Summary
Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für die schnelle Screening von Umweltproben für Siderophore Potenzial zur Mikronährstoff-Bioverfügbarkeit und Umsatz in den terrestrischen Systemen.
Abstract
Siderophores (niedermolekulare Gewicht Metall chelatisierenden Verbindungen) sind in verschiedenen ökologischen Phänomen von Eisen (Fe) in Böden, für den Erreger Wettbewerb, Pflanze Wachstumsförderung und Kreuz-Königreich Signalisierung biogeochemische Radfahren wichtig. Darüber hinaus sind Siderophores auch kommerzielles Interesse an Feldversuchen und Bioweathering von Metall-Lager Mineralien und Erze. Eine schnelle, kostengünstige und robuste Mittel Siderophore Produktion in komplexen Proben quantitativ zu bewerten ist der Schlüssel zur Identifizierung von wichtigen Aspekte der ökologischen Auswirkungen von Siderophore Aktivitäten, einschließlich, neuartige Siderophore Mikroben produziert. Die hier vorgestellte Methode wurde entwickelt, um Siderophore Aktivität in Takt Microbiome Gemeinschaften in Umweltproben wie Boden- oder Gewebe zu beurteilen. Die Proben wurden homogenisiert verdünnt in einem modifizierten M9 Medium (ohne Fe) und Anreicherungskulturen waren für 3 Tage inkubiert. Siderophore Produktion wurde in Proben in 24, 48 und 72 Stunden (h) mit einem neuartigen 96-Well Mikrotestplatte CAS (Chrom Azurol Sulphonate) bewertet-Fe-Agar-Assay, eine Anpassung der die traditionell mühsam und zeitaufwändig farbmetrischen Methode zur Beurteilung der Siderophore Aktivitäten in einzelnen kultivierten mikrobielle Isolate. Unsere Methode, um 4 verschiedene Genotypen/Linien von Weizen (Triticum Aestivum L.), einschließlich Lewjain, Madsen, und PI561725 und PI561727, die häufig in der Binnenschifffahrt Pacific Northwest angebaut haben wir angewendet. Siderophore Produktion wurde das Erbgut des Weizens und in bestimmten Arten von Pflanzengewebe beobachtet deutlich beeinflusst. Wir verwendet erfolgreich unsere Methode schnell auf den Bildschirm für die Beeinflussung der Pflanze Genotyp Siderophore Produktion, eine Schlüsselfunktion in terrestrischen und aquatischen Ökosystemen. Wir produziert viele technische Wiederholungen, sehr zuverlässigen statistischen Unterschiede in Böden und im Pflanzengewebe nachgeben. Wichtig ist, zeigen die Ergebnisse, dass die vorgeschlagene Methode lässt sich schnell Siderophore Produktion in komplexen Proben mit einem hohen Maß an Zuverlässigkeit, in einer Art und Weise zu untersuchen, die Gemeinden für die spätere Arbeit Taxa und funktionelle Gene identifizieren bewahrt werden können.
Introduction
Siderophores sind wichtige Biomoleküle in erster Linie im Eisen-Chelat für Bioverfügbarkeit, aber mit einer Vielzahl von zusätzlichen Zwecke in terrestrischen und aquatischen Ökosystemen von mikrobiellen Quorum sensing, Signalisierung, mikrobielle Pflanze-Hosts, Pflanzen Sie, Wachstumsförderung, Kooperation und Wettbewerb innerhalb komplexer mikrobieller Gemeinschaften1,2. Siderophores können grob unterteilt werden entsprechend ihrer aktiven Zentren und Strukturmerkmale, Erstellen von vier Grundtypen: Carboxylat, Hydroxamate, Catecholate, und gemischte Typen3,4. Viele Mikroorganismen sind in der Lage, die Ausscheidung über mehrere Typen von Siderophore5 und in komplexen Gemeinschaften, eine große Mehrheit der Organismen Biosynthese Membranrezeptoren um die Aufnahme eine noch breitere Palette von Siderophores1zu ermöglichen, 6. Aktuelle Arbeit zeigt, dass Siderophores besonders wichtig auf Gemeinschaftsebene und sogar in Inter Königreich Kommunikations- und biogeochemischen Transfer7,8,9,10 ,11.
Chrom Azurol Sulphonate (CAS) hat seit über 30 Jahren als ein Chelatbildner verwendet worden, um Eisen (Fe) zu binden dergestalt, dass Zusatz von Liganden (z. B. Siderophores) Dissoziation des CAS-Fe-komplexes, erstellen eine leicht erkennbare Farbe Veränderung in das Medium führen kann 12. wenn die CAS mit Fe gebunden ist, der Farbstoff erscheint als eine Farbe Königsblau und wie der CAS-Fe-Komplex dissoziiert, das Medium verfärbt sich nach der Art der Liganden verwendet, um die Fe-13aufräumen. Das anfängliche, Liquid-basierter Medium von Schwyn und Neilands gegründet 1987, modifiziert, in vielerlei Hinsicht zu beherbergen, wechselnde mikrobielle Ziele14, Wachstum Gewohnheiten und Einschränkungen15sowie einer Vielzahl von Metallen neben Fe, einschließlich Aluminium, Mangan, Kobalt, Nickel Cadmium, Lithium, Zink16, Kupfer17und sogar Arsen18.
Viele menschliche Krankheitserreger, sowie als Wachstum fördert Mikroorganismen (PGPM) Pflanzen wurden identifiziert als Siderophore produzierenden Organismen3,19,20, und wichtige Rhizosphäre und endophytische PGPM oft testen positiv für die Siderophore-Produktion4. Die traditionelle Fe-basierte Flüssigkeit Methode wurde angepasst Mikrotiter-Isolate in der Bearbeitung für Siderophore Produktion21testen. Aber nicht diese Techniken, die Bedeutung der mikrobiellen Gemeinschaft als Ganzes (das Mikrobiom), in Zusammenarbeit und mögliche Regulierung der Siderophore Produktion in Böden und Pflanzen Systeme22zu erkennen. Aus diesem Grund haben wir eine Hochdurchsatz-Gemeinschaftsebene Bewertung der Siderophore Produktion von einer bestimmten Umgebung, basierend auf der traditionellen CAS-Assay, aber mit Replikation, Benutzerfreundlichkeit, Zuverlässigkeit und Wiederholbarkeit in einer Mikrotestplatte entwickelt. Assay.
In dieser Studie wird ein kostengünstiger, Hochdurchsatz-CAS-Fe-Assay zur Erkennung von Siderophore Produktion präsentiert, um die Bereicherung der Siderophore Produktion von komplexen Proben (z.B. Boden und Pflanze Gewebe Homogenates) zu bewerten. Bulk, locker gebunden und fest gebundene Rhizosphäre Boden (in Bezug auf wie der Boden um den Stamm gebunden war) wurden zusammen mit Korn, schießen und Wurzel Gewebe aus vier unterschiedlichen Weizen (Triticum Aestivum L.) Genotypen erhalten: Lewjain, Madsen, PI561725, und PI561727. Es wurde vermutet, dass grundlegende Unterschiede in der Weizen-Genotypen zu Unterschieden bei der Rekrutierung und Auswahl von Siderophore produzieren Gemeinschaften führen könnte. Von besonderem Interesse ist der Unterschied zwischen mikrobieller Gemeinschaften verbunden mit der PI561725 isogene Linie Aluminium tolerant, ist da sie ALMT1 (Aluminium-aktivierte Malat Transporter 1) besitzt, mit dem Aluminium im Vergleich empfindliche PI561727 isogenen Linie, die eine nicht-Aluminium ansprechende Form des Gens, almt123,24,25,26besitzt. Das Hauptziel der Studie war es, eine einfache und schnelle Methode quantitativ bewerten Siderophore Produktion in Siderophore Anreicherungskulturen von komplexen Probentypen unter Beibehaltung der Kulturen für die künftige Arbeit zu entwickeln.
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Protocol
Hinweis: Speicherort der Wiese: Washington State University, Pflanze Pathologie Bauernhof (46 ° 46' 38,0" N 117 ° 04' 57,4" W). Die Aussaat der Samen wurden mit einem mechanischen Pflanzer auf 19. Oktober 2017. Jedes Weizen Genotyp wurde in Headrows, ca. 1 Meter auseinander, vermeiden überlappende Wurzelsystem gepflanzt. Pflanzen-und Bodenproben wurden am 9. August 2018, gesammelt als Pflanzen zur Ernte bereit waren. Proben wurden von drei Wiederholungen von vier Weizen Genotypen gesammelt: PI561727, PI561725, Madsen, Lewjain.
1. Vorbereitung des modifizierten M9 medium
- Verwendung Na2PO4∙7H2O (12,8 g/200 mL), KH2PO4 (0,3 g/200 mL), NaCl (0,5 g/200 mL) und NH4Cl (1 g/20 mL) Reagenzien, die M9 Salzlösung vorzubereiten.
- Verwenden Sie 18 g MgSO4∙7H2O in 100 mL doppelte entionisiertem Wasser (DdH2O), um 0,75 M MgSO4∙7H2O. vorbereiten
- Machen Sie 1 M CaCl2∙2H2O durch Zugabe von 14,7 g CaCl2∙2H2O 100 ml DdH2O.
- Vorbereiten der Pufferlösung durch 6,048 g von Rohren in 156 mL DdH2O unter Rühren auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 mit 5 M NaOH.
- Bereiten Sie 20 % Glukose (Traubenzucker-Monohydrat vor) durch Auflösen von 20 g Glucose in 100 mL DdH2O.
- Bereiten Sie Lösungen und individuell Autoklav alle aber die Glukose. Filter zu sterilisieren die Glukoselösung für zusätzlich zu den M9-Medien nach dem Autoklavieren (0,22 µm).
- Bereiten Sie das modifizierte M9 Medium durch Mischen 156 mL Pufferlösung Rohre, 40 mL der M9 Salze Lösung, 20 μL CaCl2·2H2O Lösung, 266 μL MgSO4·7H2O und 4 mL 20 % Glukose-Lösungen zusammen in die biologische Sicherheit Schrank, mit steriler Technik.
- Für die Erhaltung der modifizierten M9 Verschließen der Behälter, Deckel mit Alu-Folie zum Schutz vor UV, und platzieren Sie bei 4 ° c
2. Vorbereitung des CAS-Fe-Agar medium
- Säure waschen alle Glaswaren in 100 mM HCl/100 mM Druckaufschluss3 für mindestens 2 Stunden vor der Verwendung in der CAS-Assay.
- Bereiten Sie eine Aluminium-Backform mit Labor Grade Sand gefüllt und mit Alufolie abdecken. Autoklaven bei 121 ° C für 30 min und beiseite.
- Bereiten Sie HDTMA (Hexadecyltrimethylammonium Bromid vor), indem Sie 20 mL DdH2O 0,0365 g hinzufügen und legen Sie die Lösung bei 37 ° C, Solubilisierung zu fördern.
- Bereiten Sie 10 mM HCl und generieren Sie 1 mM FeCl3·6H2O mit 10 mM HCl als Lösungsmittel zu. 25 mL DdH2O fügen Sie 0,0302 g CAS Rühren sanft mit einem sterilen magnetische Rühren hinzu. Fügen Sie 5 mL 1 mm FeCl3·6H2O (in 10 mM HCl) auf 25 mL CAS-Lösung, während Sie weiterhin vorsichtig umrühren (die Lösung verwandelt sich in dunkle rötliche Farbe schwarz).
- Fügen Sie 20 mL HDTMA Lösung langsam unter Rühren sanft in die Fe-CAS-Lösung (Dies ergibt eine dunkele blaue Lösung hinzu)
- Vorbereiten der Pufferlösung durch 15,12 g von Rohren in 375 mL DdH2O, mit sanften Rühren auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 mit 5 M NaOH. Fügen Sie Wasser hinzu, um das Volumen zu 450 mL bringen. 5 g Agarose der Projektmappe hinzufügen. Autoklaven der Rohre Puffer Lösung und die CAS-Fe-Lösung bei 121 ° C für 30 Minuten.
- Fügen Sie die Gesamtheit der CAS-Fe-Lösung sorgfältig nach jeder von ihnen autoklaviert ist auf die Gesamtheit des Puffers Rohre in die Biosicherheit Schrank hinzu.
- Legen Sie die gemischte Lösung in einem Wasserbad bei 50 ° C.
Hinweis: Frisch bereiten Sie alle Reagenzien im CAS-Fe-Agar Medium vor jedem Assay als langfristige Lagerung bei 50 ° C Ergebnisse der Niederschläge der CAS-Fe komplex und Kühlung führt zu erstarrten Medium. - Legen Sie eine sterile Reagenz-Boot in der sterilen Sand in die Biosicherheit Kabinett und Hitze bis 50 ° C. Übertragen Sie die CAS-Fe-Agar auf das Boot dann schnell aliquoten 100 µL in jede Vertiefung in einer klaren, flach-Boden, sterile 96-Well Mikrotestplatte.
(3) Pyoverdine/EDTA standard Vorbereitung
- Pyoverdine Vorbereitung
- Bereiten Sie 800 μM Pyoverdine Standard (Mischung von Bernsteinsäure, 2-hydroxy-Glutaramide und Succinaminde Formen der Pyoverdine – siehe Tabelle der Materialien), in vorbereitete modifizierte M9 Medium.
- Verdünnen Sie diese Lösung in 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 und 6,25 μM Lösungen.
- EDTA-standard-Vorbereitung
- Fügen Sie 0,594 g Binatrium Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA: C10H14N2Na2O8.2h2O), bis 500 mL vorbereitete modifizierte M9 Mittel-bis 3200 μM EDTA Standard vorbereiten.
- Verdünnen Sie diese Lösung in 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 und 6,25 μM Lösungen.
- Standardkurve generation
- Fügen Sie 100 μL jeder Konzentration von Pyoverdine und EDTA, Brunnen von einer 96-Well Mikrotestplatte mit 100 μL der CAS-Fe Agar Medium zu trennen. Doppelte technische Replikationen von jeder Konzentration zu machen. Auch fügen Sie leere Brunnen mit nur M9 (kein EDTA oder Pyoverdine).
- Messen Sie mit einer Mikrotestplatte Leser, Extinktion (bei 420 nm und 665 nm) nach 1, 6 und 24 h Inkubation bei 22 ° C und Nutzung Extinktion Messungen Standardkurven zu generieren.
Hinweis: Bei 420 nm Messungen, subtrahieren Sie Extinktion der Rohlinge aus der Absorption von Pyoverdine oder EDTA mit Brunnen. Für 665 nm, subtrahieren Extinktion von Pyoverdine oder EDTA mit Brunnen aus Absorption von Rohlingen. Dann ist Log10(µM Pyoverdine oder EDTA) gegen die Absorption Maße zurückgebildet. Zur Vereinfachung der Probenergebnisse zu interpretieren verwenden Sie Extinktion als x-Achse und melden Sie10(µM Pyoverdine oder EDTA) als die y-Achse.
4. Erhebung von Umweltproben: Boden und pflanzlichen Geweben
- Waschen Sie Probenahmegeräte (Schaufeln und Schere) mit 0,22 µm filtriert DdH2O gefolgt von 70 % igem Ethanol und wischen Sie mit Papierhandtücher vor der Probenahme und dazwischen Proben zu pflegen sterilen Technik und reduzieren Cross-Kontamination.
- Verbrauchsteuern Sie Pflanzengewebe (Körner und Triebe) von Pflanzen auf dem Feld, und legen Sie sie in einer beschrifteten Kunststoff Aufbewahrungstasche, genug schießen Stoppeln zur einfachen Entwurzelung der gewünschten Boden und Wurzel Proben zu verlassen.
- Graben Sie, eine kleine Wurzel Kugel ca. 15 cm tief und 23 cm breit und legen Sie sie in einer separaten, beschriftete Plastiktüte für die Probenvorbereitung in der Laborumgebung. Dieser Schritt ist ähnlich wie die Methoden der McPherson Et Al.27.
- Alle Proben (Getreide, Triebe, loser Schüttung Boden und Wurzelballen in getrennten Beuteln) direkt auf dem Eis und bei 4 ° C bis Proben für die Siderophore Produktion Assay verarbeitet werden.
- Separate Wurzel verbundenen Bodenproben in loser Schüttung, locker gebundenen Rhizosphäre Boden und fest gebundene Rhizosphäre Boden.
- Nehmen Sie die Wurzelballen aus den Taschen. Sanft schüttelt Erde aus dem Wurzelballen. Abgeschüttelt Boden, zusammen mit der Erde umfasst Links in der Tasche "Bulk" Boden.
- Verwenden Sie einen Gummihammer, um weitere Erde aus dem Wurzelballen zu entfernen. Dies ist der Boden locker gebundenen Rhizosphäre.
- Fest gebundene Rhizosphäre Boden durch die Wurzeln mit der Probe fest gebunden und setzen sie in ein Zentrifugenröhrchen zu generieren. Geben Sie 30 mL DdH2O und Wirbel es für 2-3 Minuten. Entfernen Sie die Wurzeln um die eng gebundenen Rhizosphäre Boden Gülle Verdünnung zu erhalten.
5. Vorbereitung der Siderophore Anreicherungskulturen und CAS-Fe Siderophore Produktion assay
Hinweis: Alle Gläser sollte Säure gewaschen vor Beginn der Tests.
- Boden-Probenvorbereitung (für jede der drei Bodenarten Probe)
- Jeder Bodenprobe innerhalb der Beutel durch das Mischen und drehen den Boden so weit wie möglich ohne Öffnen des Beutels zu homogenisieren.
Hinweis: Dies verringert die natürliche Erde räumliche Variabilität und deckt sich mit normalen Boden Stichprobenverfahren. Andere Methoden können genutzt werden, um Umweltproben, je nach Bedarf und je nach Versuchsanordnung zu homogenisieren. - Nach jeder Probe wurde gründlich gemischt, aliquoten und 2,0 g von jeder Boden in 20 mL modifizierte M9 Medium aussetzen, dann verdünnen Sie 10-3 auf ein Gesamtvolumen von 20 mL in einem sterilen 50 mL Zentrifugenröhrchen mit einem sterilen Schaum-Stecker zur Belüftung zu ermöglichen.
- Für eng gebundenen Rhizosphäre Proben 20 mL modifizierte M9 Medium fügen Sie 2 mL der Rhizosphäre Boden Brei hinzu, dann verdünnen Sie 10-3 auf ein Gesamtvolumen von 20 mL in einem sterilen 50 mL Zentrifugenröhrchen mit einem sterilen Schaum-Stecker zur Belüftung zu ermöglichen.
- Jeder Bodenprobe innerhalb der Beutel durch das Mischen und drehen den Boden so weit wie möglich ohne Öffnen des Beutels zu homogenisieren.
- Vorbereitung der Gewebe-Probe (Wurzel, schießen und Korn)
- Oberfläche die Probe mit 70 % Ethanol zu sterilisieren. Mazerat 2,0 g des frischen Gewebe in 20 mL modifizierte M9 Medium mit einem Mixer auf hoch für 30 Sekunden. Übertragen Sie die Probe auf einem sterilen 50 mL Zentrifugenröhrchen, dann verdünnen Sie 10-3 auf ein Gesamtvolumen von 20 mL in einem sterilen 50 mL Zentrifugenröhrchen mit einem sterilen Schaum-Stecker zur Belüftung zu ermöglichen.
- Bereicherung der Siderophore Produktion durch Fe-Beschränkung
- 50 mL Zentrifuge Rohre bei Raumtemperatur inkubieren und bei 160 u/min schütteln.
(6) CAS-Fe-Agar-Assays für die Erkennung der Siderophore Produktion in Umweltproben
- 1 mL Teilproben Entferne am 24, 48 und 72 h nach der Einleitung der Bereicherung Kultur aus der Anreicherung Rohre mit steriler Technik und Zentrifuge bei 10.000 x g für 1 min in 2 mL Zentrifuge Röhren um die Zellen zu granulieren.
- Sammeln Sie die getrennten überstand. Mit steriler Technik 100 μl des Überstands zu 100 μl Lösung von CAS-Fe-Agar in doppelt oder dreifach in die Mikrotestplatte hinzufügen. Auch Agrega 100 µL steriler M9 Medium (Leerzeichen). Dann die Platte bei 28 ° c inkubieren
- Aussetzen Sie die restlichen überstand und Pellet für jede Probe (nicht hinzugefügt Mikrotiterplatte) in eine eigene, steril 2 mL Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 400 μl steriler Glycerin in jeder Probe überstand Rohr und Aufschwemmen der Pellet um Glycerin Bestände zu erstellen. Frieren Sie die Aktie bei-80 ° C für spätere Analysen.
Hinweis: Dieser Schritt kann geändert werden, um Glycerin Vorräte nach bevorzugte interne Protokoll zu generieren. - Messung der Extinktion bei 6, 24, 48 und 72 h bei 420 nm Wellenlänge.
- Verwenden Sie Standardkurven erstellt von Pyoverdine oder EDTA Extinktion Probemessungen in Form von Pyoverdine äquivalenten zu interpretieren.
Hinweis: Pyoverdine war entschlossen, einen gehobenen Standard im Vergleich mit EDTA (vide infra), so dass EDTA nicht verwendet wurde, um die Ergebnisse in der aktuellen Studie zu interpretieren.
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Representative Results
Eine Pyoverdine Mischung Biosynthesized durch Pseudomonas Fluorescens diente als Standard zu interpretieren und zu quantifizieren, Extinktion (bei 420 nm) der Proben in Form von Pyoverdine äquivalenten in µM. Abbildung 1 zeigt den Zusammenhang zwischen Extinktion (420 nm) und Konzentration der Pyoverdine (Log10 Molarity in µM) ab. EDTA hat keinen angemessenen Standard bereitgestellt, da Proben ausgestellten größere Absorption Messungen als erreichbar mit Pyoverdine und R-2 war (Abbildung 2) senken. Beim ersten Arbeiten mit der CAS-Fe-Test als eine Methode der Siderophore Erkennung gemessene Extinktion bei 630 nm, in einer entsprechenden Studie mit eine sehr ähnliche Methode (CAS-Fe-Agar wurde gemischt 1:1 mit modifizierten M9 eine 200 µL-Spalte in der Mikrotestplatte generieren), es wurde beobachtet, dass die Peak-Extinktion war bei 665 nm, aber das 420 nm war mehr reproduzierbar im Hinblick auf Veränderungen in Absorption induziert durch Proben (Abbildung 3).
Siderophore Produktion war in Anreicherungskulturen von allen Gewebetypen beobachtet, nach 72 h Fe-Defizit Bereicherung und Siderophore Aktivität erschienen, nach 48 h Inkubation (ergänzende Abbildung1) zu stabilisieren. So wurde Siderophore Aktivität der Bereicherung 72 h auf 48 h Inkubation um den Einfluss von Genotyp und Probe Typ auf Siderophore Isolation (Abbildung 4) bewertet. Siderophore Aktivität in loser Schüttung Bodenproben war relativ gering und hat keine Ausstellung Unterschiede zwischen der Weizen-Genotyp, aus denen der Großteil Boden war, abgetastet (Abbildung 4A). Bereicherungen der locker gebundenen Boden isoliert von der PI561725-Genotyp ausgestellt größeren Siderophore Produktion lose gebundenen Böden von Madsen und PI561727, aber nicht Lewjain (Abbildung 4 b) gegenüber. Siderophore Produktion in Bereicherungen aus eng gebundenen Boden war nicht vom Genotyp (Abbildung 4) stark beeinflusst.
Anreicherungskulturen von Korn Gewebe ergab relativ niedrigen Siderophore Produktion unabhängig vom Genotyp (Abbildung 4). Bereicherungen des Lewjain schießen Gewebes hatten deutlich niedrigeren Siderophore Produktion als die anderen Genotypen und PI561725 schießen Gewebekulturen führte variablere Siderophore Produktion (Abb. 4E). Siderophore Aktivität war mehr als 200 % höher in in Gewebekulturen Bereicherung Wurzel des PI561725 im Vergleich zu allen anderen Genotypen (Abb. 4F).
Abbildung 1: Extinktion bei 420 nm und 655 nm zurückgebildet gegen die log10-Konzentration von Pyoverdine. (A) Extinktion bei 420 nm zurückgebildet gegen die Log10 Konzentration von Pyoverdine in µM. Eine polynomische Kurve war fit, eine erläuternde Gleichung für die Interpretation der Extinktion in Bezug auf die Pyoverdine Entsprechungen zu erhalten. (B) Extinktion bei 665 nm zurückgebildet gegen das Protokoll10 Konzentration von Pyoverdine in µM. R2 entspricht dem Quadrat der Pearson-Korrelationskoeffizient, und die Gleichung erklärt die angepasste Kurve. Punkte sind Duplikate der Extinktion Messungen bei 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 und 6,25 µM Pyoverdine nach 6 h Inkubation bei 28 ° C. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Extinktion bei 420 nm und 655 nm gegen die log10-Konzentration von EDTA zurückgebildet. (A) Extinktion bei 420 nm zurückgebildet gegen die Log10 Konzentration von EDTA in µM. Eine polynomische Kurve war fit, eine erläuternde Gleichung für die Interpretation der Extinktion in Bezug auf die Pyoverdine Entsprechungen zu erhalten. (B) Extinktion bei 665 nm zurückgebildet gegen das Protokoll10 Konzentration von EDTA in µM. R2 entspricht dem Quadrat der Pearson-Korrelationskoeffizient, und die Gleichung erklärt die angepasste Kurve. Punkte sind Duplikate der Extinktion Messungen bei 3200, 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 und 6,25 µM EDTA nach 6 h Inkubation bei 28 ° C und Fehlerbalken. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Absorption von 315−1000 nm Mikrotestplatte Brunnen mit 200 µL Spalten von 1:1 CAS-Fe-Agar scannt und modifiziert M9 oder M9 Medium mit Siderophore, die Herstellung von Proben. Die Platte wurde für 72 Stunden vor der Messung der Absorption in einem Mikrotestplatte Reader bei 28 ° C inkubiert. Extinktion-Scans zeigen die drei Leerstellen enthält keine Probe (schwarze Linien) ergab dicht gruppierte Kurven mit einem Peak bei 665 nm. Extinktion scannt zeigen die drei Rohlinge mit Siderophore, die Herstellung von Proben (graue Linien) ergab Kurven mit mehr Variabilität, aber mit konsequenter Extinktion bei 420 nm im Vergleich mit 665 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Pyoverdine Entsprechungen der Siderophore Anreicherungskulturen. Pyoverdine Entsprechungen der Siderophore Anreicherungskulturen zugeordnet (A) Masse (B) lose gebunden, und (C) eng gebunden Boden, und schießt im Gewebe Homogenates Weizen (D) Korn (E) und (F) Wurzeln. Siderophore Anreicherungskulturen wurden für 72 h vor Teilproben auf einer Mikrotestplatte übertragen und Inkubation bei 28 ° c inkubiert. Siderophore Produktion wurden nach 48 h Inkubation mit Chrom Azurol S. Genotypen/Linien sind Lew = Lewjain, Mad = Madsen, 725 = PI561725 und 727 = PI561727. Sternchen darstellen Bedeutung bei Alpha = 0,008 (nach Bonferroni-Korrektur). Bars sind Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung 1. Pyoverdine Entsprechungen im Laufe der Zeit. Pyoverdine Entsprechungen der Siderophore Anreicherungskulturen bewertet nach 24, 48 und 72 h Inkubation mit Chrom Azurol S. Sderophore Anreicherungskulturen (A) Masse (B zugeordnet) lose gebunden, und (C) eng Boden gebunden, und im Gewebe Homogenates Weizen (D) schießt Korn (E) und (F) Wurzeln. Siderophore Anreicherungskulturen wurden für 72 h vor Teilproben auf einer Mikrotestplatte übertragen und Inkubation bei 28 ° c inkubiert. und Siderophore Produktion bei jedem Timepoint bewerten unterteilt. Genotypen/Linien sind Lew = Lewjain, Mad = Madsen, 725 = PI561725 und 727 = PI561727. Siderophore Produktion wurde nach 24, 48 und 72 h Inkubationszeit beurteilt. Bars sind Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Das primäre Ergebnis dieser Arbeit ist die Herstellung einer neuen Methodik, die schnell zu bereichern für Siderophore produzieren Mikroben während der Messung quantitativ Siderophore/Produktionstätigkeit in der Umwelt Probe verwendet werden können. Die Methode ist schnell, einfach und kostengünstig, und die Ergebnisse zeigen, wie sie verwendet werden, um Siderophore Aktivität von komplexen und neuartige Probentypen erkennen (z. B.., Boden und Pflanze Gewebe). Das Protokoll führt auch bei der Herstellung von Glycerin Bestände des Bereicherung der Kulturen, die leicht durch die Zeit getroffen werden können, um Studien über Veränderungen in der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur und Funktion bei Fe-Mangel durch DNA oder RNA unterzubringen basierte Techniken . Interessenten, die bei der Prüfung der Kinetik der Siderophore Aktivität in ökologischen Studien könnte wahrscheinlich auch von dieser Methode profitieren. Die Ergebnisse zeigen auch, dass Pyoverdine-Äquivalente (Pyoverdines sind wichtige Siderophores in Bezug auf die Umwelt28 und Medizin29) bieten eine gute Methode Siderophore Produktion quantitativ zu bewerten. Eine wichtige Erkenntnis ist, dass Extinktion Messungen bei 665 nm sind unzureichend für die Bestimmung der Siderophore Aktivität im Vergleich zu den beobachteten bei 420 nm (Abbildung 1). Von besonderer Bedeutung war die Feststellung, dass Extinktion bei 665 nm in einem breiten Spektrum von Pyoverdine Konzentrationen gruppierten (Pyoverdine µM = 50-800 µM, Log10(µM Pyoverdine) = 0,18-0,76), was auf eine Erkennung Decke bei dieser Wellenlänge (Abbildung 1 b). es sei darauf hingewiesen, dass Pyoverdine einen gehobenen Standard im Vergleich zu EDTA war, es auch teuer, so wird vorgeschlagen, dass Vorarbeiten mit EDTA erfolgt oder andere kostengünstige Chelatoren um die Methodik zu gewährleisten beherrscht worden, vor Generierung von Pyoverdine Normen.
Es gibt mehrere wichtige Schritte im gesamten Protokoll, die Aufmerksamkeit erfordern. Erstens ist es wichtig, metallfreie Glaswaren und andere waren möglichst beizubehalten, wenn arbeiten mit Metallen, insbesondere in niedrigen Konzentrationen notwendig wie Fe. Zweitens weil Kulturen für die Siderophore Produktion durch Fe Begrenzung bereichert wurden, ist es wichtig, aseptische Bedingungen im gesamten Workflow zur Verringerung des Einflusses von Umweltschadstoffen beizubehalten. Zu guter Letzt Vorbereitung des CAS-Fe-Agar erfordert viel Liebe zum Detail und sollte bereit sein als eng, wie möglich beschrieben. Wenn die CAS-Fe-Agar-Lösung warm gehalten wird aber nicht schnell verwendet wird, wird zum Beispiel die CAS-Fe auszufällen. Darüber hinaus gilt es die CAS-Fe-Agar bei der Übertragung auf die Mikrotestplatte warm halten. Dies gelang mit beheizt, sterile Sand und das Medium auf die Mikrotestplatte in ein Kabinett Biosafety schnell übertragen.
Eine Einschränkung der Methodik ist, weil einige Pflanzen produzieren auch Siderophores (Phytosiderophores); Diese können zur gemessenen Siderophore Aktivität in Anreicherungskulturen von pflanzlichen Gewebe Homogenates beitragen. Auch gab es relativ hohe Variabilität in den Ergebnissen von Feld repliziert, was darauf hindeutet, dass weitere Replikation in zukünftigen Studien von Vorteil sein könnte. Eine weitere Einschränkung der Technik ist, dass während die Mikrotestplatte Methode ist Hochdurchsatz-Probe sammeln und Vorbereitung sind zeitaufwendig. Immer noch, weil ein einzelnes Mikrotestplatte für 96 Proben (einschließlich Normen) verwendet werden kann, die Zeit- und Eingänge sind viel geringer als mit vorhandenen Techniken. Dies ist vor allem, weil andere vorhandenen Methoden beruhen auf Durchführung des CAS-Fe-Tests in Petrischalen30, die sind von Natur aus weniger Zeit- und kosteneffizient als einer Mikrotestplatte vorzubereiten. Darüber hinaus da solubilisiert CAS-Fe-komplexe Niederschlag12anfällig sind, ist die vorgeschlagene Methode mit CAS-Fe-Agar Medium besser als Liquid-basierter Methoden, die auch die 96-Well-Format angepasst haben.
In Bezug auf die gemeldeten Ergebnisse angesichts der Tatsache, dass der primäre Unterschied zwischen der PI561725 und PI561727 das Vorhandensein von ALMT1 Vs.almt1, bzw. ist empfehlen die Ergebnisse die Anwesenheit von ALMT1 zu erwartenden Ergebnisse bei der Auswahl der mikrobieller Gemeinschaften in der Pflanze und den Boden, die ein größeres Potenzial für die Siderophore Produktion als bewerteten über Anreicherungskulturen haben. Zukünftige Arbeit sollte weiter untersuchen das Phänomen mit einer größeren Anzahl von Wiederholungen, um insbesondere zu klären, ob das Vorhandensein von ALMT1 speziell für verbesserte Siderophore Aktivität wählt.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Kalyani Muhunthan danken für Unterstützung in Laborverfahren, Lee Opdahl für Weizen Ernte Genotyp, die Washington State Concord Grape Research Council und der Washington State University Center für die Erhaltung der Landwirtschaft und Natürlichen Ressourcen für eine BIOAg gewähren, um diese Arbeit zu unterstützen. Zusätzliche Mittel lieferte die USDA/NIFA durch Schraffur-Projekt 1014527.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
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