Summary

環境試料からの担鉄細胞高スループット スクリーニング: 植物細胞、一括土壌および根圏土壌

Published: February 09, 2019
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Summary

担鉄細胞の潜在的な地上システムで微量栄養素のバイオアベイラビリティと売り上げ高に貢献環境試料の急速なスクリーニングのためのプロトコルを提案します。

Abstract

シデロフォア (低分子量キレート化合物)、鉄 (Fe) を病原体競争、植物成長促進とクロス王国シグナリングの土壌物質循環に至る様々 な生態学的な現象に重要です。さらに、シデロフォアはバクテリアリーチングや金属軸受け鉱物および鉱石の風化における商業的興味あります。複雑なサンプルにシデロフォアを定量的に評価する急速なコスト効果の高い、堅牢な手段など微生物の生産する新規担鉄細胞, 担鉄細胞活動の生態学的な影響の重要な側面を識別するキー。ここで紹介した方法は、土壌や植物の組織などの環境試料中のタクトにマイクロバイ コミュニティの担鉄細胞活性を評価するために開発されました。サンプルが均質化され (Fe) なし改変 M9 培地で希釈し、集積培養 3 日間培養します。シデロフォアは、24、48、および 72 時間 (h) 新規 96 ウェル マイクロ プレート CAS (クロム クロムブルー アルキルベンゼンスルホネート) を用いたサンプルの評価された-Fe 寒天アッセイ, 担鉄細胞を評価する従来手間と時間の比色定量法の適応個々 培われた分離された細菌に対して実行されたアクティビティ。内陸部の太平洋岸北西部で栽培 PI561727 と PI561725、マドセン、Lewjain を含む 4 異なる遺伝子型/コムギ (Triticum aestivum l.) のラインに私たちの手法を適用.シデロフォアだった観察植物組織の特定の種類の小麦の遺伝子型の影響を明確に。正常に急速にシデロフォア、地球および水生生態系で重要な機能に及ぼす植物遺伝子型の画面に本手法を使いました。土壌および植物組織内で非常に信頼性の統計的な差異をもたらす多くの技術的な複製を制作しました。重要なは、結果は急速にコミュニティ イチイと機能的な遺伝子を識別するより遅い仕事のために保持することができる方法で、信頼性の高い、複雑なサンプルのシデロフォアを調べる手法を使用できます。

Introduction

シデロフォアは重要な生体鉄キレートのバイオアベイラビリティが幅広い微生物クォーラム センシング、微生物工場-ホストへのシグナリングに至る地球および水生生態系における追加の目的に主に関与します。植物の成長促進、協力、複雑な微生物群集1,2内での競争。シデロフォア大別できます、アクティブ サイトと構造的特徴によると 4 つの基本的な種類を作成する: カルボン酸、hydroxamate、catecholate、タイプ3,4を混合し、。多くの微生物が排泄の担鉄細胞5および複雑な社会、生物ピロールポリアミドの大半で 1 つ以上の型膜受容体も幅広いシデロフォア1の通風管を許可することができます。 6。近作は、コミュニティ レベルでは、間王国通信と物質転送7,8,9,10 でさえ、シデロフォアが特に重要であることを示します ,11

クロム クロムブルー アルキルベンゼンスルホネート (CAS) は、(すなわち、シデロフォア) 配位子の添加させる媒体で容易に識別できる色の変化を作成する CA Fe 錯体の解離の可能性があるような方法で鉄 (Fe) をバインドするキレート剤として 30 年以上使用されています12. とき、CA が Fe でバインドされている、染料がロイヤル ブルー色として表示され、CA Fe 錯体の解離、培地鉄13を清掃するために使用する配位子の種類によって色が変わります。Schwyn および Neilands によって 1987 年に設立初期、液状の培地は微生物のターゲット14成長の習慣の制限15と鉄以外の金属の様々 な変化に対応するための多くの方法で変更されているを含むアルミニウム、マンガン、コバルト、カドミウム ニッケル、リチウム、亜鉛16、銅17、でもヒ素18

多くの人間の病原体だけでなく植物成長促進菌 (PGPM) として識別されている担鉄細胞生産生物3,1920と重要な根とよくテスト エンドファイトの PGPMシデロフォア4正。伝統的な液体 Fe ベースのメソッドは、マイクロタイター担鉄細胞生産21栽培菌株のテストに適応されています。ただし、これらのテクニックは、土壌および植物システム22シデロフォアの潜在的な規制と微生物群集 (マイクロバイ) 全体として、協力の重要性を認識に失敗します。そのため、従来の CAS アッセイ、レプリケーション、マイクロ プレートの再現性、信頼性、測定の容易さと、与えられた環境からシデロフォアの高スループット コミュニティ レベル評価を開発しました。試金。

本研究でシデロフォアを検出するためのコスト効果の高い、高スループット CA Fe アッセイは、複雑なサンプル (すなわち、土壌および植物組織ホモジネート) からシデロフォアの充実を評価するために提示されます。(どのように土壌は、ルートにバインドされた) の面で一括、弱く結び付いたと緊密にバインドされた根圏土壌粒、撮影、および 4 つの異なるコムギ (Triticum aestivum l.) の遺伝子型から根組織と共に得られた: Lewjain、マドセン、PI561725 とPI561727。小麦品種における根本的な違いが募集とコミュニティを作り出す担鉄細胞の選択の違いをされる可能性があること仮説。特別な関心のアルミニウム耐性であるALMT1 (リンゴ酸輸送体 1 の活性化アルミニウム) を持っているので、PI561725 の同質遺伝子系統に関連付けられている微生物の違いはアルミと比較します。敏感 PI561727 同質遺伝子系統、遺伝子、 almt123,24,25,26の非アルミ応答フォームを所有しています。研究の主な目的は、複雑なサンプルの型の今後の作業のための文化を保持しながら担鉄細胞集積培養のシデロフォアを定量的に評価する簡単で、急速な方法を開発することでした。

Protocol

メモ: 現場の場所: ワシントン州立大学、植物病理学ファーム (46 ° 46’38.0″N 117 ° 04’57.4″W)。蒔かれた種は、2017 年 10 月 19 日に機械式のプランターを使用します。それぞれの小麦の遺伝子型が headrows、およそ 1 メートル離れてルート システムの重複を防ぐために植えられました。植物や土壌採取した 2018 年 8 月 9 日、植物が収穫の準備ができていたときに.サンプルは、4 つの小麦品種の 3 つの?…

Representative Results

緑膿菌の fluorescensによる pyoverdine 混合物生合成が解釈し、吸光度を定量化する標準として使用された (で 420 nm) μ M の pyoverdine 同等のサンプルの図 1に示します (420 の吸光度との関係nm) と pyoverdine (μ m ログ10モル) 濃度を開始します。EDTA は、サンプル展示の大きな吸光測定 pyoverdine と R2達成可能だったよりは低い (<strong clas…

Discussion

この作業の主な結果は、環境試料中の担鉄細胞生産/活動を定量的に測定しながら微生物を作り出す担鉄細胞の急速に豊かに使用できる新しい方法論の生産です。方法論は、簡単、迅速かつコスト効果の高いと結果は、複雑で新しいサンプルの型から担鉄細胞活動を検出するための使用方法を示す (例えば.、土壌および植物組織)。プロトコルも集積培養のグリセロールの生産の結果を?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、検査手順、リー ・ オプダール小麦品種を収穫するため、ワシントン州コンコード種ブドウ研究評議会は、農業の維持のためワシントン州立大学センターの支援のため Kalyani Muhunthan を感謝したいとこの作業をサポートするを BIOAg のために天然資源を付与します。追加資金は米国農務省/NIFA ハッチ プロジェクト 1014527 によって提供されました。

Materials

Agarose Apex LF451320014
Aluminum Baking Pan
Aluminum Foil
Ammonium chloride, granular Fiesher Scientific 152315A
Autoclave and Sterilizer Thermo Scientific
Calcium chloride dihydrate Fiesher Scientific 171428
CAS (Chrome Azurol S) Chem-Impex Int'l Inc) 000331-27168
Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder Fiesher Scientific 1521754
EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal J.T.Baker JI2476
Glycerol, Anhydrous Baker Analyzed C22634
HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide Reagent World FZ0941
Hydrochloride acid ACROS Organic B0756767
Infinite M200 PRO plate reader TECAN
Iron (III) chloride hexahydrate, 99% ACROS Organic A0342179
Laboratory Fume Hood Thermo Scientific
Laboratory Incubator VWR Scientific
Magnesium Sulfate Fiesher Scientific 27855
Niric Acid, (69-70)% J.T.Baker 72287
PIPES buffer, 98.5% ACROS Organic A0338723
Potassium phosphate, dibaisc,powder J.T.Baker J48594
Pyoverdine SIGMA-ALDRICH 078M4094V
Sand
SI-600R Shaker Lab Companion
Sodium chloride, granular Fiesher Scientific 136539
Sodium hydroxide, pellets J.T.Baker G48K53
Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% ACROS Organic A0371705

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Cite This Article
Lewis, R. W., Islam, A. A., Dilla-Ermita, C. J., Hulbert, S. H., Sullivan, T. S. High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils. J. Vis. Exp. (144), e59137, doi:10.3791/59137 (2019).

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