Summary
Vi præsenterer her, metoder til høj overførselshastighed undersøgelse af en serie af den mexicanske cavefish adfærd og vitale farvning af et mechanosensory system. Disse metoder kan bruge fri software og skræddersyede scripts, giver en praktisk og omkostningseffektiv metode til undersøgelser af adfærd.
Abstract
Hulen-boligen dyr har udviklet en serie af morfologiske og adfærdsmæssige træk til at tilpasse sig deres evigt mørke og mad-sparsomme miljøer. Blandt disse træk er fouragering adfærd en af de nyttige windows i funktionelle fordele af adfærdsmæssige træk evolution. Præsenteres heri er opdateret metoder til at analysere vibrationer attraktion adfærd (VAB: en adaptive fouragering adfærd) og billeddannelse af tilknyttede mechanosensors af cave-tilpasset tetra, Astyanax mexicanus. Derudover præsenteres metoder for høj overførselshastighed tracking af en række yderligere cavefish adfærd herunder hyperaktivitet og søvn-tab. Cavefish viser også asociality, repetitive adfærd og højere angst. Derfor fungere cavefish som en dyremodel for udviklet adfærd. Disse metoder kan bruge fri software og skræddersyede scripts, der kan anvendes på andre typer af adfærd. Disse metoder giver praktiske og omkostningseffektive alternativer til kommercielt tilgængelige tracking software.
Introduction
Den mexicanske tetra, Astyanax mexicanus (Teleostei: Characidae), er unik blandt fisk for at have to radikalt forskellige alternative morphs - en seende, overflade-bolig morph og en blind, hulen-boligen morph består af flere særskilte populationer1. Selv om forskellige i morfologi og fysiologi, er de stadig interfertile2,3. Disse interfertile morfer synes at have udviklet sig hurtigt (~ 20.000 år)4, hvilket gør dem en ideel modelsystem for studiet af hurtig tilpasning. Cavefish er kendt for at have en suite af divergerende morfologiske og adfærdsmæssige træk herunder øget tæthed af smagsløg, øget antallet af mechanosensors, fouragering adfærd tunet til en bestemt frekvens af en vibrerende stimulus, hyperaktivitet, og søvnløshed. Mange af disse adfærd sandsynligvis udviklet sig samtidigt, hvoraf nogle har været foreslået for at være fordelagtige i mørke huler til fouragering5 og bevare energi i mørke og mad-sparsomme miljøer6,7.
I mange evolutionær modelsystemer er det vanskeligt at erhverve integreret viden om hvordan dyr morfologi og funktionsmåde ændring som reaktion på miljøet, fordi de fleste arter er fordelt på tværs af et kontinuerligt forløb i komplekse miljøer. Dog har kontrast mellem hule og overflade morph Astyanax der udviklede sig i stærkt kontrasterende miljøer afgrænset af en skarp ecotone ført til Astyanax fremstår som en fremragende model at forstå dyrenes udvikling. Dette gør det muligt lettere mellem gener og udviklingsprocesser med adaptive træk og udvalg i miljøet. Seneste biomedicinsk undersøgelser af disse træk i Astyanax har desuden vist, at disse egenskaber kan parallel menneskelige symptomer8,9,10. For eksempel, er tab af socialitet og søvn, og gevinst af hyperaktivitet, repetitiv adfærd og cortisol niveau lig hvad er observeret hos mennesker med autisme spektrum disorder8.
For at løse de komplekse Co-Evolution mange adfærd og morfologiske træk, er det en fordel at assay mange af dem til at fremhæve underliggende genetiske og molekylære veje. Præsenteres heri er metoder til kendetegner graden af cave-type adfærdsmæssige fænotyper af overfladen, hule og hybrid morphs af Astyanax. Fokale adfærd analyseres for at karakterisere fænotype er hule-tilpasset fouragering adfærd (vibration attraktion adfærd, benævnes fremover VAB) og hyperaktivitet/sleep varighed11,12. Også præsenteret er en billedbehandling metode til sensorisk system tilknyttet VAB13. For nylig, mange open source-tracking software til at køre adfærdsmæssige assays er blevet tilgængelig14,15. Disse arbejder meget godt for korte videoer, mindre end 10 minutter lange. Men det bliver problematisk, hvis videoen er længere på grund af intens beregning/tracking tid. I stand til kommercielt tilgængelige software kan være dyrt. De beskrevne metoder bruge primært freeware og derfor anses for omkostningseffektivt og høj overførselshastighed metoder. Også inkluderet er repræsentative resultater baseret på disse metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer udføres efter retningslinjer beskrevet i "Principper af Laboratory Animal Care" (National Institute of Health publikation nr. 85-23, revideret 1985) og godkendt af University of Hawai'i at Manoa institutionelle dyrs pleje og brug Udvalget animalske protokol 17-2560-3.
1. vibrationer attraktion adfærd (VAB) assay (≤ 10 min for hele optagelsen procedure)
Bemærk: Brug et infrarød følsomme kamera eller bygge et infrarødt kamera ved at ændre en USB webcam. Hvis du vil ændre en USB webcam, se en detaljeret beskrivelse præsenteret af Keene Lab i dette cavefish emne på JoVE (fra problemet A. mexicanus ), eller en kort beskrivelse i den supplerende materialer.
- Optagelse setup
- For at sikre, at kameraet forbliver i position, stadig, og på den korrekte brændvidde fra de fag, der skal registreres, bygge en sort boks ramme ud af polyvinylchlorid (PVC) rør, måler 120 cm H x 45 cm L x 90 cm W.
- Efter anlæggelsen af rammen, dække det med en plast mørklægning gardin som én bestemt til hydroponiske landbruget.
- På toppen af rammen, sætte en sort akryl bestyrelse med et vindue til den infrarøde kamera på byens måle samme diameter som C-monteret justerbar zoom linse. Inde i denne boks, placere VAB assay udstyr (figur 1).
- Vibration apparater
Bemærk: Vibrationer er fremstillet ved hjælp af en lille funktionsgenerator.- For de følgende metoder, tune vibrationer til en amplitude på 0,15 mm og en frekvens på 40 Hz, som er den frekvens, som fremkalder en maksimal reaktion af attraktion5,16.
- Tilsluttes en vandret modstående højttaler funktionsgenerator.
- Vedhæfte en 7,5 mm diameter glasstav 14 cm i længden til støvhætten på forsiden af højttaler ved hjælp af hot lim eller en pakning klæbemiddel.
- Vinkelret på denne stang og vender nedad, vedhæfte en anden 7.5 mm diameter glasstav 4 cm i længden (figur 1).
- Adfærdsmæssige analyse
- Acclimate en eksperimentel A. mexicanus i 4 dage i en cylindrisk assay kammer fyldt med konditioneret vand (pH-værdi mellem 6,8-7,0, ledningsevne ca. 700 µS, temperatur ca. 22 ˚C) med en 12/12 L/D cyklus. Kontrollere, om fisk har akklimatiseret ved at observere deres ventetid til at fouragere. Længere ventetid end i deres hjem tank angiver mere akklimatisering tid er nødvendig. Hele akklimatisering, fodre en gang om dagen med levende Artemia nauplii.
- Dag i dag i analysen (efter 3 dage i acclimation), erstatte vand i assay kammer med frisk vand, aircondition.
- På dagen for assay (efter 4 dage i acclimation), fratage eksperimentelle fisk mad indtil når analysen er fuldført. Mæthed vil ændre deres svar til vibrationer.
- Indstille optagelse parametre i VirtualDub freeware17: 15 frames/s, codec: x264vfw, optagelse varighed: 3 min 30 s.
- Forberede vibrationer-emitting apparatet (Se trin 1.2) af tuning til 40 Hz. Se figur 1 forklaring af apparater. Skyl den vibrerende glasstang med deioniseret vand for at fjerne enhver vandopløselige kemikalier.
- Arbejder i mørke, Placer assay cylinder på optagelse scenen belyst af en infrarød baggrundslys i den sorte boks og lad fisk til at acclimate til 3 min.
- Efter 3 min akklimatisering, optage 3 min. 30 s video. Ved starten af optagelsen, skal du indsætte den vibrerende glasstav i vandsøjlen (ca. 0,5 cm dybde).
- Undgå at foretage støj eller vibrationer mens positionering vibrerende glasstaven i vandet som fisk kan forstand selv de mest mindre forstyrrelser.
- Udfør denne procedure inden for 30 s for at starte videooptagelse for at sikre, at mere end 3 min af adfærden registreres.
- Overvåge video samtidig optagelse til at sikre, at ingen fejl opstår i denne fase.
- Efter endt registrering, fjerne den vibrerende glasstang fra cylindrisk assay kammer og fjerne assay salen fra stadiet optagelse. Gentag fra 1.3.5 for den næste fisk.
- Video analyse
Bemærk: Konvertering codec til et format, at ImageJ kan indlæse virker kun på Windows operativsystem18 (tabel 1).- Konvertere til komprimeret avi video til et læsbart format for ImageJ og sæt analyseparametre.
- Installere AviSynth_260.exe (https://sourceforge.net/projects/avisynth2/), pfmap build 178 (http://pismotec.com/pfm/ap/) og avfs ver1.0.0.5 eller ver1.0.0.6 (https://sourceforge.net/projects/avf/). Bemærk, at denne metode programversion/følsomme. Den angivne hjemmeside links vil guide til de korrekte versioner (tabel 1).
- Køre batchfilen ved at dobbeltklikke på avs_creater.bat (supplerende fil). Højreklik på filen avs video skal analyseres (Vælg fra avs filer skabt af avs_creater.bat).
- Som video analyse ved hjælp af Tracker plugin i ImageJ kræver læsning af ImageJ makro (supplerende fil Macro_VAB_moko.txt), skal du indlæse makroen af træk og slip i GUI skallen af ImageJ. Denne makro vil aktivere visse hot nøgler for den følgende analyse.
- Opret en ny mappe med titlen "Process_ImageJ" i arbejdsmappen.
- Højreklik på filen .avs skal analyseres (Vælg fra avs filer skabt af avs_creater.bat). Vælg indstillingen hurtig mount . Når filen avs er monteret som et eksternt drev, åbne filen avi i ImageJ (avi-fil har navn slutter med ".avi").
- Hvis du vil angive omfanget af afstandsmåling, Vælg diameteren af assay kammer ved at tegne en lige linje tværs over salen ved hjælp af lineær markeringsværktøjet, og klik derefter Analyze > angive skala funktion. For eksempel, input 9,4 cm hvis bruger en cylindrisk parabol med en 9,4 cm indvendig diameter. Indskrive boksen af Global for at standardisere skalaen på tværs af alle de følgende video analyser.
- Konvertere til binære stak og køre analyse.
- Kopiere assay kammeret område ved hjælp af markeringsværktøjet oval og derefter Højreklik og vælg billede > Dubler. På dette tidspunkt, Angiv intervallet af rammer for at holde for yderligere analyse, f.eks., holde de første 2.700 rammer efter den vibrerende stang indtastet vand (på 15 fps dette er nøjagtig 3 minutter video).
- Klart uden for analysen kammer og konvertere til et binært billede ved at trykke på hurtigtasten 7 på linjen nummer af tastaturet.
- Efter baggrunden rydder og en prompt vises, skal du tilføje en sort prik i midten til at angive placeringen af den vibrerende glasstav ved hjælp af værktøjet oval udvalg allerede indstillet til sort med funktionen Fyld . Klik på OK og en prompt vises videre til justeringen tærskelværdi.
- Sat tærsklen til at lave en binær (alle sort-hvid) billede af fisken. Justere tærsklen, så fisken kan ses i hele videoklip, og vælg derefter Anvend.
- Kør "Tracker" plugin ved at ramme den varme centrale 8 på linjen nummer. Sat minimum pixelstørrelse til 100 når du bliver bedt om og ramte OK, generering af afstanden mellem den vibrerende stang og fisk pr. ramme for alle 3 min af den binære video.
- Justere mis tracking genereret af støj i video. For at gøre det, kontrollere resultatvinduet for at identificere de rammer, der returnerer objekt nummer 3 eller højere-angivelse ekstra objekter i disse frames (fx partikler i vandet eller i skyggen af den gennemsigtige arm af stangen) ud over den "rod" og "fisk" den ramme. Fjern eventuelle ekstra objekter ved hjælp af malerpenselværktøjet.
- Ramte den varme centrale 9 på linjen nummer til at eksportere en binær stak billeder af hele videoen (hvis det er nødvendigt at genanalyserer) og en .xls-fil med koordinater og afstand data (supplerende filer CF01.xls, Threshold_CF01.tif og Trac_CF01.tif ). Hot centrale 9 vil også lukke alle filer knyttet til den aktuelle video. Gentag trin 1.4.2.1 gennem 1.4.2.6 for alle replikater.
- Kør scriptet makro (supplerende fil JoVE_2cmVAB_template_15fps.xlsm) for at konsolidere flere Tracker resultat filer (.xls) i ét regneark og tælle antallet og varigheden af tilgange til en 1,5 cm område fra stangen. Tilgange ikke varig mindst 0,5 s vil ikke blive medregnet. Ændre parametrene for afstand og tid, tælles som en tilgang ud fra særlige spørgsmål af interesse.
- Slip PC-diskplads efter endt alle analyser. Fjerne monteret filer for at frigøre diskplads - avi.avi og. avi.avs filer (extensions genereret af softwaren)-ved at køre en batch fil multiunmountdel.bat i den samme mappe, hvor avs_creater.bat blev kørt i afsnittet 1.4.1.2.
- Konvertere til komprimeret avi video til et læsbart format for ImageJ og sæt analyseparametre.
2. søvn og hyperaktivitet assay (24 h optagelse)
- Adfærdsmæssige analyse
- Acclimate fem eksperimentelle fisk i 4 dage eller mere i kamrene i en specialdesignet 10 L akryl optagelse akvarium (45.9 cm x 17,8 cm x 17,8 cm, længde x bredde x dybde, henholdsvis) fyldt med konditioneret vand (Se trin 1.3.1).
- Adskille hver enkelt kammer med sort akryl plader gør kamre lige i størrelse, måle 88.9 mm × 177.8 mm × 177.8 mm (figur 2). Sørg for at dække hver tank for at forhindre fisk fra hoppe mellem afdelingerne.
- Indstil programmerbare magt timeren til automatisk tænde hvid LED lys til 12 h, og ud i 12 timer hver dag i acclimation periode (for eksempel, sæt lys på klokken 7 om morgenen og off kl). Dette vil entrain døgnrytme af fisk (hvis det er modtagelige for medrivning).
- Brug uigennemsigtig, hvid akryl plader af samme dimension til 10 L tank som diffusorer til at passere hvid og infrarødt lys gennem for at give diffuse lys selv intensitet på tværs af alle tanke.
- Hele akklimatisering, feed når en dag med levende Artemia nauplii og give beluftning gennem svamp filtre i hvert akvarium.
Bemærk: Sikre, at fisk fodres på konsekvent gange (dvs., 1 x pr. dag klokken 9:00) som fodringstid kan også påvirke medrivning af døgnrytmen19. - Kontrollere, om fisk blive akklimatiseret ved at observere deres ventetid til at fouragere. En længere ventetid end i deres hjem tank angiver mere akklimatisering tid er nødvendig.
- Dagen før dagen for analysen (3 dage eller mere af akklimatisering), erstatte vand i assay kammer med frisk aircondition vand (Se trin 1.3.1).
- Indstil parameteren optagelse i VirtualDub software17: 15 frames/s, codec: x264vfw, optagelse varighed: 86.400 Sørensen (24 h).
- Slår den infrarøde baggrundsbelysning bag optagelse fase (Se figur 2). Ved at observere VirtualDub levende billede på skærmen, skal du justere placeringen af hvert akvarium at gøre dem ansigt USB-kamera.
- På dagen for optagelse, foder hver fisk med levende Artemia nauplii, fjerne alle svamp filtre, og aktivere infrarød baggrundsbelysningen.
- Start 24 h optagelse i morgen (for eksempel starttidspunkt er kl og sluttidspunkt er kl dagen efter). Starte optagelsen af videoen og sikkert sted for at undgå forstyrrelser. Kontroller regelmæssigt, at optagelsen kører.
- Efter 24 h, Sørg for, at videoen gemmes korrekt. Overføre video til PC arbejdsstation til at spore og analysere de fisk adfærd.
- Acclimate fem eksperimentelle fisk i 4 dage eller mere i kamrene i en specialdesignet 10 L akryl optagelse akvarium (45.9 cm x 17,8 cm x 17,8 cm, længde x bredde x dybde, henholdsvis) fyldt med konditioneret vand (Se trin 1.3.1).
- Video analyse
- Kontrol først, video kvaliteten ved at kigge på belysningen. Check hvis der er én fisk i hvert afsnit, og hvis der er nogen udenlandske bevægelser, der kan medføre mis tracking.
- Forberede maske til at undgå mis tracking uden for akvariet. Lave to masker: en til 'selv' og en 'ulige' fisk, baseret på deres rækkefølge rækkefølge i tankene.
- Gøre to mapper med navnet "underligt" og "selv" i for masker beskrevet ovenfor. Flytte sporing parameterfil af SwisTrack i hver af disse mapper.
- Åbner sporingen parameterfil af SwisTrack tracking software (supplerende fil Tracking_odd.swistrack eller Tracking_even.swistrack). Angiv stien til den video fil og maske fil, så Gem og Afslut ud af sporing parameterfil. Justere blob antallet og maksimale pixels parametre i "Blob opdagelse" og "Nærmeste nabo Tracking" komponenter, henholdsvis efter forsøgene.
- Dobbeltklik på at køre et script af win-automation software, der automatisk åbner SwisTrack software (supplerende fil swistrack_1.exe, swistrack_2.exe, swistrack_3.exe eller swistrack_4.exe- disse er alle de samme eksekverbare filer), som aids i at opdatere adaptive baggrund subtraktion i SwisTrack.
- Åbne Tracking_odd.swistrack eller Tracking_even.swistrack i SwisTrack software til at indlæse tracking parameterfil. Efter indlæsning af parametrene, skal du trykke på run knappen for at begynde at spore.
- I de indledende 9.000 rammer (600 s, dvs første 10 min af den optagede video), kontrollere, om fisk sporing fungerer ved at kigge på adaptive baggrund subtraktion, binære maske, og nærmeste nabo tracking på komponentlisten af SwisTrack (jf. ledsagende video). Vælg derefter Adaptive baggrund subtraktion i komponentlisten.
- Tryk på R knappen på tastaturet for at genoptage win-automation og lade pc'en til at spore. Tracking vil tage 5-7 h pr. 24 h video nemlig en desktop med 4-CPU kerner og 8 GB hukommelse. Efter behov, skal du køre flere SwisTrack processer (herunder lige og ulige arenaer af en enkelt videofil) op til antallet af kerner i CPU'en. Eksempelvis kan 4-kerner håndtere 4 videoer på én gang.
- Under denne sporing, undgå at bruge denne PC til andre formål, fordi win-automation programmet automatisk flytter musemarkøren. De indledende 9.000 rammer vil blive kasseret i følgende procedure.
- Allokere 3 Perl scriptfiler (1.fillupGaps2.pl, 2.Calc_fish_id_moko_robust, og 3.pl, 3.Sleep_summary_4cm_movingWindow.pl) til den mappe, der indeholder sporing filer genereret af SwisTrack i 'selv' og 'ulige' mapper (Se trin 2.2.3).
- Klip et billede af videoen fra video-fil ved hjælp af VirtualDub og importere dette klip som et foto i ImageJ. Vælg længden på akvariet (45.9 cm) i ImageJ og beregne pixel/cm ratio. Skrive pixel/cm forholdet i 1.fillGaps2.pl i et tekstredigeringsprogram og gemme.
- Lancere CygWin program, en Unix emulator. Find mappen SwisTrack, der indeholder de 3 Perl scripts ved hjælp af cd på kommandolinjen.
- Køre Perl-script ved at skrive Perl 1.fillGaps.pl. Disse tre Perl scripts vil tildele hver sporing fil til en unik kammer i akvariet og analysere søvn varigheden og svømning afstanden, mens fisk var vågen. Det vil tage 1-2 h at afslutte analysen.
- Vurdere den tekstfil benævnt Summary_Sleep.txt at afgøre, om antallet af frames faldt fra analysen er acceptabel lav; mangler mindre end 15% af frames betragtes som acceptabelt.
- Afskrift og opklæbe de analyserede resultaterne fra Summary_Sleep.txt til et regneark med makro (supplerende fil Sleep_12hr12hr_TEMPLATE.xlsm).
- Makroen for at udtrække de opsummerede data for at spore filer.
3. DASPMI eller DASPEI farvning af mechanosensory neuromasts
Bemærk: DASPMI og DASPEI farvning er lysfølsomt og skal gøres i mørke omgivelser. Følgende protokol er for både DASPMI og DASPEI ved hjælp af DASPMI som eksempel.
- Farvning protokol
- For i alt 1 liter farvning stamopløsning (25 µg/mL), tilsættes 0,025 g DASPEI eller DASPMI krystaller til 1 L med dH2O og lad det opløse natten over. Holde løsning opbevares ved 4 ° C og beskyttet mod lys.
- Fordyb fisk i 2,5 µg/mL DASPMI eller DASPEI opløst i vand, aircondition (Se trin 1.3.1) i 45 min. i mørke omgivelser ved 22 ° C.
- Efter 45 min, fjerne fisk fra DASPMI eller DASPEI løsningen og bedøver ved nedsænkning i isbad-konditioneret vand med 66,7 µg/mL "buffered"-ethyl 3-aminobenzoat metan sulfonat salt (MS222).
- Montere fisk i en petriskål plade og fotografere under et mikroskop for fluorescerende. Tage z-stak billeder og gemme som .tif-filer til følgende analyse.
- Billedanalyse ved hjælp af ImageJ
- Inde i mappen, der indeholder .tif-filer, indsætte en skabelon i filen ImageJ makro (Neuromast_ImageJ.txt) og oprette en ny mappe med titlen "Process_ImageJ". I filen ImageJ makro, skal du angive stien til den aktuelle mappe.
- Lancere ImageJ og åbne makroen ved at trække makro-fil i GUI eller ved at klikke på fil > Åbn og vælge filen makro.
- Kør makroen ved at klikke på makroer > køre makroen. Makroen vil derefter automatisk åbne en billedfil der skal analyseres. Hvis billedfilen ikke åbnes, skal du klikke på makro > fil afhente.
- Vælg regionen af interesse ved hjælp af Polygon værktøjfor Neuromast kvantificering.
- Ramte den varme centrale 5 dublerede region af interesse.
- Bruge Paint værktøj til at fjerne eller tilføje prikker for ekstra eller mangler neuromast fra det forrige billede og derefter ramte 6. Efter at ramme 6, to nye vinduer vises: ordning af nummererede neuromasts prikker og en tabel med samlede neuromasts kvantificeret.
- Ramte 7 hen til opspare begge to filer: én fil er gemt som en .tif billedfil og den anden er gemt som en .xls-fil. Når disse filer er gemt, åbner en ny billedfil til analyse.
- Konsolidere neuromast tæller hver fisk ind i et regneark ved at køre scriptet makro (SN_Number_Diameter.xlsm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne præsenteres heri er repræsentative eksempler på hvad kan erhverves med de metoder, der præsenteres. Derfor kan resultater afvige lidt fra dem, der præsenteres her for både cavefish og overflade fisk alt efter de eksperimentelle betingelser.
Vibration attraktion adfærd
Repræsentative resultater for VAB kan findes i figur 3 overflade fisk og hule. Bemærk kanten-følgende adfærd i den overflade fisk (figur 3A, en attribut deles med cavefish) og den stærke tiltrækning af cavefish til den vibrerende rod (figur 3B). Peak attraction plan blev observeret i nærheden af 35 Hz for cavefish (figur 3D) men ikke overflade fisk (figur 3 c), der repræsenterer en væsentlig forskel i de to morphs adfærdsmæssige fænotyper. Peak i attraktion omkring denne frekvens repræsenterer sandsynligvis frekvens vibrationer af byttedyr eller mad varer20,21.
Søvn og hyperaktivitet assay
Kriterierne heri at definere søvn passer svar tærskler tidligere fast besluttet på at være effektiv for Astyanax11. Søvn er kendetegnet ved længere perioder af ubevægelighed og er defineret som immobilitet > 60 s og forhøjede svar tærskel12,22,23. I forhold til overflade fisk, kortere søvn varigheder forekomme i larve og voksen cavefish11,12, derfor, søvn assays er en effektiv måde at behaviorally fænotype Astyanax i alle aldre. Mens cavefish viste mindre-søvn (figur 4B, kortere søvn varigheden i cavefish), er de også hyperaktiv (figur 4A).
DASPMI eller DASPEI farvning af mechanosensory neuromasts
Neuromasts er sammensat af sensoriske celler, der let kan farves med DASPEI eller DASPMI og observerede in vivo under et mikroskop for fluorescerende. Præsenteres resultatet var resultatet af DASPMI farvning. Antallet af overfladiske neuromasts er forbedret i regionen kranie af cavefish i forhold til overflade fisk (figur 5 c, D), og begge størrelse-en proxy af antallet af mechanosensory hår celler- og antallet af overfladiske neuromasts er positivt korreleret med niveauet af vibrationer attraktion adfærd (antallet af tilgange til den vibrerende rod: figur 5A,B).
| Software | Analyse | version | hjemmeside |
| avfs | Aktivitet/sove | Version 1.0.0.6 | http://turtlewar.org/avfs/ |
| AviSynth | VAB | Version 2.6.0 | http://AviSynth.nl/index.php/main_page |
| Cygwin | Aktivitet/sove | Version 2.11.0 | https://www.Cygwin.com/ |
| ImageJ | VAB og DASPEI | Version 1.52e | https://ImageJ.NIH.gov/IJ/ |
| pfmap | Aktivitet/sove | Bygge 178 | http://pismotec.com/download/ (på "Download arkiv" linket nederst) |
| SwisTrack | Aktivitet/sove | Version 4 | https://en.Wikibooks.org/wiki/SwisTrack |
| WinAutomation | Aktivitet/sove | Version 8 | https://www.WinAutomation.com/ (gratis stand-alone app for denne procedure) |
| Windows-operativsystemet | VAB og aktivitet/sove | 7, 8 eller 10 | https://www.Microsoft.com/en-us/Windows |
| x264vfw | Alle analyser | NA | https://sourceforge.net/projects/x264vfw/ |
Tabel 1. Liste over freeware bruges i disse analyser og kilde hjemmeside.
Figur 1 : Skematisk af vibrationsudstyr attraktion adfærdsmæssige assay eksperimentelle. Et glasstang fastgjort til en højttaler er tunet til en frekvens på 40 Hz og neddykket i en dybde af ca. 0,5 cm i starten af videooptagelse. Dette tal er ændret fra Yoshizawa et al.5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Skematisk af søvn assay eksperimentelle udstyr. Tankene er custom-made fra 0,7 cm tykke gennemsigtig akryl bestyrelser; septa er 0,3 cm tyk helt uigennemsigtig sort akryl plader. Uigennemsigtig sort akryl plader anvendes for denne del af tankene, så fisk ikke kan se hinanden. (A) Top view: Bemærk at de ydre kamre af tanken har vippes indad septa til at rumme forskelle i kameraet vinkel. (B, C) Front og side synspunkter, henholdsvis. (D) Array af tre tanke baggrundsbelyst med infrarødt lys passerer gennem en diffuser for at homogenisere lysets intensitet på tværs af alle tanke. Bemærk, at hver tank orientering reguleres, således at alle bevægelser af hver fisk i sine respektive afdeling er synlige. Panelet (C) og (D) er ændret fra16. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Repræsentative resultater af en 3- minut vibration attraktion opførsel analyse. (A, B) Ovenfra af stien svømning overflade fisk (A) og cavefish (B); redlines er spor af den vej, som fisken tog i løbet af 3-min video. Den sorte prik i midten angiver placeringen af den vibrerende glasstav. wrMtrck ImageJ plugin blev brugt til at visualisere fisk spor24. (C, D) Sammenligning af resultater fra overflade fisk (C) og cavefish (D) udsættes for flere frekvenser af vibrationer. Hver prik repræsenterer hver fisk. Mørke skyggelagte områder er interkvartil rækkevidde. Bemærk at på tværs af alle frekvenser, overflade fisk ikke vise bemærkelsesværdige attraktion for vibrationer cavefish viser et maksimum i attraktion nær 35 Hz. (C, D) ændret fra 16. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Repræsentant resultater fra flere foranstaltninger for aktivitet analyse - Daglige aktivitet mønstre i overflade fisk og cavefish. (A-B) Dag (gule søjler) og nat (sorte bjælker) snesevis af svømning afstand (m pr. 10 min, A), og søvn varigheden (1.000. s/12 h, B). Hver søjle repræsenterer gennemsnit ± standardfejl af middelværdien. Blå stjerner angiver niveauet af betydning for statistiske sammenligninger mellem overflade fisk (Sf) og cavefish (Cf). Cavefish og overflade fisk har væsentligt forskellige dag-nat aktiviteter. To-vejs ANOVA statistik for hver fænotype er: for svømning afstanden (A) mellem overflade fisk (Sf) og cavefish (Cf): F1,399 = 185.8, P < 0,001, mellem dag og nat: F1,399 = 26,9, P < 0,001, interaktion mellem befolkningen og dag-nat: F1,399 = 3,6, P = 0.060 (ikke signifikant: n.s.); for søvn varigheden (B) mellem Sf og Cf: F1,399 = 237.9, P < 0,001, mellem dag og nat: F1,399 = 164.1, P < 0,001, samspillet mellem befolkningen og dag-nat: F1,399 = 26.5, P < 0,001. Begge analyser, N = 200 og 201 til overflade fisk og cavefish, henholdsvis. Forskellen mellem dag og nat aktiviteter blev testet af post-hoc parret t-test med Bonferroni korrektioner og betegnes med sorte stjerner. betegner P < 0,001. ** Angiver P < 0,01. Et undersæt af dataene blev genbrugt og opdateret fra 11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Repræsentative resultater af forholdet mellem VAB og neuromast. (A, B) Forholdet mellem VAB og neuromast antal og størrelse i cavefish, overflade fisk og F1 hybrid afkom af overflade fisk x cavefish. Bemærk at de normaliserede scorer af vibrationer attraktion (kvadratroden af antallet af tilgange) er positivt korreleret med neuromast overflod (Pearson korrelationskoefficienten r = 0,62, P < 0,001) og neuromast diameter (Pearson korrelation koefficient r = 0.31, P < 0,01). Panel A og B er ændret fra5. (C, D) DASPMI farvning af neuromasts i regionen kind (C) en overflade fisk og (D) en cavefish. Skalalinjen i indsatser (C) og (D) er 1,0 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende materialer. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Disse præsenteres metoder er let adgang til men kan være kompliceret at udføre på grund af sin freeware oprindelse. Derfor er det stærkt anbefales at udføre retssag assays og analyser før nogen faktiske eksperimenter.
Data generation kan være hurtig når den eksperimenterende og analytiske ramme er etableret. Når der oprettet, er det muligt at optage to fisk i 7 min til VAB assayet, 30 fisk i 24 h for assay aktivitet/søvn og en fisk i 2,5 til 3 min. til neuromast imaging, startende fra MS222 anæstesi til endelige billedoptagelse. Varigheden af de video og billede analyser kan variere betydeligt afhængigt af udførelsen af den anvendte computer. Ved hjælp af en PC med en 4-core CPU og 8 GB RAM, VAB analyse kan tage 5-7 min pr. fisk, aktivitet/sleep analyse kan tage 6-8 h pr. gruppe af 30 fisk og neuromast billedanalyse kan tage 5 eller 10 min. pr. fisk (single side eller begge sider af billeder af den kranie region, henholdsvis). Kommercielt tilgængelige tracking software (Tabel af materialer) er et alternativ til videoanalyse. Det er meget stærk i dyret tracking, men dyrt (fx basere software ~ USD$ 5, 000USD og multi tracking modul ~ USD$ 4.000). I dette øjeblik, vores sporingsmetoder synes at opnå tilsvarende nøjagtighed af sporing, især for aktivitet/sleep analyse, dvs., mangler rammer er typisk lavere end 15% af de samlede rammer. Denne metode også viste en høj reproducerbarhed i fire replikater (supplerende tabel 1). Men er vanskeligheden at udvikle dette system uden en forståelse af grundlæggende kodning i Vinduer OS og Linux/Unix OS må anerkendes.
I fisk acclimation perioder, og før og under adfærdsmæssige assays er det vigtigt at give de bedst mulige og konsekvent levevilkår for eksperimenterende fisk. Dette omfatter fodring fødevarer af høj kvalitet på samme tid og mængde, hver dag og opretholde høj vandkvalitet (lav ammoniak, nitrat, nitrit og opløste organics, ~ pH 7 og lignende ledningsevne omkring 700 µS). Det er også vigtigt at udføre assays i et område ikke forstyrret af støj. Støjende fodspor og klaprende lyde kan ændre adfærdsmæssige reaktioner og søvn-aktivitet-mønstre. For at reducere skadens til mechanosensory enheder mens håndtering fisk, er det nyttigt at bruge en bøde-maske fisk netto mens overføre fisk; Dette vil bidrage til at undgå at beskadige Slim cupula af neuromasts.
DASPEI farvestof har subletale virkninger på fisk, men overdreven udsættelse kan resultere i toksiske virkninger. For eksempel, vil nedsænkning fisk i DASPEI løsningen for 2 h øge chancen for dødelighed under genoprettelse efter anæstesi. DASPEI farvning er lysfølsomt og derfor bør ske i mørke omgivelser.
Hvad angår freeware installation, AviSynth software, Avisynth Virtual File System (avfs) og Pismo fil montere revision pakke (pfmap) påkrævet specifikke versioner til at arbejde sammen fasthed. Det blev bekræftet af denne protokol, avfs (v1.0.0.5), AviSynth (2.6.0) og pfmap (1.7.8) arbejde sammen, men i det mindste nyeste pfmap build gjorde ikke arbejde nemlig den fil-montering procedure. Af denne grund, opmærksomhed på software-versioner (tabel 1). VirtualDub fungerer bedre under 32-bit version i stedet for 64-bit. Indstilling af 15 frames per Sørensen giver en god tidsopløsning og kræver ikke overdreven opbevaring volumen (1,6 GB til en 24-h søvn assay video og 3 MB en VAB video). For ImageJ, kan den store vanskelighed komme fra indstilling filstier i makroen. I Vinduer OS, kan stien til filen udtrykkes normalt som "C:Document\my Document\...". ImageJ makroen kører under Java environment og har brug for en ekstra "\" til filstien, dvs "C\:Document\\my Document\\...". Se venligst filen eksempel ImageJ makro. Derudover kan det være nødvendigt at installere to plugins, Skive Remover og objekt Tracker25, og Tildel hurtigtaster (genvejstaster) 6 og 8, henholdsvis, således at analyserne arbejde problemfrit (Plugins > genveje > Tilføj Genveje... 26 ). SwisTrack har en funktion til at angive Sporingsparametre, men det er muligt, at en fryse og/eller nedbrud kan forekomme samtidigt med at nedgang sporingsparametre. Det er bedre at redigere parameter i en tekst editor app som Notepad ++. For nærmere oplysninger om parameterindstillinger, se venligst27. Installer Cygwin (Unix emulator) indeholder et installationsprogram for at installere Perl-pakken, som ikke er inkluderet i standard installation indstilling. Det anbefales, at specielt vælge pakken Perl under installationen af Cygwin.
Selv om denne procedure er begrænset til en sidelinjen-baserede adfærd (VAB) og svømning aktivitet og søvn, kan dette dyr tracking system tilpasses til andre adfærd, herunder stereotyp gentagne adfærd, sociale interaktioner og asymmetriske skik ( venstre/højre) af kraniel neuromasts under fouragering (lateralitet)13, selv om disse metoder kan kræve lavvandede arenaer som foreslået af idTracker14. Med en suite af udviklet adfærd, kan man anvende forskellige scripts for at analysere de registrerede X - og Y - akserne data og undersøge forskellige adfærdsmønstre. Denne analyse rørledning er beregnet til at give et fundament for at løse mekanismen af udviklingen i flere adfærd, og også hvordan comorbide autisme-lignende adfærd er reguleret af genetiske, epigenetiske, og de miljømæssige faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmerne af Yoshizawa lab herunder N. Cetraro, N. Simon, C. Valdez, C. Macapac, J. Choi, L. Lu, J. Nguyen, S. Podhorzer, H. Hernandes, J. Fong, J. Kato og I. Herren for fisk pleje på den eksperimentelle fisk, der anvendes i dette håndskrift. Vi takker også A. Keene lab medlemmer herunder s. Masek for at træne min at samle IR CCD kamera. Endelig vil vi gerne takke Media Lab - College of Social Sciences - skole for kommunikation ved University of Hawaii Mānoa for deres uvurderlige hjælp med at gøre video, især B. Smith, J. Lam og S. hvid. Dette arbejde blev støttet af Hawaiian Fællesskabet Foundation (16CON-78919 og 18CON-90818) og nationale Institut for sundhed NIGMS (P20GM125508) tilskud til min.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide) | MilliporeSigma | D3418 | |
| 880 nm wave length black light | Advanced Illumination | BL41192-880 | |
| avfs | freeware | Version 1.0.0.6 | http://turtlewar.org/avfs/ |
| Avisynth | freeware | Version 2.6.0 | http://avisynth.nl/index.php/Main_Page |
| Cygwin | freeware | Version 2.11.0 | https://www.cygwin.com/ |
| Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish) | Corning | 3140-100 | 10 cm diameter 5 cm high |
| Ethovision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | Version 14 | https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt |
| Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black | Jardin (through Amazon.com) | NA | Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system |
| Grade A Brine shrimp eggs | Brine shrimp direct | BSEA16Z | |
| ImageJ | freeware | Version 1.52e | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens | Toyo | NA | Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer |
| Neutral Regulator | Seachem | NA | |
| Optical cast plastic IR long-pass filter | Edmund optics | 43-948 | Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam |
| pfmap | freeware | Build 178 | http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom) |
| Reef Crystals Reef Salt | Instant Ocean | RC15-10 | |
| SwisTrack | freeware | Version 4 | https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack |
| USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam) | Microsoft | Q2F-00013 | Cut 2-2.5 cm of the front |
| WinAutomation | freeware | Version 8 | https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure) |
| Windows operating system | Microsoft | 7, 8 or 10 | https://www.microsoft.com/en-us/windows |
| x264vfw | freeware | NA | https://sourceforge.net/projects/x264vfw/ |
References
- Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Elsevier Inc. Amsterdam. (2015).
- Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. Mexican eyeless characin fishes, genus Astyanax: Environment, distribution, and evolution.Special publications the museum Texas Tech University. (12), Texas Tech Press. Texas. (1977).
- Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax-fasciatus (Characidae, Pisces) - Support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
- Fumey, J., Hinaux, H., Noirot, C., Thermes, C., Rétaux, S., Casane, D. Evidence for late Pleistocene origin of Astyanax mexicanus cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 1-19 (2018).
- Yoshizawa, M., Gorički, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. The energetic cost of vision and the evolution of eyeless Mexican cavefish. Science Advances. 1 (8), e1500363 (2015).
- Yoshizawa, M., et al. The Evolution of a Series of Behavioral Traits is associated with Autism-Risk Genes in Cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 89 (2018).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38 (1), 107-111 (2006).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), 15 (2015).
- Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
- Fernandes, V. F. L., Macaspac, C., Lu, L., Yoshizawa, M. Evolution of the developmental plasticity and a coupling between left mechanosensory neuromasts and an adaptive foraging behavior. Developmental Biology. 441 (2), 262-271 (2018).
- Pérez-Escudero, A., Vicente-Page, J., Hinz, R. C., Arganda, S., de Polavieja, G. G. idTracker: tracking individuals in a group by automatic identification of unmarked animals. Nature Methods. 11, 743 (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., Van Netten, S. M., McHenry, M. J. The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus). Journal of Experimental Biology. 217 (6), (2014).
- Lee, A. Virtualdub. , http://www.virtualdub.org/ (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Cavallari, N., et al. A blind circadian clock in cavefish reveals that opsins mediate peripheral clock photoreception. PLoS Biology. 9 (9), e1001142 (2011).
- Swimmer, B., Lang, H. H. Surface Wave Discrimination between Prey and Nonprey by the Back Swimmer Notonecta glauca L. (Hemiptera , Heteroptera ). 6 (3), Springer Stable. https://www.jstor.org/stable/4599284 233-246 (1980).
- Montgomery, J. C., Macdonald, J. A. Sensory Tuning of Lateral Line Receptors in Antarctic Fish to the Movements of Planktonic Prey. 235 (4785), American Association for the Advancement of Science Stable. https://www.jstor.org/stable/1698962 195-196 (1987).
- Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A., Sung, R. J., Schier, A. F. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. The Journal of Neuroscience. 26 (51), 13400-13410 (2006).
- Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P.
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Rasband, W. S. Object Tracker. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/tracker.html (2000).
- Ferreira, T., Rasband, W. Create Shortcuts. ImageJ User Guide. , https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-31.html#sub:Create-Shortcuts... (2012).
- Lochmatter, T., Roduit, P., Cianci, C., Correll, N., Jacot, J., Martinoli, A. SwisTrack. , https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack (2008).
