Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

التحليل الكمي لتكوينها الخلوي في الآفات تصلب الشرايين المتقدمة للعضلات الملساء خلية تتبع النسب الفئران

Published: February 20, 2019 doi: 10.3791/59139
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1,4
1Heart, Lung, Blood and Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia, 4Division of Cardiology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

ونحن نقترح بروتوكول موحد لوصف تكوين الخلوية أواخر المرحلة مورين الآفات تصلب الشرايين بما في ذلك أساليب منهجية لتشريح الحيوان وتضمين الأنسجة، وتمزيقها، وتلطيخ، وتحليل الشرايين براتشيوسيفاليك من العضلات الملساء أثيروبروني خلية تتبع النسب الفئران.

Abstract

تصلب الشرايين ويظل السبب الرئيسي للوفاة في العالم، وعلى الرغم من عدد لا يحصى من الدراسات الإكلينيكية تصف الأهداف العلاجية الواعدة، التدخلات رواية ظل بعيد المنال. هذا المرجح يرجع، جزئيا، إلى اعتماد على نماذج السريرية منع التحقيق في آثار التلاعبات الجينية أو العلاجات الدوائية في تطوير تصلب الشرايين بدلاً من هذا المرض الراسخة. أيضا، ونتائج هذه الدراسات غالباً التباس بسبب استخدام تحليلات سطحية الآفة وعدم وجود توصيف الآفة خلية السكان. للمساعدة في التغلب على هذه العقبات متعدية الجنسيات، ونقترح زيادة اعتماد على نماذج التدخل التي توظف تحقيق تغيرات في التركيبة الخلوية على مستوى خلية واحدة تلطيخ إيممونوفلوريسسينت والفحص المجهري [كنفوكل]. وتحقيقا لهذه الغاية، نحن وصف بروتوكول لاختبار عامل علاجية المفترضة في نموذج تدخل مورين بما في ذلك اتباع نهج منتظم لتشريح الحيوان والتضمين، وتمزيقها، وتلطيخ والتحديد الكمي لآفات الشريان براتشيوسيفاليك. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لتنوع المظهرية من الخلايا ضمن المرحلة المتأخرة آفات تصلب الشرايين، يصف لنا أهمية استخدام النسب الخاصة بالخلية، إيندوسيبلي تتبع الماوس أنظمة وكيف هذا يمكن الاستدانة لتوصيف غير منحازة السكان خلية الآفة تصلب الشرايين. معا، هذه الاستراتيجيات يمكن أن تساعد علماء الأحياء والأوعية الدموية أكثر دقة نموذج التدخلات العلاجية وتحليل مرض تصلب الشرايين، ونأمل أن يترجم إلى ارتفاع معدل النجاح في التجارب السريرية.

Introduction

تصلب الشرايين هو السبب الرئيسي للاعتلال والوفيات في جميع أنحاء العالم الكامنة وراء الغالبية من مرض الشريان التاجي، وأمراض الشرايين، والسكتة الدماغية. تصلب الشرايين التاجية المرحلة المتأخرة يمكن أن يؤدي إلى مضاعفات خطيرة، بما في ذلك المحاسبة مخالفة احتشاء عضلة القلب لما يقرب من 16 في المائة من العالم السكان وفيات1،2. نظراً لتأثيرها المدمر على الصحة العامة، بذلت جهود كبيرة فك آليات القيادة تطور تصلب الشرايين، كذلك فيما يتعلق بوضع استراتيجيات علاجية جديدة. حتى الآن، أن معدل احتمال الموافقة (لوا) للتجارب السريرية لأمراض القلب والأوعية الدموية بين أدنى بالمقارنة مع غيرها من المجالات السريرية (فقط 8.7 في المائة للمرحلة الأولى)3. ويمكن تفسير ذلك جزئيا بالعديد من الحواجز أن تصلب الشرايين يطرح لتطوير الأدوية فعالة بما في ذلك طبيعتها تقريبا في كل مكان والتقدم صامتة سريرياً، والتغاير المرض كبيرة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يعزى التصميم الأمثل للدراسات السريرية على الحيوانات أيضا لعدم النجاح في الترجمة السريرية. على وجه التحديد، ونحن نعتقد أنه من الضروري تنفيذ دراسات التدخل كلما كان ذلك ممكناً للتحقيق في مدى فعالية الاستراتيجيات العلاجية. كما أن هناك حاجة ماسة إلى القيام بإجراءات موحدة لتحليلات الآفة بما في ذلك توصيف متقدمة لتكوين الخلوية أواخر المرحلة تصلب الشرايين الآفة قبل تحديد مصير و phenotyping.

الغالبية العظمى من تصلب الشرايين دراسات تركز على نماذج لمنع تصلب الشرايين تتكون من المخدرات العلاج أو الجينات التلاعب (خروج المغلوب أو طريقة الكبس) في الفئران الصغار صحية، قبل بدء المرض والتقدم. وقد كشفت هذه الدراسات عدد كبير من الجينات والجزيئات مما يشير إلى أن تلعب دوراً في تطور تصلب الشرايين. ومع ذلك، فشل في معظم هذه الأهداف ترجمة للعلاجات الفعالة في الإنسان. والواقع أن من الصعب استقراء أثر علاج على الفئران الصغار صحية لكبار السن من المرضى الذين يعانون من آفات تصلب الشرايين المتقدمة. على هذا النحو، يوفر تنفيذ دراسات تدخل في خط الأنابيب التجريبي السريري المحتمل تصوير أكثر دقة لمدى أهمية وفعالية جديدة العلاجية. يدعم الفكرة آثار تباين لافت للنظر التي تعوق سيتوكين برو التحريضية انترلوكين-1β (إيل-1β) عند استخدام منع4،،من56 أو تدخل استراتيجية7. الاختلافات بين الوقاية والتدخل الدراسات تشير إلى أن العمليات الخلوية المختلفة تحدث في مراحل مختلفة من التنمية تصلب الشرايين، ويسلط الضوء على حقيقة أن دراسات الوقاية من المحتمل غير كافية لنموذج سيناريو السريري على نحو كاف.

جمعية القلب الأمريكية مؤخرا بنشر بيان علمية تفاصيل توصيات للتصميم التجريبي السليم وتوحيد الإجراءات، والتحليل والإبلاغ عن تصلب الشرايين الحيوان الدراسات8. أنه يسلط الضوء على فوائد وتقييدات الغالبة التقنيات المستخدمة في هذا المجال. على سبيل المثال، الوجه أون تلطيخ "السودان الرابع" من الشريان الاورطي يتم إجراء غالباً كقراءة أولى. على الرغم من en الوجه "الرابع السودان" تلطيخ ترسب الدهن طريقة مناسبة لتقييم عبء البلاك العالمية، أنه غير قادر على تمييز الآفات الانتصارات الدهنية في مرحلة مبكرة من آفات أواخر مرحلة أكثر تقدما. على هذا النحو، تفسير تلطيخ الوجه أون من الأحيان غامضة وسطحية9. تحليل دقيق من الأنسجة توفر المقاطع العرضية باستخدام معلمات مورفولوجك حجم السفينة والآفة، والتجويف والتحديد الكمي لمؤشرات الاستقرار الآفة إلى فهم أدق لتأثير تجربة.

وأخيراً، دراسات الأنسجة البشرية اقترح أن تكوين الخلوية مؤشرا أفضل لتمزق من حجم الآفة نفسها، مع الأغنياء في الضامة يجري أكثر عرضه لتمزق10، والفقراء الآفات في خلايا العضلات الملساء (SMC) 11. كانت هذه الملاحظات تستند إلى تلطيخ للعلامات المستخدمة تقليديا لتحديد الخلية (أي، ACTA2 SMC و LGALS3 أو CD68 الضامة). ومع ذلك، التعبير عن هذه العلامات غير مقيد تماما إلى نوع خلية مفردة في الآفات تصلب الشرايين سبب اللدونة الأنساب متعددة بما في ذلك SMC وخلايا بطانية وخلايا النقوي12. على وجه الخصوص، لا لبس فيها SMC داخل الآفة تصلب الشرايين وكان تحديد يكاد يكون من المستحيل حتى العقد الماضي بسبب الخاصية هذه الخلايا إلى ديديفيرينتياتي وقمع جيناتها العلامة الخاصة بالنسب (عملية يشار التبديل بين المظهرية) في السفن المتضررة أو المريضة13. وقد تم الالتفاف حول هذا القيد في تعريف SMC بوضع النسب التتبع7،14،15،16،،من1718، 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24-وهو يتألف من وضع العلامات بشكل دائم SMC وذرياتهم تتبع مصير وتطور المظهرية أثناء تطور تصلب الشرايين باستخدام مزيج من التعبير عن ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية التي يقودها المروجين SMC محددة (أي، Myh117،17،15،18،20،،من1921،،من2223 , 24،25، Acta226 و، SM22α14،16) والتنشيط للصحفيين (مثل البروتينات الفلورية، β-جالاكتوسيداسي) [استعرض في بينتزون وماجيسكي 27من 2018]. في واحدة من أولى الدراسات التي تستخدم تتبع النسب SMC خارج الإعداد امبريوجينيسيس، قدم سبير et al.14 أن SMC يمكن أن تعدل عن النمط الظاهري وترانسديفيرينتياتي إلى خلايا تشوندروجينيك أثناء تكلس الأوعية الدموية باستخدام الأدلة نموذج تتبع نسب "العرقية R26R لاكز" SM22α . على الرغم من أن هذه الدراسات كانت رائدة تتبع النسب SMC، كانوا جزئيا لبس في ذلك سوف يكون المسمى SM22α وإذ تعرب عن أي معطى غير SMC في الإعداد لهذا المرض حسب المراسل. قد تم تجاوز هذا الحد بتطوير واستخدام لجنة المساواة العرقية تاموكسيفين إيندوسيبلي ERT/لوكسب يسمح عنصر تحكم الزمانية لوسم الخلية. تسمية الخلية يحدث حصرا أثناء الولادة تاموكسيفين وستكون مقتصرة على الخلية معربا عن المروج نوع معين خلية القيادة التعبير المكون من لجنة المساواة العرقية في وقت التعرض تاموكسيفين، وتجنب اقتفاء أثر أنواع الخلايا البديلة تفعيل لجنة المساواة العرقية في الإعداد لتطور المرض. لتتبع النسب من SMC في تصلب الشرايين، تاموكسيفين-إيندوسيبلي Myh11-Cre/ERT2 التحوير المرتبطة مع الصحفيين الفلورسنت (ايفب7،15،،من1718 , 21، متمج19،25، حلويات20،،من2223 لدراسات التوسع في الاستنساخ) أثبتت كفاءة ملحوظة وخصوصية في وسم SMC وقد استخدمت لمصير السكان SMC الخريطة في الآفات تصلب الشرايين في الدراسات التي أجريت مؤخرا. الأهم من ذلك، كشفت هذه الدراسات عن أن: 1) 80% SMC متقدمة داخل هل الآفات تصلب الشرايين لم يعرب عن أي التقليدية SMC علامات (ACTA2، MYH11) المستخدمة في التحليل إيمونوهيستولوجيكال ولذلك سيكون قد أساءوا دون تتبع النسب 17؛ 2) مجموعات فرعية SMC التعبير عن علامات لأنواع الخلايا البديلة بما في ذلك علامات بلعم أو الخلايا الجذعية الوسيطة علامات16،،من1719؛ و 3) SMC الاستثمار وتعبئة الآفة تصلب الشرايين بالتوسع في أوليجوكلونال واستنساخ SMC الاحتفاظ اللدونة للانتقال إلى فئات سكانية مختلفة فينوتيبيكالي20،23. لتلخيص، من الواضح الآن أن خلايا العضلات الملساء تنوع المظهرية ملحوظا في الآفات تصلب الشرايين ويمكن أن يكون مفيداً أو ضاراً أدوار على الآفة المرضية تبعاً لطبيعة هذه التحولات المظهرية. وتمثل هذه الاكتشافات سبيلاً علاجية جديدة رائعة لاستهداف SMC عصيدة تعزيز التحولات المظهرية في أواخر المرحلة تصلب الشرايين.

هنا، فإننا نقترح على بروتوكول موحد لتحليل المرحلة المتأخرة مورين آفات تصلب الشرايين بما في ذلك أساليب منهجية لتشريح الحيوان والتضمين وتمزيقها، وتلطيخ والتحديد الكمي لآفات الشريان براتشيوسيفاليك. لتحديد تأثير تثبيط انترلوكين-1β على مصير SMC والنمط الظاهري، قمنا باستخدام النسب SMC تتبع الذين--/-- الفئران تغذت غربي لمدة 18 أسبوعا قبل تلقي حقن أسبوعية للأجسام المضادة IL1β أو مطابقة ايستب مراقبة مفتش.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تربية الحيوان والمناولة وإجراءات أقرتها جامعة فرجينيا وجامعة بيتسبرغ مؤسسات الرعاية الحيوانية واستخدام اللجنة.

1-جيل فئران تتبع النسب SMC

  1. سلالة Myh11الذكور-Cre/ERT228 (مختبر جاكسون؛ #019079) مع الإناث R26R-ايفب (مختبر جاكسون؛ #006148) للحصول على Myh11-Cre/ERT2+ R26R-ايفب+ + الذكور.
  2. سلالة Myh11-Cre/ERT2+ R26R-ايفب+ + الذكور مع الذين--/-- الفئران الإناث (مختبر جاكسون؛ #002052). عبور الذرية وحدد بالتنميط Myh11-Cre/ERT2+ R26R-ايفب+ + الذين أنثى--/-- و R26R-ايفب+ + الذين--/-- الفئران الإناث كمربي النهائي. مقطع الذيول وإجراء التنميط على ليتيرماتيس. يجب أن تكون جميع الفئران الذكور Myh11-Cre/ERT2+ R26R-ايفب+ + الذين--/-- ويمكن أن تستخدم كالفئران التجريبية (الشكل 1أ).
    ملاحظة: يمكن الاطلاع على البروتوكولات التنميط على موقع مختبر جاكسون. يقع التحوير Cre/ERT2 Myh11 على كروموسوم Y، تحول دون استخدام الإناث. يمكن استخدام أنظمة التتبع النسب الأخرى، ولكن هذا النظام حتى الآن استراتيجية تتبع النسب الأكثر موثوقية لمصير خريطة SMC في تصلب الشرايين.

2-العضلات الملساء خلية تتبع النسب الماوس الحمية والعلاجات

  1. وقد ذكر Myh11-Cre/ERT2+ R26R-ايفب+ + الفئران-/- الذين تلقي سلسلة من حقن 1 ملغ تاموكسيفين من ستة إلى ثمانية أسابيع عمر التسمية بشكل دائم Myh11+ SMC مع يفب وتتبع مصيرهم (الشكل 1 A).
    1. زيت الفول السوداني الحرارة على 55 درجة مئوية.
    2. إضافة تاموكسيفين في زيت الفول السوداني قبل ساخنة تحضير حلاً في 10 ملغ/مل واحتضان في 55 درجة مئوية حتى انحلال تاموكسيفين كاملة.
    3. إجراء حقنه داخل مع 0.1 مل من 10 ملغ/مل تاموكسيفين حل لسلسلة من عشر حقن أكثر من أسبوعين.
      ملاحظة: تاموكسيفين الوقاية من الإخطار البيولوجية ويجب التعامل معها بحذر.
  2. خمسة إلى سبعة أيام بعد الحقن الماضي مع تاموكسيفين، استبدال النظام الغذائي تشو مع حمية عالية الدهون (مثل النظام الغذائي الغربي؛ 42% سعره حرارية من الدهون الكولسترول الكلي 0.2%) لمدة 18 أسبوعا للسماح لتطوير الآفات تصلب الشرايين المتقدمة، التي استمرار تطور في أسرة الأوعية الدموية متعددة بما في ذلك القوس الاورطي والشريان براتشيوسيفاليك وجذر الاورطي البطني.
  3. تبدأ في 18 أسبوعا حمية عالية الدهون التغذية، التدخل العلاجي للمدة المطلوبة (الشكل 1ب).
    ملاحظة: على سبيل مثال، أجرينا الحقن داخل أسبوعية مع جسم IL1β المضادة أو عنصر تحكم مفتش ايستب المطابقة بين 18 و 26 أسبوعا من حمية عالية الدهون.
  4. إزالة الغذاء للفئران بسرعة 8 إلى 16 ح قبل الأنسجة الحصاد لإجراء قراءات دقيقة للبلازما الكوليسترول والدهون الثلاثية.

3-حصاد الشريان Brachiocephalic (اتفاق التعاون الأساسي)

  1. ينبغي أن تتبع القتل الرحيم الحيوان متطلبات "العناية بالحيوان" واستخدام اللجنة (أكوك) والأنظمة. Euthanize الفئران التجريبية CO2 خنقاً لمدة 5 دقائق أبروكسيماتيفيلي والتحقق من الموت برشة أخمص القدمين.
  2. وزن الماوس وجمع الدم.
    1. وزن الماوس
    2. رذاذ الجانب البطني للماوس مع 70% إيثانول
    3. إجراء ثقب القلب بإدخال إبرة ز 25 متصلاً بحقنه 1 مل في طين من الجانب الأيسر من تجويف الصدر. ويمكن جمع 0.1 إلى 1 مل دم.
    4. نقل الدم إلى أنبوب فراغ يدتا قبل التنظيف المحاقن ووضع الأنبوب على الروك أو المدورة لمدة 10-15 دقيقة.
    5. نقل الدم إلى أنبوب 1.5 مل والطرد المركزي لمدة 10 دقائق 250 x ز في 4 درجات مئوية. عناية الانسحاب في مرحلة البلازما أعلى مع ماصة والنصائح الكافية، ونقل إلى أنبوب جديد. تخزين في-20 درجة مئوية قبل قياس نسبة الكولسترول في الدم والدهون الثلاثية.
      ملاحظة: يمكن استخدام الدم كله لإجراء دراسات إضافية بما في ذلك عدد خلايا الدم ومكونات الدم الأخرى بما في ذلك السيتوكينات أو التنميط الخلايا المناعية.
  3. جعل شق أبروكسيماتيفيلي 2 سم في الجلد في منتصف البطن باستخدام المقص وسحب الجلد لفضح تجويف البطن. قطع الصفاق حتى القص دون الأضرار الأنسجة. إجراء تخفيضات اثنين في سطر الابطية منتصف عبر الصدر، مع الحرص على عدم الأضرار بالقلب والرئتين.
  4. رفع القص مع ملاقط وقطع الحجاب الحاجز لفضح جزئيا القلب. إذا كان القلب لا يمكن الوصول إليها بسهولة، قطع بعيداً القفص الصدري ما فيه الكفاية تصل إلى الاذين الأيمن.
  5. نتخلل الماوس مع نظام التروية جاذبية (الشكل 2أ). تثبيت نظام التروية خطورة مثل أن ضغط السوائل نضح ما يعادل متوسط ضغط الدم موريني (الشكل 2ب). يسمح هذا النظام للاتساق في نضح وكلاهما يحافظ على خلايا الدم الحمراء السفينة مورفولوجيا والاحمرار.
    ملاحظة: كمرجع، لها الفئران C57Bl6 ضغط الدم الفسيولوجية بين 120 مم زئبق (متوسط ضغط الدم الانقباضي) و 70 مم زئبق (متوسط ضغط الدم االنقباضي)29،30. يمكن أن تختلف متوسط ضغط الدم الانقباضي والانبساطي مع الماوس الخلفية الوراثية.
    1. الاتصال 23 أو 25 غ الفراشة الإبرة إلى نظام التروية الجاذبية وتشغيل مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) عن طريق الإبرة لطرد الهواء من الأنابيب. أدخل الإبرة في البطين الأيسر وتأمين الإبرة في المكان. باستخدام مقص آيريس، جعل شق صغير (< 2 مم) في الاذين الأيمن أو الشريان الاورطي تصاعدي.
    2. نتخلل مع 5 مل من برنامج تلفزيوني، ثم 10 مل محلول بارافورمالدهيد (PFA) 4%، ثم 5 مل من برنامج تلفزيوني. استخدام برنامج تلفزيوني و 4% حل منهاج العمل في درجة حرارة الغرفة.
    3. جمع أنسجة الاهتمام (مثل الكبد، والرئة، والطحال) ووضعها في الحل منهاج العمل 4%.
  6. كشف اتفاق التعاون الأساسي
    1. تنظيف منطقة الرقبة بإزالة الجلد والغدد اللعابية.
    2. إجراء قطع واحد أسفل خط الوسط للقص من خلال قبضة استخدام المقص. كن حذراً من أن المقص البقاء على مقربة من الجزء الخلفي القص لتجنب إتلاف المفرج أسفل القص عن كثب. سحب كلا الجانبين القفص الصدري مع الملقط لفتح كامل تجويف الصدر. كاروتيدس يجب أن تكون مرئية جزئيا.
    3. تنظيف بسحب العضلات والنسيج الضام، وإزالة الدهون بملاقط غرامة حتى السباتي الأيمن، الشريان brachiocephalic التشعب subclavian والقوس الاورطي في تنظيفها والمنعزلة المحيطة بالنسيج الضام والدهون (الشكل 2ج).
  7. إزالة اتفاق التعاون الأساسي
    1. باستخدام الملقط، انتزاع السباتي الصحيح أدناه التشعب وهو قطع أولى أعلاه الملقط (الشكل 2د).
    2. ما زالت تحتجز جعل السباتي، قطع ثانية عن طريق الشريان سوبكلافيان. التخفيضات النهائية اثنان من خلال قوس الاورطي، على جانبي الشريان براتشيوسيفاليك (الشكل 2د).
    3. جمع الأنسجة الوعائية الأخرى ذات الأهمية (مثل الشريان الاورطي البطني، متفوقة الجزء من القلب الذي يحتوي على جذر الاورطي).
    4. وضع في اتفاق التعاون الأساسي والأنسجة الأخرى في حل منهاج العمل 4% بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: وقت التثبيت ينبغي أن تظل متسقة في جميع أنحاء الدراسة.

4-الأنسجة تجهيز وتقطيع

  1. إزالة الأنسجة من 4% منهاج العمل ومكان في كاسيت أنسجة مسمى (الشكل 3أ). استخدام الرغاوي منصات في الكاسيت لضمان الأنسجة الاحتفاظ بالتوجه ويبقى في الكاسيت من خلال خطوة معالجة (الشكل 3ب). إغلاق أشرطة الكاسيت وتزج في الإيثانول 70% حتى الأنسجة المعالجة (24 إلى 72 ساعة).
    1. عملية اتفاق التعاون الأساسي والأنسجة الأخرى التي تم جمعها لغذائها وتلطيخ على النحو التالي (على سبيل المثال من الإجراء الروتيني بين عشية وضحاها باستخدام معالج مع تغلغل الفراغ) إيمونوفلوريسسينت: مخزنة المحايد 10% فورمالين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (2x)، 75% الإيثانول لمدة 60 دقيقة في 30 درجة مئوية (س 1)، الإيثانول 90% لمدة 60 دقيقة في 30 درجة مئوية (س 1)، الإيثانول 95% لمدة 60 دقيقة في 30 درجة مئوية (س 1)، الإيثانول 100% لمدة 60 دقيقة في 30 درجة مئوية (س 3)، زيلين نفط لمدة 60 دقيقة في 30 درجة مئوية (س 3)، وشمع البارافين لمدة 80 دقيقة في 62 درجة مئوية (س 3).
  2. تضمين اتفاق التعاون الأساسي عمودياً، مع القوس الاورطي الأقرب إلى وجهة كتلة (الشكل 3ج).
  3. قطع طريق كتلة البارافين في مبضع دوارة (10 ميكرون سمك) حتى وصلت إلى الأنسجة المضمنة.
  4. بمجرد تظهر الأنسجة، دراسة قسم تحت مجهر لتحديد الموقف. إذا كان القوس الاورطي لا تزال مرئية، إزالة حتى أبواب عشرة 10 ميكرون في وقت، دراسة مقطع في كل فاصل زمني.
  5. عند قد تم مقطوع القوس الاورطي عن طريق الشريان brachiocephalic مرئياً، ضبط اتجاه الكتلة لتحديد موضع عمودي تماما على شفرة مبضع النسيج.
  6. قص اتفاق التعاون الأساسي في سمك باب 10 ميكرون. عند هذه النقطة، يتم جمع كافة المقاطع متسلسل مع ثلاثة أقسام كل شريحة. جمع حتى وصلت إلى التشعب subclavian (الشكل 3د).
    ملاحظة: من المهم قص في اتفاق التعاون الأساسي في سمك باب 10 ميكرون للحصول على الصور [كنفوكل] z-مكدس اللاحقة والعد خلية مفردة. وسيسمح هذا السمك تقييم صارم وغير كوفوندينج من الرابطة بين نواة واحدة وهيولي أو الغشاء تلطيخ على الرغم من عمق المقطع العرضي.

5-إيممونوفلوريسسينت تلطيخ

ملاحظة: يتضمن وصفاً كاملا لآفات تصلب الشرايين تقييم البارامترات المورفولوجية ومؤشرات اللوحة الاستقرار أو عدم الاستقرار وتكوين الخلوية التي لن يكون التركيز في هذا البروتوكول. مورفولوجية الآفة ومحتوى الكولاجين، ونزيف إينترابلاك يمكن تحليلها موفات7،17، 7،بيكروسيريوس الأحمر31، Ter119 المصبوغة 7،18، على التوالي. هنا، ونحن سوف تصف البروتوكول لتحليل تكوين الخلوية من الآفات.

  1. احتضان الشرائح في الحلول التالية في درجة حرارة الغرفة تحت غطاء كيميائية: زيلين نفط 5 دقيقة (2x), الإيثانول 100% لمدة 5 دقائق (2x)، الإيثانول 95% لمدة 5 دقائق (2x)، الإيثانول 70% لمدة 5 دقائق (2x)، ومنزوع H2O (diH2س) لمدة 5 دقائق (2 x).
  2. احتضان الشرائح في مستضد استرجاع الحل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    1. مع حمض الستريك على أساس الحل تعرية مستضد (انظر الجدول للمواد)، تضعف 3 مل من محلول في 320 مل من مكان سين diH2الشرائح المصبوغة الخزان وتعبئة للأعلى مع الحل استرجاع مستضد استعداد.
    2. سد أي فتحات فارغة في حامل الشريحة مع شرائح فارغة لضمان التدفئة حتى. تغطية الحاوية مع غطاء للسماح بحل استرجاع مستضد تغلي دون التبخر.
    3. الحرارة الشرائح في فرن ميكروويف لمدة 20 دقيقة في ما يقرب من 675-700 واط. راجع الشرائح بشكل منتظم واستبدال تبخر السائل مع diH2س تظل مثل هذه المقاطع غارقة في تعرية الحل في جميع الأوقات.
    4. السماح للشرائح لتبرد في حل ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
  3. حل ز 6 من الجيلاتين من جلد السمك (FSG) في 1 لتر من برنامج تلفزيوني. ويستخدم برنامج تلفزيوني/FSG كالغسيل المخزن المؤقت. إعداد حل حظر المصل العادي 10% في برنامج تلفزيوني/FSG.
    ملاحظة: يتم استخدام "الجيلاتين من جلد" السمك في إعداد المخزن المؤقت حظر. FSG لا تحتوي على بروتينات المصل الذي يمكن كروسرياكت مع أجسام الثدييات، تقليل الضوضاء الخلفية. ومع ذلك، يجب أن يكون الخيار حظر الأخرى المفضل مع أنظمة الكشف عن البيوتين FSG يحتوي على البيوتين الذاتية. يستند نوع المصل العادي يستخدم جسم الثانوية المستخدمة. عندما يتم استخدام الأجسام المضادة الثانوية حمار، ينبغي اختيار مصل الحصان العادي لتخفيف الحظر والأجسام المضادة.
  4. احتضان الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. دائرة أقسام الأنسجة بقلم مسعور. وتغطي الأجزاء مع المخزن المؤقت حظر المصل برنامج تلفزيوني/FSG/عادي ح 1 في درجة حرارة الغرفة. إعداد الحل جسم الأولية في برنامج تلفزيوني/FSG/عادي المصل أثناء هذه الخطوة في حين يتم تجميد الأنسجة.
  5. احتضان مع الأجسام المضادة الأساسي المخفف في برنامج تلفزيوني/FSG/عادي المصل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في دائرة رطوبة. وينبغي أن المحتضنة مقطع واحد كل شريحة مع مزيج من الأجسام المضادة مراقبة مفتش في تركيز نفسه والأجسام المضادة الأساسي لعنصر التحكم لخصوصية جسم الأولية.
  6. يغسل الشرائح على النحو التالي في درجة حرارة الغرفة: برنامج تلفزيوني/FSG لمدة 5 دقائق (3 س)، ثم برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق (س 1).
  7. احتضان مع أضداد الثانوية fluorophore مترافق (انظر الجدول للمواد) ودياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) لنواة كونتيرستينينج المخفف في برنامج تلفزيوني/FSG/عادي المصل ح 1 في درجة حرارة الغرفة. حماية الشرائح من الضوء.
  8. تغسل شرائح كما هو موضح في الخطوة 5، 6.
  9. تحميل الشرائح باستخدام تركيب وسائط مناسبة للأسفار (انظر الجدول للمواد).

6-[كنفوكل] مجهرية

ملاحظة: استخدام مجهر [كنفوكل] واقتناء z-مكدس أمر بالغ الأهمية لعد الخلايا المفردة.

  1. تعيين معلمات اقتناء لاستخدامها طوال فترة الدراسة: صورة قرار (1024 × 1024 أو 2048 × 2048 بكسل)؛ المسار البصري وعدد من القنوات، ودالة للجمع بين الأجسام المضادة الثانوية المحددة؛ سرعة المسح الضوئي (أوصى بسرعة المسح الضوئي: 7-8)؛ وتدخل فرق التباين (DIC) القناة.
  2. استخدام المقاطع ملطخة بالأجسام المضادة الأولية ومراقبة مفتش، تعيين حساسية الكاشف، طاقة الليزر، وإزاحة لكل قناة الفردية. يتم استخدام عنصر التحكم مفتش لتقليل الإشارات الخلفية.
  3. إعداد المناصب العليا والسفلي لاقتناء z-مكدس. سلفا بسمك وعدد المكدسات للحصول على. هذه المعلمات يجب أن تبقى ثابتة طوال فترة الدراسة.
    ملاحظة: نوصي بالتصوير رزمة من 8 إلى 10 من 1 ميكرون سمك. تبقى ثابتة في عدد المكدسات تصويرها طوال فترة الدراسة.
  4. أقسام الأنسجة صورة ملطخة بالأجسام المضادة الأولية ومراقبة مفتش لكافة القنوات بما في ذلك مدينة دبي للإنترنت.
  5. قم بتسمية صورة واحدة على الأقل مع شريط مقياس لمعايرة الصورة أثناء العد خلية مفردة.

7-وحيد الخلية العد

  1. تثبيت وفتح إيماجيج. إذا لزم الأمر، تحميل الإضافات في القسم تحميل > الإدخال/الإخراج من إيماجيج إنشاء موقع على شبكة الإنترنت لفتح ملف الصورة تبعاً لشكل الصور التي تم إنشاؤها بواسطة المجهر [كنفوكل].
  2. قم بفتح ملف الصورة في إيماجيج.
  3. معايرة الصورة باستخدام مقياس مرجعي شريط باستخدام الصورة التي تم إنشاؤها في 6.6.
  4. تحدد منطقة الاهتمام الذي عد خلية مفردة سيتم استخدام قناة دبي (الشكل 4).
    ملاحظة: يمكن تحديد منطقة واحدة في وقت واحد. تبعاً للأسئلة التجريبية، من عد خلية مفردة يمكن أن يتم في منطقة الآفة كامل (انظر 7.3.1) و/أو في سوبلوكاتيون للآفة. على سبيل المثال، التحقيق في منطقة كاب الليفي (انظر 7.3.2) ذات أهمية خاصة نظراً لتكوينها الخلوي مؤشر هام للآفة الميل إلى تمزق.
    1. تحدد منطقة الآفة باتباع الحدود التجويف (الشكل 4أ؛ الأسهم البيضاء) والداخلية مطاطا الصفيحة (الشكل 4أ؛ سهام الأصفر) تظهر في الصورة DIC.
    2. لمزيد من التحليل لمنطقة كاب الليفي، تحديد الحدود البعيدة من 30 ميكرون من التجويف وتتبع الحدود ( الشكل 4ب-د).
      ملاحظة: يعرف منطقة كاب الليفي تقليديا كمنطقة أثري في ACTA2 + الخلايا والكولاجين كي التجويف (الشكل 4ب). الإثراء في ACTA2 + الخلايا والكولاجين يلعب دوراً حاسما في الاستقرار الآفة. حددت الدراسات السابقة أن منطقة كاب ليفية غنية ACTA2 + خلية المتوسطات سماكة 30 ميكرون من التجويف في النسب SMC تتبع الذين-/- تغذية الفئران حمية عالية الدهون لمدة 18 إلى 26 أسبوعا (الشكل 4ج). وهكذا، توصيف دقيق لآثار التلاعب بالجينات أو العلاج الدوائي على تكوين منطقة كاب الليفي الخلوية ذات الصلة على نحو ملحوظ.
  5. فتح لوحة الأدوات القنوات (الصورة > ألوان > "أدوات قناة") وتلطيخ الألوان الزائفة مختلف القنوات (الشكل 5أ؛ 1 مربع).
  6. دمج قنوات اللون (الصورة > ألوان > "دمج ألوان") (الشكل 5ألف؛ مربع 2). يجب أن تكون كافة القنوات مرئية في نفس الصورة (الشكل 5ب). تشغيل وإيقاف قنوات الألوان الفردية باستخدام لوحة الأدوات قناة (الشكل 5أ؛ 1 مربع).
  7. إعداد أداة العد.
    1. حق انقر على أيقونة العد في شريط الأدوات (الشكل 5ج؛ الإطار 1) وقم بتحديد أداة متعددة النقاط.
    2. انقر نقراً مزدوجاً فوق الرمز نفسه لفتح لوحة أداة نقطة (الشكل 5ج؛ 2 مربع).
    3. حدد نوع وحجم العناصر المستخدمة لحساب عدد الخلايا.
    4. تحقق من إظهار الكل.
  8. قم بتشغيل القناة DAPI فقط في لوحة الأدوات قناة وحدد القناة العداد 0 (الشكل 5ج؛ 3 مربع). انقر فوق النوى الفردية التي سوف تكون المعلمة (أصفر مثلاً النقاط في الشكل 5ج-د). قم بالتمرير z-مداخن لعد جميع الأنوية الملون في منطقة الاهتمام. عدد الأحداث التي ترد أدناه القناة العداد في لوحة أداة نقطة (الشكل 5ج؛ 4 مربع).
  9. قم بتشغيل قناة المصبوغة أخرى (مثلاً، تلطيخ ايفب). قم بتحديد القناة العداد 1. انقر فوق الخلايا التي توجد كولوكاليزيشن بين DAPI وتلطيخ. لتلطيخ هيولى، حدد الخلايا مع تلطيخ يحيط نواة لعمق كامل للنواة (التحقق من مداخن ض عدة).
  10. كرر بتعديل تلطيخ تركيبات وتحديد قنوات جديدة مضادة لعد سكان الخلية للفائدة. يمثل كل لون دوت سكان خلية مختلفة (الشكل 5د). يمكن التعبير عن نتائج عدد من الخلايا إلى العدد الإجمالي ل DAPI أو عدد من الخلايا بالمنطقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Myh11--Cre/ERT2 R26R-تم حقن الفئران-/- الذين ايفب مع تاموكسيفن بين ستة وثمانية أسابيع من العمر قبل اطعامهم وجبة عالية الدهون. في 18 أسبوعا حمية الدهون عالية التغذية، يعاملون مجموعتين من الفئران ثمانية أسبوعيا مع جسم المضادة-إيل-1β [مونوكلونل] ماوس أو عنصر تحكم مفتش ايستب المطابقة في 10 مغ/كغ لمدة 8 أسابيع (الشكل 1)7. تم التضحية بالفئران و perfused مع حل منهاج عمل بيجين-برنامج تلفزيوني 4%. تشريح الشرايين براتشيوسيفاليك، ومعالجتها، ومقطوع كما هو موضح أعلاه (الشكل 2 و الشكل 3).

وكان تصويرها المقاطع العرضية بعد تلطيخ إيممونوفلوريسسينت مع الأجسام المضادة التي تستهدف النسب تتبع مراسل (يفب) وعلامات المظهرية (ACTA2، LGALS3، RUNX2)، بسمك 8-10 ميكرون من اتفاق التعاون الأساسي استخدام مجهر [كنفوكل]. تم الحصول على صور لكل صبغة فردية DAPI (تلطيخ النووية) ومدينة دبي للإنترنت. تم إجراء ترسيم المناطق ذات الاهتمام لخلية مفردة العد (الآفة، كاب الليفي) باستخدام الصور DIC (الشكل 4). تم إجراء وحيد الخلية الفرز لتحديد الوفرة من مختلف قطاعات السكان المستمدة من SMC باستخدام إيماجيج (الشكل 5).

نقدم اثنين من تلطيخ إيممونوفلوريسسينت الممثل والعد واحد تقييم الأثر لتثبيط إيل-1β عن التركيبة الخلوية في الآفات تصلب الشرايين المتقدمة. أولاً، تم تلطيخ للمراسل تتبع النسب SMC يفب وعلامة SMC ACTA2، وعلامة بلعم LGALS3 في المقاطع العرضية في موقعين مختلفين من اتفاق التعاون الأساسي (ميكرومتر 480 و 780 ميكرومتر من القوس الاورطي) (الشكل 6). تم إجراء تحليل خلية مفردة العد في منطقة كاب الليفي في هذه المقطع العرضي، وتم العثور على اختلافات ملحوظة في تكوين منطقة كاب الليفي بين الفئران تعامل مع الأجسام المضادة-إيل-1β الخلوية والفئران التي عولجت مطابقة ايستب مفتش مراقبة (الشكل 6A). تثبيط إيل-1β كان مرتبطاً مع انخفاض في يفب + SMC وزيادة في LGALS3 + الخلايا (الشكل 6ب). فيما يتعلق تعمل للسكان SMC، لوحظ انخفاضا في عدد يفب + ACTA2 + SMC، بينما العدد النسبي ل SMC المستمدة الضامة (يفب + LGALS3 +) تمت زيادة كبيرة في كلا الموقعين اتفاق التعاون الأساسي (الشكل 6ج).

وأخيراً، نحن التحقيق في تأثير تثبيط إيل-1β على الانتقال SMC المظهرية إلى خلايا تشوندروجينيك. هو هذا التحول المظهرية دافعا هاما تكلس الأوعية الدموية، السمة الرئيسية للمرحلة المتأخرة تصلب الشرايين14،،من3233. كانت الملون اتفاق التعاون الأساسي المقاطع العرضية للمراسل تتبع النسب SMC يفب وعلامة أوستيوتشوندروجينيك RUNX2، وعلامة بلعم LGALS3 (الشكل 7أ). كانت تتسم الوفرة، والمنشأ للخلايا تشوندروجينيك RUNX2 + داخل منطقة الآفة في أعمالنا مجموعتين تجريبية. وجدنا أن تثبيط إيل-1β لا يؤثر العدد الإجمالي RUNX2 + الخلايا داخل الآفة، ولا نسبة المستمدة من SMC (يفب + RUNX2 +) والمستمدة من بلعم (يفب-LGALS3 + RUNX2 +) تشوندروجينيك الخلايا (الشكل 7ب).

Figure 1
الشكل 1 : دراسات التدخل في العضلات الملساء الخلية الفئران تتبع النسب. (أ) التمثيل التخطيطي من لجنة المساواة العرقية- Myh11/ERT2 R26R-الذين ايفب-- تاموكسيفين إيندوسيبلي SMC نسب محددة تتبع الماوس نموذج. العلاج بعقار تاموكسيفين الحث على جزئ محور يفب R26R والختان كودون التوقف والتعبير الدائم عن يفب قبل SMC. دراسات التخطيطي (ب) التدخل في أي Myh11-Cre/ERT2 R26R-الفئران-/- الذين ايفب تغذية النظام غذائي غربي لمدة 18 أسبوعا كانت حقن أسبوعيا مع جسم إيل-1β أو جسم مراقبة مفتش مطابقة ايستب بتركيز 10 مجم/ كجم لمدة 8 أسابيع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : تشريح الشريان براتشيوسيفاليك. (أ) التخطيطي للجاذبية مدفوعة نظام التروية. يتم إعداد النظام على ارتفاع محدد يسمح التروية عند ضغط قريبة من متوسط ضغط الدم الانقباضي في الفئران. الضغط يختلف قليلاً مع ارتفاع حجم السائل المستخدم أثناء التروية بين ارتفاع ح1 وح2. (ب) معادلة لحساب ضغط السوائل ثابتة وتحديد الارتفاع تصل إلى ضغط التروية مساوياً لضغط الدم الانقباضي متوسط بين C57Bl6 الماوس. (ج) صور الدانية الشريان الاورطي والشرايين المتفرعة في الماوس C57Bl6 تغذية نظام غذائي تشاو (الصورة اليسرى) والذين الماوس-/- تغذية نظام غذائي الدهون عالية لمدة 26 أسبوعا (الصورة اليمنى). النجمة تشير إلى وجود آفات تصلب الشرايين. (د) التخطيطي الدانية الشريان الاورطي والشرايين المتفرعة. تمثل الأسهم الحمراء تخفيضات لعزل السباتي الأيمن والشريان براتشيوسيفاليك العزلة وأرقام تشير إلى الترتيب التخفيضات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : تجهيز الأنسجة، والتضمين، وتمزيقها. (أ) صورة فوتوغرافية لكاسيت التضمين مع الأنسجة اتفاق التعاون الأساسي. يتم وضع في اتفاق التعاون الأساسي على وسادة رغوة. (ب) التكبير في لاتفاق التعاون الأساسي المتمركزة على وسادة رغوة. وتتجه اتفاق التعاون الأساسي مع القوس الاورطي القريبة من الجزء تسمية الكاسيت والسباتي مستقيماً عمودياً. شريط المقياس: 1 سم. التخطيطي (ج) من البارافين كتلة بعد تضمين الشريان براتشيوسيفاليك. (د) التخطيطي الشرائح المسلسل مع 10 ميكرون سميكة مقاطع المسلسل مع إشارة إلى المسافة من القوس الاورطي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : لتحديد الآفة تصلب الشرايين ومنطقة كاب الليفي. (A) ميكروجرافس الممثل لمدينة دبي للإنترنت صورة الآفة تصلب الشرايين في الشريان براتشيوسيفاليك المقاطع العرضية من Myh11-لجنة المساواة العرقية/ERT2 R26R-الذين ايفب-/-. لومينال وحدود الصفيحة المرنة الداخلية تكون مترجمة بالأبيض والأصفر السهام، على التوالي (اللوحة اليمنى). تحدد منطقة الآفة بشريط مقياس خط متقطع (اللوحة اليمنى): ميكروجرافس الممثل 100 ميكرومتر. (ب) DIC و ACTA2 تلطيخ. تظهر الأسهم مزدوج الرأس سمك ACTA2 تلوين داخل منطقة كي التجويف تعريف منطقة كاب الليفي. (ج) التحديد الكمي سوبلومينال ACTA2+ سمك في Myh11-Cre/ERT2 R26R-الذين ايفب-/- تغذية حمية عالية الدهون لمدة 18 و 21 و 26 أسبوعا. باستخدام هذه السلالة من الفئران، قد الغطاء الليفي سمك متوسط من 25-30 ميكرومتر في الآفات تصلب الشرايين مقدما. يتم التعبير عن النتائج بمتوسط ± sem. ترسيم (د) منطقة كاب ليفية سميكة 30 ميكرومتر الثابتة لعد خلية مفردة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : عد خلية مفردة باستخدام إيماجيج- يلتقط الشاشة توضح الخطوات الرئيسية لخلية مفردة العد مع إيماجيج في الصور التي حصل عليها [كنفوكل] مجهرية. قناة (A) كل صبغة فردية ومكدس z الفردية مرئية بالتمرير أشرطة c: و z: في الجزء السفلي من الصورة. القنوات Staining الزائفة الملونة باستخدام لوحة القنوات (1) يتم دمج القنوات Staining (يفب، LGALS3، ACTA2، DAPI لتلطيخ النووية ومدينة دبي للإنترنت) باستخدام لوحة دمج قناة (2). (ب) نتائج قناة دمج يفب، LGALS3، ACTA2، DAPI، ومدينة دبي للإنترنت. (ج) نواة عد استناداً إلى تلطيخ DAPI باستخدام رمز العد (1) ولوحة أداة نقطة (2). ويستخدم قناة مضادة مختلفة لكل سكان الخلية (3). وترد أدناه القناة العداد (4) عدد الأحداث التي تم عدها. المستطيل الأبيض: توسيع المنطقة على الحق. (د) صورة تمثيلية من خلية مفردة العد داخل منطقة كاب الليفي (خط متقطع) للسكان خلية متعددة بما في ذلك DAPI (النقاط الصفراء)، خلايا يفب+ (أرجواني النقط)، يفب–LGALS3+ الخلايا (النقاط السماوي)، يفب+LGALS3+ الخلايا (النقاط البرتقالي)، يفب+ACTA2+ الخلايا (النقاط الخضراء)، ويفب–ACTA2+ الخلايا (النقاط الأزرق الداكن). المستطيل الأبيض: توسيع المنطقة على الحق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 : وصف للآثار لتثبيط إيل-1β على تكوين منطقة كاب الليفي في موقعين اتفاق التعاون الأساسي متميزة من النسب SMC تتبع الذين/الفئران الخلوية. (أ) اتفاق التعاون الأساسي عبر المقاطع في 480 ميكرومتر وميكرومتر 780 من القوس الاورطي من الفئران تعامل مع جسم إيل-1β أو مفتش عنصر التحكم كما هو موضح في الشكل 1 كانت الملون يفب، LGALS3، و DAPI (تلطيخ النووية) والقسم تم تصويرها بمدينة دبي للإنترنت. تم دمج القنوات إيمونوفلوريسسينت (لوحات اليمنى السفلي). خطوط متقطعة تحدد مناطق الغطاء الليفي. تغيير حجم أشرطة: 100 ميكرومتر-(ب) خلية مفردة عد يكشف أن تثبيط إيل-1β مرتبط بانخفاض ملحوظ في خلايا يفب+ وزيادة في LGALS3+ الخلايا داخل منطقة كاب الليفي. الخلية ج) "داخل يفب"+ السكان، وانخفاض في يفب+ACTA2+ وزيادة يفب+LGALS3+ احترام السكان. يتم التعبير عن النتائج ك ± يعني التحليل الإحصائي sem.: unpaired الاختبار t متعددة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7 : تأثير تثبيط إيل-1β على عدد RUNX2 + تشوندروجينيك الخلايا مع آفات تصلب الشرايين المتقدمة. اتفاق التعاون الأساسي A) ملطخة المقاطع العرضية يفب، LGALS3، RUNX2، و DAPI (تلطيخ النووية)، وتم دمج جميع القنوات (أسفل لوحات). خطوط متقطعة تحدد منطقة الآفة. تغيير حجم أشرطة: 100 ميكرومتر. ب) خلية مفردة العد يظهر أن تثبيط إيل-1β لا يؤثر العدد الإجمالي من RUNX2+ الخلايا داخل الآفة ولا نسبة RUNX2+ خلايا من أصل SMC (يفب+RUNX2+؛ يفب+LGALS3+RUNX2+) والأصل النقوي (يفب–LGALS3+RUNX2+). يتم التعبير عن نتائج التحليل الإحصائي sem. يعني: Unpaired الاختبار t متعددة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وعلى الرغم من عقود من البحث والتقدم التقني في دراسة تصلب الشرايين، الحقل تاريخاً مخيبة للآمال لترجمة النتائج العلمية للعلاج السريري34،35. ويمكن تفسير هذه الظاهرة في الجزء من التناقضات في نماذج حيوانية وتصاميم تجريبية، وتحليلات للآفة. وهنا، يصف لنا أنبوب تجريبية التي استخدمت لتحليل تكوين الخلوية في الآفات تصلب الشرايين المتقدمة باستخدام النسب تتبع الفئران7. يسمح هذا الأسلوب لإجراء تحقيق دقيق في تعيين مصير الخلايا وفينوتيبينج، التي هي المحددات الرئيسية التي تسيطر عليها آليات محتملة في اللعب في الآفات تصلب الشرايين المتقدمة.

نموذج الماوس تعقب SMC-النسب أداة قوية لتتبع مصير والتحويرات المظهرية هذه النسب وإسهامها إلى تصلب الشرايين المرضية بدقة. يتيح نظام لجنة المساواة العرقية-لوكسب تاموكسيفين إيندوسيبلي وسم من ناضجة SMC الأوعية الدموية إذ تعرب عن MYH11 قبل الشروع في تصلب الشرايين. استخدام هذا النظام أدلة دامغة أثبت أنه لويحات تصلب الشرايين بدرجة عالية من البلاستيك ويمكن الخضوع SMC الأوعية الدموية التبديل المظهرية، تفقد النمط الظاهري الهوس وعلامات محددة SMC، المتكاثرة، وترحيل، وحتى ترانسديفيرينتياتينج إلى بلعم تشبه الخلايا17،18. في هذا البروتوكول، نعرض الكشف عن كيفية تعقب النسب وتلطيخ إيمونوفلوريسسينت لعلامات فائدة يمكن أن تكون متكاملة لتحديد دقة المظهرية التحولات التي اضطلعت بها SMC وتواترها النسبي بين سائر السكان SMC.

هذه المنهجية مكمل عالية مع فحوصات أخرى إجراء بشكل متكرر في الميدان. أولاً، تقييم عبء تصلب الشرايين الآفة استعدادات الابهري الوجه أون جنبا إلى جنب مع الدهن تلطيخ الرابع السودان يستخدم على نطاق واسع نظراً لسهولة وسرعة. ومع ذلك، هذا تدبير عدم كفاية مفتاح معلمات المورفولوجية مثل حجم الآفة وحجم التجويف وإعادة عرض السفينة. تلوين الوجه أون الابهري "السودان الرابع" إعداد تصور ترسب الدهن يمكن استخدامها لتحديد حجم منطقة الآفة النسبية داخل الشريان الاورطي، ولكن يمكن أن توفر غير متناسقة تلطيخ من الآفات، كعنصر محايد في الدهون فقط هو تصور بينما المناطق المحتلة بمكونات أخرى، مثل المصفوفة خارج الخلية، وعادة ما تكون مهملة8. وعلاوة على ذلك، تلطيخ الوجه أون غير قادر على إطلاع مورفولوجية الآفة ولا يميز بين الشرائط الدهنية والآفات المتقدمة. مورفولوجيا السفينة معلمة هامة تستخدم لتقييم مخاطر المرحلة وتمزق تصلب الشرايين، بما في ذلك حجم الآفة، قطر التجويف، سفينة إعادة عرض7،،من3637. هذه التحاليل تتطلب المحافظة على مورفولوجية السفينة للقياس الكمي المناسب. الأهم من ذلك، إلى حد كبير بروتوكولات لتحقيق معلمات المورفولوجية تتداخل مع البروتوكول بالتفصيل هنا. على وجه الخصوص، أنها تعتمد على استخدام نظام التروية الوعائية يحركها الجاذبية لبرنامج تلفزيوني ونضح مثبت لتوفير قدر أكبر من الاتساق في الضغوط التي مورست. النظام يحركها خطورة تسلل يضمن سرعة التدفق المستمر والضغط بين كل الماوس المستقلة ويمنع تضارب اليدوي نضح يحركها القوة بين التجارب المستقلة أو الباحثين. وينبغي إقامة نظام التروية الجاذبية للحث على التروية في ضغط القرب من متوسط ضغط الدم موريني (70-120 ملم زئبق). وثانيا، قدمنا أسلوب موحد ومنهجي للتضمين وتمزيقها للشريان براتشيوسيفاليك. عن طريق تحديد موقع بداية تمزيقها والتحديد الكمي لمنطقة الآفة في مواقع متعددة في جميع أنحاء الشريان براتشيوسيفاليك، يمكن أن نقصر التباين العشوائي الذي يأتي مع أخذ عينات محدودة.

التدفق الخلوي هو تقنية أخرى تكميلية عالية مع إيمونوفلوريسسينت تلطيخ يقترن مع العد خلية واحدة فقط التي تم استخدامها على نطاق واسع في التحديد الكمي للسكان خلية ضمن آفات تصلب الشرايين38. تتكون من هضم الماوس الشريان الاورطي وتسمية الخلايا تم إصدارها مع الأجسام المضادة الفلورسنت. تدفق عروض الخلوي تحليل الكمي للسكان الخلوية الموجودة في الشريان الاورطي. ومع ذلك، مثل جميع التكنولوجيات، التدفق الخلوي على القيود. وعلى الرغم من فائدة متميزة من تركيب مجموعة كبيرة من علامات متزامنة، هناك فقدان كامل للقرار المكانية، ويصبح غير واضح ما إذا كان هو إثراء سكان خلية في الغطاء الليفي أو لب نخرية. بالإضافة إلى ذلك، هناك خطر تمييع أثر التدفق الخلوي يتطلب عدد كبير من الخلايا وغالباً ما لا يركز فقط على مناطق تصلب الشرايين. ولهذا السبب، يمكن استخدام الفلورة والتدفق الخلوي بطريقة تكاملية للسماح للتنميط الأبعاد عالية وتوطين الآفة.

أخيرا، يركز البروتوكول على التحديد الكمي للسكان SMC في اتفاق التعاون الأساسي المتقدم الآفة باستخدام مقاطع الأنسجة الثابتة بارافورمالدهيد وجزءاً لا يتجزأ من البارافين. ومع ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في أسرة الأوعية الدموية الأخرى بما في ذلك جذر الاورطي أو الشريان الاورطي البطني، الإقليمين الأوعية الدموية رهنا بتطوير تصلب الشرايين. وكانت معالجة منهجية وتمزيقها لجذر الابهر سابقا وصفاً جيدا8،39. كما تطور تصلب الشرايين في مواقع مختلفة، وأن التلاعب بالجينات أو التدخل العلاجي غير المتجانسة يمكن أن تؤثر هذه المواقع21، من المهم أن التحقيق العديد من الأوعية الدموية الأسرة قدر الإمكان استخلاص نتائج دقيقة. تلوين إيممونوفلوريسسينت والعد خلية مفردة يمكن أيضا إجراء باستخدام الأجزاء المجمدة. قد يكون هذا ضروريا بسبب عدم التوافق بين الأجسام المضادة مع مقاطع البارافين. على الرغم من نضح الحيوانية وأنسجة التضمين سوف تختلف من هذا البروتوكول، يمكن تتبع المحققون بقية الإجراءات التجريبية المذكورة هنا.

وفي الختام، الأساليب الموصوفة هنا مخطط مقاربة منهجية لتحليل السكان خلية الآفة وتعمل في مرحلة متأخرة موريني تصلب الشرايين. هذا البروتوكول يمكن أن تخدم كقالب للتحقيق السكان الآفة تلطيخ إيمونوفلوريسسينت في جميع أنواع التصميم التجريبي بما في ذلك تصلب الشرايين المبكر والمرحلة المتأخرة، فضلا عن دراسات الوقاية والتدخل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونشكر المركز "التصوير البيولوجية" (بدعم من المعهد الوطني للصحة 1S10OD019973-01) في جامعة بيتسبرغ لمساعدتها. وأيد هذا العمل التي تدعمها "منحة التنمية العلمية" وأيده 15SDG25860021 من "جمعية القلب الأمريكية" للإدارة العامة R.A.B. المعاهد الوطنية للصحة منح F30 HL136188.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences RT 15710 Tissue perfusion and fixation
23G butterfly needle Fisher BD367342
25G needle Fisher 14-821-13D 
A1 Confocal microscope Nikon Confocal microscope
ACTA2-FITC antibody (mouse) Sigma Aldrich F3777 Primary Antibody
Alexa-647 anti goat Invitrogen A-21447 Secondary antibody
Antigen Unmasking solution, Citric acid based Vector Labs H-3300 Antigen retrieval solution
Chow Diet Harlan Teklad TD.7012
Coverslip Fisher 12-544-14 Any 50 x 24 mm cover glass
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 Nucleus fluorescent counterstaining
Donkey Alexa-488 anti-rabbit Invitrogen A-21206 Secondary antibody
Donkey Alexa-555 anti-rat Abcam ab150154 Secondary antibody
DPBS 10X without Calcium and Magnesium Gibco 14200166 PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water
Embedding cassette Fisher 15-182-701D
ETDA vacuum tube Fisher 02-685-2B
Ethanol 200 proof Decon 2701
Foam pad Fisher 22-222-012
Gelatin from cold water fish skin Sigma Aldrich G7765
GFP antibody (goat) abcam ab6673 Primary antibody
goat IgG control Vector Labs I-5000 IgG control
High Fat Diet Harlan Teklad TD.88137
ImageJ NIH Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ 
LGALS3 antibody (rat) Cedarlane CL8942AP Primary antibody
LSM700 confocal microscope Zeiss Confocal microscope
Microscope Slides, Superfrost Plus Fisher 12-550-15
Microtome blades Fisher 30-538-35
Mouse IgG control Vector Labs I-2000 IgG control
NIS element imaging software Nikon Imaging software for z-stack image acquisition
Normal Horse serum Sigma Aldrich H1270
Pap Pen Fisher 50-550-221
Peanut oil Sigma P2144
Prolong gold Antifade mountant Invitrogen P36930 Mounting medium 
Rabbit IgG control Vector Labs I-1000 IgG control
Rat IgG control Vector Labs I-4000 IgG control
RUNX2 antibody (rabbit) Abcam ab192256 Primary Antibody
Syringe BD 309628 1 ml syringe
Tamoxifen Sigma T5648
Xylene Fisher X55K-4
Zen imaging software Zeiss Imaging software for z-stack image acquisition

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. GBD DALYs and HALE Collaborators. Global, regional, and national disability-adjusted life-years (DALYs) for 315 diseases and injuries and healthy life expectancy (HALE), 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet. 388 (10053), 1603-1658 (2016).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137 (12), 67-92 (2018).
  3. Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32 (1), 40-51 (2014).
  4. Bhaskar, V., et al. Monoclonal antibodies targeting IL-1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in Apolipoprotein E-deficient mice. Atherosclerosis. 216 (2), 313-320 (2011).
  5. Isoda, K., et al. Lack of interleukin-1 receptor antagonist modulates plaque composition in apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (6), 1068-1073 (2004).
  6. Kirii, H., et al. Lack of interleukin-1beta decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (4), 656-660 (2003).
  7. Gomez, D., et al. Interleukin-1β has atheroprotective effects in advanced atherosclerotic lesions of mice. Nature Medicine. 24, 1418-1429 (2018).
  8. Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 121 (6), 53-79 (2017).
  9. Baylis, R. A., Gomez, D., Owens, G. K. Shifting the Focus of Preclinical, Murine Atherosclerosis Studies From Prevention to Late-Stage Intervention. Circulation Research. 120 (5), 775-777 (2017).
  10. Kolodgie, F. D., et al. Pathologic assessment of the vulnerable human coronary plaque. Heart. 90 (12), 1385-1391 (2004).
  11. Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20 (5), 1262-1275 (2000).
  12. Gomez, D., Owens, G. K. Smooth muscle cell phenotypic switching in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 95 (2), 156-164 (2012).
  13. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).
  14. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circulation Research. 104 (6), 733-741 (2009).
  15. Gomez, D., Shankman, L. S., Nguyen, A. T., Owens, G. K. Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections. Nature Methods. 10 (2), 171-177 (2013).
  16. Feil, S., et al. Transdifferentiation of vascular smooth muscle cells to macrophage-like cells during atherogenesis. Circulation Research. 115 (7), 662-667 (2014).
  17. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nature Medicine. 21, 628 (2015).
  18. Cherepanova, O. A., et al. Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective. Nature Medicine. 22, 657 (2016).
  19. Albarran-Juarez, J., Kaur, H., Grimm, M., Offermanns, S., Wettschureck, N. Lineage tracing of cells involved in atherosclerosis. Atherosclerosis. 251, 445-453 (2016).
  20. Chappell, J., et al. Extensive Proliferation of a Subset of Differentiated, yet Plastic, Medial Vascular Smooth Muscle Cells Contributes to Neointimal Formation in Mouse Injury and Atherosclerosis Models. Circulation Research. 119 (12), 1313-1323 (2016).
  21. Newman, A. A., et al. Irradiation abolishes smooth muscle investment into vascular lesions in specific vascular beds. JCI Insight. 3 (15), (2018).
  22. Dobnikar, L., et al. Disease-relevant transcriptional signatures identified in individual smooth muscle cells from healthy mouse vessels. Nature Communications. 9 (1), 4567 (2018).
  23. Misra, A., et al. Integrin beta3 regulates clonality and fate of smooth muscle-derived atherosclerotic plaque cells. Nature Communications. 9 (1), 2073 (2018).
  24. Majesky, M. W., et al. Differentiated Smooth Muscle Cells Generate a Subpopulation of Resident Vascular Progenitor Cells in the Adventitia Regulated by Klf4. Circulation Research. 120 (2), 296-311 (2017).
  25. Herring, B. P., Hoggatt, A. M., Burlak, C., Offermanns, S. Previously differentiated medial vascular smooth muscle cells contribute to neointima formation following vascular injury. Vascular Cell. 6, 21 (2014).
  26. Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Science Translational Medicine. 7 (308), (2015).
  27. Bentzon, J. F., Majesky, M. W. Lineage tracking of origin and fate of smooth muscle cells in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 114 (4), 492-500 (2018).
  28. Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nature Medicine. 14 (1), 64-68 (2008).
  29. Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14 (5), Pt 1 405-408 (2001).
  30. Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2408-2415 (2004).
  31. Durgin, B. G., et al. Smooth muscle cell-specific deletion of Col15a1 unexpectedly leads to impaired development of advanced atherosclerotic lesions. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 943-958 (2017).
  32. Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
  33. Lin, M. E., et al. Runx2 Deletion in Smooth muscle Cells Inhibits Vascular Osteochondrogenesis and Calcification but not Atherosclerotic Lesion Formation. Cardiovascular Research. , (2016).
  34. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
  35. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  36. Nishioka, T., et al. Contribution of inadequate compensatory enlargement to development of human coronary artery stenosis: An in vivo intravascular ultrasound study. Journal of the American College of Cardiology. 27 (7), 1571-1576 (1996).
  37. Pasterkamp, G., et al. Paradoxical Arterial-Wall Shrinkage May Contribute to Luminal Narrowing of Human Atherosclerotic Femoral Arteries. Circulation. 91 (5), 1444-1449 (1995).
  38. Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
  39. Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative analysis and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus. Journal of Visual Experiments. (82), 50933 (2013).

Tags

الطب والمسألة 144، تصلب الشرايين، تصلب الشرايين الآفة، الشريان براتشيوسيفاليك، إعداد الأنسجة وتمزيقها، إيمونوهيستوتشيميستري، الفلورة، الفحص المجهري [كنفوكل]
التحليل الكمي لتكوينها الخلوي في الآفات تصلب الشرايين المتقدمة للعضلات الملساء خلية تتبع النسب الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mahan, S., Liu, M., Baylis, R. A.,… More

Mahan, S., Liu, M., Baylis, R. A., Gomez, D. Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice. J. Vis. Exp. (144), e59139, doi:10.3791/59139 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter