222 마 취에서 시작에 대 한 2.5 ~ 3 분에 가능 하다. 비디오 및 이미지 분석의 기간 사용 하는 컴퓨터의 성능에 따라 상당히 달라질 수 있습니다. 4 코어 CPU와 8GB의 RAM 가진 PC를 사용 하 여 VAB 분석 물고기 마다 5-7 분을 걸릴 수 있습니다, 활동/수 면 분석 30 물고기의 그룹 당 6-8 시간 걸릴 수 있습니다 및 neuromast 이미지 분석 물고기 당 5 또는 10 분 걸릴 수 있습니다 (단일 쪽 또는 양쪽의 이미지는 두개골 지역, 각각). 상용 소프트웨어 (자료 테이블) 추적 비디오 분석에 대 한 대안이 이다. 그것은 매우 강력한 추적 하지만 비싼 동물에서 (예를 들어, 소프트웨어 기초 ~ USD$ 5, 000USD와 다중 추적 모듈 ~ USD$ 4000). 이 순간, 우리의 추적 방법 즉 추적, 특히 활동/수 면 분석에 대 한의 대 등 한 정확도 달성 하는 것, 누락 된 프레임은 일반적으로 전체 프레임의 15% 보다 낮은. 이 메서드는 또한 4 개의 복제에서 높은 재현성을 보여주었다 (보충 표 1). 그러나,이 시스템은 Windows 운영 체제와 리눅스/유닉스 운영 체제에서 기본적인 코딩에 대 한 이해 없이 개발에 어려움을 인정 해야 합니다.
물고기 새 환경 순응 기간 동안, 그리고 전과 중 행동 분석 실험, 실험 물고기에 대 한 최고의 가능 하 고 일관 된 생활 조건을 제공 하 필수적 이다. 이 모든 일과 유지 높은 수 질 양과 동시에 높은-품질 식품을 먹이 포함 (암모니아, 질산염, 아 질산염, 및 용 존된 유기 물, 낮은 ~ 700 µS 주위 pH 7와 유사한 전도도). 그것은 또한 소음에 의해 방해 하지 지역에 분석 실험을 수행 하는 것이 중요입니다. 시끄러운 발자취, 그리고 르 소리 행동 반응과 활동/수 면-패턴을 변경할 수 있습니다. Mechanosensory 단위 처리 물고기 동안 손상의 수준을 줄이기 위해, 그것은 괜 찮 아 요-메쉬 물고기 물고기; 전송 하는 동안 인터넷을 사용 하는 데 도움이 이 neuromasts의 점액 cupula의 손상을 방지 하는 데 도움이 됩니다.
DASPEI 염료, 물고기에 sublethal 효과가지고 있지만 과도 한 노출은 독성 효과에 발생할 수 있습니다. 예를 들어 2 h DASPEI 솔루션에 물고기를 immersing 시킵니다 사망률의 기회를 후 마 취의 복구 하는 동안. DASPEI 얼룩 빛에 민감한 이며 따라서 어두운 조건에서 이루어져야 한다.
프리웨어 설치에 관해서는 AviSynth 소프트웨어, Avisynth 가상 파일 시스템 (avfs), 및 Pismo 파일 마운트 감사 패키지 (pfmap) 특정 버전 노드라고도 함 함께 작동 하도록 필요 합니다. 그것은 avfs (v1.0.0.5), AviSynth (2.6.0) 및 pfmap (1.7.8) 작동, 하지만 적어도 최신이이 프로토콜에 의해 확인 되었다 pfmap 빌드 파일 설치 절차에 대 한 작동 하지 않았다. 이러한 이유로, 소프트웨어 버전 (표 1)에 주의. VirtualDub 64-비트 대신 32 비트 버전에서 잘 작동합니다. S 당 15 프레임의 설정은 좋은 시간 해상도 제공 하 고 과도 한 스토리지 볼륨 (비디오 분석 결과 24 시간 수 면에 대 한 1.6 GB와 3MB VAB 비디오에 대 한)을 필요로 하지 않습니다. ImageJ를 위한 주요 어려움은 매크로에서 파일 경로 설정에서 올 수 있다. Windows 운영 체제에서 파일 경로 "C:Document\my Document\..."로 일반적으로 표현할 수 있습니다. ImageJ 매크로 자바 환경에서 실행 하 고 파일 경로, 즉, "C\:Document\\my Document\\..."에 대 한 추가 "\"를 필요 합니다. 예제 ImageJ 매크로 파일을 참조 하십시오. 또한, 그것은 해야 할 수 있습니다 조각 제거 및 개체 추적25, 2 개의 플러그인을 설치 하 고 핫 키 (바로 가기 키) 6 , 8, 각각, 할당 분석을 원활 하 게 작동 되도록 (플러그인 > 바로 가기 > 추가 바로 가기... 26 ). SwisTrack는 추적 매개 변수를 설정 하는 함수 이지만 가능한 동결 또는 충돌 추적 매개 변수를 설정 하는 동안 발생할 수 있습니다. Notepad + + 같은 텍스트 편집기 응용 프로그램에 매개 변수를 편집 하는 것이 낫다. 자세한 내용은 매개 변수 설정,27를 참조 하십시오. 시그윈 (유닉스 에뮬레이터) 설치 프로그램을 설정 기본 설치에 포함 되지 않는 Perl 패키지를 설치 하는 패키지 설치 관리자를 포함 되어 있습니다. 구체적으로 시그윈의 설치 하는 동안 Perl 패키지를 선택 하는 것이 좋습니다.
이 동물 추적 시스템 정형 반복적인 행동, 사회적 상호 작용, 그리고 비대칭 사용 (를 포함 하 여 다른 동작을 적용할 수 있지만,이 절차는 옆 라인 기반 동작 (VAB) 및 수영 활동 및 수 면, 왼쪽/오른쪽) 두개골 neuromasts의 (치러야)13을 구하고 하는 동안 이러한 메서드 idTracker14에 의해 제안 된 그들과 같은 얕은 경기장 필요할 수도 있지만. 진화 동작에의 한 벌, 한 추적 X-및 Y 축 데이터를 분석 하 고 다른 행동 패턴을 조사 하는 다른 스크립트를 적용할 수 있습니다. 이 분석 파이프라인 해결 여러 행동, 및 또한 어떻게 comorbid 자폐증 같은 행동은 유전자에서 진화의 메커니즘을 기초를 제공 하기 위한 것입니다, 후, 그리고 환경 요인.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는이 원고에 사용 되는 실험 물고기에서 물고기 치료 N. Cetraro, 북 아 일 사이먼, C. 발데스, C. Macapac, 제이 최, 나 루, 제이 구 엔, S. Podhorzer, H. Hernandes, 제이 선생, 제이 카토과 나 주 님을 포함 한 요 시 자와 실험실의 모든 회원을 감사 합니다. 우리는 또한 A. 킨 연구소 회원을 훈련 적외선 CCD 카메라를 내 피 Masek를 포함 하 여 감사 합니다. 마지막으로, 우리는 비디오를 만드는 그들의 귀중 한 도움 특히 B. 스미스, 제이 램, 그리고 미 흰색 하와이 대학 Mānoa에 커뮤니케이션의 미디어 랩-사회 과학의 대학-학교를 감사 하 고 싶습니다. 이 작품 (16CON-78919 및 18CON 90818) 하와이 커뮤니티 재단에 의해 지원 되었다 고 건강 NIGMS의 국립 연구소 (P20GM125508) 내에 부여 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide) | MilliporeSigma | D3418 | |
| 880 nm wave length black light | Advanced Illumination | BL41192-880 | |
| avfs | freeware | Version 1.0.0.6 | http://turtlewar.org/avfs/ |
| Avisynth | freeware | Version 2.6.0 | http://avisynth.nl/index.php/Main_Page |
| Cygwin | freeware | Version 2.11.0 | https://www.cygwin.com/ |
| Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish) | Corning | 3140-100 | 10 cm diameter 5 cm high |
| Ethovision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | Version 14 | https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt |
| Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black | Jardin (through Amazon.com) | NA | Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system |
| Grade A Brine shrimp eggs | Brine shrimp direct | BSEA16Z | |
| ImageJ | freeware | Version 1.52e | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens | Toyo | NA | Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer |
| Neutral Regulator | Seachem | NA | |
| Optical cast plastic IR long-pass filter | Edmund optics | 43-948 | Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam |
| pfmap | freeware | Build 178 | http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom) |
| Reef Crystals Reef Salt | Instant Ocean | RC15-10 | |
| SwisTrack | freeware | Version 4 | https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack |
| USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam) | Microsoft | Q2F-00013 | Cut 2-2.5 cm of the front |
| WinAutomation | freeware | Version 8 | https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure) |
| Windows operating system | Microsoft | 7, 8 or 10 | https://www.microsoft.com/en-us/windows |
| x264vfw | freeware | NA | https://sourceforge.net/projects/x264vfw/ |
References
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