Summary
Vi presenterer en enkel suppressor skjermen protokoll i fisjon gjær. Denne metoden er effektiv, mutagen-fri og selektive for mutasjoner som forekommer ofte i et enkelt genomisk locus. Protokollen er egnet for å isolere suppressors som lindre vekst defekter i flytende kultur som er forårsaket av en mutasjon eller et medikament.
Abstract
En genetisk skjerm for mutant alleler som hemmer fenotypiske feilene forårsaket av en mutasjon er en effektiv tilnærming til å identifisere tilblivelse det tilhører nært beslektede biokjemiske trasé. Metodene som syntetisk genetisk Array (SGA) analyse og tilfeldig mutagenese teknikker med ultrafiolett (UV) eller kjemikalier som ethyl methanesulfonate (EMS) eller N-etyl-N-nitrosourea (ENU), mye brukt, men er ofte kostbare og arbeidskrevende. Også er metodene mutagen-basert screening ofte forbundet med alvorlige bivirkninger på organismen, inducing flere mutasjoner som i tillegg til kompleksiteten med å isolere suppressors. Her presenterer vi en enkel og effektiv protokoll for å identifisere suppressor mutasjoner i mutanter som overdrar vekst feil Schizosaccharomyces pombe. Egnethet av celler med en vekst-mangel på standard flytende medierik eller syntetiske flytende medium kan overvåkes for gjenoppretting ved hjelp av en automatisert 96-brønns plate leser over en lengre periode. Når en celle kjøper en suppressor mutasjon i kultur, utkonkurrere underordnede de av foreldrenes cellene. Gjenopprettede cellene har en konkurransedyktig vekst fordel over foreldrenes cellene kan deretter isolert og backcrossed med foreldre celler. Suppressor mutasjoner identifiseres deretter bruker hele-genome sekvensering. Bruker denne tilnærmingen, har vi har isolert flere suppressors som lindre alvorlige vekst feil forårsaket av tap av Elf1, en AAA + familie ATPase som er viktig i kjernefysiske mRNA transport og vedlikehold av genomisk stabilitet. Det er over 400 gener i S. pombe med mutanter overdragelse vekst feil. Som mange av disse genene er uncharacterized, foreslår vi at vår metode vil skynde identifikasjon av romanen funksjonell interaksjon med denne brukervennlige, høy gjennomstrømming.
Introduction
Grunnlag for forståelse funksjonelle koblinger mellom gener er avhengig av evnen til å identifisere den molekylære mechanism(s) som komplekse genetiske egenskaper divergere for å produsere ulike fenotyper1. I fisjon gjær, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), er fleste av protein-koding gener unnværlig for levedyktigheten2. Dette resultatet snakker ikke unimportance av disse genene, men heller til intrikate kompenserende mekanismer underliggende biokjemiske veier slik gener tilhører. Dissekere disse kompenserende mekanismer har generert epistasis kart, som har avdekket omfattende genetisk interaksjoner og utvidet vår forståelse av funksjonelle biochemical pathways3,4.
Høy gjennomstrømming metoder (f.eks syntetiske genetisk Array analysen eller SGA) er utviklet for å identifisere genomet hele genetisk interaksjoner i spirende gjær, og har blitt utvidet til bruk i fisjon gjær5,6. Disse er ofte avhengige av et bibliotek av stammer som inneholder alle levedyktig enkelt protein-koding genet slettinger (rundt 3300 haploid sletting mutanter dekker over 92% av fisjon gjær genomet), og krever en robotarm å utføre genetiske kors mellom de stamme av interesse og alle mulige belastninger i library6. Videre SGA teknikker er avhengig av evnen til biblioteket stammer har riktig og effektivt parring, en fenotypen som er unormal til 444 preget gener i S. pombe2.
Til tross for kompleksiteten i genetisk interaksjoner, sammenligne fenotypen belastning bærer mutasjoner i to gener til fenotypen av to stammer bærer individuelle mutasjoner av hver genet kan ha én av to bemerkelsesverdige resultater: 1) dobbel mutant fenotypen er verre enn de forventede multiplikativ foreldrenes fenotyper i form av sykdom eller i det mest ekstreme tilfellet, dødelighet. Dette kalles en negativ genetisk samhandling, og er vanligvis et tegn på at de to genene handle i parallell biologiske banene. 2) dobbel mutant fenotypen er bedre enn forventet kombinasjonen av foreldrenes fenotyper, også kjent som en positiv genetisk interaksjon. En positiv genetisk interaksjon er spesielt interessant fordi det angir at disse genene fungere i samme prosess. To positivt samspill gener har tre potensielle relasjoner: en muterte genet kan opp-regulere uttrykk for andre genet i en parallell vei, de to genene kan arbeide sammen i den samme stien nedstrøms fra hverandre, eller de to genene kode proteiner som kommuniserer direkte med hverandre. Derfor kan positive genetisk interaksjoner brukes til å tilordne genet regulatoriske noder og klassifisere uncharacterized gener i biochemical pathways7,8.
En suppressor er en mutasjon som kan lindre sykdom fenotypen av mutasjon av en annen genet, vanligvis representerer en positiv genetisk samhandling mellom de to gener9,10. Suppressor mutasjoner på et annet locus enn mutasjon de undertrykker kalles extragenic suppressors. De er spesielt verdifull i å studere ikke-levedyktige genetiske mutasjoner av syntetisk redde den dødelige fenotype (også kjent som Lazarus effekt)11. De har også potensielle terapeutiske programmer i behandling av arvelige sykdommer12,13.
For alle disse grunner, har identifikasjon av suppressor mutasjoner i ulike modell organismer blitt mye utnyttet for å lette vår forståelse av ulike biochemical pathways14,15,16. Screening for suppressors er vanligvis basert på fenotypen av mutasjon i spørsmålet og krever gjennomføre tilfeldig mutagenese å isolere mutasjoner som ville lette fenotypen. Nesten alle modell organismer har etablert tilfeldig mutagenese metoder. For eksempel N-etyl-N-nitrosourea (ENU) og ethylmethanesulfonate (EMS), to mutagener som kan indusere punkt mutasjoner i DNA, er viden ansatt i ulike modeller fra bakterier til mus17,18,19 . I tillegg har mangan klorid lenge vært brukt i gjær mulighet for mangan kasjon å hemme DNA reparasjon veier20. En annen felles tilnærming er UV-indusert mutagenese, som genererer genomet hele mutagene pyrimidine dimers21,22.
Selv om bruken av kjemiske mutagenese å identifisere suppressor mutasjoner er populære, har metoden mange ulemper, inkludert bruk av farlige kjemikalier, svært variabel suksess priser og innføring av ekstra forvirrende variabler presentert av den negative bivirkninger av mutagen på flere cellulære prosesser23,24. I tillegg medfører kjemiske mutagenese ofte flere mutasjoner i genomet som legger til kompleksiteten med å bruke genetisk og sekvensering teknikker for å identifisere den nøyaktige mutasjonen som gitt suppressor fenotypen i organismen25.
For å løse svakhetene ved dagens mutagenese tilnærminger, presenterer vi en metode for å skjermen for spontane suppressor mutasjoner i fisjon gjær som ikke stole på noen mutagener eller et bibliotek som sletting. Metoden isolerer suppressors gjennom en positiv utvalg analysen. Prinsippet om denne metoden er basert på vekst fordelen av muterte suppressor subpopulasjon i flytende kultur, som kan overvåkes av en automatisert plate-leser. Mating og meiose brukes bare hvis du ønsker å rydde opp genetisk bakgrunnen eller bekrefte tilstedeværelse av monogenic alleler av suppressors før hele-genome sekvensering. Hvis undertrykkelse fenotypen skyldes en enkelt mutasjon, vil suppressor fenotypen skille 2:2 etter backcrossing med foreldre påkjenninger. Suppressor mutasjoner kan deretter identifiseres med hele-genome sekvensering. Vi foreslår at denne metoden gjelder for screening suppressors i alle mikroorganismer som kan vokse til en stor befolkning i flytende kultur.
Protocol
1. belastning konstruksjon og forberedelse
- Generere en mutasjon eller sletting av genet (yfm, din favoritt mutasjon) bruker standard område-rettet mutagenese (SDM) som beskrevet tidligere26.
- Før du starter skjermen, (optimalt) backcross mutant stammene med en vill-type belastning å rengjøre genetisk bakgrunnen og generere friske-født mutant celler som foreldre påkjenninger. Strek foreldrenes belastningen til individuelle kolonier på standard medierik plater. Tilfeldig plukke åtte å seksten uavhengig kolonier (biologiske gjentak) med ønsket mutasjoner for plate leser analysen (se 3.1).
Merk: Denne protokollen er effektivt når foreldre stammene har en vekst feil i flytende media (minimal eller rik, med eller uten narkotika eller temperatur skift som forårsaker feilen vekst). Alle foreldre stammer bør være haploid og dermed kunne krysses genetisk med andre haploid stammer med en komplementær paring.
2. plate leser analysen
- Med en sterile applicator, ta en liten mengde av hver av koloniene i trinn 1.1 (ingen eksakte beløpet som er nødvendig for å vaksinere Start kultur) og plasser i en 96-brønns polystyren microplate. Suspendere hver koloniene i 200 µL av flytende mediefil (rik eller minimal, med eller uten narkotika). Inkluder et tomt godt for hver rad på tallerkenen som inneholder 200 µL av de samme mediene (ingen celler).
- Kjør følgende protokollen på en plate leser gjenkjenning programvare koblet til en automatisert microplate-leser: Angi en kinetisk program for 24t og temperatur på 30 ° C, med kontinuerlig rask orbital skjelvende (425 cpm, 3 mm amplituden). Angi den optiske lest å måle lys scatter på en bølgelengde på 600nm for optisk tetthet og angi lyset lese fra under platen med en lese frekvens på 2 min (721 totale leser løpet 24-h per brønn).
- Etter 24 timer, spille inn siste borte optisk densitet målinger (borte OD600) og bruk følgende formel til å bestemme volumet nødvendig å fortynne alle prøvene til OD = 0.1:
Merk: Eksportere dataene fra platen reader-programmet og bruke et regnearkprogram sette inn ovenfor formelen som en funksjon til batch behandler fortynning volumet som brukes i hver eksperimentelle brønn. - Hver 24 h, fortynne hvert av eksemplene bruker samme medium som dag 0 til OD = 0,1 (ca 1,5 x 106 celler/mL) ved hjelp av formelen som er angitt i trinn 2.3. Lagre alle vekst kurver generert daglig og oppmerksom på eventuelle personlige koloni som viser en økt vekst, dømt av en endelig OD som er betydelig høyere enn resten av kohorten med samme genetiske bakgrunnen eller en vekstkurve som er lik som vill-type kolonier.
Merk: Denne analysen tar vanligvis ca 7-14 dager. Alle trinnene under sterile forhold.
3. valg av suppressor kolonier og bekreftelse av fenotypen.
- Fra den siste dagen i plate leser analysen (trinn 2.4), lagre de flytende kulturene som har en betydelig gjenopprettede vekst, antagelig ved å få en suppressor mutasjon som kan lindre fenotypen av foreldrenes mutasjon. Overføre og bland 250 µL flytende kultur til en cryotube som inneholder 250 µL 50% glyserol. Flash fryse cellene i flytende nitrogen og lagre stammene i - 80oC på ubestemt tid.
- For å bekrefte at suppressor mutasjon er et genetisk arvelige element, bruker standard genetisk krysset metoder for å krysse yfm P (for foreldre, påkjenningen brukes i begynnelsen av platen leser analysen) med yfm S (for suppressor, belastningen lagret på slutten til platen leser analysen). Hvis suppressor mutasjon er faktisk et genetisk arvelige element, skal yfm P × yfm S gi tetrads der to koloniene har sykdom fenotypen av foreldrenes belastningen og to koloniene har gjenopprettet veksten av suppressor belastning.
- Fra korset av trinn 3.2, plukke tre kolonier med suppressor fenotypen (S belastning) og tre kolonier med foreldrekontroll fenotypen (P belastning) fra samme genetiske kryss (3 biologiske gjentak for hver) og fortsette med genomisk DNA utvinning og sekvensering trinnene nedenfor.
Merk: Trinn 3.2 og 3.3 er anbefales, men kreves ikke. Alternativt kan en spre gjenopprettede flytende kultur samlet fra 3.1 på rike medium til enkelt kolonier og tilfeldig plukke tre kolonier som biologiske triplicates for hele-genome sekvensering uten ytterligere genetisk bekreftelse. I dette tilfellet skal tre biologiske triplicates av foreldrenes stamme brukes for genomisk sekvensering sammenligning.
4. genomic DNA utvinning, bibliotek produksjon og sekvenser.
- DNA utvinning, bibliotek forberedelser og sekvensering, tilfeldig plukke tre biologiske gjentak per yfm P belastning, og tre biologiske gjentak av hver individuelt oppstått yfm S stammer fra genetisk kors (trinn 3.2) eller den plater som er spredt for å få enkelt kolonier av S belastningen (trinn 3.3 Merk).
- Vokse stammer i 10 mL kulturer i medierik til midten av Logg fase (OD = 0,5-0.8, om 0,75-1.2 x 107 celler/mL), og bruke en risting inkubator for å vokse flytende kulturer på 30 ° C med kontinuerlig rister på 250 rpm. Samle celler med sentrifugering ved 4 ° C i 5 min på 1000 x g.
- Suspendere pelleted celler i 400 µL av DNA utvinning buffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1 mM Na2-EDTA), deretter legge til 400 µL av glassperler og 400 µL 25:24:1 fenol: kloroform: isoamyl alkohol. Vortex kraftig i 2 minutter på 4 ° C.
- Legge en ytterligere 200 µL av DNA utvinning buffer og blanding ved å snu flere ganger. Sentrifuger i 5 min på 4 ° C på 20.000 x g.
- Overføre den vandige fasen til en ren tube, legge til 20 µg RNase A/T1 mix og ruge på 37 ° C i 15 min.
- Legge til en lik mengde 25:24:1 fenol: kloroform: isoamyl alkohol, spinn for 5 min på 4 ° C på 20.000 x g, deretter overføre den vandige fasen til en ren rør.
- Legge til en lik mengde kloroform, bland ved å snu flere ganger, deretter spinne i 5 min på 4 ° C på 20.000 x g, deretter overføre den vandige fasen til en ren rør.
- Bunnfall DNA med to bind av 100% etanol pluss 10% volumet av 3 M NaOAC (pH 4.3) på-20 ° C i minst 2 timer, deretter spinne i 5 min på 4 ° C på 20.000 x g og samle pellet.
- Vask pellet (utfelt DNA) to ganger med kjølt 70% etanol (sentrifuger på 20.000 x g, 5 min, 4 ° C) og avbryte pellet 50 µL av 10 mM Tris Buffer (pH 7.4).
- Bruk en bibliotek-prep kit (se Tabell for materiale) per produsentens anbefalinger å forberede hele-genome sekvensering biblioteket.
Merk: Vi anbefaler pakken oppført i Tabell for materiale fordi det tillater bygging av genomisk biblioteket uten PCR forsterkning, som reduserer feil mutasjoner genereres under PCR forsterkning. I tillegg under genomisk biblioteket utarbeidelse, tillater ikke perler å fullstendig tørke ved å forkorte perlen tørketid til 1-2 min. - Klipping parametere under bibliotek utarbeidelse, bruke en fokusert sonicator (se Tabell for materiale) og sette den plikt faktoren til 20%, peak strøm til 175 W, med 200 sykluser per briste, og frekvens feiende modus ved 5.5oC til 6 ° C i 45 s. Alternativt, bruk en DNA og chomatin klippe systemet (se Tabellen for materiale) med følgende innstillinger: 50% amplituden på 4 ° C med pulsmodus, 15 s på og 15 s av 10 min, med en total behandlingstid på 20 min.
- Det er viktig å håndtere farlige materialer i dette trinnet med forsiktighet. Konsultere riktig HMS-Datablad og institusjonens miljørettet helsevern og trafikksikkerhet kontor for håndtering av NaOAC, etanol, 25:24:1 fenol: kloroform: isoamyl alkohol og kloroform.
- Sekvens resulterende genomisk bibliotekene. Den hele sekvensering lest skal dekke minst tre ganger i hele genomet oppløsning med mange single nukleotid. Sammenkoblet endte sekvensering (eller nyeste teknologien) anbefales.
5. bioinformatikk analyse for identifikasjon av suppressor mutasjoner
- Utfør bioinformatikk analyse for å fokusere på genomisk endringene som identifiseres konsekvent mellom foreldre og undertrykt yfm stammer i alle biologiske replikerer.
Merk: Komplett rørledning prosessen er beskrevet nedenfor, men i tillegg to ren tekst BASH-skript filer, fastq_to_vcf.sh og vcfprocess.sh, tas som supplerende materiale å vise eksempler på arbeidsflyten behandling av leser for VCF filer og behandling og kryss av VCF filene, henholdsvis. - Trim kort-leser bruke SKJÆR (https://github.com/jbpease/shear) følgende kommandolinjer (alle andre alternativer for standard):
Shear.py - fq1 $FASTQ1 - fq2 $FASTQ2 - out1 $OUTFQ1 - out2 $OUTFQ2 \
-barcodes1 $BARCODE - plattform TruSeq--trimqual 20:20 \
-trimpolyat 0 - trimambig - filterlength 50 - filterunpaired - Kart leser til S. pombe referanse genomet v2.30 fra PomBase (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/fasta/) bruker BWA v0.7.1527. Bruk følgende kommandolinje (alle andre alternativer for standard):
BWA mem -t 8 $GENOME $OUTFQ1 $OUTFQ2 > $SAM1 - Sette justering SAM filer gjennom GATK pipeline rutiner28 for variant ringer GATK v3.629, PicardTools v2.5.0 (http://broadinstitute.github.io/picard) og SAMtools v1.3.130. Bruk følgende kommandolinjer og parametere (alle andre alternativer for standard):
Java-Xmx30g-jar picard.jar AddOrReplaceReadGroups INPUT = $SAM1 \
OUTPUT = $BAMMARKED RGID = 1 RGLB = lib01 RGPL = illumina \
RGPU = $BARCODE RGSM = $SAMPLENUMBER
samtools fixmate - O bam $BAMMARKED $BAMFIXED
samtools sortere - O bam -o $BAMSORTED -T /home/peasejb/tmp $BAMFIXED
samtools indeks $BAMSORTED
Java-Xmx30g-jar GenomeAnalysisTK.jar -T HaplotypeCaller \
-R $GENOME-jeg $BAMSORTED--genotyping_mode DISCOVERY \
-stand_emit_conf 10 - stand_call_conf 30 -o $VCFRAW - Komprimer og indekser VCF-filer ved hjelp av tabix:
bgzip $VCFRAW.vcf
tabix $VCFRAW.vcf.gz - Sammenligne VCF-filer mellom foreldre og suppressor påkjenningen sekvensering gjentak bruker BCFtools v1.3.127. Bruk følgende kommandolinjer og parametere (alle andre alternativer venstre standard):
bcftools isec - n + 1 $VCFPARENTAL1.gz $VCFPARENTAL2.gz $VCFPARENTAL3.gz \
$VCFMUTANT1.gz $VCFMUTANT2.gz $VCFMUTANT3.gz > common_variants.list
Merk: Denne kommandoen gitt en fil kodet med binære mønstre hvor sekvens varianter i første mutant bare ville være binær-kodet som "000100", andre mutant som "000010", alle tre mutanter som "000111," osv. Disse filene ble generert for hvert sett med foreldre og mutant gjenskape VCF-filer. - Kompilere variant skjæringspunktet liste filene med filnavnet til hver linje kommandoen UNIX grep:
grep "." *.list > all.list - Kryssreferanse komplett variant listen med merknadsfilen gjeldende GFF3 (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/gff3/schizosacchar omyces_pombe.chr.gff3) bruker en egendefinert Python-skript (variant_characterize.py) å identifisere konsekvent SNP nettsteder i protein-koding regioner (synonymt og ikke-synonymt), 5 ' og 3 ' UTRs og ncRNA.
python3 variant_characterize.py - listen common_variants.list \
-gff schizosaccharomyces_pombe.chr.gff3 \
--fasta Schizosaccharomyces_pombe. ASM294v2.30.DNA.Genome.FA \
--mønster 000100--ut all.list.filter.000100
Gjenta denne skriften å endre--mønster og suffikset for utdatafilen (-ut) bruke binærfilen
mønstre: 000010, 000001, 000110, 000011, 000101 og 000111 - Kombinere utdata fra alle disse skriptet kjører i en tabulatordelt fil som skal vises som et regneark. Tabellen kommenterte varianter inkluderer de som vises i enten en eller begge mutant strain(s) i forhold til bakgrunnen. Binær flagg-feltet angir enten utseende i en enkelt mutert stamme (000100, 000010, 000001), to mutant stammer (000011, 000101, 000110), eller alle tre mutant stammer (000111).
- Analysere listene utgang kommenterte varianter finnes ikke i foreldrenes prøvene, men i ett, to eller alle tre mutant prøver. Merknaden angir både genomisk plasseringen og klasse variant (synonymt/ikke-synonymt i en koding region, 3/5' UTR, ikke-koding, etc.). Et eksempel på et sterkt relevante kandidater kan være en ikke-synonymt koding variant vises konsekvent i alle tre stammer fra denne listen av kandidaten mutasjoner. En annen ville sterk kandidat være en opphopning av ulike ikke-synonymt eller antatte regulatoriske mutasjoner i de muterte stammene vises tett eller i det samme genet.
Representative Results
Sakte voksende mutanter viser fenotypiske utvinning i flytende kultur
Vi valgte tre mutanter involvert i en rekke biologiske veier med en syk, sakte voksende, fenotype: AAA familie ATPase Elf1, Histone Deacetylase Clr6 og ekson Junction komplekse komponenten Fal1. En vill-type belastning og påkjenningen bærer mutasjoner av disse tre gener som hadde vært backcrossed med vill-type stammer var stripete til individuelle kolonier og 16 enkelt kolonier var tilfeldig valgt å være kulturperler i flytende medierik bruker 96-brønns platen som beskrevet ovenfor. Vekst kurver av personlige kolonier ble spilt inn på det første tidspunktet (dag 0) og 6 dager med kontinuerlig overvåking ved hjelp av platen leseren. Som forventet, viser vill-type kolonier ingen merkbare endringer i vekst kurver hele eksperimentet31 (figur 1). Spesielt, viser en dramatisk endring i fire kolonier med elf1∆ bakgrunn og en fal1∆ koloni i vekst fra sakte voksende til noen ulike nivåer av vekst tilsvarende eller i nærheten av vill-type kolonier. Dramatisk, viser alle clr6-1 mutanter en konsekvent fenotypiske utvinning, vokser raskere ved slutten av analysen31 (figur 1). Betegner i Norge, kaller vi de opprinnelige stammene som er sakte voksende som "P stammer" (eller foreldre stammer) og stammene viser fenotypiske utvinning som "S stammer" (eller undertrykt stammer). Merk at figur 1 er et eksempel på en runde av screening eksperimentet, og representerer ikke de totale ikke-utfyllende suppressors identifisert og sekvensert i følgende representant resultater.
Fenotypiske utvinning er tilskrevet arvelige egenskaper
S. pombe kan vokse som en haploid i rike medier, men to haploid stammer med komplementær paring typer kompis under nitrogen sult. Meiose i fisjon gjær innebærer en runde med duplisering etterfulgt av to rundene av cellen divisjon. Seksuell syklusen resulterer i dannelsen av fire haploid sporer bærer genetisk materiale for foreldre belastningen med 2:2 segregering av genetiske egenskaper følgende regler klassisk Mendelian genetikk (figur 2A). Når vokst på samme plate for den samme tid, bekreftet vi 2:2 segregering når tilbake-krysset alle undertrykt stammer (S stammer) med sine foreldre stammer (P stammer), som resulterte i 2 små (vekst defekt) og 2 store (suppressor fenotypen) kolonier. Enkelte eksempler for undertrykt elf1∆, clr6-1 og fal1∆ celler vises i figur 2B. Vi har bekreftet at alle isolerte S belastninger gjennomføre en monogenic genetisk element som undertrykker sakte voksende fenotypen av deres P stammer (data ikke vist).
Hele-genome sekvensering identifiserer vellykket suppressor mutasjoner
Som et eksempel brukte vi sammen-end hele genomet sekvensering for å identifisere genetiske elementer ansvarlig for fenotypiske utvinning i elf1∆ S stammer. En mer utfyllende beskrivelse av dataanalyse er tilgjengelig online31. Kort ansatt vi biologiske triplicates av to selvstendig generert elf1∆ P stammer og biologiske duplikater av fem ikke-utfyllende elf1∆ S stammer, hver inneholder ulike suppressors. Etter at vi fikk en liste over kommenterte varianter fra bioinformatikk analyse (6.1-10), prioriteres vi visse klasser av varianter som var relevant for vår analyse. Vi fokusert på identifikasjon av konsekvent genomisk endringer som var identiske i alle de biologiske gjentak av personlige elf1∆ S stammer sammenlignet med sine foreldre elf1∆ P stammer (Figur 3 og ekstra tabeller 1-4 ). Vi identifisert fem nonsynonymous endringer på CDer regioner i alle fem ulike elf1∆ S belastninger, inkludert rli1 +, SPBPJ4664.02, cue2 + og rpl2702 +. Både S-A1 og S-A2 inneholder muterte SPBPJ4664.02, selv om mutasjoner oppstår på ulike aminosyrer. SPBPJ4664.02 er en lang genet (11,916 nukleotider) med hundrevis av ganger, kunne mutasjoner ikke bekreftes ved å utføre PCR etterfulgt av sekvenser. S-A3 inneholder en sletting mutant i rli1 som har samme begge biologiske duplikater. Imidlertid mutant ikke co skille med S fenotypen i elf1∆ bakgrunn. Vi identifisert en cue2 mutant (cue2-1) i S-B1, med aminosyrer 396-400 mangler. S-B2 inneholder en rpl2702 mutant (rpl2702-1), som endrer aminosyre posisjonen 45 fra glysin Aspartate31. Både cue2-1 og rpl2702-1 ble bekreftet som elf1∆ suppressors som vist nedenfor.
Genetisk bekreftelse av identifiserte suppressor mutasjoner bekrefter heritability av utvinning fenotypen
To av de identifiserte nonsynonymous endringene, cue2-1 og rpl2702-1, ble ombygget i laboratoriet ved hjelp av standardprotokoller for området-rettet mutagenese. Dobbel mutant stammer cue2-1 elf1∆ P og rpl2702-1 elf1∆ P var korslagt med den gratis elf1∆ P belastning31 (Figur 4). Hvis den nonsynonymous mutasjoner, identifisert gjennom dette skjermbildet var tilstrekkelig til å undertrykke elf1∆ P, ville deretter de resulterende tetrads viser en 2:2 små og store forholdet i koloniene som følge av 4 spores i hver tetrad. Faktisk viste genetisk krysset at identifiserte suppressor mutasjoner er vellykket i undertrykke sakte voksende fenotypen av elf1∆ P og er arvelig.
Figur 1: fenotypiske utvinning kan overvåkes ved vekst kurver i en plate leser. Seksten enkelt kolonier av vill-type (WT), elf1∆, clr6-1og fal1∆ plassert i en 96-brønns plate. Vekst kurver innspilt løpet 24-h og kolonier var re utvannet daglig i medierik. Vekst feilen er tydelig ved lav absorbansen (OD) på slutten av 24 timer perioden på dag 0. Svært gjenopprettede stammer er de som viser en vekstkurve lignende, eller nær, at av vill-type i 24-h periode på dag 6. Fire kolonier av elf1∆, en koloni av fal1∆og alle kolonier av clr6-1 viste ulike nivåer av fenotypiske gjenoppretting etter 6 dager. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: genetiske krysset kan bekrefte at fenotypiske utvinning er knyttet til en enkelt arvelige allelet. (A) når fisjon gjær cellene gjennomgår nitrogen sult, to haploid celler med en komplementær paring kan generere en zygote som sporulates til å generere en tetrad av 4 sporer. Foreldrekontroll genetiske materialet vil skille under meiose følgende regler Mendelian genetikk. (B) svært gjenopprettet kolonier (merket S, for undertrykt) med indikerte foreldrenes genotyper var tilbake-krysset med deres gratis foreldrekontroll kolonien (som viser noen fenotypiske utvinning, merket P, for foreldre). Genetisk krysser viser 2:2 små (dårlig fitness) til store (gjenopprettede fitness) kolonier viser at fenotypiske utvinning er arvelig og kan tilskrives en genetisk enkeltelement. Røde bokser er kolonier bærer suppressor allelet boksene er kolonier bærer det foreldre allelet. Dette tallet er endret fra Marayati et al., 201831. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: analyse av genomet hele sekvensering data å identifisere genetiske elementer ansvarlig for fenotypiske utvinning. Tre biologiske gjentak av to foreldre "P" stammer (P-A og P-B), og to biologiske gjentak fem svært gjenopprettet "S" stammer (S-A1, S-A2 og S - A3 utvinnes fra P-A; S-B1 og S-B2 fra P-B), ble sekvensert og mutasjoner ble organisert som en liste over hver mutasjon i gjenopprettede belastningen i forhold til foreldrenes stamme genomet avledet av (f.eks pa vs S-A1, etc.). Totalt antall oppdaget mutasjoner over hele genomet av alle slike parvis sammenligninger var 660. Totalt 44 mutasjoner ble identifisert når bare mutasjoner som forekommer i begge biologiske gjenskapninger av samme "S" belastningen ble valgt. Ut av 44 mutasjoner var 12 mutasjoner innsetting/sletting (INDEL) eller ikke - synonymt mutasjoner. Ut av 12 INDEL eller ikke-synonymt mutasjoner, fem oppstod i protein koding sekvens. Fem mutasjoner potensielt korrelerer med enkelt genetisk grunnstoffet de svært gjenopprettede stammene: en ikke-synonymt mutasjon i SPBPJ4664.02 funnet i S-A1 og S-A2, INDEL i rli1 funnet i S-A3, INDEL i cue2 i S-B1 og ikke-synonymt mutasjoner i rpl2702 funnet i S-B2. Detaljert oppstartsrekkefølgen mutasjoner og filtrert bakgrunnen er inkludert i ekstra tabeller 1-4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: bekreftelse av suppressors identifisert gjennom hele-genome sekvensering. Resultater fra hele-genome sekvensering ble bekreftet av uavhengig generere mutasjoner og utføre genetiske krysser for å bekrefte fenotypiske utvinning ved krysset en elf1∆ cue2-1 belastning elf1∆ P belastning, og elf1∆ rpl2702-1 med elf1∆ P belastning. Tre representant loddrett tetrads vises. Røde bokser er dobbel-mutant kolonier (elf1 cue2-1eller elf1 rpl2702-1); boksene er elf1∆ kolonier. Dette tallet er endret fra Marayati et al., 201831. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra tabell 1. Klikk her for å laste ned denne tabell.
Supplerende tabell 2 . Klikk her for å laste ned denne tabell.
Supplerende tabell 3 . Klikk her for å laste ned denne tabell.
Supplerende tabell 4 . Klikk her for å laste ned denne tabell.
Supplerende koding filer . Klikk her for å laste ned filene.
Discussion
Protokollen beskrevet her representerer en ny og enkel skjerm for spontane suppressor mutasjoner synlig gjennom fenotypiske utvinning av mutasjoner overdragelse langsom vekst i fisjon gjær, en fenotypen karakteristisk for over 400 gener i S. pombe, den funksjonen til mange av dem er fortsatt ukjente2,32. Metodene har tatt andre tilnærminger til skjermen for suppressor mutasjoner i mikroorganismer, inkludert bruk av mutagener21eller anvendelsen av en temperatur endring i temperatur-sensitive mutant bakgrunner33. Derimot viser denne protokollen at fenotypiske utvinning skjer uten ekstra miljø/kjemisk forstyrrelser og fremhever fitness fordelen av fremveksten av undertrykkelse mutasjoner slutt å ta over ressursene i flytende kultur. Dette skjermbildet kan isolering av både omkjøringsvei suppressors eller samhandling suppressors fordi det er effektivt for både tap-av-funksjon mutasjoner som elf1∆ eller fal1∆ og punkt mutasjoner som clr6-1, så lenge mutanter demonstrere fitness defekter i flytende kultur.
Alle gjenopprettede S stammer som vi har undersøkt har hittil vist varierende fenotypiske utvinning. Som oppdaget gjennom genetisk krysset, gjenopprettede fenotypen skyldes ett genetisk element og er arvelig (eksempler vist i figur 2). Dette er en av de viktigste fordelene med denne metoden sammenlignet med kjemisk-baserte eller UV-baserte suppressor skjermbilder som ofte målet flere genomisk loci. Det er vanlig å observere en eller to kolonier utvinnes av 16 koloniene/belastning (rundt 10%) innen en uke. Vi imidlertid merke til at visse mutanter, som tap av funksjon av Rrp6, kjernefysisk-spesifikke exosome-underenheten, aldri utvinnes til nesten vill-type veksten observert i elf1Δ celler31. Det er sannsynlig at funksjonen til Rrp6 bare kan være delvis kompensert av suppressors, i motsetning til funksjonen av andre mutanter testet, inkludert fal1∆, som ble vist å forårsake en alvorlig meiotic defekt gjennom sin viktige funksjon i regelverket skjøting34. Vi tror at alternativ suppressor screening metoder vil være underlagt samme problem når yfg har unike, ikke-utskiftbare roller i cellevekst.
Før du utfører genomisk sekvensering, er det optimalt å tilbake tvers svært gjenopprettede koloniene, identifisert fra plate-leseren, med foreldrekontroll stammene å fjerne genetisk bakgrunnen og få biologiske gjentak. I tillegg identifiserer dypt hele-genome sekvensering hundrevis av single nukleotid endringer, hvorav de fleste ikke er identiske mellom biologiske gjentak av liten interesse for screening. For eksempel fant vi totalt 660 genomisk endringer over alle tre kromosomene mellom de to elf1Δ P og de fem forskjellige S stammene (Figur 3). Vi observerer ikke vanligvis identiske mutasjoner mellom sekvensert biologiske gjentak av hver stamme, antyder at enten nye mutasjoner kan oppstå under dyrking av elf1Δ celler før genomisk biblioteket bygging eller tilfeldige feil kan være introdusert i biblioteket konstruksjon og sekvenser. Derfor er isolere mutasjoner som er konsekvente i biologiske gjentak et viktig aspekt ved vellykket identifikasjon av suppressors bruker hele-genome sekvensering.
Vi identifisert og bekreftet to suppressors i CDer regioner i fem sekvensert S stammer. Selv om mutasjoner i SPBPJ4664.02 ble oppdaget i både S-A1 og S-A2 stammer, er det usannsynlig at SPBPJ4664.02 er en gyldig suppressor fordi S-A1 og S-A2 ikke inneholder en suppressor på det samme genet som de ikke er utfyllende med hverandre ( data ikke vist). Vi også ikke bekrefte rli1 i S-A3, som ikke co skille med S fenotypen når backcrossed med elf1Δ. Vi fant også spesifikke mutasjoner i ikke-koding regioner i S-A1, S-A2 og S-A3. Det er mulig at disse endrede ikke-koding genomisk regionene lindre elf1Δ fenotypen, som vil bli behandlet i våre fremtidige studier. Sammenlignet med tradisjonelle metoder som et koblingen analysen, som kan ta år å kartlegge en genetisk mutasjon, identifisert vi to suppressors innen to måneder etter å ha bekreftet at et monogenic element forårsaket S fenotypen. Med den raske utviklingen av hele-genome sekvensering teknologi er vi optimistisk at denne metoden blir mer effektivt å identifisere konsekvent genetiske mutasjoner i overskuelig fremtid.
I sammendraget gir denne protokollen trinnvise instruksjonene for å kunne identifisere suppressor mutasjoner for noen genet av interesse med en langsom voksende defekt flytende kultur. Enkelheten av denne analysen gir store screening av flere genetisk bakgrunn rundt med litt trening. Det er plass til ytterligere automatisere prosessen ved å bruke en flytende håndtering robot til å utføre de daglige fortynninger. Siden laboratorium manipulering av mikroorganismer uunngåelig krever vekst i flytende kultur, en prosess som er iboende selektiv til fitness, foreslår vi at denne protokollen bredt kan brukes på andre store-befolkningen modell organismer som bakterier og andre gjær arter.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen påtegninger av produsentene av instrumenter brukes i denne metoden og ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of General Medical Sciences, tilskudd 1R15GM119105-01 til K.Z. Vi takker alle korrekturlesere innsiktsfulle. Vi takker også James Tucker, Alicia Anderson, Elizabeth svart og Glen Marrs for diskusjon og kommentarer på dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine, Powder | Acros Organics | 147441000 | Use at 75 mg/L to make liquid and solid rich media (YEA) |
| Bacteriology Petri Dish | Corning, Falcon | C351029 | 100 ×15 mm, use to grow strains to single colonies on solid rich media |
| D-Glucose Anhydrous, Powder | Fisher Chemical | D16-1 | Use at 30 g/L to make liquid and solid rich media (YEA) |
| Difco Agar, Granuated | Becton, Dickinson and Co. | 214530 | Use at 20 g/L to make solid rich media (YEA) |
| DNA extraction buffer | 2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1mM Na2-EDTA | ||
| Focused-ultrasonicator | Covaris Inc. | S220 | Alternatively, use QSonica Q800R sonicator/DNA and chromatin shearing system |
| Gen5 Data Collection and Analysis Software | Biotek, Inc. | GEN5SECURE | Or equivalent, must be compatible with the micro-plate reader, use to export data readings from the micro-plate reader |
| Hydrochloric Acid 1N, Liquid | Fisher Chemical | SA48-4 | Use to adjust pH to 5.5 in liquid and solid rich media |
| Liquid Rich Media (liquid YEA) | 30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl | ||
| Microplate Reader, Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader | Biotek, Inc. | BTH1MG | Or equivalent, must read visible light at 600 nm wavelength range |
| Rich Media agar plates (YEA plates) | 30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, 20 g/L Agar, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl. | ||
| RNase A/T1 mix | Thermo Fisher Scientific | EN0551 | Use according to manufacturer recommendation |
| Sterile Polystyrene Inoculating Loop | Corning, Inc. | OS101 | Or equivalent, use to transfer colonies from agar plates to 96-well plate |
| Sterile workspace and burners | |||
| Tissue Culture Plate, 96-well Optical Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning, Falcon | C353072 | Or equivalent, must have optical flat bottom for micro-plate ready |
| TruSeq DNA PCR-Free LT/HT Library Prep Kit | Illumina, Inc. | 20015962 | Use to prepare the whole-genome sequencing library |
| Yeast Extract, Powder | Fisher Chemical | BP1422-500 | Use at 5 g/L to make liquid and solid rich media (YEA) |
References
- McKay, J. K., Latta, R. G. Adaptive population divergence: Markers, QTL and traits. Trends in Ecology and Evolution. 17 (6), 285-291 (2002).
- Wood, V., Harris, M. A., et al. PomBase: A comprehensive online resource for fission yeast. Nucleic Acids Research. 40 (D1), (2012).
- de Visser, J. A. G. M., Cooper, T. F., Elena, S. F. The causes of epistasis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 278 (1725), 3617-3624 (2011).
- Sailer, Z. R., Harms, M. J. Detecting high-order epistasis in nonlinear genotype-phenotype maps. Genetics. 205 (3), 107911088 (2017).
- Kuzmin, E., Costanzo, M., Andrews, B., Boone, C. Synthetic genetic arrays: Automation of yeast genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 326-332 (2016).
- Tong, A. H. Y., Boone, C. Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 313 (1), 171-192 (2006).
- Dixon, S. J., Costanzo, M., Baryshnikova, A., Andrews, B., Boone, C. Systematic Mapping of Genetic Interaction Networks. Annual Review of Genetics. 43 (1), 601-625 (2009).
- Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nature Reviews Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).
- Bai, X., Yang, Z., Jiang, H., Lin, S., Zon, L. I. Genetic suppressor screens in haploids. Methods in Cell Biology. , 129-136 (2011).
- Manson, M. D. Allele-specific suppression as a tool to study protein-protein interactions in bacteria. Methods. 20 (1), 18-34 (2000).
- Motter, A. E., Gulbahce, N., Almaas, E., Barabási, A. L. Predicting synthetic rescues in metabolic networks. Molecular Systems Biology. 4, 168 (2008).
- Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nature Biotechnology. 22 (5), 595-599 (2004).
- Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, S. C., Muchowski, P. J. A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease. Nature Genetics. 37 (5), 526-531 (2005).
- Forsburg, S. L., Patton, E., et al. The art and design of genetic screens. Nature reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).
- Johnston, D. S. The art and design of genetic screens. Genetics. 3 (March), 176-188 (2002).
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: Caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
- Gocke, E., Müller, L. In vivo studies in the mouse to define a threshold for the genotoxicity of EMS and ENU. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 678 (2), 101-107 (2009).
- Suzuki, T., Hayashi, M., et al. A comparison of the genotoxicity of ethylnitrosourea and ethyl methanesulfonate in lacZ transgenic mice (Muta(TM)Mouse). Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 395 (1), 75-82 (1997).
- Uttam, J., Alberico, C., De Stasio, E. ENU Mutagenesis. International C. elegans Meeting. , (1995).
- Putrament, A., Baranowska, H., Ejchart, A., Prazmo, W. Manganese Mutagenesis in Yeast. Methods in Cell Biology. 20, 25-34 (1978).
- Bose, J. L. Chemical and UV mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 1373, 111-115 (2016).
- Ikehata, H., Ono, T. The Mechanisms of UV Mutagenesis. Journal of Radiation Research. 52 (2), 115-125 (2011).
- Shrivastav, N., Li, D., Essigmann, J. M. Chemical biology of mutagenesis and DNA repair: cellular responses to DNA alkylation. Carcinogenesis. 31 (1), 59-70 (2010).
- De Stasio, E. A., Dorman, S. Optimization of ENU mutagenesis of Caenorhabditis elegans. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 495 (1-2), 81-88 (2001).
- Probst, F. J., Justice, M. J. Mouse mutagenesis with the chemical supermutagen ENU. Methods in Enzymology. 477 (C), 297-312 (2010).
- Bähler, J., Wu, J. Q., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows – Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Van der Auwera, G. A., Carneiro, M. O., et al. From fastQ data to high-confidence variant calls: The genome analysis toolkit best practices pipeline. Current Protocols in Bioinformatics. 43, 11.10.1-11.10.33 (2013).
- Mckenna, A., Hanna, M., et al. The Genome Analysis Toolkit: A MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Research. 20, 1297-1303 (2010).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Marayati, B. F., Drayton, A. L., et al. Loss of Elongation-Like Factor 1 Spontaneously Induces Diverse, RNase H-Related Suppressor Mutations in Schizosaccharomyces pombe. Genetics. 209 (4), 967-981 (2018).
- Harris, M. A., Lock, A., Bähler, J., Oliver, S. G., Wood, V. FYPO: The fission yeast phenotype ontology. Bioinformatics. 29 (13), 1671-1678 (2013).
- Xu, X., Wang, L., Yanagida, M. Whole-Genome Sequencing of Suppressor DNA Mixtures Identifies Pathways That Compensate for Chromosome Segregation Defects in Schizosaccharomyces pombe. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (3), 1031-1038 (2018).
- Marayati, B. F., Hoskins, V., et al. The fission yeast MTREC and EJC orthologs ensure the maturation of meiotic transcripts during meiosis. RNA. 22 (9), 1349-1359 (2016).
