Summary
Aqui, apresentamos métodos para estudo da elevado-produção de uma série do mexicano cavefish comportamentos e coloração vital de um sistema de mechanosensory. Esses métodos usam scripts de software livre e sob medidos, fornecendo um método prático e econômico para os estudos de comportamentos.
Abstract
Caverna-moradia animais evoluíram uma série de características morfológicas e comportamentais para se adaptar a seus ambientes perpetuamente escuros e comida esparsas. Entre essas características, comportamento de forrageamento é uma das janelas úteis em vantagens funcionais da evolução do traço comportamental. Aqui apresentados são atualizados métodos para analisar o comportamento de atração de vibrações (VAB: um comportamento de forrageamento adaptativo) e da imagem latente do associado mechanosensors da caverna-adaptado tetra, Astyanax mexicanus. Além disso, métodos são apresentados para o seguimento do elevado-throughput de uma série de comportamentos cavefish adicionais, incluindo hiperatividade e perda de sono. Cavefish também mostram asociality, comportamentos repetitivos e maior ansiedade. Portanto, cavefish servir como um modelo animal para comportamentos evoluídos. Esses métodos usam software livre e feito por scripts que podem ser aplicados a outros tipos de comportamento. Esses métodos fornecem alternativas práticas e econômicas para software de rastreamento disponíveis comercialmente.
Introduction
O tetra mexicano, Astyanax mexicanus (Teleostei: Characidae), é único entre os peixes para ter dois morfos alternativos radicalmente distintos - um morph avistado, superfície-moradia e um morph cego, caverna-moradia composta de várias distintas as populações1. Embora diferentes em morfologia e fisiologia, são ainda interfertile2,3. Estes morfos interfertile parecem ter evoluído rapidamente (~ 20.000 anos)4, que os torna um sistema de modelo ideal para o estudo da adaptação rápida. Cavefish são conhecidos por terem um conjunto de características morfológicas e comportamentais divergentes, incluindo o aumento da densidade das papilas gustativas, aumento do número de mechanosensors, com particular frequência portadora de um estímulo vibratório, hiperatividade, comportamento de forrageamento e insônia. Muitos destes comportamentos provavelmente evoluído simultaneamente, alguns dos quais têm sido sugeridos para ser vantajoso na escuridão das cavernas para forrageamento5 e conservação de energia em ambientes escuros e comida esparsas6,7.
Em muitos sistemas do modelo evolucionista, é difícil adquirir conhecimentos integrados de mudança como animal de morfologia e comportamento em resposta ao ambiente, porque a maioria das espécies são distribuídos em um gradiente contínuo em ambientes complexos. No entanto, o contraste entre a caverna e superfície metamorfose Astyanax que evoluiu em altamente contrastantes ambientes delineados por um afiada ecótono levou a Astyanax emergindo como um excelente modelo para entender a evolução animal. Isto torna possível relacionar-se mais facilmente os genes e processos de desenvolvimento com características adaptativas e seleção no ambiente. Além disso, recentes investigações biomédicas desses traços em Astyanax revelou que estes traços podem paralelo sintomas humano8,9,10. Por exemplo, perda de sociabilidade e sono e ganho de hiperatividade, comportamento repetitivo e o nível de cortisol são semelhantes ao que é observado em humanos com autismo espectro desordem8.
Para resolver a complexa co-evolução de muitos comportamentos e características morfológicas, é vantajoso para muitos para destacar percursos genéticos e moleculares subjacentes do ensaio. Aqui apresentados são métodos para caracterizar o grau de fenótipos comportamentais de caverna-tipo de superfície, caverna e híbrido morfos de Astyanax. Os comportamentos focais analisados para caracterizar o fenótipo são caverna adaptada a comportamento de forrageamento (comportamento de atração da vibração, doravante designado VAB) e hiperatividade/sono duração11,12. Também apresentado é um método de imagem para o sistema sensorial associado VAB13. Recentemente, muitos softwares de controle de código-fonte aberto para a execução de ensaios comportamentais tornaram-se disponíveis14,15. Estes funcionam muito bem para vídeos curtos, a menos de 10 minutos de duração. No entanto, torna-se problemático se o vídeo é mais por causa do tempo de computação intensa/acompanhamento. Software disponível comercialmente capaz pode ser caro. Os métodos apresentados principalmente usam freeware e, portanto, são considerados métodos de baixo custo e alta produtividade. Também incluídos resultados representativos baseiam esses métodos.
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Protocol
Todos os procedimentos são realizados seguindo as orientações descritas em "Princípios de laboratório Animal Care" (Instituto Nacional de saúde publicação n º 85-23, revista em 1985) e os aprovados pela Universidade do Havaí em Manoa institucional Animal cuidados e uso Protocolo de Comité animal 17-2560-3.
1. ensaio de comportamento (VAB) vibração atração (≤ 10 min para o procedimento de gravação)
Nota: Usar uma câmera de infravermelha sensível ou construir uma câmera infravermelha, modificando uma webcam USB. Para modificar uma webcam USB, consulte uma descrição detalhada, apresentado pelo laboratório Keene nesta edição cavefish em JoVE (partir desta edição da . mexicanus ), ou uma breve descrição dos materiais complementares.
- Configuração de gravação
- Para garantir que a câmera permanece na posição, ainda e com a distância focal adequada do sujeito (s) a ser gravado, construir um quadro de caixa preta de policloreto de tubos (PVC), medindo 120 cm H x 45 cm L x 90 cm w.
- Após a construção do quadro, cubra-o com uma cortina de plástico apagão, tais como os destinados a uma agricultura hidropônica.
- No topo do quadro, coloque uma placa de acrílico preta com uma janela para a câmera de infravermelha no centro medindo o diâmetro da lente de zoom ajustável C-montado. Dentro desta caixa, coloque o equipamento de ensaio de VAB (Figura 1).
- Aparelho de vibração
Nota: As vibrações são produzidas usando um gerador de função pequeno.- Para os seguintes métodos, Sintonize as vibrações de uma amplitude de 0,15 mm e uma frequência de 40 Hz, qual é a frequência que provoca uma resposta máxima de atração5,16.
- Ligue o gerador de função para um falante de revestimento horizontal.
- Anexe uma vareta de vidro 7,5 mm diâmetro 14 cm de comprimento para cobertura contra o pó no rosto o alto-falante usando cola quente ou um adesivo de junta.
- Perpendicular a esta vara e virada para baixo, anexar outra vareta de vidro de diâmetro de 7,5 mm 4 cm de comprimento (Figura 1).
- Ensaio comportamental
- Aclimate um experimental a. mexicanus por 4 dias em uma câmara cilíndrica de ensaio cheia de água condicionada (pH entre 6.8-7.0, condutividade aproximadamente 700 µS, temperatura aproximadamente de 22 ˚ c) com um ciclo de 12/12 L/D. Verifique se o peixe tem aclimatados, observando sua latência de forragem. Latência mais tempo do que em seu tanque em casa indica que é necessário mais tempo de aclimatação. Ao longo de aclimatação, alimente uma vez por dia com náuplios de Artemia vivos.
- O dia antes do dia do ensaio (após 3 dias de aclimatação), substituir a água na câmara de ensaio com água fresca, condicionada.
- No dia do ensaio (após 4 dias de aclimatação), priva o peixe experimental de alimentos até após o ensaio completo. Saciedade vai mudar a sua resposta a vibrações.
- Defina os parâmetros de gravação no VirtualDub freeware17: 15 frames/s, codec: x264vfw, gravação duração: 3 min 30 s.
- Prepare os aparelhos emissores de vibração (consulte a etapa 1.2) ajustando a 40 Hz. Veja a Figura 1 para a explicação dos aparelhos. Lave o vidro haste com água desionizada para remover quaisquer produtos químicos solúveis em água.
- Trabalhando no escuro, coloque o cilindro de ensaio no palco gravação iluminado por um backlight infravermelho na caixa preta e permitir que o peixe se adaptar por 3 min.
- Após a aclimatação de 3 min, grave 3 min 30 s de vídeo. No início da gravação, inserir a haste vidro na coluna de água (cerca de 0,5 cm de profundidade).
- Evite fazer qualquer ruído ou vibrações enquanto posicionando a haste vidro na água como os peixes pode sentir mesmo os mais pequenos distúrbios.
- Termine este procedimento dentro de 30 s de iniciar a gravação de vídeo para garantir que mais de 3 min do comportamento é gravado.
- Monitor de vídeo durante a gravação para garantir que nenhum erro ocorre durante este estágio.
- Depois de terminar a gravação, remover a vareta de vidro a vibração da câmara de ensaio cilíndrico e remova a câmara de ensaio desde a fase de gravação. Repita de 1.3.5 para o próximo peixe.
- Análise de vídeo
Nota: Converter o codec em um formato que pode carregar o ImageJ funciona somente em Windows sistema operacional18 (tabela 1).- Converta o vídeo avi compactado em um formato legível para os parâmetros de análise de conjunto e ImageJ.
- Instale o AviSynth_260.exe (https://sourceforge.net/projects/avisynth2/), pfmap construir 178 (http://pismotec.com/pfm/ap/) e avfs ver1.0.0.5 ou ver1.0.0.6 (https://sourceforge.net/projects/avf/). Observe que esse método é sensível de versão/programa. Os links de site fornecido guiará para as versões adequadas (tabela 1).
- Execute o arquivo de lote clicando avs_creater.bat (arquivo complementar). Clique com o botão direito sobre o arquivo de vídeo avs para ser analisado (selecione os arquivos de avs criados por avs_creater.bat).
- Como análise de vídeo usando o plugin do Tracker no ImageJ requer o carregamento da macro ImageJ (arquivo suplementar Macro_VAB_moko.txt), carrega a macro por arrastar e soltar no shell do GUI do ImageJ. Essa macro irá permitir certas teclas de atalho para a análise a seguir.
- No diretório de trabalho, crie uma nova pasta intitulada "Process_ImageJ".
- Clique com o botão direito sobre o arquivo .avs para ser analisado (selecione os arquivos de avs criados por avs_creater.bat). Selecione a opção de montagem rápida . Depois que o arquivo avs é montado como uma unidade externa, abra o arquivo avi no ImageJ (o arquivo avi tem nome final com ". avi").
- Para definir a escala de medição da distância, selecione o diâmetro da câmara de ensaio desenhando uma linha reta em toda a câmara usando a ferramenta seleção em linha retae, em seguida, clique em análise > definir escala função. Por exemplo, entrada 9,4 cm se usando um prato cilíndrico com um diâmetro interno de 9,4 cm. Marque a caixa de rádio da Global a fim de padronizar a escala através de todas as análises a seguir.
- Converter para binária pilha e executar a análise.
- Copiar a área de câmara de ensaio usando a ferramenta de seleção oval e, em seguida, clique direito e selecione imagem > Duplicar. Neste momento, especifica o intervalo de quadros para manter para posterior análise, por exemplo, manter os primeiro 2.700 quadros após a haste entrou na água (em 15 fps é exatamente 3 minutos de vídeo).
- Limpar o exterior da câmara de ensaio e converter para uma imagem binária, pressionando a tecla de atalho 7 na barra de número do teclado.
- Depois de limpa o fundo e aparece um prompt, adicione um ponto preto no centro para indicar a posição da haste vibratória vidro usando a ferramenta de seleção oval já definida para preto, com a função de preenchimento . Clique Okey e um prompt será exibido Avançar para o ajuste de limite.
- Defina o limite para fazer uma imagem binária (tudo preto e branco) do peixe. Ajuste o limite para que o peixe pode ser visto em toda clips de vídeo e selecione Apply.
- Execute o plugin "Tracker" batendo a chave quente 8 na barra de número. Defina o tamanho do pixel mínimo para 100 quando solicitado e Okey, gerando a distância entre a haste e o peixe por quadro para todos os 3 min do vídeo binário.
- Ajuste o tracking mis gerado pelo ruído no vídeo. Para fazer isso, verifique a janela de resultados para identificar os quadros que retornam o objeto número 3 ou superior-indicando objetos extras naqueles quadros (por exemplo, as partículas na água ou a sombra do braço da haste transparente) Além da "vara" e "peixe", quadro. Remova quaisquer objetos extras usando a ferramenta pincel.
- Bata a chave quente 9 na barra número para exportar uma pilha binária de imagens de todo o vídeo (no caso, é necessário reanalisar) e um arquivo. xls com coordenadas e dados de distância (complementares arquivos , CF01.xls, Threshold_CF01.tif e, Trac_CF01.tif ). Chave quente 9 também fechará todos os arquivos associados com o vídeo atual. Repita as etapas 1.4.2.1 através de 1.4.2.6 para todas as repetições.
- Execute o script de macro (arquivo complementar JoVE_2cmVAB_template_15fps.xlsm) para consolidar vários arquivos de resultado Tracker (. xls) em uma planilha e contar o número e a duração das abordagens em uma área de 1,5 cm da haste. Abordagens não dura pelo menos 0,5 s vontade não será contado. Altere os parâmetros de distância e tempo contado como uma abordagem de acordo com questões específicas de interesse.
- Liberar espaço em disco do PC depois de terminar todas as análises. Remover arquivos montados para liberar espaço em disco - avi.avi e. avi.avs de arquivos (extensões geradas pelo software)-executando um lote de arquivos multiunmountdel.bat na mesma pasta onde o avs_creater.bat foi executado na seção 1.4.1.2.
- Converta o vídeo avi compactado em um formato legível para os parâmetros de análise de conjunto e ImageJ.
2. sono e hiperatividade do ensaio (gravação de 24 h)
- Ensaio comportamental
- ACCLIMATE cinco peixes experimentais por 4 dias ou mais em cada câmara de um aquário de gravação de acrílico personalizados 10 L (45,9 x 17,8 cm x 17,8 cm; comprimento x largura x profundidade, respectivamente) cheio de água condicionada (consulte a etapa 1.3.1).
- Separe cada câmara individual com placas de acrílico pretas fazendo câmaras iguais em tamanho, medindo 88.9 mm × 177,8 mm × 177,8 mm (Figura 2). Certifique-se de cobrir cada tanque para impedir que os peixes saltando entre as câmaras.
- Configurar o temporizador programável de potência para automaticamente ligar LED branco luz para 12h e fora para 12 h todos os dias durante o período de aclimatação (por exemplo, definir a luz às 07:00 e desligar às 19:00). Isto irá arrastar o ritmo circadiano de peixe (se é suscetível de arrastamento).
- Use placas de acrílico opacas, brancas de dimensão semelhante ao tanque 10L como difusores para passar luz branca e infravermelho através a fim de fornecer luz difusa com intensidade até mesmo em todos os tanques.
- Ao longo de aclimatação, alimentam-se de uma vez por dia com live náuplios de Artemia e fornecer aeração através de filtros de esponja em cada aquário.
Nota: Certifique-se de peixes são alimentados às vezes consistentes (ou seja, 1 x por dia às 09:00) como tempo de alimentação também pode afetar o arrastamento dos ritmos circadianos19. - Verifique se peixes têm se tornar aclimatados, observando sua latência para forragem. Uma latência mais tempo do que em seu tanque em casa indica que é necessário mais tempo de aclimatação.
- O dia antes do dia do ensaio (3 dias ou mais da aclimatação), substituir a água na câmara de ensaio com recém condicionado água (ver passo 1.3.1).
- Defina o parâmetro de gravação no VirtualDub software17: 15 frames/s, codec: x264vfw, duração de gravação: 86.400 s (24 h).
- Ligar a luz infravermelha posterior atrás do palco de gravação (ver Figura 2). Observando a imagem ao vivo do VirtualDub na tela, ajuste a posição de cada aquário para torná-los a enfrentar a câmera USB.
- No dia da gravação, alimentar cada peixe com náuplios de Artemia vivos, remover todos os filtros de esponja e ligar a luz de fundo infravermelho.
- Iniciar 24 h gravação pela manhã (por exemplo, o horário de início é 09:00 e o tempo de chegada é de 09:00 do dia seguinte). Iniciar a captura do vídeo e fixar o local para evitar uma perturbação. Verifique periodicamente se a gravação está em execução.
- Após 24h, certifique-se de que o vídeo salvo corretamente. Transferi o vídeo para a estação de trabalho do PC para acompanhar e analisar o comportamento do peixe.
- ACCLIMATE cinco peixes experimentais por 4 dias ou mais em cada câmara de um aquário de gravação de acrílico personalizados 10 L (45,9 x 17,8 cm x 17,8 cm; comprimento x largura x profundidade, respectivamente) cheio de água condicionada (consulte a etapa 1.3.1).
- Análise de vídeo
- Primeiro, verifique a qualidade do vídeo de olhar para a iluminação. Verifique se há um peixe em cada seção, e se existem quaisquer movimentos estrangeiros que podem causar mis-tracking.
- Prepare a máscara para evitar rastreamento mis fora do aquário. Fazer duas máscaras: uma para 'nem' e outra para peixe 'estranho', com base em sua ordem de sequência nos tanques.
- Fazer duas pastas com o nome "estranho" e "até" para as máscaras descritas acima. Mover o controle de arquivo de parâmetro de SwisTrack em cada uma dessas pastas.
- Abra o controle de arquivo de parâmetro de SwisTrack que segue o software (arquivo complementar Tracking_odd.swistrack ou Tracking_even.swistrack). Especifique o caminho para o arquivo de vídeo e o arquivo de máscara, em seguida, salvar e sair fora o controle de arquivo de parâmetro. Ajustar o número de blob e parâmetros de pixels máximo em "Deteção de Blob" e "Mais próximo vizinho de rastreamento" componentes, respectivamente, de acordo com as experiências.
- Clique duas vezes para executar um script de software de vitória-automação que abrirá automaticamente o software de SwisTrack (arquivo complementar, swistrack_1.exe, swistrack_2.exe, swistrack_3.exe ou swistrack_4.exe- estes são todos os mesmos arquivos executáveis), que SIDA em Atualizando a subtração de fundo adaptável em SwisTrack.
- Abra o Tracking_odd.swistrack ou Tracking_even.swistrack em SwisTrack software para carregar o rastreamento arquivo de parâmetro. Depois de carregar os parâmetros, pressione o botão Executar para iniciar o rastreamento.
- Dentro os iniciais 9.000 frames (600 s, ou seja, primeiro 10 min do vídeo gravado), verificar se o peixe de rastreamento é funcionando olhando para a subtração de fundo adaptável, máscara binária e mais próximo vizinho de rastreamento na lista de SwisTrack (ver componente de acompanhamento). Em seguida, selecione na lista de componente subtração de fundo adaptável .
- Aperte o botão R do teclado para retomar a vitória-automação e deixar o PC para controlar. Rastreamento levará vídeo para um desktop com CPU 4 núcleos e 8 GB de memória 5-7 h por 24h. De acordo com necessidades, execute vários processos de SwisTrack (incluindo arenas de pares e ímpares de um único arquivo de vídeo) até o número de núcleos de CPU. Por exemplo, 4 núcleos podem lidar com 4 vídeos de uma só vez.
- Durante esse acompanhamento, evite o uso este PC para outros fins, porque o programa de vitória-automação automaticamente move o ponteiro do mouse. Os quadros de 9.000 iniciais serão descartados no procedimento a seguir.
- Aloca 3 arquivos de script Perl (1.fillupGaps2.pl, 2.Calc_fish_id_moko_robust e 3.pl, 3.Sleep_summary_4cm_movingWindow.pl) para a pasta que contém os arquivos de rastreamento gerados pelo SwisTrack nas pastas '' e 'ímpares' (consulte a etapa 2.2.3).
- Clip um frame do vídeo do arquivo de vídeo usando o VirtualDub e importar este clipe como uma foto para o ImageJ. Selecione o comprimento do aquário (45,9 cm) no ImageJ e calcular a proporção de pixel/cm. Escrever a proporção de pixel/cm em 1.fillGaps2.pl em um programa de editor de texto e salvar.
- Lançar o programa CygWin, um emulador Unix. Localize a pasta SwisTrack que contém os 3 scripts Perl usando cd na linha de comando.
- Execute o script Perl, digitando 1.fillGaps.pl Perl. Esses três scripts Perl irão atribuir a cada arquivo de rastreamento para uma única câmara do aquário e analisar a distância de duração e natação de sono, enquanto que o peixe estava acordado. Vai demorar 1-2 h para terminar a análise.
- Avaliar o arquivo de texto chamado Summary_Sleep.txt para determinar se o número de quadros retirados da análise é aceitavelmente baixo; faltando menos de 15% dos quadros é considerado aceitável.
- Copie e cole os resultados analisados do Summary_Sleep.txt para uma planilha com a macro (arquivo complementar Sleep_12hr12hr_TEMPLATE.xlsm).
- Execute a macro para extrair os dados de resumo dos arquivos de controle.
3. DASPMI ou DASPEI dos mechanosensory neuromasts coloração
Nota: DASPMI e DASPEI de coloração é sensível à luz e deve ser feita no escuro. Seguindo o protocolo é para DASPMI e DASPEI usando DASPMI como exemplo.
- Protocolo de coloração
- Para um total de 1 L de solução (25 µ g/mL) de coloração, adicionar 0,025 g de cristais DASPEI ou DASPMI para 1 L de dH2O e deixa dissolver durante a noite. Manter a solução armazenadas a 4 ° C e protegido da luz.
- Mergulhe o peixe em 2,5 µ g/mL DASPMI ou DASPEI dissolvidos em água condicionada (consulte a etapa 1.3.1) por 45 min em um ambiente escuro a 22 ° C.
- Depois de 45 min, retire o peixe da solução DASPMI ou DASPEI e anestesiar por imersão em um banho de gelo de água condicionada com 66,7 µ g/mL de tampão-etil 3-aminobenzoato sal de sulfonato de metano (MS222).
- Monte o peixe em uma placa de Petri e fotografia sob um microscópio fluorescente. Tirar fotos de z-pilha e salvar como arquivos. tif para a análise a seguir.
- Análise de imagem usando o ImageJ
- Dentro da pasta que contém arquivos. tif, Cole um modelo do arquivo de macro ImageJ (Neuromast_ImageJ.txt) e crie uma nova pasta intitulada "Process_ImageJ". No arquivo de macro ImageJ, defina o caminho para o diretório atual.
- Lançar o ImageJ e abrir a macro, arrastando o arquivo de macro para o GUI ou clicando em arquivo > abrir e selecionar o arquivo de macro.
- Executar a macro clicando Macros > executar Macro. A macro abrirá automaticamente um arquivo de imagem para ser analisado. Se o arquivo de imagem não abrir, clique em Macro > buscar o arquivo.
- Para quantificação de Neuromast, selecione a região de interesse, usando a Ferramenta ' Polígono '.
- Bata a chave quente 5 para duplicar região de interesse.
- Use a Ferramenta de pintura para remover ou adicionar pontos para neuromast extra ou ausente da imagem anterior e depois bateu- 6. Depois de bater 6, duas novas janelas aparecerão: esquema numerado neuromasts pontos e uma mesa com total neuromasts quantificados.
- Bateu 7 para salvar os dois arquivos: um arquivo é armazenado como um arquivo de imagem. tif e o outro é salvo como um arquivo. xls. Depois que esses arquivos são armazenados, um novo arquivo de imagem será aberto para análise.
- Consolide os Condes de neuromast de cada peixe em uma folha de cálculo executando o script de macro (SN_Number_Diameter.xlsm).
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Representative Results
Os resultados aqui apresentados são representativos exemplos do que pode ser adquirido com os métodos apresentados. Portanto, os resultados podem desviar ligeiramente aqueles aqui apresentados para cavefish e peixes de superfície dependendo das condições experimentais.
Comportamento de atração de vibrações
Resultados representativos para VAB podem ser encontrados na Figura 3 para caverna e peixe de superfície. Observe o comportamento de borda-seguinte os peixes de superfície (Figura 3A; um atributo compartilhado com cavefish) e a atração forte de cavefish para a haste (Figura 3B). Perto de 35 Hz para cavefish (Figura 3D), mas o peixe não superfície (Figura 3), que representa uma diferença fundamental nos fenótipos comportamentais do dois morfos, observou-se o pico do nível de atração. O pico da atração por esta frequência provavelmente representa a frequência de vibrações feitas por presas ou alimentos itens20,21.
Ensaio do sono e hiperatividade
Os critérios usados neste documento para definir o sono se encaixam os limiares de resposta previamente determinados para ser eficaz para Astyanax11. Sono é caracterizado por longos períodos de quiescência e é definido como a imobilidade de > 60 s e limiar de resposta elevado a12,22,23. Em comparação com peixe de superfície, durações mais curtas do sono ocorrem em larvas e adultos cavefish11,12, portanto, os ensaios de sono são uma maneira eficaz de comportamentalmente fenótipo Astyanax de todas as idades. Enquanto cavefish mostrou menos-sono (Figura 4B, menor duração do sono no cavefish), são também hiperativas (Figura 4A).
Coloração de DASPMI ou DASPEI de mechanosensory neuromasts
Neuromasts são compostos por células sensoriais que podem ser facilmente coradas com DASPEI ou DASPMI e observadas in vivo sob um microscópio fluorescente. O resultado apresentado foi o resultado da coloração DASPMI. O número de neuromasts superficial é reforçado na região craniana do cavefish em comparação com peixe de superfície (Figura 5, D) e ambos o tamanho, um proxy do número de células de cabelo o mechanosensory- e o número de neuromasts superficial é positivamente correlacionada com o nível de comportamento de atração de vibrações (número de abordagens para a haste: Figura 5A,B).
| Software de | Análise | Versão | Web site |
| AvFS | Atividade/sono | Versão 1.0.0.6 | http://turtlewar.org/AvFS/ |
| AviSynth | VAB | Em sua versão 2.6.0 | http://AviSynth.nl/index.php/main_page |
| Cygwin | Atividade/sono | Versão 2.11.0 | https://www.cygwin.com/ |
| ImageJ | VAB e DASPEI | Versão 1.52e | https://ImageJ.nih.gov/IJ/ |
| pfmap | Atividade/sono | Construir 178 | http://pismotec.com/download/ (no link "Download de arquivo" na parte inferior) |
| SwisTrack | Atividade/sono | Versão 4 | https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack |
| WinAutomation | Atividade/sono | Versão 8 | https://www.WinAutomation.com/ (stand-alone app livre para este procedimento) |
| Sistema operacional Windows | VAB e atividade/sono | 7, 8 ou 10 | https://www.Microsoft.com/en-US/Windows |
| x264vfw | Todas as análises | AT | https://sourceforge.net/projects/x264vfw/ |
Tabela 1. Lista de freeware utilizado nestas análises, e o site de origem.
Figura 1 : Esquemático do equipamento experimental de vibração atração do ensaio comportamental. Uma vareta de vidro ligada a um alto-falante é ajustada para uma frequência de 40 Hz e submersa a uma profundidade de cerca de 0,5 cm no início da gravação de vídeo. Esta figura é modificada de Yoshizawa et al.5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Esquemático do equipamento experimental do sono ensaio. Os tanques são feitos sob medidos de placas acrílico transparente espessura de 0,7 cm; os septos são 0,3 cm espessura completamente opaco preto acrílico placas. Placas de acrílico pretas opacas são utilizadas para esta parte dos tanques de peixes não podem ver uns aos outros. (A) vista superior: Nota que as câmaras exteriores do tanque tem inclinado septos para dentro para acomodar as diferenças na câmera de ângulo. (B, C) Frente e lateral vistas, respectivamente. (D) matriz de três tanques retroiluminado com luz infravermelha, passando através de um difusor para homogeneizar a intensidade da luz através de todos os tanques. Observe que a orientação de cada tanque é ajustada para que todos os movimentos de cada peixe em sua respectiva câmara são visíveis. Painel (C) e (D) são modificados de16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Resultados representativos de um 3- minuto ensaio de comportamento de atração de vibrações. (A, B) Vista superior do caminho de natação de peixes de superfície (A) e cavefish (B); Redlines são vestígios do caminho que o peixe levou durante o vídeo de 3 min. O ponto preto no centro indica a localização do vidro a haste. wrMtrck ImageJ plugin foi usado para visualizar os vestígios de peixes24. (C, D) Comparação dos resultados de peixes de superfície (C) e cavefish (D) expostos a múltiplas frequências de vibração. Cada ponto representa cada peixe. Áreas sombreadas escuras são intervalo interquartil. Observe que em todas as frequências, peixes de superfície não mostram notável atração de vibração enquanto cavefish mostrar um máximo na atração perto de 35 Hz... (C, D) modificado de 16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Representante resulta de várias medidas para análise da atividade - Padrões de atividade diurnas em peixe de superfície e cavefish. (A-B) Dia (barras amarelas) e dezenas de (barras pretas) noite de nadar a distância (m por 10 min, A) e a duração do sono (1.000 s/12 h, B). Cada barra representa os média ± erros-padrão da média. Estrelas azuis indicam o nível de significância para comparações estatísticas entre os peixes de superfície (Sf) e cavefish (Cf). Cavefish e peixes de superfície têm significativamente diferentes atividades do dia-noite. São duas vias estatísticas ANOVA para cada fenótipo: para nadar a distância (A) entre os peixes de superfície (Sf) e cavefish (Cf): F1.399 = 185.8, P < 0,001, entre dia e noite: F1.399 = 26,9, P < 0,001, interação entre a população e dia-noite: F1.399 = 3.6, P = 0,060 (não significativo: n.s.); para a duração do sono (B) entre Sf e Cf: F1.399 = 237.9, P < 0,001, entre dia e noite: F1.399 = 164.1, P < 0,001, interação entre a população e dia-noite: F1.399 = 26,5, P < 0,001. Para ambas as análises, N = 200 e 201 para o peixe de superfície e cavefish, respectivamente. A diferença entre dia e noite as actividades foram testados pelo post-hoc emparelhado t-testes com correção de Bonferroni e assinaladas por asteriscos pretos. denota P < 0,001. * * denota P < 0,01. Um subconjunto dos dados foi reutilizado e atualizado a partir de 11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Resultados representante da relação entre VAB e neuromast. (A, B) A relação entre número de VAB e neuromast e tamanho em cavefish, peixe de superfície e a descendência de híbridos F1 de superfície peixe x cavefish. Observe que as pontuações normalizadas da atração de vibração (raiz quadrada do número de abordagens) está correlacionada positivamente com abundância de neuromast (coeficiente de correlação de Pearson r = 0,62, P < 0,001) e neuromast de diâmetro (correlação de Pearson coeficiente r = 0,31, P < 0,01). Painel de A e B são modificados de5. (C, D) DASPMI coloração de neuromasts na região da bochecha de (C) um peixe de superfície e (D) um cavefish. Barra de escala em baixo-relevo (C) e (D) são 1,0 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Materiais suplementares. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Estes métodos apresentados são de fácil acesso, mas podem ser complicados para realizar devido à natureza de suas origens de freeware. Portanto, é altamente recomendável realizar ensaios experimentais e análises antes de qualquer experimentação real.
A taxa de geração de dados pode ser rápida, uma vez que o quadro analítico e experimental são estabelecidos. Uma vez estabelecida, é possível gravar dois peixes em 7 min para o ensaio de VAB, 30 peixes em 24 h para o ensaio de atividade/sono e um peixe em 2,5 a 3 min para neuromast de imagem, a partir MS222 anestesia para captura de imagem final. As durações das análises vídeo e imagem podem variar consideravelmente, dependendo do desempenho do computador utilizado. Usando um PC com um CPU de 4-core e 8 GB de RAM, análise VAB pode levar de 5 a 7 min por peixe, análise da atividade de repouso pode levar de 6-8 h por grupo de 30 peixes e análise de imagens de neuromast pode levar 5 ou 10 min por peixes (único lado ou ambos os lados das imagens do região craniana, respectivamente). Comercialmente disponível que segue o software (Tabela de materiais) é uma alternativa para análise de vídeo. É muito poderoso em animal de rastreamento mas caro (por exemplo, a base software ~ USD$ 5, 000USD e módulo multi-tracking ~ USD$ 4.000). Neste momento, nossos métodos de rastreamento parecem obter precisão comparável de acompanhamento, especialmente para a análise da atividade de repouso, ou seja, faltando quadros são normalmente inferiores a 15% do total de quadros. Esse método também mostrou uma grande reprodutibilidade em quatro repetições (complementar a tabela 1). No entanto, a dificuldade no desenvolvimento deste sistema sem um entendimento do código básico em sistema operacional Windows e Linux/Unix sistema operacional deve ser reconhecida.
Durante períodos de aclimatação de peixes e antes e durante os ensaios comportamentais, é essencial para proporcionar as melhores condições de vida possíveis e consistente para peixe experimental. Isto inclui a alimentação alimentos de alta qualidade ao mesmo tempo e quantidade, todos os dias e a manutenção da qualidade da água de alta (baixa de amónia, nitratos, nitritos e orgânicos dissolvidos, ~ pH 7 e semelhante condutibilidade em torno de 700 µS). Também é importante realizar ensaios em uma área não perturbada por ruídos. Os passos ruidosos e sons ruidoso podem alterar respostas comportamentais e atividade/sono-padrões. Para reduzir o nível de dano a unidades de mechanosensory durante a manipulação de peixes, é útil usar um malha fina de peixe líquido enquanto transfere o peixe; Isto ajudará a evitar danificar o muco cupula de neuromasts.
Tintura DASPEI tem efeitos subletais sobre os peixes, mas a exposição excessiva pode resultar em efeitos tóxicos. Por exemplo, imergir o peixe na solução DASPEI para 2 h irá disparar a chance de mortalidade durante a recuperação pós-anestesia. DASPEI coloração é sensível à luz e, portanto, deve ser feito no escuro.
Quanto à instalação de freeware, software de AviSynth, sistema de arquivos Virtual Avisynth (avfs) e arquivo de Pismo montar auditoria pacote (pfmap) necessário versões específicas para trabalhar juntos de forma coesa. Foi confirmado pelo presente protocolo que avfs (v 1.0.0.5), AviSynth (2.6.0) e pfmap (1.7.8) trabalham juntos, mas pelo menos a mais recente compilação de pfmap não funcionou para o procedimento de montagem do arquivo. Por este motivo, preste atenção para as versões de software (tabela 1). VirtualDub funciona melhor sob a versão de 32 bits em vez de 64 bits. A configuração de 15 quadros por s fornece uma resolução de bom tempo e não requer volume de armazenamento excessivo (1,6 GB para um ensaio de sono 24h vídeo e 3 MB para um vídeo do VAB). Para ImageJ, a principal dificuldade pode vir de caminhos de arquivo de configuração na macro. No sistema operacional Windows, o caminho do arquivo pode ser expressa geralmente como "C:Document\my Document\....". A macro ImageJ é executado sob o ambiente Java e precisa de um extra "\" para o caminho do arquivo, ou seja, "C\:Document\\my Document\\...". Por favor, veja o exemplo de arquivo de macro ImageJ. Além disso, pode ser necessário instalar dois plugins, removedor de fatia e objeto Tracker25, e atribuir as teclas de acesso (atalhos de teclado) 6 e 8, respectivamente, para que as análises funcionam perfeitamente (Plugins > atalhos > Adicionar Atalhos... 26 ). SwisTrack tem uma função para definir os parâmetros de controle, mas é possível que um congelamento e/ou falha pode ocorrer ao definir os parâmetros de controle. É melhor editar o parâmetro em um aplicativo de editor de texto como o Notepad + +. Para obter detalhes das configurações de parâmetro, consulte27. O instalador Cygwin (emulador Unix) inclui um instalador de pacotes para instalar o pacote Perl, o que não está incluído na instalação padrão configuração. Recomenda-se especificamente, selecione o pacote Perl durante a instalação do Cygwin.
Embora, este procedimento é limitado a um comportamento baseado na linha lateral (VAB) e atividade de natação e sono, este animal, sistema de rastreamento pode ser adaptado para outros comportamentos, incluindo comportamentos repetitivos estereotipados, interações sociais e o uso assimétrico ( esquerda/direita) de neuromasts craniana durante o forrageio (lateralidade)13, embora esses métodos podem exigir arenas superficiais como as sugeridas por idTracker,14. Com um conjunto de comportamentos evoluídos, podem-se aplicar diferentes scripts para analisar os dados rastreados X - e Y - eixos e investigar diferentes padrões comportamentais. Esse pipeline de análise destina-se a fornecer uma base para resolver o mecanismo da evolução em vários comportamentos, e também como comorbidade autismo-como comportamentos são regulados pela genética, epigenética e os fatores ambientais.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a todos os membros do laboratório Yoshizawa incluindo Cetraro N. s. Simon, C. Valdez, C. Macapac, J. Choi, L. Lu, J. Nguyen, S. Podhorzer, H. Hernandes, J. Fong, J. Kato e I. senhor para cuidar de peixes no peixe experimental usado neste manuscrito. Agradecemos também a membros de laboratório r. Keene, incluindo P. Miranda Silva para treinar meu para montar a câmera do CCD do IR. Por último, gostaríamos de agradecer o Media Lab - faculdade de ciências sociais - escola de comunicações para a Universidade de Hawai ' i Manoa por sua inestimável ajuda fazendo o vídeo, especialmente B. Smith, J. Lam e S. branco. Este trabalho foi apoiado pela Fundação da Comunidade havaiana (78919-16CON e 18CON-90818) e Instituto Nacional de saúde NIGMS (P20GM125508) concede ao meu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide) | MilliporeSigma | D3418 | |
| 880 nm wave length black light | Advanced Illumination | BL41192-880 | |
| avfs | freeware | Version 1.0.0.6 | http://turtlewar.org/avfs/ |
| Avisynth | freeware | Version 2.6.0 | http://avisynth.nl/index.php/Main_Page |
| Cygwin | freeware | Version 2.11.0 | https://www.cygwin.com/ |
| Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish) | Corning | 3140-100 | 10 cm diameter 5 cm high |
| Ethovision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | Version 14 | https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt |
| Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black | Jardin (through Amazon.com) | NA | Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system |
| Grade A Brine shrimp eggs | Brine shrimp direct | BSEA16Z | |
| ImageJ | freeware | Version 1.52e | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens | Toyo | NA | Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer |
| Neutral Regulator | Seachem | NA | |
| Optical cast plastic IR long-pass filter | Edmund optics | 43-948 | Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam |
| pfmap | freeware | Build 178 | http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom) |
| Reef Crystals Reef Salt | Instant Ocean | RC15-10 | |
| SwisTrack | freeware | Version 4 | https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack |
| USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam) | Microsoft | Q2F-00013 | Cut 2-2.5 cm of the front |
| WinAutomation | freeware | Version 8 | https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure) |
| Windows operating system | Microsoft | 7, 8 or 10 | https://www.microsoft.com/en-us/windows |
| x264vfw | freeware | NA | https://sourceforge.net/projects/x264vfw/ |
References
- Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Elsevier Inc. Amsterdam. (2015).
- Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. Mexican eyeless characin fishes, genus Astyanax: Environment, distribution, and evolution.Special publications the museum Texas Tech University. (12), Texas Tech Press. Texas. (1977).
- Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax-fasciatus (Characidae, Pisces) - Support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
- Fumey, J., Hinaux, H., Noirot, C., Thermes, C., Rétaux, S., Casane, D. Evidence for late Pleistocene origin of Astyanax mexicanus cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 1-19 (2018).
- Yoshizawa, M., Gorički, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. The energetic cost of vision and the evolution of eyeless Mexican cavefish. Science Advances. 1 (8), e1500363 (2015).
- Yoshizawa, M., et al. The Evolution of a Series of Behavioral Traits is associated with Autism-Risk Genes in Cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 89 (2018).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38 (1), 107-111 (2006).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), 15 (2015).
- Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
- Fernandes, V. F. L., Macaspac, C., Lu, L., Yoshizawa, M. Evolution of the developmental plasticity and a coupling between left mechanosensory neuromasts and an adaptive foraging behavior. Developmental Biology. 441 (2), 262-271 (2018).
- Pérez-Escudero, A., Vicente-Page, J., Hinz, R. C., Arganda, S., de Polavieja, G. G. idTracker: tracking individuals in a group by automatic identification of unmarked animals. Nature Methods. 11, 743 (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., Van Netten, S. M., McHenry, M. J. The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus). Journal of Experimental Biology. 217 (6), (2014).
- Lee, A. Virtualdub. , http://www.virtualdub.org/ (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Cavallari, N., et al. A blind circadian clock in cavefish reveals that opsins mediate peripheral clock photoreception. PLoS Biology. 9 (9), e1001142 (2011).
- Swimmer, B., Lang, H. H. Surface Wave Discrimination between Prey and Nonprey by the Back Swimmer Notonecta glauca L. (Hemiptera , Heteroptera ). 6 (3), Springer Stable. https://www.jstor.org/stable/4599284 233-246 (1980).
- Montgomery, J. C., Macdonald, J. A. Sensory Tuning of Lateral Line Receptors in Antarctic Fish to the Movements of Planktonic Prey. 235 (4785), American Association for the Advancement of Science Stable. https://www.jstor.org/stable/1698962 195-196 (1987).
- Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A., Sung, R. J., Schier, A. F. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. The Journal of Neuroscience. 26 (51), 13400-13410 (2006).
- Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Rasband, W. S. Object Tracker. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/tracker.html (2000).
- Ferreira, T., Rasband, W. Create Shortcuts. ImageJ User Guide. , https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-31.html#sub:Create-Shortcuts... (2012).
- Lochmatter, T., Roduit, P., Cianci, C., Correll, N., Jacot, J., Martinoli, A. SwisTrack. , https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack (2008).
