Summary
Qui, presentiamo i metodi per lo studio di alto-rendimento di una serie della caverna messicano comportamenti e colorazione vitale di un sistema che mechanosensory. Questi metodi utilizzano script software libero e su misura, che forniscono un metodo pratico ed economico per gli studi dei comportamenti.
Abstract
Caverna-dimora animali hanno evoluto una serie di tratti morfologici e comportamentali per adattarsi ai loro ambienti perennemente buio e cibo di tipo sparse. Tra questi tratti, comportamento di foraggiamento è una delle finestre utili in vantaggi funzionali dell'evoluzione caratteristica comportamentale. Sono presentati qui metodi aggiornati per analizzare il comportamento di attrazione di vibrazione (VAB: un comportamento di foraggiamento adattivo) e formazione immagine di mechanosensors associato della grotta-adattato tetra, Astyanax mexicanus. Inoltre, i metodi sono presentati per l'inseguimento ad alta velocità di una serie di comportamenti di caverna aggiuntive tra cui iperattività e perdita di sonno. Caverna Mostra anche maggiore ansia, comportamento ripetitivo e socievolezza. Di conseguenza, caverna serve come modello animale per comportamenti evoluti. Questi metodi utilizzano gli script di software libero e su misura che possono essere applicati ad altri tipi di comportamento. Questi metodi forniscono alternative pratiche ed economicamente vantaggiose per il software di monitoraggio disponibili in commercio.
Introduction
Il tetra messicano, Astyanax mexicanus (Teleostei: Characidae), è l'unico fra i pesci per avere due radicalmente alternativo morfismo - un morph avvistato, Superficie-abitazione e un morph cieco, caverne, composto da diversi distinti popolazioni1. Sebbene diversi per morfologia e fisiologia, essi sono ancora interfertile2,3. Questi morphs interfertile sembrano sono evolute rapidamente (~ 20.000 anni)4, che li rende un sistema modello ideale per lo studio di rapido adattamento. Caverna è noti per avere una suite di divergenti tratti morfologici e comportamentali, tra cui una maggiore densità delle papille gustative, aumento del numero di mechanosensors, sintonizzato su una frequenza particolare di uno stimolo di vibrazione, iperattività, comportamento di foraggiamento e insonnia. Molti di questi comportamenti probabilmente evoluti contemporaneamente, alcuni dei quali sono stati suggeriti per essere vantaggioso nell'oscurità delle grotte per foraggiare5 e modalità di risparmio energetico in ambienti scuri e alimenti-sparse6,7.
In molti sistemi di modello evolutivo, è difficile da acquisire conoscenze integrate sul cambiamento di morfologia e comportamento come animale in risposta all'ambiente, perché la maggior parte delle specie sono distribuita su una pendenza continua in ambienti complessi. Tuttavia, il netto contrasto tra la grotta e la superficie morph Astianatte che si sono evoluti in altamente contrastanti ambienti delineati da un ecotono tagliente ha portato ad Astianatte emergendo come un eccellente modello per capire l'evoluzione degli animali. Questo rende possibile collegare più facilmente geni e processi di sviluppo con tratti adattivi e selezione nell'ambiente. Inoltre, recenti indagini biomediche di questi tratti in Astyanax ha dimostrato che questi tratti possono parallelo sintomi umano8,9,10. Ad esempio, perdita di sonno e di socialità e aumento di iperattività, comportamento ripetitivo e livello di cortisolo sono simili a ciò che è osservato in esseri umani con autismo spettro disturbo8.
Per affrontare la complessa co-evoluzione di molti comportamenti e caratteristiche morfologiche, è vantaggioso per molti di loro per evidenziare sottostanti vie genetiche e molecolari di analisi. Metodi per caratterizzare il grado di fenotipi comportamentali grotta-tipo di superficie, cave e ibrido morph di Astianattesono presentati qui. I comportamenti focali analizzati per caratterizzare il fenotipo sono Grotta-adattato foraggiamento comportamento (comportamento vibrazionale attrazione, d'ora in poi indicato come VAB) e iperattività/sonno durata11,12. Anche presentato è un metodo di imaging per il sistema sensoriale associato VAB13. Recentemente, molti software di monitoraggio open source per l'esecuzione di analisi comportamentale sono diventati disponibili14,15. Questi funzionano molto bene per brevi video, a meno di 10 minuti lunghi. Tuttavia, diventa problematico se il video è più lungo a causa di intenso monitoraggio/calcolo tempo. Software disponibile in commercio in grado può essere costoso. I metodi presentati principalmente usano freeware e quindi sono considerati metodi di alto-rendimento e costi contenuti. Inoltre incluso sono risultati rappresentativi basati su questi metodi.
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Protocol
Tutte le procedure sono eseguite seguendo le istruzioni riportate in "Principi di laboratorio Animal Care" (National Institute of Health pubblicazione n. 85-23, rivisto 1985) e approvato da Università delle Hawaii a Manoa istituzionale Animal Care e uso Protocollo animale Comitato 17-2560-3.
1. test di vibrazione attrazione comportamento (VAB) (≤ 10 min per intera registrazione procedura)
Nota: Utilizzare una termocamera ad infrarossi sensibile o costruire una termocamera ad infrarossi modificando una webcam USB. Per modificare una webcam USB, vedere una descrizione dettagliata presentata da laboratorio Keene in questo numero di caverna a Giove (da questo problema di a. mexicanus ), o una breve descrizione dei materiali complementari.
- Setup di registrazione
- Per assicurare che la fotocamera rimanga in posizione, ancora e alla corretta lunghezza focale del soggetto in fase di registrazione, costruire una cornice di scatola nera dal cloruro di polivinile tubi (PVC), misura 120 cm H x 45 cm L x 90 cm l.
- Dopo la costruzione del telaio, coprirlo con una tenda di plastica blackout come quello previsto per l'agricoltura idroponica.
- Sulla parte superiore del telaio, mettono un bordo nero acrilico con una finestra per la telecamera a infrarossi al centro dello stesso diametro della lente zoom regolabile C-montato di misura. All'interno di questa scatola, posizionare l'apparecchiatura di dosaggio VAB (Figura 1).
- Apparato di vibrazione
Nota: Le vibrazioni sono prodotte utilizzando un generatore di piccola funzione.- Per i metodi seguenti, sintonizzare le vibrazioni di un'ampiezza di 0,15 mm ed una frequenza di 40 Hz, che è la frequenza che suscita una risposta massima di attrazione5,16.
- Collegare il generatore di funzioni ad un altoparlante di fronte orizzontale.
- Allegare una bacchetta di vetro del diametro di 7,5 mm lunghezza 14 cm per il coperchio antipolvere sul volto l'altoparlante utilizzando colla a caldo o un adesivo di guarnizione.
- Perpendicolare a questa canna e rivolta verso il basso, allegare un'altra bacchetta di vetro di diametro 7,5 mm 4 cm di lunghezza (Figura 1).
- Analisi comportamentale
- Acclimatare una sperimentale a. mexicanus per 4 giorni in una camera di dosaggio cilindrico riempita con acqua climatizzata (pH tra 6,8-7,0, conducibilità circa 700 µS, temperatura circa 22 ˚ c) con un ciclo di 12/12 L/D. Controllare se il pesce siano acclimatati osservando loro latenza di foraggio. Latenza più lunga rispetto a loro casa carro armato indica che occorre più tempo di acclimatazione. In tutto di acclimatazione, nutrire una volta al giorno con naupli di Artemia dal vivo.
- Il giorno prima del giorno del dosaggio (dopo 3 giorni di acclimatazione), sostituire l'acqua nella camera di dosaggio con acqua climatizzata.
- Il giorno del test (dopo 4 giorni di acclimatazione), privare pesce sperimentale di cibo fino a dopo il test è completo. Sazietà cambierà la loro risposta alle vibrazioni.
- Impostare i parametri di registrazione a VirtualDub freeware17: 15 fps, codec: x264vfw, durata della registrazione: 3 min 30 s.
- Preparare l'apparato di emissione di vibrazione (Vedi punto 1.2) di tuning a 40Hz. Vedere la Figura 1 per la spiegazione dell'apparato. Sciacquare la vibrante bacchetta di vetro con acqua deionizzata per rimuovere eventuali sostanze chimiche solubili in acqua.
- Lavorare al buio, posizionare il cilindro di dosaggio sulla fase di registrazione illuminato da una retroilluminazione a infrarossi nella scatola nera e consentire pesce raggiunga per 3 min.
- Dopo l'acclimatazione di 3 min, registrare 3 min 30 s del video. All'inizio della registrazione, inserire la bacchetta di vetro vibrante nella colonna d'acqua (circa 0,5 cm di profondità).
- Evitare di fare qualsiasi rumore o vibrazioni mentre il posizionamento la bacchetta di vetro vibrante in acqua come i pesci può senso anche le più lievi disagi.
- Completata la procedura entro 30 s di avviare la registrazione video per garantire che viene registrato più di 3 min del comportamento.
- Monitorare il video durante la registrazione per garantire che non si verificano errori in questa fase.
- Dopo aver terminato la registrazione, rimuovere la barra vibrante di vetro dalla camera di dosaggio cilindrici e rimuovere la camera di dosaggio dalla fase di registrazione. Ripetere da 1.3.5 per il prossimo pesce.
- Analisi video
Nota: Il codec di conversione in un formato che può caricare ImageJ funziona solo su Windows sistema operativo18 (tabella 1).- Convertire i video avi compresso in un formato leggibile per ImageJ e parametri di analisi impostata.
- Installare AviSynth_260.exe (https://sourceforge.net/projects/avisynth2/), pfmap build 178 (http://pismotec.com/pfm/ap/) e avfs ver1.0.0.5 o ver1.0.0.6 (https://sourceforge.net/projects/avf/). Si noti che questo metodo è sensibile di programma e versione. I collegamenti di sito fornito verranno guiderà per le versioni appropriate (tabella 1).
- Eseguire file batch facendo doppio clic su avs_creater.bat (file supplementare). Fare clic con il pulsante destro sul file avs video per essere analizzato (selezionare dai file avs creati da avs_creater.bat).
- Come analisi video utilizzando il plugin Tracker in ImageJ richiede il caricamento della macro ImageJ (file supplementare Macro_VAB_moko.txt), è possibile caricare la macro di drag-and-drop in shell GUI di ImageJ. Questa macro consentirà alcuni tasti di scelta rapida per la seguente analisi.
- Nella directory di lavoro, creare una nuova cartella intitolata "Process_ImageJ".
- Fare clic con il pulsante destro sul file. AVS per essere analizzato (selezionare dai file avs creati da avs_creater.bat). Selezionare l'opzione di montaggio rapido . Dopo il file avs è montato come un disco esterno, aprire il file avi in ImageJ (il file avi ha nome finale con ". avi").
- Per impostare la scala di misurazione della distanza, selezionare il diametro della camera di dosaggio disegnando una linea retta in tutta la camera utilizzando lo strumento selezione linea retta, quindi fare clic Analyze > impostare scala funzione. Ad esempio, input 9,4 cm se utilizza un piatto cilindrico con un diametro interno di 9,4 cm. Selezionare la casella di radio di Global al fine di standardizzare la scala all'interno di tutte le seguenti analisi dei video.
- Convertire in binario dello stack ed eseguire analisi.
- Copiare l'area di camera di dosaggio utilizzando lo strumento di selezione ovale e quindi fare clic destro e selezionare immagine > Duplica. In questo momento, specificare l'intervallo di fotogrammi da tenere per ulteriori analisi, ad esempio, tenere i primi 2.700 fotogrammi dopo la barra vibrante entrati in acqua (a 15 fps che è esattamente 3 minuti di video).
- Chiaro all'esterno della camera di dosaggio e convertire un'immagine binaria premendo il tasto di scelta rapida 7 sulla barra dei numeri della tastiera.
- Dopo Cancella lo sfondo e viene visualizzato un messaggio, è possibile aggiungere un punto nero al centro per indicare la posizione dell'asta vibrante vetro utilizzando lo strumento di selezione ovale già impostato su nero con la funzione di riempimento . Fare clic su OK e verrà visualizzato un prompt per passare alla regolazione della soglia.
- Impostare la soglia per creare un'immagine binaria (tutto bianco e nero) del pesce. Regolare la soglia in modo che il pesce può essere visto in intero clip video e scegliere applica.
- Eseguire il plugin "Tracker" colpendo la chiave caldo 8 sulla barra dei numeri. Impostare la dimensione minima in pixel a 100 quando richiesto e premere OK, generando la distanza tra la barra vibrante e il pesce per fotogramma per tutti i 3 minuti del video binario.
- Regolare mis-l'allineamento generato dal rumore in video. A tale scopo, controllare la finestra risultati per individuare i fotogrammi che restituiscono l'oggetto numero 3 o superiore che indica oggetti aggiuntivi in quei fotogrammi (ad esempio, particelle in acqua o all'ombra del braccio trasparente dell'asta) oltre la "verga" e "pesce" telaio. Rimuovere eventuali oggetti supplementari utilizzando lo strumento pennello.
- Ha colpito la chiave caldo 9 sulla barra dei numeri per esportare una pila binaria delle immagini del video intero (nel caso in cui è necessario rianalizzare) e un file xls con le coordinate e i dati della distanza (file supplementari CF01.xls, Threshold_CF01.tif e, Trac_CF01.tif ). Chiave calda 9 chiuderà anche tutti i file associati con il video corrente. Ripetere i passaggi 1.4.2.1 attraverso 1.4.2.6 per tutte le repliche.
- Eseguire lo script di macro (file supplementari JoVE_2cmVAB_template_15fps.xlsm) per consolidare più Tracker risultato file (con estensione xls) in un foglio di calcolo e contare il numero e la durata degli approcci in un'area di 1,5 cm dall'asta. Approcci non durano almeno 0,5 s volontà non conteggiate. Modificare i parametri di distanza e tempo contato come un approccio secondo particolari questioni di interesse.
- Liberare spazio su disco del PC dopo aver terminato tutte le analisi. Rimuovere file montati per liberare spazio su disco - avi.avi e. avi.avs file (estensioni generati dal software)-mediante l'esecuzione di un batch file multiunmountdel.bat nella stessa cartella in cui è stato eseguito avs_creater.bat nella sezione 1.4.1.2.
- Convertire i video avi compresso in un formato leggibile per ImageJ e parametri di analisi impostata.
2. sonno e iperattività dosaggio (24 ore di registrazione)
- Analisi comportamentale
- Acclimatare cinque pesci sperimentale per 4 giorni o più in ogni alloggiamento di un acquario appositamente registrazione acrilico 10 L (45,9 cm x 17,8 cm x 17,8 cm; lunghezza x larghezza x profondità, rispettivamente) riempito con acqua climatizzata (Vedi punto 1.3.1).
- Separare ogni camera individuale con tavole acrilici neri rendendo chambers uguale nel formato, misura 88.9 mm x 177,8 mm x 177,8 mm (Figura 2). Essere sicuri di coprire ogni serbatoio per evitare pesce saltando tra le camere.
- Impostare il timer di potenza programmabile per automaticamente accendere il LED bianco luce per 12 h e fuori per 12 h ogni giorno durante il periodo di acclimatazione (ad esempio, impostare la luce alle 7 e si spegne alle 19). Questo sarà salire sul treno il ritmo circadiano di pesce (se è suscettibile di trascinamento).
- Utilizzare schede di acrilico opachi, bianchi di dimensione simile al serbatoio 10L come diffusori per passare luce bianca e a infrarossi attraverso al fine di fornire una luce diffusa con intensità anche attraverso tutti i carri armati.
- In tutto di acclimatazione, nutrire una volta al giorno con live naupli di Artemia e fornire aerazione attraverso filtri in spugna in ogni acquario.
Nota: Assicurarsi di pesci sono nutriti a volte coerente (cioè, 1 x al giorno alle 9:00) come tempo di alimentazione può anche influenzare il trascinamento dei ritmi circadiani19. - Verifica se pesce hanno diventare acclimatati osservando loro latenza di foraggio. Una latenza più lunga rispetto a loro casa carro armato indica che occorre più tempo di acclimatazione.
- Il giorno prima del giorno del dosaggio (3 giorni o più dell'acclimatazione), sostituire l'acqua nella camera di dosaggio con appena condizionata dell'acqua (Vedi punto 1.3.1).
- Impostare il parametro di registrazione nel software VirtualDub17: 15 fps, codec: x264vfw, durata della registrazione: 86.400 s (24 h).
- Attivare la retroilluminazione a infrarossi dietro la fase di registrazione (Vedi Figura 2). Osservando l'immagine live di VirtualDub sullo schermo, regolare la posizione di ogni acquario per farli affrontare la fotocamera USB.
- Il giorno della registrazione, ogni pesce di alimentazione con naupli di Artemia dal vivo, rimuovere tutti i filtri in spugna e attivare la retroilluminazione a infrarossi.
- Avviare 24 h registrazione al mattino (ad esempio, la data di inizio è 9 e il tempo finale è 9 il giorno seguente). Iniziare a catturare il video e la posizione per evitare una dispersione sicura. Controllare periodicamente che la registrazione è in esecuzione.
- Dopo 24 h, assicurarsi che il video salvato correttamente. Trasferire il video alla workstation PC per monitorare e analizzare il comportamento del pesce.
- Acclimatare cinque pesci sperimentale per 4 giorni o più in ogni alloggiamento di un acquario appositamente registrazione acrilico 10 L (45,9 cm x 17,8 cm x 17,8 cm; lunghezza x larghezza x profondità, rispettivamente) riempito con acqua climatizzata (Vedi punto 1.3.1).
- Analisi video
- In primo luogo, controllare la qualità del video esaminando l'illuminazione. Verifica se c'è un pesce in ogni sezione, e se ci sono eventuali movimenti stranieri che possono causare mis-tracking.
- Preparare la maschera per evitare mis-rilevamento di fuori dell'acquario. Fare due maschere: uno per 'anche' e uno per il pesce 'dispari', basato sul loro ordine di sequenza nei serbatoi.
- Fare due cartelle denominate "dispari" e "anche" per le maschere sopra descritto. Spostare il rilevamento file dei parametri di SwisTrack in ognuna di queste cartelle.
- Aprire il rilevamento file di parametri di SwisTrack software (file supplementari Tracking_odd.swistrack o Tracking_even.swistrack) di monitoraggio. Specificare il percorso per il file video e file di maschera, quindi salvare e uscire fuori il rilevamento file di parametri. Regolare numero di blob e i parametri di massimo pixel in "Rilevamento di Blob" e "Più vicina vicino Tracking" componenti, rispettivamente, secondo gli esperimenti.
- Fare doppio clic per eseguire uno script win-software di automazione che aprirà automaticamente il software SwisTrack (file supplementari swistrack_1.exe, swistrack_2.exe, swistrack_3.exe o swistrack_4.exe- questi sono tutti gli stessi file eseguibili), che AIDS in aggiornamento la sottrazione di sfondo adattivo in SwisTrack.
- Aprire Tracking_odd.swistrack o Tracking_even.swistrack in SwisTrack software per il rilevamento di caricare file di parametri. Dopo aver caricato i parametri, premere il pulsante Esegui per avviare il rilevamento.
- All'interno i fotogrammi iniziali 9.000 (600 s, vale a dire, prima 10 min del video registrato), controllo se pesce monitoraggio sta funzionando guardando la sottrazione sfondo adattivo, maschera binaria e più vicina vicino rilevamento nell'elenco dei componenti di SwisTrack (Vedi video di accompagnamento). Quindi selezionare sottrazione Adaptive sfondo nell'elenco dei componenti.
- Premere il pulsante R sulla tastiera per riprendere win-automazione e lasciare il PC per tenere traccia. Monitoraggio avrà 5-7 h per 24h dei video per un desktop con CPU a 4 core e 8 GB di memoria. In base alle esigenze, è possibile eseguire più processi di SwisTrack (tra cui arenas pari e dispari di un singolo file video) fino al numero di core della CPU. Ad esempio, 4-core possono gestire 4 video in una volta.
- Durante questa verifica, evitare di utilizzare questo PC per altri scopi, perché win-automazione programma automaticamente sposta il puntatore del mouse. I frame di 9.000 iniziali saranno scartati nella procedura seguente.
- Allocare 3 file di script Perl (1.fillupGaps2.pl, 2.Calc_fish_id_moko_robust e 3, 3.Sleep_summary_4cm_movingWindow.pl) nella cartella contenente i file di rilevamento generati da SwisTrack nelle cartelle '' e 'dispari' (Vedi punto 2.2.3).
- Clip di un fotogramma del video da file video con VirtualDub e importare questa clip come una foto in ImageJ. Selezionare la lunghezza dell'acquario (45,9 cm) in ImageJ e calcolare il rapporto pixel/cm. Scrivi il rapporto pixel/cm in 1.fillGaps2.pl in un programma di editor di testo e salvare.
- Lanciare il programma CygWin, un emulatore di Unix. Individuare la cartella SwisTrack che contiene gli script Perl 3 utilizzando cd sulla riga di comando.
- Eseguire lo script Perl digitando Perl 1.fillGaps.pl. Questi tre script Perl assegnerà ogni file di rilevamento per un unico alloggiamento dell'acquario e analizzare la distanza di nuoto e di durata di sonno, mentre il pesce era sveglio. Ci vorrà 1-2 h per completare l'analisi.
- Valutare il file di testo denominato Summary_Sleep.txt per determinare se il numero di fotogrammi non elaborati dall'analisi è accettabilmente basso; meno di 15% di fotogrammi mancanti è considerato accettabile.
- Copiare e incollare i risultati analizzati da Summary_Sleep.txt a un foglio di calcolo con la macro (file supplementari Sleep_12hr12hr_TEMPLATE.xlsm).
- Eseguire la macro per estrarre i dati di riepilogo di file di verifica.
3. colorazione di mechanosensory neuromasts DASPMI o DASPEI
Nota: DASPMI e DASPEI la macchiatura è sensibile alla luce e dovrebbe essere fatto in condizioni di oscurità. Seguendo il protocollo è per DASPMI e DASPEI utilizzando DASPMI come esempio.
- Protocollo di colorazione
- Per un totale di 1 L di soluzione madre (25 µ g/mL) di colorazione, è necessario aggiungere 0,025 g di cristalli DASPEI o DASPMI a 1 L di dH2O e lasciarlo sciogliere durante la notte. Mantenere la soluzione conservata a 4 ° C e al riparo dalla luce.
- Immergere il pesce in 2,5 µ g/mL DASPMI o DASPEI disciolto in acqua condizionata (Vedi punto 1.3.1) per 45 min in un ambiente buio a 22 ° C.
- Dopo 45 min, togliere il pesce dalla soluzione DASPMI o DASPEI e anestetizzare mediante immersione in un bagno di ghiaccio d'acqua condizionata con 66,7 µ g/mL di sale di tamponata-etil 3-aminobenzoate metano solfonato (MS222).
- Montare il pesce in una piastra di Petri e fotografare sotto un microscopio a fluorescenza. Prendere immagini dello stack z e salvare come file. TIF per la seguente analisi.
- Analisi di immagine usando ImageJ
- All'interno della cartella contenente i file con estensione TIF, incollare un modello di file di macro di ImageJ (Neuromast_ImageJ.txt) e creare una nuova cartella intitolata "Process_ImageJ". Nel file di macro di ImageJ, impostare il percorso della directory corrente.
- Avviare ImageJ e aprire la macro trascinando il file di macro nella GUI o facendo clic sul File > Apri e selezionando il file di macro.
- Eseguire la macro facendo clic su macro > Esegui Macro. La macro si aprirà automaticamente un file di immagine per essere analizzati. Se il file di immagine non si apre, fare clic su Macro > File prendere.
- Per la quantificazione di Neuromast, seleziona la regione di interesse utilizzando Lo strumento poligono.
- Ha colpito la chiave caldo 5 duplicati area di interesse.
- Utilizzare lo Strumento di disegno per rimuovere o aggiungere punti per neuromast aggiuntivi o mancanti dall'immagine precedente e poi premete 6. Dopo aver colpito 6, appariranno due nuove finestre: schema dei puntini numerati neuromasts e un tavolo con neuromasts totale quantificato.
- Premere 7 per salvare entrambi i file: un file è memorizzato come un file di immagine con estensione TIF e l'altro viene salvato come un file xls. Dopo che questi file sono memorizzati, si aprirà un nuovo file di immagine per l'analisi.
- Consolidare i conti di neuromast di ogni pesce in un foglio di calcolo eseguendo lo script di macro (SN_Number_Diameter.xlsm).
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Representative Results
I risultati presentati qui sono esempi rappresentativi di ciò che può essere acquisito con i metodi presentati. Di conseguenza, risultati possono deviare leggermente da quelli presentati qui per superficie pesce a seconda delle condizioni sperimentali e caverna.
Comportamento di attrazione di vibrazione
Risultati rappresentativi per VAB possono essere trovati nella Figura 3 per sia la grotta che pesci di superficie. Nota il comportamento di bordo-segue i pesci di superficie (Figura 3A; un attributo condiviso con caverna) e la forte attrazione della caverna per la barra vibrante (Figura 3B). Il livello di attrazione di picco è stato osservato vicino a 35 Hz per caverna (Figura 3D) ma il pesce non superficiale (Figura 3), che rappresenta una differenza chiave nei fenotipi comportamentali delle due varianti. Il picco di attrazione intorno a questa frequenza molto probabilmente rappresenta la frequenza delle vibrazioni da preda o cibo articoli20,21.
Analisi di sonno e iperattività
I criteri utilizzati nel presente documento per definire sonno montare le soglie di risposta precedentemente determinate per essere efficace per Astianatte11. Sonno è caratterizzata da lunghi periodi di quiescenza ed è definito come immobilità di > 60 s e risposta elevata soglia12,22,23. Rispetto ai pesci di superficie, durate più brevi di sonno si verificano in caverna larvale e adulto11,12, quindi, saggi di sonno sono un modo efficace per comportamentale fenotipo Astyanax di tutte le età. Mentre la caverna ha mostrato meno-sonno (Figura 4B, più breve durata del sonno nella caverna), ma sono anche iperattivo (Figura 4A).
Colorazione di mechanosensory neuromasts DASPMI o DASPEI
Neuromasts sono composti da cellule sensoriali che possono essere facilmente colorate con DASPEI o DASPMI e osservate in vivo sotto un microscopio a fluorescenza. Il risultato presentato è stato il risultato della colorazione DASPMI. Il numero di neuromasts superficiale è stato migliorato in regione cranica della caverna rispetto ai pesci di superficie (Figura 5, D) e sia il dimensione-un proxy del numero delle cellule ciliate che mechanosensory- e numerosi neuromasts superficiale correlato positivamente con il livello di comportamento vibrazionale attrazione (numero di approcci per la barra vibrante: Figura 5A,B).
| Software | Analisi | Versione | sito Web |
| AVFs | Attività/sonno | Versione 1.0.0.6 | http://turtlewar.org/AVFs/ |
| Avisynth | VAB | Versione 2.6.0 | http://avisynth.nl/index.php/main_page |
| Cygwin | Attività/sonno | Versione 2.11.0 | https://www.cygwin.com/ |
| ImageJ | VAB e DASPEI | Versione 1.52e | https://ImageJ.nih.gov/IJ/ |
| pfmap | Attività/sonno | Costruire 178 | http://pismotec.com/download/ (al link "Scarica Archivio" nella parte inferiore) |
| SwisTrack | Attività/sonno | Versione 4 | https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack |
| WinAutomation | Attività/sonno | Versione 8 | https://www.WinAutomation.com/ (stand-alone app gratuita per questa procedura) |
| Sistema operativo Windows | VAB e attività/sonno | 7, 8 o 10 | https://www.Microsoft.com/en-US/Windows |
| x264vfw | Tutte le analisi | NA | https://sourceforge.net/projects/x264vfw/ |
Tabella 1. Elenco di freeware utilizzato in queste analisi e il sito Web di origine.
Figura 1 : Schematica di attrezzature sperimentali di vibrazione attrazione test comportamentali. Una bacchetta di vetro collegata a un altoparlante è sintonizzata su una frequenza di 40 Hz e immerso a una profondità di circa 0,5 cm all'inizio della registrazione video. Questa figura è stata modificata da Yoshizawa et al.5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Schematica di attrezzature sperimentali di analisi sonno. Serbatoi sono realizzati su misura da tavole acrilico trasparente spessore di 0,7 cm; i setti sono tavole acrilico nero completamente opaco di spessore 0,3 cm. Tavole di acrilico neri opachi vengono utilizzati per questa parte dei carri armati che pesce non può vedere l'altro. (A) vista dall'alto: Nota che gli alloggiamenti esterni del serbatoio inclinato verso l'interno setti per accogliere le differenze nella fotocamera angolo. (B, C) Viste frontali e laterali, rispettivamente. (D) la matrice a tre serbatoi retroilluminato con luce infrarossa, passando attraverso un diffusore al fine di omogeneizzare l'intensità della luce attraverso tutti i carri armati. Si noti che orientamento di ogni serbatoio è regolata in modo che tutti i movimenti di ogni pesce nel suo rispettivo alloggiamento sono visibili. Pannello (C) e (D) vengono modificate da16. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Risultati rappresentativi di un 3- minuto analisi di comportamento di vibrazione attrazione. (A, B) Vista superiore del percorso nuoto dei pesci di superficie (A) e caverna (B); redlines sono le tracce del percorso che il pesce ha preso durante il video di 3 minuti. Il punto nero al centro indica la posizione della bacchetta di vetro vibrante. wrMtrck plugin di ImageJ è stato utilizzato per visualizzare le tracce di pesce24. (C, D) Confronto dei risultati da superficie pesce (C) e la caverna (D) esposti a più frequenze di vibrazione. Ogni punto rappresenta ogni pesce. Aree ombreggiate scure sono intervallo interquartile. Notare che attraverso tutte le frequenze, pesci di superficie non mostrano notevole attrazione alle vibrazioni mentre Caverna Mostra un massimo in attrazione vicino a 35 Hz. (C, D) per l'ultima volta da 16. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Rappresentante risultati da diverse misure per l'analisi di attività - Modelli di attività diurno in superficie pesce e caverna. (A-B) Giorno (barre gialle) e punteggi (barre nere) notte di nuoto distanza (m. per 10 min, A) e la durata del sonno (1.000 s/12 h, B). Ogni barra rappresenta gli errori standard di media ± di significare. Stelle blu indicano il livello di significatività per i confronti statistici tra superficie pesce (Sf) e caverna (Cf). Caverna e pesci di superficie hanno significativamente differenti attività di giorno-notte. Statistiche ANOVA a due vie per ogni fenotipo sono: per il nuoto (A) distanza tra superficie pesce (Sf) e caverna (Cf): F1.399 = 185.8, P < 0,001, tra giorno e notte: F1.399 = 26,9, P < 0,001, interazione tra popolazione e il giorno-notte: F1.399 = 3.6, P = 0.060 (non significativo: n.s.); per la durata di sonno (B) tra Sf e Cf: F1.399 = 237,9, P < 0,001, tra giorno e notte: F1.399 = 164.1, P < 0,001, interazione tra popolazione e giorno-notte: F1.399 = 26.5, P < 0,001. Per entrambe le analisi, N = 200 e 201 per i pesci di superficie e caverna, rispettivamente. La differenza tra attività diurne e notturne sono stati testati da post-hoc accoppiato t-test con correzione di Bonferroni e denotato da asterischi neri. denota P < 0,001. * * denota P < 0.01. Un sottoinsieme dei dati è stato riutilizzato e aggiornato da 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Risultati di rappresentante del rapporto tra VAB e neuromast. (A, B) Il rapporto tra VAB e neuromast il numero e le dimensioni in caverna, pesci di superficie e la progenie di ibridi F1 di superficie pesce x caverna. Si noti che i punteggi normalizzati di attrazione di vibrazione (radice quadrata del numero di approcci) è correlato positivamente con abbondanza di neuromast (coefficiente di correlazione di Pearson r = 0.62, P < 0,001) e diametro neuromast (correlazione di Pearson coefficiente r = 0,31, P < 0.01). Pannello A e B vengono modificati da5. (C, D) DASPMI colorazione di neuromasts nella regione della guancica di (C) un pesce superficiale e (D) una caverna. Barra della scala in inserto (C) e (D) sono 1,0 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questi metodi presentati sono di facile accesso, ma possono essere complicati da eseguire a causa della natura delle sue origini di freeware. Pertanto, si consiglia di eseguire analisi di prova e analisi prima di qualsiasi sperimentazione reale.
Il tasso di generazione di dati può essere rapido, una volta stabiliti il quadro sperimentale e analitico. Una volta stabilita, è possibile registrare due pesci in 7 min per il dosaggio di VAB, 30 pesci in 24 ore per il dosaggio di attività/sonno e uno di pesce a 2,5 a 3 min per neuromast imaging, a partire da MS222 anestesia alla cattura di immagine finale. Le durate delle analisi video e immagine possono variare considerevolmente a seconda delle prestazioni del computer utilizzato. Utilizzando un PC con una CPU a 4 core e 8 GB di RAM, analisi VAB possono prendere 5-7 min per pesce, analisi di attività/sonno possono prendere 6-8 h per ogni gruppo di 30 pesci e neuromast analisi dell'immagine possono prendere 5 o 10 min per pesce (singolo lato o entrambi i lati delle immagini della Regione craniale, rispettivamente). Disponibile in commercio (Tabella materiali) software di monitoraggio è un'alternativa per l'analisi dei video. È molto potente in inseguimento ma caro animale (ad esempio, software di base ~ USD$ 5, 000USD e multi-tracking module ~ USD$ 4.000). In questo momento, i nostri metodi di rilevamento sembrano ottenere precisione paragonabile al puntamento, soprattutto per l'analisi di attività/sonno, cioè, fotogrammi mancanti sono in genere inferiori al 15% del totale dei fotogrammi. Questo metodo inoltre ha mostrato un'elevata riproducibilità in quattro repliche (complementare tabella 1). Tuttavia, la difficoltà nello sviluppo di questo sistema senza una comprensione di base di codifica nel sistema operativo Windows e Linux/Unix OS deve essere riconosciuta.
Durante i periodi di acclimatazione di pesci e prima e durante le analisi comportamentali, è essenziale per fornire le migliori condizioni di vita possibile e coerente per pesce sperimentale. Questo include l'alimentazione alimenti di alta qualità allo stesso tempo e quantità ogni giorno e il mantenimento dell'acqua alta qualità (bassa ammoniaca, nitrati, nitriti e sostanze organiche disciolte, ~ pH 7 e simili conducibilità intorno a 700 µS). È anche importante eseguire le analisi in una zona non disturbata da rumori. Orme rumorose e clattering suoni potrebbero cambiare le risposte comportamentali e attività /-modelli di sonno. Per ridurre il livello di danni alle unità che mechanosensory durante la movimentazione pesce, è utile utilizzare un pesce eccellente-maglia netto durante il trasferimento del pesce; Questo vi aiuterà a evitare di danneggiare il cupula di muco di neuromasts.
DASPEI tintura ha effetti subletali sul pesce, ma l'esposizione eccessiva può causare effetti tossici. Ad esempio, immergendo il pesce nella soluzione DASPEI per 2 h aumenterà la probabilità di mortalità durante il recupero post-anestesia. DASPEI colorazione è sensibile alla luce e pertanto deve essere eseguita in condizioni di oscurità.
Per quanto riguarda l'installazione di freeware, software AviSynth, Avisynth, Virtual File System (avfs) e Pismo File Mount Audit Package (pfmap) necessarie versioni specifiche di lavorare insieme in modo coesivo. È stato confermato dal presente protocollo che avfs (v 1.0.0.5), AviSynth (2.6.0) e pfmap (1.7.8) lavorare insieme, ma almeno le ultime build di pfmap non ha funzionato per il montaggio di file. Per questo motivo, è necessario prestare attenzione per le versioni di software (tabella 1). VirtualDub funziona meglio sotto la versione a 32 bit invece di 64 bit. L'impostazione di 15 immagini / s fornisce una risoluzione di buon tempo e non necessita di volume eccessivo stoccaggio (1,6 GB per un dosaggio di sonno 24-h dei video e 3 MB per un video di VAB). Per ImageJ, la difficoltà maggiore possa provenire da impostazione dei percorsi di file nella macro. Nel sistema operativo Windows, il percorso del file può essere generalmente espressa come "C:Document\my del documento...". La macro di ImageJ viene eseguito nell'ambito dell'ambiente Java e ha bisogno di un extra "\" per il percorso del file, vale a dire, "C\:Document\\my Document\\...". Si prega di consultare il file di macro di esempio ImageJ. Inoltre, potrebbe essere necessario installare due plugin, fetta Remover e oggetto Tracker25e assegnare i tasti di scelta rapida (scelte rapide da tastiera) 6 e 8, rispettivamente, affinché le analisi lavorano senza soluzione di continuità (plugin > Scorciatoie > Aggiungi Scorciatoie... 26 ). SwisTrack ha una funzione per impostare i parametri di monitoraggio, ma è possibile che un congelamento e/o arresto anomalo del sistema possono verificarsi durante l'impostazione dei parametri di rilevamento. È preferibile modificare il parametro in un'app di editor di testo come Notepad + +. Per dettagli di impostazione dei parametri, vedere27. Il programma di installazione di Cygwin (emulatore Unix) include un pacchetto di installazione per installare il pacchetto Perl, che non è incluso nell'installazione predefinita impostazione. Si consiglia di selezionare in modo specifico il pacchetto Perl durante l'installazione di Cygwin.
Anche se, questa procedura è limitata a un comportamento basato sulla linea laterale (VAB), l'attività di nuoto e il sonno, questo animale sistema di tracciamento può essere adattato ad altri comportamenti inclusi comportamenti ripetitivi stereotipati, interazioni sociali e l'utilizzo asimmetrica ( sinistra/destra) di neuromasts cranica durante il foraggiamento (lateralità)13, anche se questi metodi possono richiedere poco profonde arene come quelli suggeriti da idTracker14. Con una suite di comportamenti evoluti, si può applicare diversi script per analizzare i dati rilevati - e assi X Y e indagare diversi modelli comportamentali. Questa pipeline di analisi è destinata a fornire una base per risolvere il meccanismo dell'evoluzione in comportamenti più, e anche come comportamenti simil-autismo del comorbid sono regolati dalla genetica, epigenetica e i fattori ambientali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Yoshizawa tra cui Cetraro N., N. Simon, Valdez C., C. Macapac, J. Choi, L. Lu, J. Nguyen, S. Podhorzer, H. Hernandes, J. Fong, J. Kato e I. Signore per la cura del pesce sul pesce sperimentale utilizzato in questo manoscritto. Ringraziamo anche i membri del laboratorio r. Keene tra cui P. Masek per addestrare MY da montare telecamera CCD IR. Infine, vorremmo ringraziare il Media Lab - facoltà di scienze sociali - scuola di comunicazione presso l'Università delle Hawaii Manoa per il loro prezioso aiuto con rendendo il video, soprattutto B. Smith, J. Lam e S. bianco. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione di comunità hawaiana (16CON-78919 e 18CON-90818) e Istituto nazionale di salute NIGMS (P20GM125508) concede a MY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide) | MilliporeSigma | D3418 | |
| 880 nm wave length black light | Advanced Illumination | BL41192-880 | |
| avfs | freeware | Version 1.0.0.6 | http://turtlewar.org/avfs/ |
| Avisynth | freeware | Version 2.6.0 | http://avisynth.nl/index.php/Main_Page |
| Cygwin | freeware | Version 2.11.0 | https://www.cygwin.com/ |
| Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish) | Corning | 3140-100 | 10 cm diameter 5 cm high |
| Ethovision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | Version 14 | https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt |
| Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black | Jardin (through Amazon.com) | NA | Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system |
| Grade A Brine shrimp eggs | Brine shrimp direct | BSEA16Z | |
| ImageJ | freeware | Version 1.52e | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens | Toyo | NA | Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer |
| Neutral Regulator | Seachem | NA | |
| Optical cast plastic IR long-pass filter | Edmund optics | 43-948 | Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam |
| pfmap | freeware | Build 178 | http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom) |
| Reef Crystals Reef Salt | Instant Ocean | RC15-10 | |
| SwisTrack | freeware | Version 4 | https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack |
| USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam) | Microsoft | Q2F-00013 | Cut 2-2.5 cm of the front |
| WinAutomation | freeware | Version 8 | https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure) |
| Windows operating system | Microsoft | 7, 8 or 10 | https://www.microsoft.com/en-us/windows |
| x264vfw | freeware | NA | https://sourceforge.net/projects/x264vfw/ |
References
- Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Elsevier Inc. Amsterdam. (2015).
- Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. Mexican eyeless characin fishes, genus Astyanax: Environment, distribution, and evolution.Special publications the museum Texas Tech University. (12), Texas Tech Press. Texas. (1977).
- Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax-fasciatus (Characidae, Pisces) - Support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
- Fumey, J., Hinaux, H., Noirot, C., Thermes, C., Rétaux, S., Casane, D. Evidence for late Pleistocene origin of Astyanax mexicanus cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 1-19 (2018).
- Yoshizawa, M., Gorički, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. The energetic cost of vision and the evolution of eyeless Mexican cavefish. Science Advances. 1 (8), e1500363 (2015).
- Yoshizawa, M., et al. The Evolution of a Series of Behavioral Traits is associated with Autism-Risk Genes in Cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 89 (2018).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38 (1), 107-111 (2006).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), 15 (2015).
- Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
- Fernandes, V. F. L., Macaspac, C., Lu, L., Yoshizawa, M. Evolution of the developmental plasticity and a coupling between left mechanosensory neuromasts and an adaptive foraging behavior. Developmental Biology. 441 (2), 262-271 (2018).
- Pérez-Escudero, A., Vicente-Page, J., Hinz, R. C., Arganda, S., de Polavieja, G. G. idTracker: tracking individuals in a group by automatic identification of unmarked animals. Nature Methods. 11, 743 (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., Van Netten, S. M., McHenry, M. J. The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus). Journal of Experimental Biology. 217 (6), (2014).
- Lee, A. Virtualdub. , http://www.virtualdub.org/ (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Cavallari, N., et al. A blind circadian clock in cavefish reveals that opsins mediate peripheral clock photoreception. PLoS Biology. 9 (9), e1001142 (2011).
- Swimmer, B., Lang, H. H. Surface Wave Discrimination between Prey and Nonprey by the Back Swimmer Notonecta glauca L. (Hemiptera , Heteroptera ). 6 (3), Springer Stable. https://www.jstor.org/stable/4599284 233-246 (1980).
- Montgomery, J. C., Macdonald, J. A. Sensory Tuning of Lateral Line Receptors in Antarctic Fish to the Movements of Planktonic Prey. 235 (4785), American Association for the Advancement of Science Stable. https://www.jstor.org/stable/1698962 195-196 (1987).
- Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A., Sung, R. J., Schier, A. F. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. The Journal of Neuroscience. 26 (51), 13400-13410 (2006).
- Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Rasband, W. S. Object Tracker. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/tracker.html (2000).
- Ferreira, T., Rasband, W. Create Shortcuts. ImageJ User Guide. , https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-31.html#sub:Create-Shortcuts... (2012).
- Lochmatter, T., Roduit, P., Cianci, C., Correll, N., Jacot, J., Martinoli, A. SwisTrack. , https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack (2008).
