Summary
Nous présentons ici les méthodes d’étude haut débit d’une série de la mexicaine agassizii comportements et coloration vitale d’un système de mécanosensoriels. Ces méthodes utilisent des scripts logiciel libre et sur mesure, fournissant une méthode pratique et rentable pour l’étude des comportements.
Abstract
Les animaux cavernicoles ont développé une série de traits morphologiques et comportementales pour s’adapter à leur environnement perpétuellement sombre et nourriture sont rares. Parmi ces traits de caractère, comportement alimentaire est l’une des fenêtres utiles dans les avantages fonctionnels de l’évolution du trait comportemental. Présentées ici sont mises à jour des méthodes pour analyser le comportement de l’attraction de vibration (VAB : un comportement adaptatif) et d’imagerie de mechanosensors associé de grotte adaptés tetra, Astyanax mexicanus. En outre, les méthodes sont présentées pour le haut débit suivi d’une série de comportements agassizii supplémentaires incluant hyperactivité et sommeil-perte. Agassizii montre également la sociabilité, de comportements répétitifs et d’anxiété plus élevée. Par conséquent, agassizii service comme modèle animal pour les comportements ont évolué. Ces méthodes utilisent des scripts de logiciel libre et sur mesure qui peuvent être appliquées à d’autres types de comportement. Ces méthodes offrent des solutions de rechange pratiques et économiques pour le logiciel de suivi disponible dans le commerce.
Introduction
Le tétra aveugle, Astyanax mexicanus (Teleostei : Characidae), est unique parmi les poissons pour avoir deux formes alternatives radicalement distinctes - un morphing voyant, surface vivant et un morphing aveugle, cavernicoles, composé de plusieurs distincts les populations1. Bien que différents dans la morphologie et de physiologie, ils sont toujours interfertiles2,3. Ces formes interfertiles semblent avoir évolué rapidement (~ 20 000 ans)4, qui en fait un système de modèle idéal pour l’étude de l’adaptation rapide. Agassizii est connus pour avoir une suite divergente traits morphologiques et comportementales dont la densité accrue des papilles gustatives, augmentation du nombre de mechanosensors, à l’écoute d’une fréquence particulière d’un stimulus vibratoire, hyperactivité, comportement et insomnie. Bon nombre de ces comportements probablement évolués en même temps, dont certaines ont été proposées pour être avantageuse dans l’obscurité des grottes pour se nourrir de5 et de conservation de l’énergie dans les environnements sombres et nourriture sont rares6,7.
Dans de nombreux systèmes de modèle évolutionniste, il est difficile d’acquérir une connaissance intégrée sur l’évolution de la morphologie et le comportement animale comment en réponse à l’environnement parce que la plupart des espèces sont réparties sur un gradient continu dans des environnements complexes. Toutefois, le contraste entre la grotte et la surface morphing Astyanax qui a évolué en contrastés environnements délimitées par un écotone forte a conduit à Astyanax en train de devenir un excellent modèle pour comprendre l’évolution animale. Cela permet de relier plus facilement les gènes et les processus de développement à caractères adaptatifs et de sélection dans l’environnement. En outre, ces dernières recherches biomédicales de ces traits à Astyanax a montré que ces traits peuvent parallèles symptômes humaine8,9,10. Par exemple, perte de socialité et de sommeil et gain d’hyperactivité, comportements répétitifs et le niveau de cortisol sont semblables à ce qui est observé chez l’homme avec l’autism spectrum disorder8.
Pour répondre à la coévolution complexe de beaucoup de comportements et de traits morphologiques, il est avantageux pour bon nombre d'entre eux pour mettre en évidence les voies génétiques et moléculaires sous-jacents. Présentées ici sont des méthodes pour caractériser le degré de phénotypes comportementaux grotte-type de surface, cave et hybride morphes de Astyanax. Les comportements focales analysées afin de caractériser le phénotype sont adaptés à la grotte du comportement alimentaire (comportement de vibration attraction, dénommé désormais VAB) et hyperactivité/sommeil durée11,12. Également présenté est une méthode d’imagerie dans le système sensoriel associé VAB13. Récemment, de nombreux logiciel de suivi de l’open source pour l’exécution de tests comportements sont devenus disponibles14,15. Elles fonctionnent très bien pour de courtes vidéos, à moins de 10 minutes de longs. Toutefois, il devient problématique si la vidéo est plus longue en raison des temps de calcul/suivi intense. Logiciels disponibles dans le commerce capable peuvent coûter cher. Les méthodes présentées utilisent principalement des freeware et sont donc considérés comme des méthodes rentables et haut débit. Aussi inclus sont résultats représentatifs basés sur ces méthodes.
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Protocol
Toutes les procédures sont effectuées suivant les directives décrites dans les « Principes of Laboratory Animal Care » (publication de l’Institut National de la santé n° 85-23, révisé 1985) et l’approuvé par l’Université d’Hawaï à Manoa animalier institutionnel et l’utilisation Comité animaux protocole no 17-2560-3.
1. test de comportement (VAB) attraction vibration (≤ 10 min pour tout enregistrement de procédure)
Remarque : Utilisez une caméra infrarouge sensible ou construire une caméra infrarouge en modifiant une webcam USB. Pour modifier une webcam USB, consultez la description détaillée présentée par le laboratoire de Keene dans ce numéro d’agassizii à JoVE (à partir de cette question a. mexicanus ), ou une brève description dans les documents complémentaires.
- Configuration de l’enregistrement
- Pour vous assurer que la caméra reste en position, encore et à la bonne longueur focale partir le sujet (s) en cours d’enregistrement, construire un cadre de boîte noire de polychlorure de vinyle, tuyaux (PVC), de 120 cm H x 45 L x 90 cm cm w.
- Après la construction du cadre, couvrez-la avec un rideaux de plastique opaques tels que celle prévue pour l’agriculture hydroponique.
- Sur le dessus de l’image, mettre un panneau acrylique noir avec une fenêtre de la caméra infrarouge au centre mesurant le même diamètre que le zoom réglable monté sur C. À l’intérieur de cette boîte, placez l’appareil de dosage de VAB (Figure 1).
- Appareil de vibration
NOTE : Vibrations sont produites à l’aide d’un générateur de petites fonctions.- Pour les méthodes suivantes, branchez-vous vibrations d’une amplitude de 0,15 mm et une fréquence de 40 Hz, qui est la fréquence qui suscite une réaction maximale d’attraction5,16.
- Connecter le générateur de fonction à un haut-parleur face horizontal.
- Fixer une baguette de verre de diamètre 7,5 mm 14 cm de longueur pour le pare-poussière sur le visage de l’enceinte à l’aide de colle chaude ou une colle joint.
- Perpendiculairement à cette canne et vers le bas, attacher une autre tige de verre de diamètre 7,5 mm 4 cm de longueur (Figure 1).
- Test comportemental
- Acclimater un expérimental a. mexicanus pendant 4 jours dans une chambre de test cylindrique remplie d’eau conditionnée (pH entre 6,8 et 7,0, conductivité µS de 700 environ, température environ 22 ° c) avec un cycle 12/12 L/J. Vérifier si les poissons ont acclimatés en observant leur latence pour se nourrir. Des temps de latence plus longue que dans leur réservoir d’origine indique plus temps d’acclimatation est nécessaire. Tout au long de l’acclimatation, nourrir une fois par jour avec des nauplii d’Artemia vivants.
- Le jour précédant la date de l’essai (après 3 jours d’acclimatation), remplacer l’eau dans la chambre de dosage d’eau conditionnée.
- Le jour de l’essai (après 4 jours d’acclimatation), prive poissons expérimentale de nourriture jusqu'à ce qu’une fois l’analyse terminée. Satiété changera leur réponse aux vibrations.
- Définir les paramètres d’enregistrement dans le freeware de VirtualDub17: 15 images/s, codec : x264vfw, durée d’enregistrement : 3 min 30 s.
- Préparer l’appareil émettant des vibrations (voir l’étape 1.2) en syntonisant 40 Hz. Voir la Figure 1 pour l’explication de l’appareil. Rincer la baguette de verre vibrant avec de l’eau déionisée pour enlever n’importe quel produits chimiques solubles dans l’eau.
- Travailler dans l’obscurité, placez le cylindre de dosage sur l’étape d’enregistrement illuminée par un rétro-éclairage infrarouge dans la boîte noire et permettre aux poissons de s’acclimater pendant 3 min.
- Après l’acclimatation de 3 min, enregistrer 3 min 30 s de vidéo. Au début de l’enregistrement, insérez la tige de verre vibrant dans la colonne d’eau (environ 0,5 cm de profondeur).
- Éviter de faire des bruits ou des vibrations tout en positionnant la tige de verre vibrant dans l’eau que le poisson peut sens même les perturbations plus mineures.
- Terminer cette procédure dans les 30 s de démarrage de l’enregistrement vidéo pour faire en sorte que plus de 3 min du comportement est enregistré.
- Surveiller la vidéo pendant l’enregistrement pour s’assurer qu’aucune erreurs ne surviennent au cours de cette étape.
- Après avoir terminé l’enregistrement, retirer la tige de verre vibrant de la chambre de dosage cylindrique et retirer la chambre d’essai dès le stade de l’enregistrement. Répéter de 1.3.5 pour le prochain poisson.
- Analyse vidéo
Remarque : Conversion du codec en un format qu’ImageJ peut charger ne fonctionne que sur Windows système d’exploitation18 (tableau 1).- Convertir la vidéo avi compressé dans un format lisible pour ImageJ et les paramètres de la série d’analyses.
- Installation de AviSynth_260.exe (https://sourceforge.net/projects/avisynth2/), pfmap build 178 (http://pismotec.com/pfm/ap/) et avfs ver1.0.0.5 ou ver1.0.0.6 (https://sourceforge.net/projects/avf/). Notez que cette méthode est programme/version sensible. Les liens de site Internet fourni guidera vers les versions appropriées (tableau 1).
- Exécutez le fichier batch en double-cliquant sur avs_creater.bat (fichier supplémentaires). Faites un clic droit sur le fichier vidéo avs pour être analysé (sélectionner dans les fichiers avs créés par avs_creater.bat).
- Comme l’analyse vidéo en utilisant le plugin Tracker dans ImageJ nécessite le chargement de la macro ImageJ (fichier supplémentaires Macro_VAB_moko.txt), charger la macro par glisser-déposer dans la coquille de GUI d’ImageJ. Cette macro va permettre certaines touches d’accès rapide pour l’analyse qui suit.
- Dans le répertoire de travail, créez un dossier intitulé « Process_ImageJ ».
- Faites un clic droit sur le fichier .avs pour être analysé (sélectionner dans les fichiers avs créés par avs_creater.bat). Sélectionnez l’option de montage rapide . Une fois le fichier avs est monté comme un disque externe, ouvrez le fichier avi dans ImageJ (le fichier avi a la fin du nom avec « .avi »).
- Pour définir l’échelle de la mesure de la distance, choisir le diamètre de la chambre de dosage en dessinant une ligne droite à travers la chambre à l’aide de l' outil de sélection linéaire, puis cliquez sur analyse > définir l’échelle fonction. Par exemple, entrée 9,4 cm si vous utilisez un plat cylindrique d’un diamètre intérieur de 9,4 cm. Cochez la case radio de Global afin de normaliser l’échelle sur l’ensemble des analyses vidéo suivantes.
- Convertir en binaire pile et lancer l’analyse.
- Copier la zone chambre de test en utilisant l’outil de sélection ovale puis faites un clic droit et sélectionnez Image > dupliquer. A cette époque, spécifiez la plage d’images à garder pour une analyse ultérieure, par exemple, garder les premiers 2 700 cadres après la tige vibrante est entré dans l’eau (à 15 images/s, qu'il s’agit d’exactement 3 minutes de vidéo).
- Désactivez l’extérieur de la chambre d’essai et convertir une image binaire en appuyant sur la touche de raccourci 7 dans la barre de numéro du clavier.
- Après l’arrière-plan efface et une invite apparaît, ajouter un point noir au centre pour indiquer la position de la tige de verre vibrant à l’aide de l’outil de sélection ovale déjà définie sur noir avec la fonction de remplissage . Cliquez sur OK et une invite s’affiche pour passer à l’ajustement du seuil.
- Définissez le seuil pour rendre une image binaire (tous noir et blanc) du poisson. Ajustez le seuil pour que les poissons peuvent être vus dans des clips vidéo entiers et sélectionnez appliquer.
- Exécutez le plugin « Tracker » en appuyant sur la clé chaud 8 dans la barre de numéro. Définir la taille minimale de pixels à 100 lorsque vous y êtes invité et cliquez sur OK, générant la distance entre la tige vibrante et le poisson par image toutes les 3 min de la vidéo binaire.
- Réglez l’alignement mauvais générée par le bruit en vidéo. Pour ce faire, vérifiez la fenêtre de résultats afin d’identifier les cadres qui renvoient le numéro de l’objet 3 ou supérieur-indiquant les objets supplémentaires dans ces cadres (par exemple, les particules dans l’eau ou à l’ombre du bras transparent de la tige) en plus de la « tige » et « poisson » le cadre. Supprimer tous les objets supplémentaires à l’aide de l’outil pinceau.
- Frapper la clé chaud 9 sur la barre numéro d’exporter un empilement binaire des images de la vidéo complète (dans le cas où il est nécessaire d’analyser de nouveau) et un fichier .xls avec coordonnées et distance données (fichiers supplémentaires CF01.xls, Threshold_CF01.tif et, Trac_CF01.tif ). Chaud clés 9 entraînera la fermeture de tous les fichiers associés à la vidéo en cours. Répétez les étapes 1.4.2.1 par 1.4.2.6 pour toutes les répétitions.
- Exécutez le script de macro (fichier complémentaire JoVE_2cmVAB_template_15fps.xlsm) pour consolider les fichiers de résultats multiples Tracker (.xls) dans une feuille de calcul et de compter le nombre et la durée des approches dans un espace de 1,5 cm de la tige. Ne pas une durée au moins 0,5 s volonté s’approche ne pas prises en compte. Modifier les paramètres de la distance et le temps compté comme une approche en fonction des questions d’intérêt particuliers.
- Libérer l’espace disque PC après avoir terminé toutes les analyses. Supprimer des fichiers montés pour libérer de l’espace disque - avi.avi et. avi.avs fichiers (extensions générées par le logiciel)-en exécutant un lot de fichiers multiunmountdel.bat dans le même dossier où avs_creater.bat a été exécuté dans l’article 1.4.1.2.
- Convertir la vidéo avi compressé dans un format lisible pour ImageJ et les paramètres de la série d’analyses.
2. le sommeil et le dosage de l’hyperactivité (enregistrement de 24 h)
- Test comportemental
- Acclimater cinq poissons expérimentaux pendant 4 jours ou plus dans chaque chambre d’un aquarium sur-mesure d’enregistrement acrylique 10 L (45,9 cm x 17,8 cm x 17,8 cm ; longueur x largeur x profondeur, respectivement) rempli d’eau conditionnée (voir étape 1.3.1).
- Séparer chaque chambre individuelle avec des planches acryliques noirs faisant chambres égal en taille, mesurant 88,9 mm × 177,8 mm x 177,8 mm (Figure 2). N’oubliez pas de couvrir chaque cuve pour empêcher les poissons de sauter entre chambres.
- Réglez la minuterie programmable puissance automatiquement allumer LED blanc lumineux pendant 12 h, et au large pendant 12 h tous les jours au cours de la période d’acclimatation (par exemple, placez la lampe sur à 07:00 et arrêt à 19:00). Cela va monter le rythme circadien de poissons (si il est sensible à l’entraînement).
- Utilisation opaque blanc acryliques planches de dimension similaire à la cuve de 10 L comme diffuseurs de passer une lumière blanche et infrarouge à travers afin de fournir une lumière diffuse avec la même intensité dans l’ensemble de tous les réservoirs.
- Tout au long de l’acclimatation, nourrir une fois par jour avec live nauplii d’Artemia et fournissent l’aération par le biais de filtres d’éponge dans chaque aquarium.
Remarque : Assurez-vous que les poissons sont nourris à la fois cohérentes (c.-à-d. 1 x par jour à 09:00) car le moment des repas peuvent aussi affecter l’entraînement des rythmes circadiens19. - Vérifier si les poissons ont devenu acclimatés en observant leur latence pour se nourrir. Un temps de latence plus longue que dans leur réservoir d’origine indique plus temps d’acclimatation est nécessaire.
- Le jour avant le jour de l’essai (3 jours ou plus de l’acclimatation), remplacer l’eau dans la chambre de dosage avec fraîchement conditionnée de l’eau (voir étape 1.3.1).
- Définissez le paramètre d’enregistrement dans le logiciel de VirtualDub17: 15 images/s, codec : x264vfw, durée d’enregistrement : 86 400 s (24h).
- Activer le rétro-éclairage infrarouge derrière la scène de l’enregistrement (voir Figure 2). En observant l’image live de VirtualDub sur écran, ajuster la position de chaque aquarium pour faire face à la caméra USB.
- Le jour de l’enregistrement, nourrir chaque poisson avec des nauplii d’Artemia vivants, supprimer tous les filtres d’éponge et activer le rétro-éclairage infrarouge.
- Commencer à 24 h d’enregistrement le matin (par exemple, l’heure de début est de 09:00 et l’heure de fin est 09:00 le lendemain). Commencez à capturer la vidéo et sécuriser l’emplacement pour éviter toute perturbation. Vérifier périodiquement que l’enregistrement est en cours d’exécution.
- Après 24h, assurez vous que la vidéo enregistrée correctement. Transférer la vidéo vers la station de travail PC de suivre et analyser le comportement du poisson.
- Acclimater cinq poissons expérimentaux pendant 4 jours ou plus dans chaque chambre d’un aquarium sur-mesure d’enregistrement acrylique 10 L (45,9 cm x 17,8 cm x 17,8 cm ; longueur x largeur x profondeur, respectivement) rempli d’eau conditionnée (voir étape 1.3.1).
- Analyse vidéo
- Tout d’abord, vérifier la qualité vidéo en regardant l’éclairage. Vérifier s’il y a un poisson dans chaque section, et s’il ne sont a aucun mouvements étrangers sont susceptible de mal suivis.
- Préparez le masque afin d’éviter les mauvais suivi à l’extérieur de l’aquarium. Faire deux masques : un pour « même » et un « odd » poisson, selon leur ordre de séquence dans les réservoirs.
- Faire deux dossiers nommés « bizarre » et « même » pour les masques décrit ci-dessus. Déplacer le suivi fichier de paramètres de SwisTrack dans chacun de ces dossiers.
- Ouvrir le suivi des fichier de paramètres de SwisTrack dépistant le logiciel (fichier complémentaire Tracking_odd.swistrack ou Tracking_even.swistrack). Spécifier le chemin vers le fichier vidéo et fichier de masque, puis sauvegarder et quitter le suivi fichier de paramètres. Ajuster le nombre de blob et paramètres de pixels maximum en « Détection de Blob » et « Suivi du voisin le plus proche » composants, respectivement, selon les expériences.
- Double-cliquez pour exécuter un script du logiciel win-automation qui ouvre automatiquement le logiciel SwisTrack (fichier supplémentaire swistrack_1.exe, swistrack_2.exe, swistrack_3.exe ou swistrack_4.exe- ce sont tous les mêmes fichiers exécutables), ce qui aide à la mise à jour de la soustraction du fond adaptative dans SwisTrack.
- Ouvrez Tracking_odd.swistrack ou Tracking_even.swistrack dans le logiciel SwisTrack pour charger le suivi fichier de paramètres. Après avoir chargé les paramètres, appuyez sur le bouton exécuter pour commencer le suivi.
- Dans le cadre initial de 9 000 (600 s, c'est-à-dire des 10 premières min de la vidéo enregistrée), vérifier si le poisson de suivi fonctionne en regardant la soustraction du fond adaptative, masque binaire et le plus proche voisin a suivi dans la liste des composants de SwisTrack (voir vidéo ci-jointe). Puis sélectionnez soustraction Adaptive background dans la liste des composants.
- Appuyez sur la touche R du clavier pour reprendre la victoire-automation et laisser le PC pour effectuer le suivi. Suivi prendra 5-7 h par 24h vidéo pour un ordinateur de bureau avec 4 processeurs cores et 8 Go de mémoire. Selon les besoins, exécuter plusieurs processus de SwisTrack (y compris les arènes paires et impaires d’un seul fichier vidéo) jusqu’au nombre de cœurs dans le processeur. Par exemple, 4 noyaux peut gérer 4 vidéos à la fois.
- Au cours de ce suivi, évitez d’utiliser ce PC à d’autres fins, car le programme win-automation déplace automatiquement le pointeur de la souris. 9 000 cadres initiaux seront ignorés dans la procédure suivante.
- Répartir les 3 fichiers de script Perl (1.fillupGaps2.pl, 2.Calc_fish_id_moko_robust et 3.pl, 3.Sleep_summary_4cm_movingWindow.pl) dans le dossier contenant les fichiers de suivi générés par SwisTrack dans les dossiers « même » et « odd » (voir l’étape 2.2.3).
- Couper une image de la vidéo à partir du fichier vidéo à l’aide de VirtualDub et importer ce clip comme une photo dans ImageJ. Sélectionnez la longueur de l’aquarium (45,9 cm) dans ImageJ et calculer le rapport de pixels/cm. Écrivez le ratio pixels/cm en 1.fillGaps2.pl dans un programme d’édition de texte, puis enregistrez.
- Lancer le programme de CygWin, un émulateur Unix. Recherchez le dossier SwisTrack qui contient les 3 scripts Perl en utilisant des cd sur la ligne de commande.
- Exécutez le script Perl en tapant Perl 1.fillGaps.pl. Ces trois scripts Perl vont affecter chaque fichier de suivi à une chambre unique de l’aquarium et d’analyser la distance de natation et de la durée de sommeil tandis que le poisson était éveillé. Il faudra attendre 1-2 h à la fin de l’analyse.
- Évaluer le fichier texte nommé Summary_Sleep.txt pour déterminer si le nombre d’images exclus de l’analyse est acceptablement bas ; manque de moins de 15 % des cadres est jugée acceptable.
- Copiez et collez les résultats analysés de Summary_Sleep.txt à une feuille de calcul avec la macro (fichier complémentaire Sleep_12hr12hr_TEMPLATE.xlsm).
- Exécutez la macro pour extraire les données sommaires des fichiers de suivi.
3. DASPMI ou DASPEI de coloration de mécanosensoriels neuromasts
Remarque : DASPMI et DASPEI de coloration est sensible à la lumière et doit être faite dans l’obscurité. Suivant le protocole est pour les DASPMI et les DASPEI en utilisant DASPMI comme un exemple.
- Protocole de coloration
- Pour un total de 1 L de la coloration de la solution mère (25 µg/mL), ajouter 0,025 g de cristaux de DASPEI ou DASPMI pour 1 L de dH2O et laissez-le se dissoudre pendant la nuit. Conserver la solution stockés à 4 ° C et l’abri de la lumière.
- Plonger le poisson en 2,5 µg/mL DASPMI ou de DASPEI dissous dans l’eau conditionnée (voir étape 1.3.1) pendant 45 min dans un environnement sombre à 22 ° C.
- Après 45 min, retirer les poissons de la solution DASPMI ou DASPEI et anesthésier par immersion dans un bain de glace d’eau conditionnée avec 66,7 µg/mL de tampon-éthyl 3-aminobenzoate méthane sulfonate sel (MS222).
- Monter le poisson dans un plat de Pétri et la photographie sous un microscope à fluorescence. Prendre des images de z-pile et enregistrer les fichiers .tif pour l’analyse qui suit.
- Analyse d’images à l’aide de ImageJ
- Dans le dossier contenant les fichiers .tif, collez un modèle du fichier macro ImageJ (Neuromast_ImageJ.txt) et créez un nouveau dossier intitulé « Process_ImageJ ». Dans le fichier de macro ImageJ, affectez le chemin d’accès au répertoire en cours.
- Lancez ImageJ et ouvrez la macro en faisant glisser le fichier de macro dans l’interface graphique ou en cliquant sur fichier > ouvrir et en sélectionnant le fichier macro.
- Exécutez la macro en cliquant sur Macros > exécuter Macro. La macro s’ouvre alors automatiquement un fichier image à analyser. Si le fichier de l’image ne s’ouvre pas, cliquez sur Macro > fichier ramasser.
- Pour la quantification de le Neuromast, sélectionnez la zone concernée à l’aide de L’outil polygone.
- Frapper la clé chaud 5 à double zone d’intérêt.
- Utilisez l' Outil de peinture pour enlever ou ajouter des points de neuromast supplémentaire ou manquant de l’image précédente et ensuite appuyez sur 6. Après avoir atteint 6, deux nouvelles fenêtres apparaîtront : schéma de points numérotés neuromasts et une table avec neuromasts total quantifié.
- Appuyez sur 7 pour sauver les deux fichiers : un fichier est enregistré comme un fichier d’image .tif et l’autre est enregistrée comme fichier .xls. Une fois ces fichiers sont stockés, un nouveau fichier de la photo s’ouvre pour l’analyse.
- Consolider les comtes de neuromast de chaque poisson dans une feuille de calcul en exécutant le script de macro (SN_Number_Diameter.xlsm).
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Representative Results
Les résultats présentés ici sont des exemples représentatifs de ce qui peut être acquis avec les méthodes présentées. Donc, les résultats peuvent dévier légèrement de celles présentées ici pour poulsoni et poissons de surface selon les conditions expérimentales.
Comportement de l’attraction de vibration
On trouvera les résultats représentatifs pour VAB à la Figure 3 pour cave et poissons de surface. Notez le comportement de bord de suivi dans les poissons de surface (Figure 3 a; un attribut partagé avec agassizii) et la forte attraction de poulsoni à la tige vibrante (Figure 3 b). Le niveau de crête attraction a été observé près de 35Hz agassizii (Figure 3D) mais pas surface poissons (Figure 3), ce qui représente une différence essentielle dans les phénotypes comportements des deux morphes. Le sommet d’attraction autour de cette fréquence représente probablement la fréquence des vibrations de proies ou la nourriture points20,21.
Test de sommeil et l’hyperactivité
Les critères utilisés dans les présentes pour définir le sommeil correspondent aux seuils de réponse préalablement déterminées pour être efficace pour Astyanax11. Sommeil est caractérisée par longues périodes de quiescence et est défini comme l’immobilité de > 60 s et seuil de réponse élevé12,22,23. En comparaison avec des poissons de surface, les périodes de sommeil plus courtes se produisent dans agassizii larvaire et adulte11,12, donc, essais de sommeil sont un moyen efficace au phénotype comportemental d’Astyanax , de tous âges. Agassizii ont montré moins-sommeil (Figure 4 b, courte durée de sommeil en agassizii), ils sont aussi hyperactif (Figure 4 a).
DASPMI ou DASPEI de coloration de mécanosensoriels neuromasts
Neuromasts sont composées de cellules sensorielles qui peuvent être facilement colorées au DASPEI ou DASPMI et observées in vivo sous un microscope à fluorescence. Le résultat présenté était le résultat d’une coloration DASPMI. Le nombre de neuromasts superficiel est renforcé dans la région crânienne de l’agassizii par rapport aux poissons de surface (Figure 5, D) et les deux la taille, un proxy du nombre des cellules mécanosensoriels cheveux- et nombre de neuromasts superficielles sont en corrélation positive avec le niveau de comportement attraction vibration (nombre d’approches à la tige vibrante : Figure 5 a,B).
| Logiciel | Analyse | Version | site internet |
| avfs | Activité/sommeil | Version 1.0.0.6 | http://turtlewar.org/avfs/ |
| Avisynth | VAB | Version 2.6.0 | http://Avisynth.nl/index.php/main_page |
| Cygwin | Activité/sommeil | Version 2.11.0 | https://www.Cygwin.com/ |
| ImageJ | VAB et DASPEI | Version 1.52e | https://ImageJ.nih.gov/IJ/ |
| pfmap | Activité/sommeil | Construire des 178 | http://pismotec.com/download/ (sur le lien « Télécharger les archives » en bas) |
| SwisTrack | Activité/sommeil | Version 4 | https://en.Wikibooks.org/wiki/SwisTrack |
| WinAutomation | Activité/sommeil | Version 8 | https://www.WinAutomation.com/ (app gratuite autonome pour cette procédure) |
| Système d’exploitation Windows | VAB et activité/sommeil | 7, 8 ou 10 | https://www.Microsoft.com/en-US/Windows |
| x264vfw | Toutes les analyses | NA | https://sourceforge.net/projects/x264vfw/ |
Le tableau 1. Liste de logiciels libres utilisés dans ces analyses et le site Web d’origine.
Figure 1 : Schématique du matériel expérimental de vibration attraction test comportemental. Une tige de verre attachée à un haut-parleur est accordée à une fréquence de 40 Hz et immergée jusqu'à une profondeur d’environ 0,5 cm au début de l’enregistrement vidéo. Ce chiffre a été modifié de Yoshizawa et al.,5. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Schématique du matériel expérimental de dosage sommeil. Les citernes sont faits sur mesure des planches acrylique transparent épaisseur 0,7 cm ; septa est 0,3 cm grosses complètement opaque noir acrylique planches. Tableaux acrylique noir opaque est utilisés pour cette partie des réservoirs afin que les poissons ne peuvent pas voir l’autre. (A) vue de dessus : Note que les chambres extérieures de la citerne ont incliné septa vers l’intérieur pour tenir compte des différences à huis clos angle. (B, C) Frontal et latéral vues, respectivement. (D) tableau de trois réservoirs de rétro-éclairé avec lumière infrarouge en passant par un diffuseur afin d’homogénéiser l’intensité de la lumière à travers tous les réservoirs. Notez que l’orientation de chaque réservoir est ajustée afin que tous les mouvements de chaque poisson dans sa chambre respective soient visibles. Panneau (C) et (D) sont modifiés du16. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Résultats représentatifs d’une 3- minute test de comportement attraction vibration. (A, B) Vue de dessus de la voie de la nage des poissons de surface (A) et poulsoni (B) ; Marie y a des traces de la voie que les poissons pris au cours de la vidéo de 3 min. Le point noir au centre indique l’emplacement de la baguette de verre vibrant. plugin d’ImageJ wrMtrck a été utilisé pour visualiser les traces de poissons24. (C, D) Comparaison des résultats des poissons de surface (C) et poulsoni (D) exposés à plusieurs fréquences de vibration. Chaque point représente chaque poisson. Les zones ombrées foncées sont intervalle interquartile. Notez que dans l’ensemble de toutes les fréquences, poissons de surface ne montrent pas une attraction remarquable aux vibrations alors qu’agassizii montrent un maximum dans l’attraction près de 35 Hz. (C, D) modifié du 16. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Représentant les résultats de plusieurs mesures pour l’analyse de l’activité - Schémas d’activité diurne dans les poissons de surface et poulsoni. (A-B) Jour (barres jaunes) et les notes (barres noires) nuit de natation distance (m / min 10, A) et la durée du sommeil (1 000 s/12 h, B). Chaque barre représente les moyenne ± erreurs-types de moyenne. Étoiles bleues indiquent le niveau de signification pour les comparaisons statistiques entre les poissons de surface (Sf) et poulsoni (FC). Agassizii et poissons de surface ont significativement différentes activités de jour comme de nuit. Double sens statistique ANOVA pour chaque phénotype est : pour la natation distance (A) entre les poissons de surface (Sf) et poulsoni (FC) : F1 399 = 185,8, P < 0,001, entre jour et nuit : F1 399 = 26,9, P < 0,001, l’interaction entre la population et de jour comme de nuit : F1 399 = 3,6, P = 0,060 (non significative : n.s.) ; pour la durée du sommeil (B) entre Sf et FC : F1 399 = 237.9, P < 0,001, entre jour et nuit : F1 399 = 164.1, P < 0,001, l’interaction entre la population et de jour comme de nuit : F1 399 = 26.5, P < 0,001. Pour les deux analyses, N = 200 et 201 pour les poissons de surface et poulsoni, respectivement. La différence entre les activités de jour comme de nuit ont été testés par post-hoc jumelé t-tests avec des corrections de Bonferroni et indiquées par des astérisques noirs. indique le P < 0,001. ** indique P < 0,01. Un sous-ensemble des données a été réutilisé et mise à jour du 11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Représentant les résultats de la relation entre VAB et neuromast. (A, B) La relation entre VAB et neuromast le numéro et la taille en spelaea, poissons de surface et la progéniture hybride F1 de poissons de surface x agassizii. Notez que les scores normalisés d’attraction de vibration (racine carrée du nombre des approches) est corrélée avec l’abondance neuromast (Pearson coefficient de corrélation r = 0,62, P < 0,001) et le diamètre de neuromast (corrélation de Pearson coefficient r = 0,31, P < 0,01). Groupe A et B sont modifiés de5. (C, D) DASPMI coloration de neuromasts dans la région de la joue (C) un poisson de surface et (D) un poulsoni. Barre d’échelle en médaillon (C) et (D) sont 1,0 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ces méthodes présentées sont facile d’accès, mais peuvent être compliqués à réaliser en raison de la nature de ses origines de freeware. Par conséquent, il est fortement recommandé d’effectuer l’essais essais et analyses avant toute expérimentation réelle.
Le taux de génération de données peut être rapid une fois que le cadre analytique et expérimental sont établis. Une fois établi, il est possible des deux poissons Records en 7 min pour le dosage de VAB, 30 en 24h pour le dosage de l’activité et de sommeil et un poisson en 2,5 à 3 min pour neuromast d’imagerie, à partir de MS222 anesthésie à la capture de l’image finale. Les durées des analyses vidéo et image peuvent varier considérablement selon les performances de l’ordinateur utilisé. En utilisant un PC avec un CPU à 4-core et 8 Go de RAM, VAB analyse peut prendre 5-7 min par poisson, analyse de l’activité et de sommeil peut prendre de 6 à 8 heures par groupe de 30 poissons et analyse d’images neuromast peut prendre 5 ou 10 min par poisson (simple côté ou les deux côtés d’images de la region cranienne, respectivement). Disponible dans le commerce dépistant le logiciel (Table des matières) est une alternative pour l’analyse vidéo. Il est très puissant dans animal suivi mais cher (par exemple, logiciel de base ~ USD$ 5, 000 $us et multi-tracking module ~ USD$ 4 000). En ce moment, nos méthodes de suivi semblent atteindre une précision comparable du suivi, notamment pour l’analyse de l’activité et de sommeil, c'est-à-dire, les images manquantes sont généralement plus bas que 15 % du nombre total de trames. Cette méthode a également montré une grande reproductibilité dans quatre réplicats (supplémentaire tableau 1). Toutefois, la difficulté dans le développement de ce système sans une compréhension de base de codage dans le système d’exploitation Windows et Linux/Unix OS doit être reconnue.
Pendant les périodes d’acclimatation au poisson, ainsi qu’avant et au cours de tests comportements, il est essentiel d’offrir les meilleures conditions de vie possible et compatible pour poissons expérimentaux. Cela comprend alimentation nourriture de haute qualité dans le même temps et quantité tous les jours et maintien l’eau haute qualité (ammoniac, nitrates, nitrites et matières organiques, à faible ~ pH 7 et même conductivité autour 700 µS). Il est également important d’effectuer des essais dans une zone non perturbée par les bruits. Traces bruyants et des bruits de cliquetis peuvent changer des réponses comportementales et activité /-les habitudes de sommeil. Pour réduire le niveau des dommages à mécanosensoriels unités tandis que manipulation poisson, il est utile d’utiliser un filet de maille fine pendant le transfert des poissons ; Ceci aidera à éviter d’endommager la cupula mucus de neuromasts.
DASPEI colorant a des effets sublétaux sur le poisson, mais une exposition excessive peut avoir des effets toxiques. Par exemple, plonger le poisson dans la solution DASPEI pour 2 h augmentera les chances de mortalité au cours de la récupération de l’anesthésie après. DASPEI coloration est sensible à la lumière et par conséquent doit être faite dans l’obscurité.
En ce qui concerne l’installation du freeware, logiciels de AviSynth, système de fichiers virtuel Avisynth (avfs) et Pismo fichier monter Audit paquet (pfmap) requis des versions spécifiques de travailler ensemble de façon cohérente. Il a été confirmé par le présent protocole qu’avfs (v1.0.0.5), AviSynth (2.6.0) et pfmap (1.7.8) travaillent ensemble, mais au moins plus tard pfmap build n’a pas fonctionné pour la procédure de montage en fichier. Pour cette raison, faites attention aux versions logiciels (tableau 1). VirtualDub est plus efficace sous la version 32 bits au lieu de 64 bits. Le réglage de 15 images / s offrant une résolution de bon moment et ne nécessite pas de volume de stockage excessif (1,6 Go pour un test de sommeil 24h vidéo et 3 Mo pour une vidéo de VAB). Pour ImageJ, la principale difficulté peut provenir de définition des chemins d’accès dans la macro. Dans le système d’exploitation Windows, le chemin d’accès peut être généralement exprimée comme « C:Document\my Document\... ». La macro ImageJ fonctionne sous l’environnement d’exécution Java et a besoin d’un supplément « \ » pour le chemin du fichier, c'est-à-dire, « C\:Document\\my Document\\... ». Veuillez consulter le fichier de macro exemple ImageJ. En outre, il peut être nécessaire d’installer deux plugins, tranche Remover et objet Tracker25et assigner les touches d’accès rapide (raccourcis clavier), 6 et 8, respectivement, alors que les analyses fonctionnent de façon transparente (Plugins > raccourcis > ajouter Raccourcis... 26 ). SwisTrack a une fonction pour définir les paramètres de suivi, mais il est possible qu’un gel et/ou accident peut-être survenir pendant le réglage des paramètres de suivi. Il est préférable de modifier le paramètre dans une application éditeur de texte tel que Notepad ++. Pour le détail des réglages de paramètres, s’il vous plaît voir27. Le programme d’installation de Cygwin (émulateur Unix) inclut un installateur de package pour installer le paquet Perl, qui n’est pas inclus dans l’installation par défaut définissant. Il est recommandé de sélectionner le package Perl lors de l’installation de Cygwin.
Même si, cette procédure est limitée à un comportement basé sur la ligne latérale (VAB) et activité de nage et le sommeil, cet animal, système de suivi peut être adapté aux autres comportements dont les comportements répétitifs stéréotypés, interactions sociales et l’utilisation asymétrique ( gauche/droite) de neuromasts crânienne au cours de la recherche de nourriture (latéralité)13, bien que ces méthodes peuvent nécessiter des arènes peu profondes comme celles proposées par idTracker,14. Avec une suite de comportements ont évolué, on peut appliquer des scripts différents pour analyser les données d’axes X et Y sur chenilles et enquêter sur les différents modèles de comportement. Ce pipeline analyse vise à fournir une base pour résoudre le mécanisme de l’évolution en plusieurs comportements, et aussi comment les comportements de type autisme de comorbid sont réglementées par génétique, épigénétique et les facteurs environnementaux.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions tous les membres du laboratoire Yoshizawa dont N. Cetraro, N. Simon, C. Valdez, C. Macapac, J. Choi, L. Lu, J. Nguyen, S. Podhorzer, H. Hernandes, J. Fong, J. Kato et I. Lord pour soins de poissons sur les poissons expérimentaux utilisés dans ce manuscrit. Nous remercions également les membres de laboratoire A. Keene, dont P. Masek pour former mon montage caméra CCD IR. Enfin, nous tenons à remercier l’école Media Lab - collège des Sciences sociales - des Communications à l’Université d’Hawaï Manoa pour leur inestimable aide à faire de la vidéo, surtout B. Smith, J. Lam et S. White. Ce travail a été soutenu par Hawaiian Community Foundation (16CON-78919 et 18CON-90818) et Institut National de NIGM santé (P20GM125508) accorde aux MY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide) | MilliporeSigma | D3418 | |
| 880 nm wave length black light | Advanced Illumination | BL41192-880 | |
| avfs | freeware | Version 1.0.0.6 | http://turtlewar.org/avfs/ |
| Avisynth | freeware | Version 2.6.0 | http://avisynth.nl/index.php/Main_Page |
| Cygwin | freeware | Version 2.11.0 | https://www.cygwin.com/ |
| Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish) | Corning | 3140-100 | 10 cm diameter 5 cm high |
| Ethovision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | Version 14 | https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt |
| Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black | Jardin (through Amazon.com) | NA | Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system |
| Grade A Brine shrimp eggs | Brine shrimp direct | BSEA16Z | |
| ImageJ | freeware | Version 1.52e | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens | Toyo | NA | Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer |
| Neutral Regulator | Seachem | NA | |
| Optical cast plastic IR long-pass filter | Edmund optics | 43-948 | Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam |
| pfmap | freeware | Build 178 | http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom) |
| Reef Crystals Reef Salt | Instant Ocean | RC15-10 | |
| SwisTrack | freeware | Version 4 | https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack |
| USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam) | Microsoft | Q2F-00013 | Cut 2-2.5 cm of the front |
| WinAutomation | freeware | Version 8 | https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure) |
| Windows operating system | Microsoft | 7, 8 or 10 | https://www.microsoft.com/en-us/windows |
| x264vfw | freeware | NA | https://sourceforge.net/projects/x264vfw/ |
References
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