Summary
אנו מציגים פרוטוקול להקרנה מהירה של דגימות סביבתי עבור siderophore פוטנציאל לתרום הזמינות הביולוגית micronutrient והמסירה במערכות יבשתי.
Abstract
Siderophores (משקל נמוך-מולקולרי מתכת chelating תרכובות) חשובים שונים לתופעה אקולוגית החל ברזל (Fe) biogeochemical על אופניים בקרקעות, תחרות הפתוגן, צמח צמיחה קידום של צלב-ממלכת איתות. יתר על כן, siderophores גם הם עניין מסחרי ב- bioleaching ו- bioweathering של מינרלים, עפרות מתכת-מיסב. אמצעי מהיר, חסכוני וחזק באופן כמותי הערכת ייצור siderophore בדגימות מורכבות היא המפתח לזיהוי היבטים חשובים של ההשלכות האקולוגי של פעילות siderophore, כולל, הרומן siderophore בהפקת חיידקים. השיטה המוצגת כאן פותחה כדי להעריך את הפעילות siderophore של קהילות microbiome בטקט, בדגימות סביבתיים, כגון רקמות אדמה או צמח. הדגימות היו הומוגני, מדולל במדיום M9 ששונתה (ללא Fe), העשרה תרבויות היו הדגירה למשך 3 ימים. Siderophore ההפקה נאמד בדגימות ב 24, 48, 72 שעות (h) באמצעות microplate 96-ובכן הרומן של רשויות אישורים (כרום azurol sulphonate)-Fe אגר assay, עיבוד של השיטה באופן מסורתי מייגע ולגזול ערכי צבע מוחלטים של הערכת siderophore פעילות, המבוצעות על הפרט טיפח מבודד מיקרוביאלי. נוכל להחיל את השיטה שלנו 4 שונים אחרים/שורות של חיטה (חיטת הלחם ל'), כולל Lewjain, מדסן, ו PI561725 ו- PI561727 בדרך כלל גדל בצפון-מערב האוקיינוס השקט היבשה. Siderophore הייצור היה בבירור מושפע של גנוטיפ של חיטה, ובעוד סוגים ספציפיים של רקמות הצמח שנצפו. אנחנו משתמשים בהצלחה השיטה שלנו על המסך במהירות עבור השפעת הצמח גנוטיפ על ייצור siderophore, פונקציה מפתח במערכות אקולוגיות יבשתי ו הימית. שהפקנו משכפל טכניים רבים, מניב אמינים מאוד הבדלים סטטיסטיים בקרקעות ובתוך רקמות הצמח. חשוב לציין, התוצאות מציגות שהשיטה המוצעת ניתן לבחון במהירות siderophore ייצור בדגימות מורכבים עם רמה גבוהה של אמינות, באופן המאפשר קהילות להישמר לעבודה מאוחר יותר לזהות את taxa ואת הגנים פונקציונלי.
Introduction
Siderophores הם בעיקר מעורב ברזל-קלאציה הזמינות הביולוגית, אבל עם מגוון רחב של מטרות נוספות של מערכות אקולוגיות יבשתי ו הימית, החל quorum מיקרוביאלי חישה, איתות צמח חיידקים-המארחים, חשוב מולקולות קידום התפתחות הצמח, שיתוף פעולה ותחרות בתוך קהילות מיקרוביאלי מורכבים1,2. Siderophores יכולים להיות בהרחבה מסווגים לפי אתרים פעילים שלהם תכונות מבניות, יצירת מארבעה סוגים: carboxylate, hydroxamate, catecholate, מעורבבים סוגים3,4. מיקרואורגניזמים רבים מסוגלים מפריש יותר מסוג אחד של siderophore5 , בקהילות מורכבים, הרוב המכריע של אורגניזמים biosynthesize קולטני ממברנה כדי לאפשר את קליטת מגוון רחב אף יותר של siderophores1, 6. עבודה מצביע על כך siderophores הן חשוב במיוחד ברמה הקהילתית, אפילו התקשורת הבין-הממלכה, העברות biogeochemical7,8,9,10 ,11.
Chrome azurol sulphonate (CA) שימש במשך למעלה מ-30 שנה בתור חומר מכלט לקשור על ברזל (Fe) בצורה כזאת, כי תוספת של ליגנדים (קרי: siderophores) יכול לגרום דיסוציאציה במתחם קסטיאל-Fe, יצירת שינוי צבע קלות לזיהוי במדיום 12. כאשר רשויות אישורים מאוגד עם Fe לצבוע מופיע בצבע כחול אדמדם, כפי dissociates המתחם CAS-Fe, המדיום משנה את צבעו בהתאם לסוג של ליגנד להתרגל לנקות את Fe13. המדיום הראשונית, בנוזל נוסדה על ידי Schwyn, Neilands בשנת 1987, שונתה בדרכים רבות כדי להכיל שינוי מטרות מיקרוביאלי14, גדילה הרגלי מגבלות15, וכן מגוון של מתכות חוץ Fe, כולל אלומיניום, מנגן, קובלט, ניקל קדמיום, ליתיום, אבץ16, נחושת17ו אפילו ארסן18.
פתוגנים אנושיים רבים, כמו גם כמו צמח צמיחה קידום מיקרואורגניזמים (PGPM) זוהו אורגניזמים לייצר siderophore3,19,20, ו rhizosphere חשוב PGPM endophytic לעיתים קרובות מבחן חיובית עבור ייצור siderophore4. מבוסס-Fe נוזלי השיטה המסורתית כבר מותאם microtiter בדיקה של מבודד בטיפוח הפקה siderophore21. עם זאת, שיטות אלה אינם מזהים את החשיבות של הקהילה מיקרוביאלי בכללותה (microbiome), בשיתוף ורגולציה פוטנציאל הייצור siderophore קרקעות, צמח מערכות22. לכן, פיתחנו הערכה הקהילה ברמת תפוקה גבוהה של siderophore הפקה של סביבה נתונה, המבוססת על וזמינותו CAS מסורתי, אבל עם שכפול, קלות מדידה, אמינות של הדיר ב- microplate וזמינותו.
במחקר זה, מוצג assay CAS-Fe חסכונית, תפוקה גבוהה לגילוי siderophore הייצור כדי להעריך את העשרת siderophore הייצור מדגימות מורכבים (קרי, אדמת וצמח רקמת homogenates). Rhizosphere בתפזורת, באופן רופף מכורך ו בחוזקה מאוגד-אדמת (מבחינת איך האדמה קשורה השורש) התקבלו יחד עם התבואה, לירות, שורש רקמות ארבעה אחרים ברורים חיטה (חיטת הלחם ל'): Lewjain, מדסן, PI561725, ו PI561727. זה היה שיערו כי יסוד הבדלים אחרים חיטה יכול לגרום הבדלים גיוס ומיון של siderophore בהפקת קהילות. עניין מיוחד הוא ההבדל בין קהילות חיידקים הקשורים עם קו isogenic PI561725, אשר אלומיניום עמיד בפני תקלות כי הוא בעל ALMT1 (מופעל אלומיניום בנויים המשלח 1), בהשוואה עם האלומיניום רגיש PI561727 isogenic קו, אשר ברשותה אלומיניום שאינם מגיבים צורה של הגן, almt123,24,25,26. המטרה הראשית של המחקר הייתה לפתח שיטה פשוטה, מהירה באופן כמותי להעריך הייצור siderophore בתרבויות העשרה siderophore של סוגי מדגם מורכבים תוך שמירה על התרבויות לעבודה עתידית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: המיקום של אתר שדה: אוניברסיטת מדינת וושינגטון, צמח פתולוגיה החווה (46 ° 46'38.0 "N 117 ° 04'57.4" W). הזרעים נזרעו באמצעות עציץ מכני על אוקטובר 19, 2017. גנוטיפ חיטה כל ניטע ב- headrows, כ 1 מטר אחד מהשני כדי למנוע חפיפה של מערכת השורשים. צמח וקרקע נאספו ב אוגוסט 9, 2018, כאשר הצמחים היו מוכנים לקציר. הדגימות היו נאספים משכפל שלושה של ארבעה אחרים חיטה: PI561727, PI561725, מדסן, Lewjain.
1. הכנת ששונה M9 בינוני
- שימוש נה2PO4∙7H2O (12.8 g/200 מ"ל), ח'2PO4 (0.3 g של 200 מ"ל), NaCl (0.5 ג'י של 200 מ"ל), NH4ריאגנטים קלרנית (1 g של 20 מ"ל) כדי להכין את תמיסת מלח M9.
- השתמש 18 גרם MgSO4∙7H2O ב- 100 מ של מים יונים כפול (ddH2O) כדי להכין 0.75 מ' MgSO4∙7H2O.
- להפוך 1 מ' של ∙2H2CaCl2O על-ידי הוספת 14.7 גרם CaCl2∙2H2O עם 100 מ של ddH2O.
- הכינו את בופר על ידי המסת g 6.048 צינורות לתוך 156 מ של ddH2O עם ערבוב. להתאים את ה-pH ל 6.8 עם 5 M NaOH.
- להכין 20% גלוקוז (דקסטרוז מונוהידראט) על ידי המסת 20 גר' גלוקוז לתוך 100 מ של ddH2O.
- להכין פתרונות בנפרד אוטוקלב כל אך הגלוקוז. מסנן לעקר את תמיסת גלוקוז בנוסף למדיה M9 לאחר autoclaving (0.22 מיקרומטר).
- להכין המדיום M9 ששונה על-ידי ערבוב 156 מ של צינורות בופר, 40 מ של פתרון מלחי M9, μL 20 של פתרון2O ·2H2CaCl 266 μL של MgSO4·7H2O, מ 4 ל 20% גלוקוז פתרונות ביחד אבטחה הקבינט, באמצעות טכניקה סטרילי.
- לשימור M9 ששונה, לסגור את המיכל, מכסים ברדיד אלומיניום כדי להגן מפני UV, מקום ב 4 º C.
2. הכנת CAS-Fe-אגר בינוני
- חומצה לשטוף כל כלי זכוכית במ מ HCl/100 100 מ מ עב ס3 לפחות שעתיים לפני ניצול וזמינותו CAS.
- הכן של אלומיניום אפיה מלא בחול כיתה מעבדה, לכסות אותו ברדיד אלומיניום. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, להניח בצד.
- הכנת HDTMA (hexadecyltrimethylammonium ברומיד) על-ידי הוספת 0.0365 g 20 מ"ל ddH2O ולמקם את הפתרון ב 37 ° C כדי לקדם את solubilization.
- הכינו 10 מ מ HCl וצור 1 מ"מ FeCl3·6H2O באמצעות 10 מ מ HCl כמו הממס. להוסיף g 0.0302 של רשויות אישורים מ 25 ל- ddH2O תוך כדי לערבב בעדינות עם בר מערבבים מגנטי סטרילי. לאחר מכן הוסף 5 מ של 1 מ מ FeCl3·6H2O (ב- 10 מ מ HCl) 25 מ של רשויות אישורים פתרון תוך מערבבים בעדינות (את פתרון הופך כהה שצבעו שחור).
- לאט לאט להוסיף mL 20 של HDTMA פתרון תוך ערבוב בעדינות, לתוך הפתרון Fe-CAS (זה התשואות פתרון כחול כהה).
- הכינו את בופר על ידי המסת 15.12 גרם של צינורות לתוך 375 מ של ddH2O, עם ערבוב עדין. להתאים את ה-pH ל 6.8 עם 5 M NaOH. מוסיפים מים כדי להביא את אמצעי האחסון 450 מ. להוסיף 5 גר' agarose הפתרון. אוטוקלב הצינורות מאגר פתרון והפתרון CAS-Fe ב 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- להוסיף בזהירות מכלול של הפתרון CAS-Fe למכלול של המאגר צינורות ב אבטחה הקבינט, אחרי כל אחד מהם הוא בלוק.
- המקום הפתרון מעורב באמבט מים בטמפרטורה 50 º c
הערה: להכין טרי כל ריאגנטים במדיום CAS-Fe-אגר לפני כל assay, כמו אחסון לטווח ארוך תוצאות 50 ° C בכמות המשקעים של CAS-Fe מורכבים ולאחר קירור התוצאות במדיום הקרושה. - למקם את סירה ריאגנט עקר החול סטרילי אבטחה ארון חום עד 50 מעלות צלזיוס. להעביר את CAS-Fe-אגר את הסירה, אז µL 100 aliquot במהירות אל כל טוב ב microplate 96-ובכן ברור, שטוח התחתונה, סטרילי.
3. Pyoverdine/EDTA הכנה רגיל
- הכנה Pyoverdine
- להכין תקן pyoverdine μM 800 (תערובת של חומצה סוקסינית, 2 הידרוקסי glutaramide, וצורות succinaminde של pyoverdine – ראה טבלה של חומרים), בעבר מוכן בינוני M9 ששונה.
- לדלל את הפתרון הזה לתוך 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, ופתרונות μM 6.25.
- הכנת תקן EDTA
- להוסיף 0.594 גר' ניתרן ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA: C10H14N2נה2O8.2H2O), עד 500 מ"ל של מדיום M9 ששונה בעבר מוכן להכין 3200 μM EDTA סטנדרטי.
- זה הפתרון מדולל לתוך 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 ופתרונות μM 6.25.
- דור עיקול רגיל
- להוסיף 100 μL של כל ריכוז של pyoverdine ו- EDTA להפרדת בארות microplate 96-ובכן המכיל 100 μL CAS-Fe אגר בינוני. להפוך כפולים שכפולי טכני של ריכוז כל. כמו כן, להוסיף בארות ריק עם רק M9 (אין EDTA או pyoverdine).
- שימוש בקורא microplate, למדוד את ספיגת (ב 420 ננומטר ולאחר 665 ננומטר) לאחר דגירה 1, 6 ו- 24 h-22 ° C, ומדידות שימוש ספיגת כדי ליצור עקומות סטנדרטי.
הערה: עבור מדידות 420 ננומטר, לחסר ספיגת החסר מ ספיגת pyoverdine או בארות המכילה EDTA. עבור 665 ננומטר, לחסר ספיגת pyoverdine או EDTA המכיל בארות של ספיגת החסר. לאחר מכן, יומן10(מיקרומטר pyoverdine או EDTA) הוא הטיפש-נגד המדידות ספיגת. על מנת להקל על פענוח תוצאות המדגם, שתשמש את ספיגת ה-x, להיכנס10(מיקרומטר pyoverdine או EDTA) כמו ציר ה-y.
4. איסוף דגימות סביבתי: רקמות אדמה
- לשטוף את ציוד דגימה (אתים, מספריים) עם 0.22 מיקרומטר מסונן ddH2O ואחריו 70% אתנול, לנגב עם מגבות נייר לפני דגימה בין דגימות לשמור על סטרילי טכניקה ולהפחית את זיהום צולב.
- לסלק את רקמות הצמח (גרגרים ויורה) מצמחים בשדה, ומניחים אותם בתוך שקית אחסון מפלסטיק עם תוויות, להשאיר זיפים לירות מספיק על מנת להקל על עקירת דגימות אדמה ושורש הרצוי.
- חפירת של שורש קטן הכדור כ 15 ס מ עמוקה ו 23 ס מ ומניחים אותו בתוך שקית פלסטיק נפרדות, עם תוויות עבור הכנת הדוגמא בסביבת מעבדה. שלב זה דומה בשיטות של מקפירסון ואח27.
- במקום כל דוגמאות (גרגרים, יורה, האדמה בתפזורת ו שורש כדורי בשקיות נפרדות) ישירות על הקרח ולשמור ב 4 ° C עד דגימות יעובדו עבור וזמינותו ייצור siderophore.
- שורש נפרדים הקשורים דגימות. אדמה לתוך בצובר באופן רופף מכורך rhizosphere אדמה, אדמה בחוזקה מאוגד-rhizosphere.
- לקחת את הכדורים הבסיס מתוך התיקים. בעדינות לנער מהאדמה הכדור השורש. ניערתי מעליי באדמה, יחד עם האדמה שמאלה לתוך השקית כוללת את האדמה "בתפזורת".
- השתמש פטיש גומי כדי נוסף הסרת אדמה הכדור השורש. זוהי הקרקע באופן רופף מאוגד-rhizosphere.
- צור rhizosphere בחוזקה מכורך קרקע על-ידי לקיחת שורשים עם הדגימה בחוזקה מכורך מכניס אותם שפופרת צנטרפוגה. להוסיף 30 מ של ddH2O ו מערבולת זה ל 2-3 דקות. הסר את השורשים להשיג דילול slurry אדמת rhizosphere בחוזקה מאוגד.
5. הכנת siderophore העשרה תרבויות, CAS-Fe siderophore ייצור assay
הערה: כל כלי זכוכית צריך להיות חומצה נשטף לפני תחילת מבחני.
- הכנת הדוגמא אדמה (עבור כל אחד מסוגי דגימת קרקע שלוש)
- Homogenize כל מדגם קרקע בתוך השקית לדוגמה, על-ידי ערבוב והפעלת הקרקע ככל האפשר מבלי לפתוח את השקית.
הערה: זה מסייע להפחית את ההשתנות המרחבית קרקע טבעי, מתיישר עם אדמה רגילה דגימה הליכים. שיטות אחרות עשויים להיות מנוצל כדי homogenize דגימות איכות הסביבה, לפי הצורך, בהתאם לעיצוב הניסיונית. - לאחר כל מדגם היה מעורב באופן יסודי, aliquot להשעות 2.0 g כל אדמה ב 20 מיליליטר ששונה M9 בינוני, ואז לדלל 10-3 כדי הנפח הכולל של 20 מ בשפופרת צנטרפוגה סטרילי 50 מ עם פקק קצף סטרילי כדי לאפשר אוורור.
- לדוגמאות בחוזקה מכורך rhizosphere, להוסיף 2 מיליליטר slurry אדמת rhizosphere 20 מ של מדיום M9 ששונו ולאחר מכן לדלל 10-3 כדי הנפח הכולל של 20 מ בשפופרת צנטרפוגה סטרילי 50 מ עם פקק קצף סטרילי כדי לאפשר אוורור.
- Homogenize כל מדגם קרקע בתוך השקית לדוגמה, על-ידי ערבוב והפעלת הקרקע ככל האפשר מבלי לפתוח את השקית.
- הכנת הדוגמא (שורש, לירות, תבואה) רקמה
- משטח לעקר את הדגימה עם 70% אתנול. Macerate 2.0 גרם של רקמת טריים ב- 20 מ של מדיום M9 ששונתה באמצעות בלנדר-גבוהה למשך 30 שניות. להעביר את הדגימה שפופרת צנטרפוגה סטרילי 50 מ ל, ואז לדלל 10-3 כדי הנפח הכולל של 20 מ בשפופרת צנטרפוגה סטרילי 50 מ עם פקק קצף סטרילי כדי לאפשר אוורור.
- העשרה של Siderophore ייצור באמצעות הגבלה Fe
- דגירה 50 מ ל צינורות צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ומנערים ב 160 סיבובים לדקה.
6. CAS-Fe מבחני אגר לצורך זיהוי של siderophore ייצור בדגימות איכות הסביבה
- בגיל 24, 48, 72 שעות לאחר התרבות העשרה, להסיר 1 מ"ל subsamples מן הצינורות העשרה באמצעות סטרילי טכניקה צנטריפוגה ב 10,000 x g דקות 1 2 mL צינורות צנטריפוגה כדי pelletize את התאים.
- לאסוף את תגובת שיקוע מופרדים. שימוש סטרילי טכניקה, להוסיף 100 μL של תגובת שיקוע 100 פתרון μL של רשויות אישורים-Fe-אגר כפילויות או שהפקידים ב microplate. גם להוסיף 100 µL של אמצעי M9 סטרילי (ריקים). ואז דגירה את הצלחת ב 28 º C.
- להשעות את תגובת שיקוע הנותרים ואת גלולה עבור כל דגימה (לא הוסיף לצלחת microtiter) לתוך צינור צנטריפוגה משלו, mL 2 סטרילי. הוסף μL 400 של גליצרול סטרילי לתוך כל שפופרת מדגם-תגובת שיקוע, resuspend בגדר כדי ליצור גליצרול מניות. להקפיא את המניה ב- 80 ° C עבור בהמשך מנתח.
הערה: שלב זה יכול להיות שונה כדי ליצור גליצרול מניות לפי בכל פרוטוקול שבאתר המועדפת. - למדוד ספיגת ב 6, 24, 48, 72 h, 420 באורך גל של nm.
- השתמש רגיל עקומות שנוצרו pyoverdine או EDTA לפרש מדגם מדידות ספיגת מבחינת pyoverdine מקבילות.
הערה: Pyoverdine היה נחוש בדעתו להיות תקן מעולה בהשוואה עם EDTA (וידאו אינפרא), אז לא נעשה שימוש EDTA לפרש תוצאות במחקר הנוכחי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biosynthesized תערובת pyoverdine על ידי Pseudomonas fluorescens שימש תקן כדי לפענח ולכמת ספיגת (ב 420 ננומטר) של דגימות מבחינת pyoverdine מקבילות מיקרומטר איור 1 מציג את קשרי הגומלין בין ספיגת (420 ננומטר) מתחילה ריכוז של pyoverdine (molarity10 יומן ב מיקרומטר). EDTA לא סיפקו תקן נאותה כי דגימות הייצוגיים מדידות ספיגת גדול יותר מאשר היו השגה עם pyoverdine, R2 היה נמוך (איור 2). תוך כדי התחלתי לעבוד באמצעות וזמינותו CAS-Fe כשיטת siderophore ספיגת זיהוי נמדד ב- 630 ננומטר, במחקר הקשורים באמצעות שיטה דומה מאוד (CAS-Fe-אגר היה מעורב 1:1 עם M9 ששונה כדי ליצור עמודה 200 µL ב microplate), זה היה ציין כי ספיגת שיא היה 665 ננומטר, אבל זה 420 nm היה יותר לשחזור מבחינת שינויים ספיגת המושרה על ידי דגימות (איור 3).
Siderophore הייצור נצפתה בתרבויות העשרה של כל סוגי רקמות לאחר 72 h Fe-הפסדי העשרה ופעילות siderophore הופיע לייצב לאחר 48 שעות של דגירה (משלים איור 1). לפיכך, פעילות siderophore העשרת 72 h נאמד ב 48 שעות הדגירה כדי לקבוע את ההשפעה של סוג גנוטיפ ודגימת על בידוד siderophore (איור 4). פעילות Siderophore דגימות. אדמה בצובר היה נמוך יחסית, לא מוצגים ההבדלים בין גנוטיפ חיטה שממנו האדמה בתפזורת היתה שנדגמו (איור 4A). Enrichments מאוגדים באופן רופף אדמה מבודד של גנוטיפ PI561725 הציג הפקה siderophore גדולה יותר בהשוואה מאוגדים באופן רופף מהאדמה מדסן, PI561727, אבל לא Lewjain (איור 4B). Siderophore ייצור enrichments מן הקרקע בחוזקה מאוגד לא הושפע במידה רבה על ידי גנוטיפ (איור 4C).
העשרה תרבויות רקמת תבואה הניב siderophore נמוך יחסית הייצור בין גנוטיפ (איור 4D). Enrichments של רקמת לירות Lewjain היה ייצור siderophore נמוך משמעותית מאשר אחרים אחרים, וכתוצאה בתרביות רקמה לירות PI561725 siderophore משתנה יותר ייצור (איור 4E). פעילות Siderophore היה גדול יותר אצל בתרבויות העשרה רקמת השורש של PI561725 לעומת כל אחרים אחרים (איור 4F) יותר מ- 200%.
איור 1. ספיגת-420 nm ו 655 nm לנסיגה כנגד ריכוז log10 pyoverdine. (א) ספיגת-420 nm לנסיגה נגד הריכוז10 יומן של pyoverdine ב מיקרומטר. עיקול פולינום כשיר לקבל משוואה הסבר לטענה כי ספיגת מבחינת pyoverdine מקבילות. ספיגת (B)-665 ננומטר נסוגה מפני ביומן10 ריכוז pyoverdine מיקרומטר. R2 הוא הריבוע של מקדם המתאם פירסון, המשוואה מסביר את עקומת מצויד. נקודות הם העתקים של ספיגת מדידות-800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 ו- 6.25 מיקרומטר pyoverdine לאחר דגירה 6-אייץ '-28 מעלות צלזיוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. ספיגת-420 nm ו 655 nm לנסיגה נגד הריכוז log10 של EDTA. (א) ספיגת-420 nm לנסיגה נגד הריכוז10 יומן של EDTA ב מיקרומטר. עיקול פולינום כשיר לקבל משוואה הסבר לטענה כי ספיגת מבחינת pyoverdine מקבילות. ספיגת (B)-665 ננומטר נסוגה מפני ביומן10 ריכוז של EDTA מיקרומטר. R2 הוא הריבוע של מקדם המתאם פירסון, המשוואה מסביר את עקומת מצויד. נקודות הם העתקים של ספיגת מדידות-3200, 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 ו- EDTA מיקרומטר 6.25 לאחר דגירה 6-אייץ ' 28 ° C, ואת קווי שגיאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. ספיגת סריקות של nm 315−1000 של בארות microplate המכיל 200 µL טורים של 1:1 CAS-Fe-אגר ושינית M9 או M9 בינוני עם siderophore בהפקת דגימות. הצלחת, נדגרה ב 28 מעלות צלזיוס, במשך 72 שעות לפני מדידת ספיגת ב קורא microplate. ספיגת סריקות להראות החסר שלושה המכילה לא הדגימה (קווים שחורים) הניב עקומות באשכולות בחוזקה לשיא-665 ננומטר. ספיגת סורק הצג החסר שלושה המכיל siderophore בהפקת דגימות (קווים אפורים) הניב עקומות עם השתנות יותר, אבל עם ספיגת עקבית יותר-420 nm לעומת 665 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. Pyoverdine מקבילות בתרבויות העשרה siderophore. Pyoverdine מקבילות בתרבויות העשרה siderophore המשויך בתפזורת (A) (B) מחויב באופן רופף, ו (ג) הלחוצים באדמה, בתוך רקמת homogenates של חיטה חיטה (D) (E) יורה ו שורשים (F). Siderophore העשרה תרבויות היו מתפשט על 72 h לפני העברת subsamples microplate ו המקננת ב 28 º C. Siderophore ההפקה נאמד לאחר 48 שעות של דגירה עם כרום azurol ס אחרים/קווים הם לו = Lewjain, Mad = מדסן, 725 = PI561725, 727 = PI561727. כוכביות מייצג משמעות- alpha = 0.008 (לאחר תיקון Bonferroni). ברים הם סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים איור 1. Pyoverdine מקבילות לאורך זמן. Pyoverdine מקבילות בתרבויות העשרה siderophore העריכו לאחר 24, 48, 72 h של דגירה עם כרום azurol ס' Sderophore העשרה תרבויות הקשורות בתפזורת (A) (B) מחויב באופן רופף, (ג) הלחוצים באדמה, ו ב- homogenates רקמות של חיטה (D) יורה תבואה (E), שורשים (F). Siderophore העשרה תרבויות היו מתפשט על 72 h לפני העברת subsamples microplate ו המקננת ב 28 º C. subsampled כדי להעריך את הייצור siderophore כל timepoint. אחרים/קווים הם לו = Lewjain, Mad = מדסן, 725 = PI561725, 727 = PI561727. Siderophore ההפקה נאמד לאחר, 24, 48, 72 h של דגירה. ברים הם סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התוצאה העיקרית של עבודה זו הוא הייצור של מתודולוגיה חדשה זה יכול לשמש כדי להעשיר במהירות siderophore בהפקת חיידקים בעוד באופן כמותי מדידת siderophore ייצור/פעילות במדגם סביבתיים. המתודולוגיה היא מהירה, פשוטה וחסכונית, התוצאות מציגות כיצד זה יכול לשמש כדי לזהות פעילות siderophore של סוגי מדגם מורכבים ולא הרומן (למשל., אדמה וצמח רקמות). הפרוטוקול גם גורמת לייצור גליצרול מניות של התרבויות העשרה, אשר יכול בקלות לקחת בזמן כדי להכיל את המחקרים של שינויי מבנה הקהילה מיקרוביאלית ותפקוד במהלך Fe מחסור דרך ה-DNA או RNA המבוסס על טכניקות . אלו המעוניינים לבחון את קינטיקה של פעילות siderophore מחקרים אקולוגיים יכול גם סביר להניח תועלת בשיטה זו. התוצאות גם מראים כי pyoverdine מקבילות (pyoverdines הם siderophores חשוב מבחינת הסביבה28 ו רפואה29) מספק שיטה טובה באופן כמותי הערכת ייצור siderophore. ממצא חשוב הוא ספיגת את המידות-665 ננומטר לא מתאימים לקביעת פעילות siderophore לעומת אלו נצפו על 420 nm (איור 1). חשיבות מיוחדת היתה מציאת את ספיגת-665 ננומטר מרוכזים על פני מגוון רחב של ריכוז pyoverdine (Pyoverdine מיקרומטר = 50-800 מיקרומטר, יומן10(pyoverdine מיקרומטר) = 0.18-0.76), רומז תקרה זיהוי ובאורך הגל הזה (איור 1B)-יצוין בזמן pyoverdine היה תקן מעולה בהשוואה עם EDTA, גם הוא יקר, אז הוא הציע כי עבודה ראשוני מתבצע עם EDTA או אחרים chelators חסכונית כדי להבטיח את המתודולוגיה שולט בעבר יצירת סטנדרטים pyoverdine.
ישנם מספר שלבים קריטיים ברחבי הפרוטוקול הדורשים תשומת לב. ראשית, חשוב לשמור על כלי זכוכית ללא מתכות, משטיחים אחרים בכל מקום אפשרי בעת עבודה עם מתכות, במיוחד אלה הכרחי בריכוזים נמוכים, כמו Fe. שנית, כי תרבויות היו מועשרים לייצור siderophore באמצעות הגבלה Fe, חשוב לשמור על תנאים aseptic ברחבי זרימת העבודה כדי להפחית את ההשפעה של מזהמים סביבתיים. לבסוף, הכנת CAS-Fe-אגר דורש תשומת לב רבה לפרטים, צריך להיות מוכן כמו מקרוב תיאר ככל האפשר. למשל, אם הפתרון CAS-Fe-אגר נשמר חם אך לא משמש במהירות, לזרז CAS-Fe. בנוסף, זה חיוני כדי לחמם את CAS-Fe-אגר במהלך העברה כדי microplate... זה הושג באמצעות מחומם, סטרילי חול ו במהירות העברת המדיום microplate ב אבטחה ארון.
מגבלה אחת של המתודולוגיה זה בגלל כמה צמחים גם לייצר siderophores (phytosiderophores); אלה יכול לתרום siderophore נמדד פעילות בתרבויות העשרה של מפעל רקמה homogenates. כמו כן, היתה השתנות גבוהה יחסית תוצאות שדה משכפל, רומז שכפול נוסף יכול להיות מועיל מחקרים עתידיים. הגבלה נוספת של הטכניקה היא השיטה microplate הוא תפוקה גבוהה, לדוגמה איסוף ואילו ההכנה הם זמן רב. עדיין, כי microplate בודד יכול לשמש עבור דגימות 96 (כולל סטנדרטים), תשומות זמן ועלות נמצאים הרבה נמוך לעומת טכניקות הקיים. זה בעיקר כי קיימות שיטות אחרות להסתמך על ביצוע וזמינותו CAS-Fe פטרי30, אשר הם מטבעם פחות זמן ועלות יעיל להכין יותר microplate. בנוסף, מכיוון solubilized CAS-Fe מתחמי נוטים משקעים12, השיטה המוצעת באמצעות רשויות אישורים-Fe-אגר בינוני הוא שיטות נעלה בנוזל, אשר יש גם להיות מותאם לתבנית 96-ובכן.
מבחינת הממצאים שדווחה, נתון כי ההבדל העיקרי בין PI561725 לבין PI561727 היא הנוכחות של ALMT1 לעומת.almt1, בהתאמה, להתוצאות מציע את הנוכחות של תוצאות סביר להניח ALMT1 בבחירה של קהילות מיקרוביאלי המפעל והן את האדמה אשר יש פוטנציאל גדול לייצור siderophore, כמו הערכה באמצעות העשרה תרבויות. בעבודתה העתידית צריכה להמשיך לחקור את התופעה באמצעות מספר גדול יותר של משכפל, במיוחד כדי להבהיר אם הנוכחות של ALMT1 בוחר באופן ספציפי לפעילות siderophore משופר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות Muhunthan קאליאני לסיוע תהליכי מעבדה, Opdahl לי על חיטה גנוטיפ קציר, המועצה למחקר עינב מדינת וושינגטון ו המרכז האוניברסיטאי של מדינת וושינגטון לחקלאות הסדירה ו משאבים טבעיים עבור BIOAg להעניק תמיכה עבודה זו. מימון נוסף סופק על ידי משרד החקלאות/NIFA דרך פתח פרוייקט 1014527.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
References
- Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities. Nature Communications. 8, (2017).
- Ghirardi, S., et al. Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads. Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. L. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Saha, M., et al. Microbial siderophores and their potential applications: a review. Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).
- Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).
- Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from 'Concord' Grape Vineyards. Microbial Ecology. , Accepted (2018).
- Li, S. S., et al. The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway. Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).
- Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- O'Brien, S., Fothergill, J. L. The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung. Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).
- Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa. Current Biology. 28 (13), (2018).
- Popat, R., et al. Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago. Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).
- Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad. Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).
- Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection. Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).
- Nakouti, I., Hobbs, G. A new approach to studying ion uptake by actinomycetes. Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).
- Wang, L. J., et al. Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus. Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).
- Retamal-Morales, G., et al. Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay. Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).
- Desai, A., Archana, G. Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).
- Dertz, E. A., Raymond, K. N. Comprehensive coordination chemistry II. Que, L., Tolman, W. B. 8, Elsevier, Ltd. (2003).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7, 9 (2017).
- Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes. Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).
- Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux. Planta. 238 (4), 657-668 (2013).
- Sasaki, T., et al. A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter. The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).
- Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars. Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).
- Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation. Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).
- McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).
- Mirleau, P., et al. Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake. FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection. Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
