Høy gjennomstrømming Siderophore Screening fra miljøprøver: plante vev, Bulk jord og Rhizosphere jord
Summary
Vi presenterer en protokoll for rask screening av miljøprøver for siderophore potensielle bidra til micronutrient bioavailability og omsetning i terrestriske systemer.
Abstract
Siderophores (lav-molekylær vekt metall chelaterande forbindelser) er viktige i ulike økologiske fenomenet fra iron (Fe) biogeochemical sykling i jord, patogen konkurranse, plante vekst forfremmelse og kryss-rike signalering. Videre er siderophores også av kommersiell interesse i bioleaching og bioweathering av metall-bærende mineraler og malm. En rask, kostnadseffektiv og robust betyr kvantitativt vurdere siderophore produksjon i komplekse eksempler er nøkkelen til å identifisere viktige aspekter av de økologiske konsekvensene av siderophore aktivitet, inkludert, Roman siderophore produsere mikrober. Metoden som presenteres her er utviklet for å vurdere siderophore aktivitet av inne-takt microbiome samfunn, i miljøprøver, som jord eller plante vev. Prøvene ble homogenisert og fortynnet i en endret M9 medium (uten Fe) og berikelse kulturer ble inkubert for 3 dager. Siderophore produksjon ble vurdert i eksempler på 24, 48 og 72 timer (h) med en roman 96-brønnen microplate CAS (Chrome azurol sulphonate)-Fe agar analysen, en tilpasning av tradisjonelt kjedelig og tidkrevende kolorimetrisk metoden vurdere siderophore aktivitet, på enkelte dyrket mikrobiell isolater. Vi brukt vår metode til 4 forskjellige genotyper/linjer hvete (Triticum aestivum L.), inkludert Lewjain, Madsen, og PI561725 og PI561727 vanligvis dyrkes i innlands Pacific Northwest. Siderophore produksjon var tydelig påvirket av genotype hvete, og i bestemte typer anlegg vev observert. Vi brukt vår metode å raskt skjermen for påvirkning av anlegget genotype på siderophore produksjon, en viktig funksjon i terrestriske og akvatiske økosystemer. Vi produserte mange tekniske gjentak, gir svært pålitelig statistiske forskjeller i jord og plante vev. Viktigst, viser resultatene den foreslåtte metoden kan brukes til å raskt undersøke siderophore produksjon i komplekse prøver med en høy grad av pålitelighet, på en måte som tillater samfunn skal bevares for senere arbeid for å identifisere taxa og funksjonelle gener.
Introduction
Siderophores er viktig biomolecules involvert i jern-chelation for biotilgjengelighet, men med en lang rekke flere formål i terrestriske og akvatiske økosystemer fra mikrobiell quorum sensing, signalisering til microbial plante-verter, plante vekst forfremmelse, samarbeid og konkurranse innen komplekse mikrobielle samfunn1,2. Siderophores kan grovt klassifiseres i henhold til deres aktive nettsteder og strukturfunksjonene, opprette fire hovedtyper: carboxylate, hydroxamate, catecholate, og blandet typer3,4. Mange mikroorganismer kan skiller ut mer enn én type siderophore5 og komplekse samfunn, et stort flertall av organismer biosynthesize membran reseptorer slik at opptaket av enda større valgmulighet siderophores1, 6. Nyere arbeid indikerer at siderophores er spesielt viktig i samfunnsnivå, og selv i mellom Storbritannia kommunikasjon og biogeochemical transport7,8,9,10 ,11.
Chrome azurol sulphonate (CAS) har blitt brukt i over 30 år som chelaterande agent binde iron (Fe) slik at tillegg av ligander (dvs. siderophores) kan resultere i av CAS-Fe komplekset, å skape en lett identifiserbare fargeendring i medium 12. Når the CAS er bundet med Fe fargestoff vises som en royal blå farge og som CAS-Fe komplekset dissociates, mediet endrer farge i henhold til ligand brukes åtseleter Fe13. Den første, vannbasert mediet etablert av Schwyn og Neilands i 1987, er endret på mange måter å imøtekomme endre mikrobiell mål14, vekst vaner og begrensninger15, samt en rekke metaller foruten Fe, inkludert aluminium, mangan, kobolt, nikkel kadmium, litium, sink16, kobber17og selv arsen18.
Mange menneskelige patogener, så vel som anlegg veksten fremme mikroorganismer (PGPM) har blitt identifisert som siderophore-produserende organismer3,19,20, og viktige rhizosphere og endophytic PGPM ofte test positiv for siderophore-produksjon4. Den tradisjonelle Fe-baserte flytende metoden er tilpasset å være ferdig innen testing av isolerer i dyrking for siderophore produksjon21. Imidlertid mislykkes disse teknikkene å anerkjenne betydningen av mikrobielle samfunnet som helhet (microbiome), i samarbeid og potensielle regulering av siderophore produksjon i jord og plante systemer22. Derfor har vi utviklet en høy gjennomstrømming fellesskapet nivå vurdering av siderophore produksjon fra et gitt miljø, basert på tradisjonell CAS analysen, men med replikering, måling, pålitelighet og repeatability i en microplate analysen.
I denne studien er en kostnadseffektiv, høy gjennomstrømming CAS-Fe analysen for å oppdage siderophore produksjon presentert for å vurdere anriking av siderophore produksjon fra komplekse eksempler (dvs. jord og plante vev homogenates). Bulk, løst-bundet og tett-bundet rhizosphere jord (i form av hvordan jord var bundet til roten) ble innhentet korn, skyte og rot vev fra fire forskjellige hvete (Triticum aestivum L.) genotyper: Lewjain, Madsen, PI561725, og PI561727. Var hypotesen at grunnleggende forskjeller i hvete genotyper kan resultere i forskjeller i rekruttering og utvelgelse av siderophore produsere samfunn. Av spesiell interesse er forskjellen mellom mikrobielle samfunn forbundet med PI561725 isogenic linjen er aluminium tolerant fordi det har ALMT1 (aluminium-aktivert Malate Transporter 1), sammenlignet med aluminium sensitive PI561727 isogenic linje, som besitter en ikke-aluminium mottakelig form av genet, almt123,24,25,26. Det viktigste målet for studien var å utvikle en enkel, rask metode kvantitativt vurdere siderophore produksjon i siderophore berikelse kulturer av komplekse utvalg samtidig bevare kulturene for fremtiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Primære resultatet av dette arbeidet er produksjon av en ny metode som kan brukes til å raskt berike for siderophore produsere mikrober mens kvantitativt måle siderophore produksjon/aktivitet i miljømessige utvalget. Metodene er rask, enkel og kostnadseffektiv, og resultatene viser hvordan den kan brukes til å oppdage siderophore aktivitet fra komplekse og romanen typer (f.eks., jord og plante vev). Protokollen resulterer også i produksjonen av glyserol aksjer av berikelse kulturer, som kan lett bli tatt g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Kalyani Muhunthan for assistanse i laboratorium prosedyrer, Lee Opdahl for hvete genotype høsting, Washington State Concord drue forskningsråd og Washington State University Center for opprettholde landbruk og Naturressurser for en BIOAg gi for å støtte dette arbeidet. Ekstra midler ble gitt av USDA/NIFA gjennom Luke prosjekt 1014527.
Materials
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
References
- Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities. Nature Communications. 8, (2017).
- Ghirardi, S., et al. Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads. Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. L. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Saha, M., et al. Microbial siderophores and their potential applications: a review. Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).
- Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).
- Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from 'Concord' Grape Vineyards. Microbial Ecology. , (2018).
- Li, S. S., et al. The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway. Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).
- Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- O’Brien, S., Fothergill, J. L. The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung. Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).
- Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa. Current Biology. 28 (13), (2018).
- Popat, R., et al. Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago. Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).
- Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad. Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).
- Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection. Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).
- Nakouti, I., Hobbs, G. A new approach to studying ion uptake by actinomycetes. Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).
- Wang, L. J., et al. Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus. Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).
- Retamal-Morales, G., et al. Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay. Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).
- Desai, A., Archana, G. . Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).
- Dertz, E. A., Raymond, K. N., Que, L., Tolman, W. B. . Comprehensive coordination chemistry II. 8, (2003).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7, 9 (2017).
- Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes. Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).
- Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux. Planta. 238 (4), 657-668 (2013).
- Sasaki, T., et al. A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter. The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).
- Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars. Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).
- Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation. Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).
- McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).
- Mirleau, P., et al. Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake. FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection. Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
