Summary

Kvantitativ analyse af cellulære sammensætning i avancerede aterosklerotiske læsioner af glat muskel celle afstamning sporingen mus

Published: February 20, 2019
doi:

Summary

Vi foreslår en standardiseret protokol for at karakterisere den cellulære sammensætning af sene murine aterosklerotiske læsioner herunder systematiske metoder til animalsk dissektion, væv indlejring, skæring, farvning og analyse af brachiocephalic arterier fra atheroprone glat muskel celle afstamning sporingen mus.

Abstract

Åreforkalkning er stadig den hyppigste årsag til dødsfald på verdensplan, og trods utallige prækliniske undersøgelser beskriver lovende terapeutiske mål, Roman interventioner har forblev undvigende. Dette er sandsynligvis skyldes, dels at en afhængighed af prækliniske forebyggelse modeller undersøge effekten af genetiske manipulationer eller farmakologiske behandlinger på udvikling af åreforkalkning snarere end de etablerede sygdom. Også, resultaterne af disse undersøgelser er ofte forstyrrende på grund af brugen af overfladisk læsion analyser og manglende karakterisering af læsioner cellepopulationer. For at hjælpe med at overvinde disse translationel forhindringer, foreslår vi en øget afhængighed af intervention modeller, der beskæftiger undersøgelse af ændringer i cellulære sammensætning på en enkelt celle niveau af immunfluorescent farvning og konfokal mikroskopi. Til dette formål beskriver vi en protokol for at teste en formodede terapeutisk agens i en murine intervention model herunder en systematisk tilgang til animalsk dissektion, indlejring, skæring, farvning og kvantificering af brachiocephalic arterie læsioner. Derudover den fænotypisk variation af celler i sene aterosklerotiske læsioner beskriver vi betydningen af at bruge celle-specifikke, inducerbar afstamning sporingen mus systemer og hvordan dette kan udnyttes til upartiske karakterisering af aterosklerotiske læsioner cellepopulationer. Sammen, disse strategier kan hjælpe vaskulære biologer at mere præcist model terapeutiske interventioner og analysere aterosklerotisk sygdom og forhåbentlig vil oversætte til en højere sats for succes i kliniske forsøg.

Introduction

Åreforkalkning er den hyppigste årsag til sygelighed og dødelighed på verdensplan ligger bag flertallet af koronar arteriesygdom, perifer arterie sygdomme og slagtilfælde. Sene koronar aterosklerose kan føre til alvorlige komplikationer, herunder Myokardie overtrædelse tegner sig for næsten 16% af verdens befolkning dødelighed1,2. På grund af dens ødelæggende indvirkning på folkesundheden, er der sket betydelige indsats at dechifrere de mekanismer, der driver åreforkalkning progression, samt for at udvikle nye terapeutiske strategier. Endnu, sandsynligheden for godkendelse (LOA) satsen for kliniske forsøg for hjerte-kar-sygdom er blandt de laveste sammenlignet med andre kliniske felter (kun 8,7% for fase I)3. Dette kan forklares i en del af mange hindringer at åreforkalkning udgør for effektive stof udvikling herunder dens næsten allestedsnærværende, klinisk tavs progression og betydelig sygdom heterogenitet. Suboptimal udformningen af prækliniske dyreforsøg kan desuden også være regnskabsmæssigt manglende succes i klinisk oversættelse. Specifikt, mener vi, at det er nødvendigt at gennemføre intervention undersøgelser når det er muligt at undersøge effekten af terapeutiske strategier. Der er også et kritisk behov for at udføre standardiserede procedurer for læsion analyser herunder avancerede karakterisering af sene aterosklerotisk læsion cellulære sammensætning af skæbne kortlægning og fænotyper.

Langt størstedelen af åreforkalkning studier fokusere på modeller af åreforkalkning forebyggelse bestående af narkotika behandling eller gen manipulation (knockout eller knock-in) i sunde unge mus, inden sygdommen indledningen og progression. Disse undersøgelser har afsløret en lang række gener og signalering molekyler, der spiller en rolle i udvikling af åreforkalkning. Men de fleste af disse mål ikke at oversætte til effektive behandlinger i menneskelige. Det er vanskeligt at ekstrapolere den effekt en terapi har på sunde unge mus til ældre patienter med avanceret aterosklerotiske læsioner. Som sådan, giver gennemførelsen af intervention undersøgelser i prækliniske eksperimentelle rørledningen sandsynligvis en mere præcis skildring af relevans og effektivitet af en ny terapeutisk. Ideen er støttet af de påfaldende divergerende virkningerne af hæmme det pro-inflammatoriske cytokine Interleukin-1β (IL-1β), når ansætte en forebyggelse4,5,6 eller intervention strategi7. Forskelle mellem forebyggelse og intervention undersøgelser tyder på, at forskellige cellulære processer forekomme på forskellige faser af udvikling af åreforkalkning og fremhæver, at forebyggende undersøgelser er sandsynligvis utilstrækkelig til at modellere den kliniske scenario tilstrækkeligt.

American Heart Association for nylig offentliggjort en videnskabelig udtalelse beskriver anbefalinger for ordentlig eksperimentelle design, proceduremæssige standardisering, analyse og rapportering af animalske åreforkalkning undersøgelser8. Det fremhæver de fordele og begrænsninger af dominerende teknikker, der anvendes i feltet. For eksempel, er da ansigt Sudan IV farvning af aorta ofte udført som en første udlæsning. Selv om en ansigt Sudan IV farvning af lipid deposition er en velegnet metode til vurdering af globale plaque byrde, er det ude af stand til at skelne debuterende fede streak læsioner fra mere avancerede sene læsioner. Som sådan er er fortolkningen af en ansigt farvning ofte tvetydige og overfladiske9. Omhyggelig analyse af væv tværsnit ved hjælp af morfologiske parametre fartøj, læsion og lumen størrelse og kvantificering af indeks af læsion stabilitet giver en mere præcis forståelse af effekten af et eksperiment.

Endelig, menneskelige histopatologiske undersøgelser har antydet, at cellulære sammensætning er en bedre indikator for brud end læsion størrelse, med læsioner fattige i glatte muskelceller (SMC), rige i makrofager at være mere modtagelige for briste10, 11. Disse observationer blev baseret på farvning for markører klassisk bruges til celle identifikation (dvs. ACTA2 for SMC og LGALS3 eller CD68 til makrofager). Udtryk for disse markører er imidlertid ikke strengt begrænset til en enkelt celletype i aterosklerotiske læsioner på grund af plasticitet af flere slægter herunder SMC, endotelceller og myeloide celler12. Den entydige identifikation af SMC inden for aterosklerotisk læsion var især næsten umuligt indtil det seneste årti på grund af egenskaben for disse celler til dedifferentiate og undertrykke deres slægt-specifikke markørgener (en proces, der er nævnt som fænotypisk switching) i tilskadekomne eller syge fartøjer13. Denne begrænsning i SMC identifikation er omgået ved udviklingen af afstamning sporingen7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. det består af permanent mærkning SMC og deres afkom for at spore deres skæbne og fænotypiske evolution under åreforkalkning progression ved hjælp af en kombination af udtryk af Cre recombinase drevet af SMC-specifikke initiativtagere (dvs., Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24, Acta225,26 og SM22α14,16) og aktivering af journalister (fx fluorescerende proteiner, β-galactosidase) [gennemgik i Bentzon og Majesky 201827]. I en af de første undersøgelser beskæftiger SMC afstamning sporingen uden for embryogenese indstilling, Speer et al.14 fremlagde beviser for, at SMC kan modulere deres fænotype og transdifferentiate i chondrogenic celler under vaskulære forkalkning ved hjælp af en SM22α Cre R26R LacZ afstamning sporingen model. Selv om disse undersøgelser banebrydende SMC afstamning sporingen, var de delvist tvetydige, idet enhver given ikke-SMC udtrykker SM22α i fastsættelsen af sygdommen vil være mærket af journalisten. Denne begrænsning er blevet omgået af udvikling og brug af tamoxifen-inducerbar Cre ERT/LoxP tillader en tidsmæssig kontrol af celle mærkning. Celle mærkning forekommer udelukkende i tamoxifen levering og vil være begrænset til cellen at udtrykke celle type-specifikke promotor kørsel Cre ERT udtryk samtidig med tamoxifen eksponering, undgå sporing af alternative celletyper aktivering Cre i den indstilling af sygdomsprogression. For afstamning sporingen af SMC i åreforkalkning, tamoxifen-inducerbar Myh11– Cre/ERT2 transgenet forbundet med fluorescerende journalister (eYFP7,15,17,18 , 21, mTmG19,25, konfetti20,22,23 for klonal ekspansion studier) har udvist en bemærkelsesværdig effektiviteten og specificiteten i SMC mærkning og har været brugt til skæbne kort SMC populationer i aterosklerotiske læsioner i nyere undersøgelser. Vigtigere, disse undersøgelser viste, at: 1) 80% af SMC inden for avanceret aterosklerotiske læsioner ikke udtrykke nogen konventionel SMC markører (ACTA2, MYH11) bruges i immunohistological analyse og derfor ville have været fejlidentificerede uden afstamning sporingen 17; 2) delmængder af SMC express markører for alternative celletyper, herunder makrofag markører eller mesenkymale stamceller markører16,17,19; og 3) SMC investere og udfylde den aterosklerotiske læsion af oligoklonale ekspansion og SMC kloner bevarer plasticitet til overgangen til fænotype forskellige populationer20,23. For at opsummere, er det nu klart, at glatte muskelceller præsentere en bemærkelsesværdig fænotypiske mangfoldighed i aterosklerotiske læsioner og kan have gavnlige eller skadelige roller på læsion patogenese afhængigt af arten af deres fænotypiske overgange. Disse opdagelser repræsenterer en bemærkelsesværdig nye terapeutiske avenue til målretning SMC athero-fremme fænotypiske overgange i sene åreforkalkning.

Heri, foreslår vi en standardiseret protokol til at analysere sene murine aterosklerotiske læsioner herunder systematiske metoder til animalsk dissektion, indlejring, skæring, farvning og kvantificering af brachiocephalic arterie læsioner. For at bestemme virkningen af Interleukin-1β hæmning på SMC skæbne og fænotype, brugte vi SMC lineage sporing ApoE– / – mus fodret en vestlig kost for 18 uger før modtager ugentlige injektioner af en anti-IL1β antistof eller isotype-matchede IgG kontrol.

Protocol

Dyreavl, håndtering og procedurer blev godkendt ved University of Virginia og University of Pittsburgh institutionelle dyrs pleje og brug udvalget. 1. generation af SMC afstamning sporingen mus Yngle Myh11- Cre/ERT2 hanner28 (Jackson laboratorium; #019079) med R26R-EYFP kvinder (Jackson laboratorium; #006148) til at opnå Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/ + hanner. Yngle Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EY…

Representative Results

Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / – mus blev sprøjtet med tamoxifen mellem seks og otte ugens i alder før fodres en høj fedt diæt. På 18 uger af højt fedtindhold kost fodring, blev to grupper af otte mus behandlet ugentligt med enten et monoklonalt muse-antistof, anti-IL-1β eller en isotype-matchede IgG kontrol på 10 mg/kg for 8 uger (figur 1)7. Mus blev ofret og perfunderet med en 4% PFA-PBS løsning. Brach…

Discussion

Trods årtiers forskning og tekniske fremskridt i at studere åreforkalkning, har feltet en skuffende historie omsætte videnskabelige resultater til klinisk terapier34,35. Dette fænomen kan forklares tildels ved uoverensstemmelser i dyremodeller, eksperimenterende design og læsion analyser. Heri, beskriver vi en eksperimentel rørledning, som vi brugte til at analysere den cellulære sammensætning i avancerede aterosklerotiske læsioner ved hjælp af afstamni…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker centrum for biologiske Imaging (støttet af NIH 1S10OD019973-01) på University of Pittsburgh for deres bistand. Dette arbejde blev støttet af er understøttet af videnskabelige udvikling Grant 15SDG25860021 fra American Heart Association til D.G. R.A.B. blev støttet af NIH give F30 HL136188.

Materials

16% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences RT 15710 Tissue perfusion and fixation
23G butterfly needle Fisher BD367342
25G needle Fisher 14-821-13D 
A1 Confocal microscope Nikon Confocal microscope
ACTA2-FITC antibody (mouse) Sigma Aldrich F3777 Primary Antibody
Alexa-647 anti goat Invitrogen A-21447 Secondary antibody
Antigen Unmasking solution, Citric acid based Vector Labs H-3300 Antigen retrieval solution
Chow Diet Harlan Teklad TD.7012
Coverslip Fisher 12-544-14 Any 50 x 24 mm cover glass
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 Nucleus fluorescent counterstaining
Donkey Alexa-488 anti-rabbit Invitrogen A-21206 Secondary antibody
Donkey Alexa-555 anti-rat Abcam ab150154 Secondary antibody
DPBS 10X without Calcium and Magnesium Gibco 14200166 PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water
Embedding cassette Fisher 15-182-701D
ETDA vacuum tube Fisher 02-685-2B
Ethanol 200 proof Decon 2701
Foam pad Fisher 22-222-012
Gelatin from cold water fish skin Sigma Aldrich G7765
GFP antibody (goat) abcam ab6673 Primary antibody
goat IgG control Vector Labs I-5000 IgG control
High Fat Diet Harlan Teklad TD.88137
ImageJ NIH Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ 
LGALS3 antibody (rat) Cedarlane CL8942AP Primary antibody
LSM700 confocal microscope Zeiss Confocal microscope
Microscope Slides, Superfrost Plus Fisher 12-550-15
Microtome blades Fisher 30-538-35
Mouse IgG control Vector Labs I-2000 IgG control
NIS element imaging software Nikon Imaging software for z-stack image acquisition
Normal Horse serum Sigma Aldrich H1270
Pap Pen Fisher 50-550-221
Peanut oil Sigma P2144
Prolong gold Antifade mountant Invitrogen P36930 Mounting medium 
Rabbit IgG control Vector Labs I-1000 IgG control
Rat IgG control Vector Labs I-4000 IgG control
RUNX2 antibody (rabbit) Abcam ab192256 Primary Antibody
Syringe BD 309628 1 ml syringe
Tamoxifen Sigma T5648
Xylene Fisher X55K-4
Zen imaging software Zeiss Imaging software for z-stack image acquisition

References

  1. GBD DALYs and HALE Collaborators. Global, regional, and national disability-adjusted life-years (DALYs) for 315 diseases and injuries and healthy life expectancy (HALE), 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet. 388 (10053), 1603-1658 (2016).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137 (12), 67-92 (2018).
  3. Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32 (1), 40-51 (2014).
  4. Bhaskar, V., et al. Monoclonal antibodies targeting IL-1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in Apolipoprotein E-deficient mice. Atherosclerosis. 216 (2), 313-320 (2011).
  5. Isoda, K., et al. Lack of interleukin-1 receptor antagonist modulates plaque composition in apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (6), 1068-1073 (2004).
  6. Kirii, H., et al. Lack of interleukin-1beta decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (4), 656-660 (2003).
  7. Gomez, D., et al. Interleukin-1β has atheroprotective effects in advanced atherosclerotic lesions of mice. Nature Medicine. 24, 1418-1429 (2018).
  8. Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 121 (6), 53-79 (2017).
  9. Baylis, R. A., Gomez, D., Owens, G. K. Shifting the Focus of Preclinical, Murine Atherosclerosis Studies From Prevention to Late-Stage Intervention. Circulation Research. 120 (5), 775-777 (2017).
  10. Kolodgie, F. D., et al. Pathologic assessment of the vulnerable human coronary plaque. Heart. 90 (12), 1385-1391 (2004).
  11. Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20 (5), 1262-1275 (2000).
  12. Gomez, D., Owens, G. K. Smooth muscle cell phenotypic switching in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 95 (2), 156-164 (2012).
  13. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).
  14. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circulation Research. 104 (6), 733-741 (2009).
  15. Gomez, D., Shankman, L. S., Nguyen, A. T., Owens, G. K. Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections. Nature Methods. 10 (2), 171-177 (2013).
  16. Feil, S., et al. Transdifferentiation of vascular smooth muscle cells to macrophage-like cells during atherogenesis. Circulation Research. 115 (7), 662-667 (2014).
  17. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nature Medicine. 21, 628 (2015).
  18. Cherepanova, O. A., et al. Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective. Nature Medicine. 22, 657 (2016).
  19. Albarran-Juarez, J., Kaur, H., Grimm, M., Offermanns, S., Wettschureck, N. Lineage tracing of cells involved in atherosclerosis. Atherosclerosis. 251, 445-453 (2016).
  20. Chappell, J., et al. Extensive Proliferation of a Subset of Differentiated, yet Plastic, Medial Vascular Smooth Muscle Cells Contributes to Neointimal Formation in Mouse Injury and Atherosclerosis Models. Circulation Research. 119 (12), 1313-1323 (2016).
  21. Newman, A. A., et al. Irradiation abolishes smooth muscle investment into vascular lesions in specific vascular beds. JCI Insight. 3 (15), (2018).
  22. Dobnikar, L., et al. Disease-relevant transcriptional signatures identified in individual smooth muscle cells from healthy mouse vessels. Nature Communications. 9 (1), 4567 (2018).
  23. Misra, A., et al. Integrin beta3 regulates clonality and fate of smooth muscle-derived atherosclerotic plaque cells. Nature Communications. 9 (1), 2073 (2018).
  24. Majesky, M. W., et al. Differentiated Smooth Muscle Cells Generate a Subpopulation of Resident Vascular Progenitor Cells in the Adventitia Regulated by Klf4. Circulation Research. 120 (2), 296-311 (2017).
  25. Herring, B. P., Hoggatt, A. M., Burlak, C., Offermanns, S. Previously differentiated medial vascular smooth muscle cells contribute to neointima formation following vascular injury. Vascular Cell. 6, 21 (2014).
  26. Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Science Translational Medicine. 7 (308), (2015).
  27. Bentzon, J. F., Majesky, M. W. Lineage tracking of origin and fate of smooth muscle cells in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 114 (4), 492-500 (2018).
  28. Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nature Medicine. 14 (1), 64-68 (2008).
  29. Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14 (5), 405-408 (2001).
  30. Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D’Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2408-2415 (2004).
  31. Durgin, B. G., et al. Smooth muscle cell-specific deletion of Col15a1 unexpectedly leads to impaired development of advanced atherosclerotic lesions. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 943-958 (2017).
  32. Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
  33. Lin, M. E., et al. Runx2 Deletion in Smooth muscle Cells Inhibits Vascular Osteochondrogenesis and Calcification but not Atherosclerotic Lesion Formation. Cardiovascular Research. , (2016).
  34. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
  35. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  36. Nishioka, T., et al. Contribution of inadequate compensatory enlargement to development of human coronary artery stenosis: An in vivo intravascular ultrasound study. Journal of the American College of Cardiology. 27 (7), 1571-1576 (1996).
  37. Pasterkamp, G., et al. Paradoxical Arterial-Wall Shrinkage May Contribute to Luminal Narrowing of Human Atherosclerotic Femoral Arteries. Circulation. 91 (5), 1444-1449 (1995).
  38. Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
  39. Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative analysis and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus. Journal of Visual Experiments. (82), 50933 (2013).

Play Video

Cite This Article
Mahan, S., Liu, M., Baylis, R. A., Gomez, D. Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice. J. Vis. Exp. (144), e59139, doi:10.3791/59139 (2019).

View Video