Behavior

Verhaltens-Tracking und Neuromast Darstellung der mexikanischen Cavefish

Published: April 6, 2019 doi: 10.3791/59099

McLean Worsham¹, Vânia Filipa Lima Fernandes², Alexander Settle¹, Chantell Balaan², Kimberly Lactaoen², Lillian J. Tuttle^1,3, Motoko Iwashita¹, Masato Yoshizawa¹

¹Department of Biology, University of Hawai'i at Mānoa, ²Department of Anatomy, Biochemistry and Physiology, University of Hawai'i at Mānoa, ³Pacific Biosciences Research Center, University of Hawai'i at Mānoa

Summary

Hier präsentieren wir Methoden für Hochdurchsatz-Studie eine Reihe von mexikanischen Cavefish, Verhaltensweisen und lebenswichtigen Färbung eines Mechanosensory-Systems. Diese Methoden nutzen freier Software und kundenspezifische Skripte, bietet eine praktische und kostengünstige Methode für das Studium des Verhaltens.

Abstract

Höhlenbewohnenden Tiere haben eine Reihe von morphologischen und verhaltensbezogene Merkmale Anpassung an ihre Umgebung ständig dunkel und Essen spärlich entwickelt. Unter diesen Eigenschaften ist Futtersuche Verhalten eines nützlichen Windows in funktionalen Vorteilen der behavioral Merkmal Evolution. Aktualisierte Methoden für die Analyse von Attraktion Schwingungsverhalten sind hierin dargestellt (VAB: eine adaptive Futtersuche Verhalten) und der damit verbundenen Mechanosensors der Höhle angepasst Tetra imaging Astyanax Mexicanus. Darüber hinaus werden Methoden für Hochdurchsatz-Tracking von einer Reihe von zusätzlichen Cavefish Verhaltensweisen wie Hyperaktivität und Schlafverlust vorgestellt. Cavefish zeigen auch Asozialität, repetitive Verhaltensweisen und höhere Angst. Cavefish dienen daher als Tiermodell für weiterentwickelte Verhaltensweisen. Diese Methoden nutzen freier Software und kundenspezifische Skripte, die auf andere Arten von Verhalten angewendet werden können. Diese Methoden bieten praktische und kostengünstige Alternativen zu den im Handel erhältlichen Tracking-Software.

Introduction

Die mexikanische Tetra, Astyanax Mexicanus (Teleostei: Characidae), ist einzigartig unter den Fischen mit zwei radikal verschiedene alternative Morphen - sehende, Oberfläche-Wohnung Morph und eine blinde, höhlenbewohnenden Morph, bestehend aus mehreren unterschiedlichen Populationen¹. Obwohl verschiedene in der Morphologie und Physiologie, sind sie noch interfertile²^,³. Diese interfertile Morphs scheinen schnell (~ 20.000 Jahre)⁴, wodurch sie ein ideales Modellsystem für das Studium der rasche Anpassung entwickelt haben. Cavefish sind bekannt für eine Reihe von unterschiedlichen morphologischen und Verhaltensstörungen Eigenschaften einschließlich erhöhte Dichte der Geschmacksnerven, erhöhte Anzahl von Mechanosensors, Futtersuche Verhalten auf einer bestimmten Frequenz eines vibrierenden Stimulus, Hyperaktivität, abgestimmt und Schlaflosigkeit. Viele dieser Verhaltensweisen entwickelt, wahrscheinlich gleichzeitig, von denen einige vorgeschlagen wurden, als vorteilhaft in der Dunkelheit von Höhlen für die Nahrungssuche⁵ und Energiesparen in dunklen und Essen spärlich Umgebungen⁶^,⁷.

In vielen evolutionären Modellsystemen ist es schwierig, integrierte wissen auf wie tierischer Morphologie und Verhalten ändern in Reaktion auf die Umwelt zu erwerben, da die meisten Arten in einem kontinuierlichen Verlauf in komplexen Umgebungen verteilt sind. Jedoch führte der starke Kontrast zwischen der Höhle und Oberfläche Morph Astyanax , die entwickelt in kontrastreichen Umgebungen abgegrenzt durch eine scharfe Ökoton Astyanax auftauchen als ein hervorragendes Modell zur tierischen Evolution zu verstehen. Dies macht es möglich, leichter Gene und Entwicklungsprozesse mit adaptiven Eigenschaften und Auswahl in der Umgebung zu verbinden. Darüber hinaus neue biomedizinische Untersuchungen dieser Merkmale in Astyanax hat gezeigt, dass diese Züge menschlichen Symptome⁸^,⁹^,¹⁰parallele können. Z. B. sind Verlust von Sozialität und Schlaf und Gewinn von Hyperaktivität, repetitive Verhaltensweisen und Cortisolspiegel ähnlich, was bei Menschen mit Autismus Spektrum Störung⁸beobachtet wird.

Um komplexe Ko-Evolution von vielen Verhaltensweisen und morphologischen Merkmale zu begegnen, ist es vorteilhaft, viele von ihnen zugrunde liegenden genetischen und molekularen Wege markieren assay. Hier werden Methoden zur Charakterisierung des Grades der Höhle-Typ Verhaltens Phänotypen von Oberfläche, Höhle und Hybrid Morphs von Astyanax. Die fokalen Verhaltensweisen analysiert, um Phänotyp zu charakterisieren sind Höhle angepasst Futtersuche Verhalten (Attraktion Schwingungsverhalten, fortan als VAB bezeichnet) und Hyperaktivität/Schlaf Dauer¹¹^,¹². Auch präsentiert, ist ein bildgebendes Verfahren für das sensorische System VAB¹³zugeordnet. Vor kurzem, sind viele OpenSource-Tracking-Software für die Ausführung von Verhaltensstörungen Assays zur Verfügung¹⁴^,¹⁵geworden. Diese arbeiten sehr gut für kurze Videos, weniger als 10 Minuten lang. Allerdings wird es problematisch, wenn das Video wegen intensiver Berechnung/Tracking Zeit länger ist. In der Lage, kommerziell verfügbare Software kann teuer werden. Vorgestellten Methoden verwenden hauptsächlich Freeware und daher gelten als kostengünstige und Hochdurchsatz-Methoden. Repräsentative Ergebnisse basieren sich auf diese Methoden ebenfalls enthalten.

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Protocol

Alle Eingriffe werden durchgeführt nach den Richtlinien beschrieben in "Grundsätze des Laboratory Animal Care" (National Institute of Health Publikation Nr. 85-23, überarbeitet, 1985) und der genehmigten durch Universität von Hawai ' i bei Manoa institutionelle Animal Care und Verwendung Ausschuss Tier Protokoll 17-2560-3.

(1) Vibration Attraktion Verhalten (VAB) Assay (≤ 10 min für die gesamte Aufnahme-Verfahren)

Hinweis: Verwenden Sie eine Infrarot-empfindliche Kamera oder bauen Sie eine Infrarotkamera durch Ändern einer USB-Webcam. Um eine USB-Webcam zu ändern, finden Sie eine detaillierte Beschreibung präsentiert von Keene Labor in dieser Cavefish Ausgabe bei Jupiter (aus dieser Ausgabe A. Mexicanus ) oder eine kurze Beschreibung in den ergänzenden Materialien.

Recording-setup
1. Um sicherzustellen, dass die Kamera in Position bleibt, noch, und die richtige Brennweite aus dem Subjekt (s) aufgezeichnet, bauen eine Black-Box-Rahmen aus Polyvinylchlorid (PVC) Rohre, von 120 cm H X 45 cm L X 90 cm w.
2. Bedecken Sie nach der Konstruktion des Rahmens es mit einem Kunststoff Verdunkelung Vorhang wie vorgesehen für die Hydrokultur Landwirtschaft.
3. Oben auf dem Rahmen setzen Sie einen schwarzen Acryl Board mit einem Fenster für die Infrarot-Kamera in der Mitte den gleichen Durchmesser wie das C montiert einstellbare Zoom-Objektiv zu messen. Platzieren Sie in dieser Box die VAB-Assay-Ausrüstung (Abbildung 1).
Vibration-Apparat
Hinweis: Schwingungen werden mit einem kleinen Funktionsgenerator hergestellt.
1. Vibrationen zu einer Amplitude von 0,15 mm und einer Frequenz von 40 Hz tune für die folgenden Methoden an, das ist die Frequenz, die eine maximale Antwort Attraktion⁵^,¹⁶entlockt.
2. Verbinden Sie der Funktionsgenerator mit einer horizontal gerichteten Lautsprecher.
3. Die Abdeckhaube auf der Vorderseite des Lautsprechers zuordnen Sie einen 7,5 mm Durchmesser Glasstab 14 cm in der Länge mit heiß-Kleber oder eine Dichtung Kleber.
4. Senkrecht zu dieser Rute und nach unten, legen eine weitere 7,5 mm Durchmesser Glasstab 4 cm in der Länge (Abbildung 1).
Verhaltens-assay
1. Eine experimentelle A. Mexicanus für 4 Tage in einer zylindrischen Assay-Kammer gefüllt mit konditionierten Wasser (pH-Wert zwischen 6,8-7,0, ca. 700 µS Leitfähigkeit, Temperatur ca. 22 ° c) mit einem 12/12 L/D-Zyklus zu akklimatisieren. Überprüfen Sie, ob Fische eingewöhnt haben, durch die Beobachtung ihrer Latenz zu Futter. Längere Latenz als in ihrer Heimat Tank bedeutet mehr Zeit der Akklimatisierung benötigt wird. In der gesamten Akklimatisierung feed einmal täglich mit live Artemia Nauplien.
2. Am Tag vor dem Tag des Tests (nach 3 Tagen Akklimatisierung), Wasser in der Assay-Kammer mit konditionierten Frischwasser ersetzen.
3. Am Tag des Tests (nach 4 Tagen Akklimatisierung) berauben Sie experimentelle Fisch essen bis nachdem der Test abgeschlossen ist. Sättigung wird ihre Reaktion auf Schwingungen zu ändern.
4. Legen Sie die Aufnahmeparameter in VirtualDub Freeware¹⁷: 15 Bilder/s, Codec: x264vfw, Aufnahme Dauer: 3 min 30 s.
5. Bereiten Sie die Vibration-emittierende Vorrichtung (siehe Schritt 1.2) von tuning bis 40 Hz. Siehe Abbildung 1 für die Erklärung des Apparates. Spülen Sie das Glas Schwingstab mit entionisiertem Wasser, keine wasserlöslichen Chemikalien zu entfernen.
6. Arbeiten in der Dunkelheit, den Assay-Zylinder auf der Aufnahme-Bühne beleuchtet durch eine Infrarot-Beleuchtung in der Black Box und Fisch, 3 min zu gewöhnen.
  1. Zeichnen Sie nach der Akklimatisierung 3 min 3 min 30 s Video auf Legen Sie zu Beginn der Aufnahme der Schwingstab Glas in der Wassersäule (ca. 0,5 cm Tiefe).
  2. Vermeide Lärm oder Vibrationen bei der Positionierung der Schwingstab Glas im Wasser wie ein Fisch Sinn können sogar die kleinsten Störungen.
  3. Beenden dieses Verfahren innerhalb von 30 s um sicherzustellen, dass die Videoaufnahme zu starten mehr als 3 min des Verhaltens erfasst.
7. Überwachen Sie das Video während der Aufnahme um sicherzustellen, dass keine Fehler in dieser Phase auftreten.
8. Nach Beendigung der Aufnahme, der Schwingstab Glas aus der zylindrischen Assay-Kammer und Entfernen der Assay-Kammer von der Aufnahme-Bühne. Wiederholung von 1.3.5 für die nächsten Fische.
Video-Analyse
Hinweis: Umwandlung des Codecs in ein Format, die geladen werden kann, ImageJ funktioniert nur auf Windows Betriebssystem¹⁸ (Tabelle 1).
1. Konvertieren Sie das komprimierte Avi-Video für ImageJ und Set Analyseparameter in ein lesbares Format.
  1. AviSynth_260.exe (https://sourceforge.net/projects/avisynth2/), Pfmap Build 178 (http://pismotec.com/pfm/ap/) und Avfs ver1.0.0.5 oder ver1.0.0.6 (https://sourceforge.net/projects/avf/) installieren. Beachten Sie, dass diese Methode Programmversion empfindlich ist. Der bereitgestellten Website-Links führen zu den korrekten Versionen (Tabelle 1).
  2. Führen Sie Batch-Datei per Doppelklick avs_creater.bat (zusätzliche Datei aus). Klicken Sie rechts auf die Avs-video-Datei zu analysieren (Auswahl der Avs-Dateien erstellt von avs_creater.bat).
  3. Wie Videoanalyse mit dem Tracker-Plugin in ImageJ Laden von ImageJ-Makro (ergänzende Datei Macro_VAB_moko.txt) erfordert, laden Sie das Makro per Drag-and-Drop in die GUI-Shell von ImageJ. Dieses Makro ermöglicht bestimmte Hotkeys für die folgende Analyse.
  4. Erstellen Sie im Arbeitsverzeichnis einen neuen Ordner mit dem Titel "Process_ImageJ".
  5. Klicken Sie rechts auf die .avs Datei analysiert (Auswahl der Avs-Dateien erstellt von avs_creater.bat). Wählen Sie die Quick Mount -Option. Nachdem die Avs Datei als externes Laufwerk bereitgestellt ist, öffnen Sie die Avi-Datei in ImageJ (Avi-Datei hat Namen Ende mit ".avi").
  6. Um das Ausmaß der die Distanzmessung festzulegen, wählen Sie den Durchmesser der Assay-Kammer durch Zeichnen von geraden Linien in der Kammer mit dem geradlinigen Auswahl-Werkzeugaus, und klicken Sie dann auf analysieren > Maßstab Funktion. Geben Sie 9,4 cm z. B. wenn eine zylindrische Schale mit 9,4 cm Innendurchmesser zu verwenden. Kontrollkästchen Sie das Radio Global um die Skala in alle folgenden video Analysen zu standardisieren.
2. Konvertieren in binären Stack und Analyse ausführen.
  1. Bereich Assay-Kammer mit dem Oval -Auswahl-Werkzeug zu kopieren und dann Rechtsklick und wählen Sie Bild > duplizieren. Geben Sie zu diesem Zeitpunkt den Rahmen für weitere Analysen, z.B., halten die ersten 2.700 Bilder nach der Schwingstab trat das Wasser (bei 15 fps ist dies genau 3 Minuten Video-Material).
  2. Deaktivieren Sie außen an der Assay-Kammer und konvertieren in ein binäres Bild durch Drücken der Hotkey 7 auf die Nummer der Tastatur.
  3. Nachdem Hintergrund löscht und eine Eingabeaufforderung angezeigt wird, fügen Sie einen schwarzen Punkt in der Mitte zur Anzeige der Position von der Schwingstab Glas mit dem Oval -Auswahl-Werkzeug auf schwarz mit der Füllung -Funktion bereits gesetzt. Klicken Sie auf "OK" und eine Eingabeaufforderung wird angezeigt, auf der Schwelle-Anpassung zu bewegen.
  4. Setzen Sie den Schwellenwert, eine Binärdatei (alle schwarz und weiß) Bild des Fisches zu machen. Passen Sie den Schwellenwert, so dass die Fische im gesamten video-Clips zu sehen, und wählen Sie dann anwenden.
  5. Das Plugin "Tracker" von schlagen die heißen Schlüssel 8 auf der Nummer Bar geführt. Die minimale Pixelgröße auf 100, wenn dazu aufgefordert, und drücken Sie "OK", erzeugen die Entfernung zwischen der Schwingstab und die Fische pro Frame für alle 3 min des binären Videos festgelegt.
  6. Passen Sie das MIS Tracking erzeugte Lärm im Video. Dazu überprüfen das Ergebnisfenster um die Frames zu identifizieren, die die Objektnummer 3 oder höher, das angibt, zusätzliche Objekte in diesen Frames (z. B. Teilchen im Wasser oder im Schatten des transparenten Arms des Stabes) zurück neben den "Stab" und "Fisch" in der Rahmen. Entfernen Sie alle zusätzlichen Objekte mit dem Pinselwerkzeug.
  7. Hit der heißen Schlüssel 9 auf der Nummer Bar einen binären Stapel von Bildern des gesamten Videos exportieren (für den Fall, dass es notwendig zu diagnostizieren ist) und eine XLS-Datei mit Koordinaten und Entfernungsdaten (ergänzende Dateien CF01.xls, Threshold_CF01.tif und Trac_CF01.tif ). Hot Key 9 schließt auch alle Dateien, die das aktuelle Video zugeordnet. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.2.1 durch 1.4.2.6 für alle Replikate.
  8. Führen Sie das Makroskript (ergänzende Datei JoVE_2cmVAB_template_15fps.xlsm) um mehrere Tracker Ergebnisdateien (XLS) in einer Tabelle zu konsolidieren und zählen Sie die Anzahl und Dauer der Ansätze in einen 1,5 cm vom Stab. Nähert sich nicht dauerhaft um mindestens 0,5 s wird nicht gezählt werden. Ändern Sie die Parameter von Distanz und Zeit gezählt als Ansatz nach bestimmten Fragen von Interesse.
3. Lassen Sie den PC Speicherplatz nach Beendigung aller Analysen. Bereitgestellte Dateien Speicherplatz - frei zu entfernen avi.avi und. avi.avs Dateien (Erweiterungen durch die Software generiert)-durch ausführen ein Batch Datei multiunmountdel.bat im selben Ordner wo avs_creater.bat im Abschnitt 1.4.1.2 ausgeführt wurde.

2. Sleep und Hyperaktivität Assay (24 h-Aufzeichnung)

Verhaltens-assay
1. Fünf experimentelle Fisch zu akklimatisieren, für 4 Tage oder mehr in jeder Kammer eine speziell angefertigte 10 L Acryl Aufnahme Aquarium (45,9 x 17,8 cm x 17,8 cm; Länge x Breite x Tiefe, beziehungsweise) mit konditionierten Wasser gefüllt (siehe Schritt 1.3.1).
  1. Trennen Sie jede einzelne Kammer mit schwarzem Acryl Boards machen Kammern gleicher Größe messen 88,9 mm × 177,8 mm × 177,8 mm (Abbildung 2). Achten Sie darauf, jeden Tank verhindern, dass Fische springen zwischen den Kammern zu decken.
  2. Stellen Sie den Timer programmierbar macht, automatisch schaltet sich weiße LED Licht für 12 h, und für 12 h täglich Akklimatisierung Zeitraum (z. B. festgesetzt 07:00 das Licht auf und ab um 19:00). Dies wird den zirkadianen Rhythmus des Fisches mitzureißen, (wenn es anfällig für Mitnahme ist).
  3. Spielbretter undurchsichtige, weiße Acryl ähnliche Dimension in den 10 L Tank als Diffusoren weiße und Infrarot-Licht durch zu gehen, um diffuses Licht sogar Intensität über alle Tanks zur Verfügung zu stellen.
  4. Im gesamten Akklimatisierung ernähren Sie sich einmal ein Tag mit Artemia Nauplien und Belüftung durch Schwammfilter in jedes Aquarium.
    Hinweis: Vergewissern Sie sich Fische werden zu einheitlichen Zeiten gefüttert (z.B. 1 X pro Tag um 09:00) da die Fütterung auch Mitnahme von zirkadianen Rhythmen¹⁹beeinflussen kann.
  5. Überprüfen Sie, ob Fische eingewöhnt werden, durch die Beobachtung ihrer Latenz zu Futter. Eine längere Wartezeit als in ihrer Heimat Tank bedeutet mehr Zeit der Akklimatisierung benötigt wird.
2. Am Tag vor dem Tag des Assays (3 Tage oder mehr die Akklimatisierung), ersetzen Sie Wasser in der Assay-Kammer mit frisch bedingt Wasser (siehe Schritt 1.3.1).
3. Legen Sie den Aufnahme-Parameter in VirtualDub Software¹⁷: 15 Bilder/s, Codec: x264vfw, Aufnahme Dauer: 86.400 s (24 h).
4. Schalten Sie die Infrarot-Beleuchtung hinter der Aufnahme-Bühne (siehe Abbildung 2). Passen Sie durch die Beobachtung der VirtualDub-live-Bild auf dem Bildschirm die Position jedes Aquarium zu machen, die USB-Kamera.
5. Am Tag der Aufnahme, jeder Fisch mit live Artemia Nauplien füttern alle Schwammfilter zu entfernen, und die Infrarot-Beleuchtung einschalten.
6. 24 h Aufnahme am Morgen zu starten (zum Beispiel die Startzeit ist 09:00 und die Endzeit ist 09:00 des Folgetages). Starten Sie die Videoaufnahme und sichern Sie die Position, um eine Störung zu vermeiden. In regelmäßigen Abständen zu überprüfen, dass die Aufnahme läuft.
7. Stellen Sie nach 24 h sicher, dass das Video korrekt gespeichert. Übertragen Sie das Video auf den PC-Arbeitsplatz zu verfolgen und analysieren die Fische Verhalten.
Video-Analyse
1. Prüfen Sie zunächst, die video-Qualität mit Blick auf die Beleuchtung. Überprüfen Sie, ob in jedem Abschnitt gibt es einen Fisch und MIS-tracking gibt es keine ausländischen Bewegungen, die verursachen können.
2. Bereiten Sie die Maske, MIS Verfolgung außerhalb des Aquariums zu vermeiden. Zwei Masken zu machen: eins für "selbst" und eins für "ungerade" Fisch, basierend auf ihre Reihenfolge in den Tanks.
3. Machen Sie zwei Ordner mit den Namen "odd" und "selbst" für die Masken beschrieben. Bewegen Sie das Tracking Parameterdatei des SwisTrack in jedem dieser Ordner.
4. Öffnen Sie das Tracking Parameterdatei von SwisTrack tracking-Software (ergänzende Datei Tracking_odd.swistrack oder Tracking_even.swistrack). Geben Sie den Pfad der Videodatei und Maskendatei, dann speichern und beenden Sie das Tracking Parameterdatei. Passen Sie Blob-Nummer und maximale Pixel-Parameter in "Blob-Erkennung" und "Nächster Nachbar Tracking" Komponenten, bzw., nach den Experimenten.
5. Doppelklicken Sie zum Ausführen eines Skripts von Win-Automatisierungssoftware, die SwisTrack Software automatisch geöffnet wird (ergänzende Datei swistrack_1.exe, swistrack_2.exe, swistrack_3.exe oder swistrack_4.exe- das sind die gleichen ausführbaren Dateien), die Hilfsmittel bei der Aktualisierung der adaptive Hintergrundabzug in SwisTrack.
6. Öffnen Sie Tracking_odd.swistrack oder Tracking_even.swistrack in SwisTrack-Software, um das Tracking zu laden Parameterdatei. Nach dem Laden der Parameter, drücken Sie den Betriebsschalter zu verfolgen.
7. Im ersten 9.000 Rahmen (600 s, d. h. ersten 10 min des aufgezeichneten Videos), prüfe, ob Fisch tracking funktioniert durch das Betrachten der adaptive Hintergrundabzug, binäre Maske und Verfolgung in der Komponentenliste des SwisTrack (siehe nächste Nachbar dazugehörige Video). Wählen Sie in der Komponentenliste Adaptive Hintergrundabzug .
8. Drücken Sie die R -Taste auf der Tastatur wieder gewinnen-Automatisierung und lassen Sie den PC zu verfolgen. Tracking dauert ca. 5-7 Stunden pro 24 h video für einen Desktop mit 4 CPU-Kerne und 8 GB Speicher. Je nach Bedarf führen Sie mehrerer SwisTrack Prozesse (einschließlich der geraden und ungerade Arenen von eine einzelne Videodatei aus) bis zur Anzahl der Kerne in der CPU. Zum Beispiel können 4-Kerne 4 Videos gleichzeitig verarbeiten.
9. Während dieses Tracking, vermeiden Sie mit diesem PC für andere Zwecke, weil Win-Automatisierungsprogramm automatisch den Mauszeiger bewegt. Die ersten 9.000 Frames werden in der folgenden Prozedur verworfen.
10. Der Ordner mit den Tracking-Dateien von SwisTrack in den Ordnern "selbst" und "ungeraden" (siehe Punkt 2.2.3) erzeugt ordnen Sie 3 Perl-Skript-Dateien (1.fillupGaps2.pl, 3.Sleep_summary_4cm_movingWindow.pl, 2.Calc_fish_id_moko_robust, und 3.pl zu).
11. Ein Frame des Videos aus der video-Datei mit VirtualDub Clip und importieren Sie diesen Clip als Foto in ImageJ. Wählen Sie die Länge des Aquariums (45,9 cm) in ImageJ und berechnen Sie Pixel/cm Verhältnis zu. Das Verhältnis der Pixel/cm in 1.fillGaps2.pl in einem Text-Editor-Programm schreiben und speichern.
12. CygWin-Programm, ein Unix-Emulator zu starten. Suchen Sie den SwisTrack Ordner mit 3 Perl-Skripts mithilfe von cd auf der Kommandozeile.
13. Führen Sie das Perl-Skript durch Eingabe von Perl 1.fillGaps.pl. Diese drei Perl-Skripts werden eine einzigartige Kammer des Aquariums jeder Tracking-Datei zuweisen und den Schlaf Dauer und Schwimmen Abstand zu analysieren, während die Fische wach war. Es dauert ca. 1-2 h um die Analyse zu beenden.
14. Beurteilen Sie die Textdatei mit dem Namen Summary_Sleep.txt um festzustellen, ob die Anzahl der Frames, die aus der Analyse fiel akzeptabel niedrig ist; weniger als 15 % der Rahmen fehlt, ist akzeptabel.
15. Kopieren Sie und fügen Sie der analysierten Ergebnisse aus Summary_Sleep.txt mit einem Arbeitsblatt mit dem Makro (ergänzende Datei Sleep_12hr12hr_TEMPLATE.xlsm ein).
16. Führen Sie das Makro um die Zusammenfassungsdaten von tracking-Dateien zu extrahieren.

3. DASPMI oder DASPEI Färbung des Mechanosensory neuromasts

Hinweis: DASPMI und DASPEI Färbung ist lichtempfindlich und sollte im Dunkeln erfolgen. Nach Protokoll ist für DASPMI und DASPEI mithilfe von DASPMI als Beispiel.

Färbeprotokoll
1. Für insgesamt 1 L der Färbung Stammlösung (25 µg/mL) 1 L dH₂O 0,025 g DASPEI oder DASPMI Kristalle hinzu und lassen Sie es über Nacht auflösen. Aufzubewahren Sie Lösung bei 4 ° C gelagert und vor Licht geschützt.
2. Tauchen Sie den Fisch in 2,5 µg/mL DASPMI oder DASPEI in klimatisierten Wasser aufgelöst (siehe Schritt 1.3.1) für 45 min in einer dunklen Umgebung bei 22 ° C.
3. Nach 45 min Fisch aus der DASPMI oder DASPEI Lösung zu entfernen und durch Eintauchen in ein Eisbad konditionierten Wasser mit 66,7 µg/mL gepuffert-Ethyl-3-Aminobenzoate Methan Sulfonate Salz (MS222) zu betäuben.
4. Fisch in eine Petrischale Platte und ein Foto unter dem Fluoreszenz-Mikroskop zu montieren. Nehmen Sie Z-Stapel Bilder und speichern Sie als .tif-Dateien für die folgende Analyse.
Bildanalyse mit ImageJ
1. Innerhalb des Ordners mit TIF-Dateien fügen Sie eine Vorlage von ImageJ-Makro-Datei (Neuromast_ImageJ.txt) und erstellen Sie einen neuen Ordner mit dem Titel "Process_ImageJ". Legen Sie in der Makrodatei ImageJ den Pfad zum aktuellen Verzeichnis.
2. ImageJ zu starten und das Makro öffnen, indem man die Makrodatei in die GUI oder durch Klicken auf Datei > Öffnen Sie und die Makrodatei auswählen.
3. Führen Sie das Makro, indem Sie auf Makros > Makro ausführen. Das Makro öffnet sich dann automatisch eine Bild-Datei analysiert werden. Wenn die Bilddatei nicht geöffnet wird, klicken Sie Makro > Datei abholen.
4. Wählen Sie für die Quantifizierung von Neuromast die Region von Interesse mit Polygon-Werkzeug.
5. Drücken Sie die heiße Schlüssel 5 doppelte Region von Interesse.
6. Verwenden Sie das Malwerkzeug zu entfernen oder fügen Sie Punkte für zusätzliche oder fehlende Neuromast aus dem vorherigen Bild und drücken Sie dann 6. Nach der Kollision mit 6, zwei neue Fenster erscheint: Schema der nummerierten Neuromasts Punkte und einen Tisch mit insgesamt Neuromasts quantifiziert.
7. Drücken Sie 7 um beide Dateien zu speichern: eine Datei wird als .tif Bilddatei gespeichert und der andere wird als XLS-Datei gespeichert. Nachdem diese Dateien gespeichert sind, öffnet sich eine neue Bilddatei für die Analyse.
8. Konsolidieren Sie die Neuromast Grafen von jeder Fisch in einer Tabelle durch Ausführen der Makroskript (SN_Number_Diameter.xlsm).

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Representative Results

Die hier vorgestellten Ergebnisse sind repräsentative Beispiele der was mit den vorgestellten Methoden erworben werden können. Ergebnisse können daher leicht von den hier vorgestellten für Cavefish und Oberfläche Fisch abhängig von den experimentellen Bedingungen abweichen.

Schwingungsverhalten Attraktion

Repräsentative Ergebnisse für VAB finden Sie in Abbildung 3 für Höhle und Oberfläche Fisch. Beachten Sie die Rand-folgendes Verhalten an der Oberfläche Fischen (Abbildung 3A; ein Attribut mit Cavefish geteilt) und die starke Anziehungskraft des Cavefish, der Schwingstab (Abb. 3 b). Der Spitzenpegel Attraktion wurde in der Nähe von 35 Hz für Cavefish (Abbildung 3D) aber nicht Oberfläche Fisch (Abbildung 3), einen wesentlichen Unterschied in der behavioralen Phänotypen von zwei Morphs vertritt beobachtet. Der Gipfel Attraktion rund um diese Frequenz repräsentiert wahrscheinlich die Frequenz der Vibrationen von Beute oder Lebensmittel Artikel²⁰^,²¹gemacht.

Schlaf und Hyperaktivität assay

Den Schlaf definieren hierin verwendeten Kriterien entsprechen die Ansprechschwellen zuvor entschlossen, für Astyanax¹¹wirksam. Schlaf ist gekennzeichnet durch längere Ruhe und ist definiert als Unbeweglichkeit der > 60 s und erhöhte Antwort Schwelle¹²^,²²^,²³. Im Vergleich zur Oberfläche Fisch kürzere Schlaf Laufzeiten treten bei Larven und adulten Cavefish¹¹^,¹², deshalb Schlaf-Assays sind eine effektive Möglichkeit, verhaltensorientierte Phänotyp Astyanax aller Altersgruppen. Während Cavefish weniger Schlaf (Abbildung 4 b, kürzere Schlafdauer in Cavefish) gezeigt hat, sind sie auch hyperaktiv (Abb. 4A).

DASPMI oder DASPEI Färbung des Mechanosensory neuromasts

Neuromasts bestehen aus Sinneszellen, die leicht gefärbt mit DASPEI oder DASPMI und in-vivo unter dem Fluoreszenz-Mikroskop beobachtet werden können. Das präsentierte Ergebnis war das Ergebnis der DASPMI Färbung. Die Anzahl der oberflächlichen Neuromasts wird in der Oberkopf Cavefish im Vergleich zur Oberfläche Fisch (Abbildung 5, D) und beide die Größe-ein Proxy der Anzahl der Haarzellen Mechanosensory verbessert- und Anzahl der oberflächlichen Neuromasts sind positiv korreliert mit dem Grad der Anziehung Schwingungsverhalten (Anzahl der Ansätze der Schwingstab: Abbildung 5A,B).

Software	Analyse	Version	Webseite
AVFS	Aktivität/Schlaf	Version 1.0.0.6	http://turtlewar.org/AVFS/
AviSynth	VAB	Version 2.6.0	http://AviSynth.nl/Index.php/main_page
Cygwin	Aktivität/Schlaf	Version 2.11.0	https://www.Cygwin.com/
ImageJ	VAB und DASPEI	Version 1.52e	https://ImageJ.nih.gov/IJ/
pfmap	Aktivität/Schlaf	Build 178	http://pismotec.com/Download/ (unter "Download-Archiv" Link unten)
SwisTrack	Aktivität/Schlaf	Version 4	https://en.Wikibooks.org/wiki/SwisTrack
WinAutomation	Aktivität/Schlaf	Version 8	https://www.WinAutomation.com/ (kostenlose Standalone-app für dieses Verfahren)
Windows-Betriebssystem	VAB und Aktivität/Schlaf	7, 8 oder 10	https://www.Microsoft.com/en-US/Windows
x264vfw	Alle Analysen	NA	https://sourceforge.net/projects/x264vfw/

Tabelle 1. Liste der Freeware in dieser Analysen und Quelle-Website verwendet.

Abbildung 1 : Schema der Vibration Attraktion Verhaltens Assay experimentelle Ausstattung. Ein Glasstab, an einen Lautsprecher angeschlossen ist auf einer Frequenz von 40 Hz abgestimmt und unter Wasser bis zu einer Tiefe von ca. 0,5 cm zu Beginn der Videoaufzeichnung. Diese Zahl wird von Yoshizawa Et Al.⁵geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Stromlaufplan von Schlaf-Assay experimentelle Ausstattung. Tanks sind nach Maß von 0,7 cm dicken transparenten Acryl Boards; Septen sind 0,3 cm dicken völlig undurchsichtig schwarz Acryl Boards. Opak schwarz Acryl Boards sind für diesen Teil der Panzer verwendet, damit Fische gegenseitig nicht sehen können. (A) Draufsicht: Beachten Sie, dass die äußeren Kammern des Tanks nach innen Septen unterzubringen gekippt haben Unterschiede in der Kamera Winkel. (B, C) Front- und Seitenairbags anzeigt, beziehungsweise. (D) Array mit den drei Panzer Hintergrundbeleuchtung mit Infrarot-Licht durch einen Diffusor um die Intensität des Lichtes über alle Tanks zu homogenisieren. Beachten Sie, dass jeder Tank Ausrichtung so eingestellt ist, dass alle Bewegungen der jeder Fisch in der jeweiligen Kammer sichtbar sind. Panel (C) und (D) werden von¹⁶geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Repräsentative Ergebnisse von 3- Minute Vibration Attraktion Verhalten Assay. (A, B) Draufsicht auf den schwimmen Weg der Oberfläche Fische (A) und Cavefish (B); Redlining sind Spuren des Pfades, die der Fisch während der 3-Minuten-Video nahm. Der schwarze Punkt in der Mitte gibt die Position von der Schwingstab Glas. WrMtrck ImageJ Plugins wurde verwendet, um die Fische Spuren²⁴zu visualisieren. (C, D) Vergleich der Ergebnisse von Oberfläche Fisch (C) und Cavefish (D), mehrere Frequenzen der Schwingungen ausgesetzt. Jeder Punkt steht für jeden Fisch. Dunklen Schattenbereichen sind Interquartilbereich. Beachten Sie, dass über alle Frequenzen Oberfläche Fisch keine bemerkenswerte Anziehungskraft auf Vibration zeigen während Cavefish ein Maximum in Attraktion in der Nähe von 35 Hz zeigen. (C, D) von ¹⁶geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 : Vertreter ergibt sich aus mehrere Maßnahmen zur Analyse - Tagaktive Aktivitätsmuster in Oberfläche Fisch und Cavefish. (A-B) Tag (gelber Balken) und Nacht (schwarze Balken) Resultate von Schwimmen Abstand (m / 10 min, A) und Schlafdauer (1.000 S/12 h, B). Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert ± Standardfehler von Mittelwert. Blaue Sterne bedeuten das Signifikanzniveau für statistische Vergleiche zwischen Oberfläche Fisch (Sf) und Cavefish (Cf). Cavefish und Oberfläche Fisch haben deutlich unterschiedliche Tag-Nacht-Aktivitäten. Zwei-Wege-ANOVA-Statistiken für jedes Phänotyp sind: zum Schwimmen Abstand (A) zwischen Oberfläche Fisch (Sf) und Cavefish (Cf): F_1.399185,8, P = < 0,001, zwischen Tag und Nacht: F_1.399 26,9, P = < 0,001, Interaktion zwischen Bevölkerung und Tag / Nacht: F_1.399= 3,6, P = 0.060 (nicht signifikant: n.s.); für die Schlafdauer (B) zwischen Sf und Cf: F_1.399 = 237.9, P < 0,001, zwischen Tag und Nacht: F_1.399 164,1, P = < 0,001, Interaktion zwischen Bevölkerung und Tag / Nacht: F_1.39926,5, P = < 0,001. Für beide Analysen, N = 200 und 201 für Oberfläche Fische und Cavefish, beziehungsweise. Der Unterschied zwischen Tag und Nacht Aktivitäten wurden durch Post-hoc-gepaart tgetestet-tests mit Bonferroni Korrektur und durch schwarze Sternchen gekennzeichnet. bezeichnet P < 0,001. ** kennzeichnet P < 0,01. Eine Teilmenge der Daten wurde wiederverwendet und von ¹¹aktualisiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5 : Ergebnisse der Vertreter des Verhältnisses zwischen VAB und Neuromast. (A, B) Die Beziehung zwischen VAB und Neuromast Anzahl und Größe in Cavefish, Oberfläche Fisch und die F1 Hybride Nachkommen der Oberfläche Fisch x Cavefish. Beachten Sie, dass die normalisierten Bewertungen der Vibration Anziehung (Quadratwurzel der Anzahl der Ansätze) ist positiv korreliert mit Neuromast Fülle (Pearson Korrelationskoeffizient R = 0,62, P < 0,001) und Neuromast Durchmesser (Pearson-Korrelation Koeffizient R = 0,31, P < 0,01). Gruppe A und B werden von⁵geändert. (C, D) DASPMI Färbung des Neuromasts in der Wange-Region (C) eine Oberfläche Fisch und (D) eine Cavefish. Maßstabsleiste im Einschub (C) und (D) sind 1,0 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Zusatzmaterialien. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

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Discussion

Diese vorgestellten Methoden sind leicht zu erreichende aber können kompliziert sein, aufgrund der Beschaffenheit des Landstrichs Freeware durchführen. Daher ist es dringend empfohlen, Test Tests und Analysen vor jeder tatsächlichen Experimente durchführen.

Die Rate der Datengenerierung kann schnell sein, sobald der experimentelle und analytischen Rahmen geschaffen. Einmal etabliert, ist es möglich, aufzeichnen zwei Fische in 7 min zum VAB Test, 30 Fische in 24 h für die Aktivität/Schlaf-Assay und einen Fisch in 2,5 bis 3 min für Neuromast imaging, ausgehend von MS222 Anästhesie zu Finalbild erfassen. Die Dauer der Video- und Analysen können je nach Leistung des Computers erheblich variieren. Durch die Verwendung eines PCs mit einem 4-Kern-CPU und 8 GB RAM, VAB Analyse dauert ca. 5-7 min pro Fisch, Aktivität/Schlafanalyse dauert 6 bis 8 h pro Gruppe mit 30 Fische und Neuromast Bildanalyse kann 5 oder 10 min pro Fisch nehmen (einzelne Seite oder auf beiden Seiten der Bilder von der Oberkopf, beziehungsweise). Handelsübliche tracking-Software (Table of Materials) ist eine Alternative zur Videoanalyse. Es ist sehr mächtig in Tier verfolgen aber teuer (z. B. Basis Software ~ USD$ 5, 000USD und Multi-tracking Modul ~ USD$ 4.000). In diesem Augenblick unsere Tracking-Methoden scheinen vergleichbare Genauigkeit des Trackings, vor allem für die Aktivität/Schlafanalyse, d. h. zu erreichen, fehlenden Frames sind in der Regel niedriger als 15 % des gesamten Frames. Diese Methode zeigte auch eine hohe Reproduzierbarkeit in vier Wiederholungen (zusätzliche Tabelle1). Allerdings muss die Schwierigkeiten bei der Entwicklung dieses Systems ohne ein Verständnis der grundlegenden Codierung in Windows OS und Linux/Unix OS anerkannt werden.

Fisch Akklimatisierung Zeiten sowie vor und während der Verhaltens-Assays ist es unerlässlich ist, die besten möglich und einheitliche Lebensbedingungen für experimentelle Fisch. Dazu gehören qualitativ hochwertige Lebensmittel zur gleichen Zeit und Menge füttern, jeden Tag und die Aufrechterhaltung hoher Wasserqualität (geringe Ammoniak, Nitrat, Nitrit und gelöste organische Stoffe, ~ pH 7 und ähnliche Leitfähigkeit um 700 µS). Es ist auch wichtig, dass Proben in einem Gebiet nicht durch Geräusche gestört. Laute Schritte und klappernde Geräusche können Verhaltensreaktionen und Aktivität/Schlaf-Muster ändern. Um die Höhe des Schadens auf Mechanosensory Einheiten beim Umgang mit Fisch zu reduzieren, ist es hilfreich, ein feinmaschiges Fischnetz während der Übertragung von Fisch zu verwenden; Dies wird helfen, um eine Beschädigung der Schleim Cupula des Neuromasts.

DASPEI Farbstoff hat subletale Wirkungen auf die Fische, aber übermäßige Belastung durch toxische Wirkungen führen kann. Beispielsweise wird die Chance der Sterblichkeit Eintauchen der Fisch in der DASPEI-Lösung für 2 h während der Wiederherstellung der Post-Anästhesie erhöhen. DASPEI Färbung ist lichtempfindlich und sollte daher in dunklen Bedingungen erfolgen.

Wie bei Freeware-Installation erforderliche AviSynth Software, Avisynth Virtual File System (Avfs) und Pismo File Mount Audit-Paket (Pfmap) bestimmte Versionen zusammenhängend zusammenarbeiten. Durch dieses Protokoll wurde bestätigt, dass Avfs (v1.0.0.5), AviSynth (2.6.0) und Pfmap (1.7.8) zusammen, aber zumindest die neuesten Arbeiten Pfmap Build nicht für die Datei-Montage-Verfahren arbeiten. Achten Sie aus diesem Grund auf die Software-Versionen (Tabelle 1). VirtualDub funktioniert besser unter der 32-Bit-Version anstelle von 64-Bit. Die Einstellung von 15 Frames pro s bietet eine gute zeitliche Auflösung und erfordert keine übermäßige Speichervolumen (1,6 GB für einen 24-Stunden-Schlaf-Assay video und 3 MB für eine VAB-Video). Für ImageJ kommen die Hauptschwierigkeit Dateipfade in das Makro festlegen. In Windows-Betriebssystem kann den Pfad der Datei in der Regel als "C:Document\my Document\..." ausgedrückt werden. ImageJ Makro läuft unter der Java-Umgebung und benötigt eine zusätzliche "\" für den Pfad der Datei, das heißt, "C\:Document\\my Document\\...". Finden Sie die Beispieldatei ImageJ Makro. Darüber hinaus kann es zu installieren zwei Plugins, Slice-Entferner und Object Tracker²⁵, und ordnen Sie die Hotkeys (Tastenkombinationen) 6 und 8, bzw. notwendig sein, so dass die Analysen nahtlos (Plugins > Shortcuts > hinzufügen Verknüpfungen... ²⁶ ). SwisTrack hat eine Funktion, um die Tracking-Parameter eingestellt, aber es ist möglich, dass ein Einfrieren und/oder Absturz auftreten kann, während der Einstellung der Parameter. Es ist besser, den Parameter in einen Text-Editor-app wie Notepad++ bearbeiten. Details der Parametereinstellungen entnehmen Sie bitte der²⁷. Cygwin (UNIX-Emulator) enthält einen Paket-Installer, um die Perl-Paket zu installieren, die nicht in der Einstellung Standard-Installation enthalten ist. Es empfiehlt sich, speziell die Perl-Paket wählen während der Installation von Cygwin.

Obwohl dieses Verfahren mit einer Seitenlinie basierende Verhalten (VAB) und Schwimmen Aktivität und Schlaf beschränkt ist, kann dieses Tier-Tracking-System an andere Verhaltensweisen Stereotype repetitive Verhaltensweisen, soziale Interaktionen und die asymmetrische Nutzung (einschließlich angepasst werden links/rechts) des kranialen Neuromasts bei der Nahrungssuche (Lateralität)¹³, obwohl diese Methoden flachere Arenen, wie die von IdTracker¹⁴vorgeschlagenen verlangen können. Mit einer Suite von weiterentwickelten Verhaltensweisen kann man verschiedene Skripte, um die verfolgten X- und y-Achse Daten analysieren und untersuchen verschiedene Verhaltensmuster gelten. Diese Analyse Pipeline soll eine Grundlage zur Behebung den Mechanismus der Evolution in mehrere Verhalten, und auch, wie Appetenzstörung Autismus-ähnliche Verhaltensweisen durch genetische reguliert werden, epigenetische, und Umweltfaktoren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir danken allen Mitgliedern des Yoshizawa Labor einschließlich N. Cetraro, N. Simon C. Valdez, C. Macapac, J. Choi, L. Lu, J. Nguyen, S. Podhorzer, H. Hernandes, J. Fong, J. Kato und I. Lord für Fisch Pflege auf die experimentelle Fische in diesem Manuskript verwendet. Wir danken auch A. Keene Lab-Mitglieder, darunter s. Masek Train MY IR CCD Kamera zusammenzubauen. Zu guter Letzt möchten wir der Media Lab - College of Social Sciences - School of Communications an der University of Hawai ' i Mānoa für ihre unschätzbare Hilfe mit macht das Video vor allem B. Smith, J. Lam und S. White danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Hawaiian Community Foundation (16CON-78919 und 18CON-90818) und nationale Institute der Gesundheit NIGMS (P20GM125508) vergibt an MY.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide)	MilliporeSigma	D3418
880 nm wave length black light	Advanced Illumination	BL41192-880
avfs	freeware	Version 1.0.0.6	http://turtlewar.org/avfs/
Avisynth	freeware	Version 2.6.0	http://avisynth.nl/index.php/Main_Page
Cygwin	freeware	Version 2.11.0	https://www.cygwin.com/
Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish)	Corning	3140-100	10 cm diameter 5 cm high
Ethovision XT	Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands	Version 14	https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt
Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black	Jardin (through Amazon.com)	NA	Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system
Grade A Brine shrimp eggs	Brine shrimp direct	BSEA16Z
ImageJ	freeware	Version 1.52e	https://imagej.nih.gov/ij/
macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens	Toyo	NA	Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer
Neutral Regulator	Seachem	NA
Optical cast plastic IR long-pass filter	Edmund optics	43-948	Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam
pfmap	freeware	Build 178	http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom)
Reef Crystals Reef Salt	Instant Ocean	RC15-10
SwisTrack	freeware	Version 4	https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack
USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam)	Microsoft	Q2F-00013	Cut 2-2.5 cm of the front
WinAutomation	freeware	Version 8	https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure)
Windows operating system	Microsoft	7, 8 or 10	https://www.microsoft.com/en-us/windows
x264vfw	freeware	NA	https://sourceforge.net/projects/x264vfw/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Behavior

Verhaltens-Tracking und Neuromast Darstellung der mexikanischen Cavefish

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Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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