Vi foreslår en standardiseret protokol for at karakterisere den cellulære sammensætning af sene murine aterosklerotiske læsioner herunder systematiske metoder til animalsk dissektion, væv indlejring, skæring, farvning og analyse af brachiocephalic arterier fra atheroprone glat muskel celle afstamning sporingen mus.
Åreforkalkning er stadig den hyppigste årsag til dødsfald på verdensplan, og trods utallige prækliniske undersøgelser beskriver lovende terapeutiske mål, Roman interventioner har forblev undvigende. Dette er sandsynligvis skyldes, dels at en afhængighed af prækliniske forebyggelse modeller undersøge effekten af genetiske manipulationer eller farmakologiske behandlinger på udvikling af åreforkalkning snarere end de etablerede sygdom. Også, resultaterne af disse undersøgelser er ofte forstyrrende på grund af brugen af overfladisk læsion analyser og manglende karakterisering af læsioner cellepopulationer. For at hjælpe med at overvinde disse translationel forhindringer, foreslår vi en øget afhængighed af intervention modeller, der beskæftiger undersøgelse af ændringer i cellulære sammensætning på en enkelt celle niveau af immunfluorescent farvning og konfokal mikroskopi. Til dette formål beskriver vi en protokol for at teste en formodede terapeutisk agens i en murine intervention model herunder en systematisk tilgang til animalsk dissektion, indlejring, skæring, farvning og kvantificering af brachiocephalic arterie læsioner. Derudover den fænotypisk variation af celler i sene aterosklerotiske læsioner beskriver vi betydningen af at bruge celle-specifikke, inducerbar afstamning sporingen mus systemer og hvordan dette kan udnyttes til upartiske karakterisering af aterosklerotiske læsioner cellepopulationer. Sammen, disse strategier kan hjælpe vaskulære biologer at mere præcist model terapeutiske interventioner og analysere aterosklerotisk sygdom og forhåbentlig vil oversætte til en højere sats for succes i kliniske forsøg.
Åreforkalkning er den hyppigste årsag til sygelighed og dødelighed på verdensplan ligger bag flertallet af koronar arteriesygdom, perifer arterie sygdomme og slagtilfælde. Sene koronar aterosklerose kan føre til alvorlige komplikationer, herunder Myokardie overtrædelse tegner sig for næsten 16% af verdens befolkning dødelighed1,2. På grund af dens ødelæggende indvirkning på folkesundheden, er der sket betydelige indsats at dechifrere de mekanismer, der driver åreforkalkning progression, samt for at udvikle nye terapeutiske strategier. Endnu, sandsynligheden for godkendelse (LOA) satsen for kliniske forsøg for hjerte-kar-sygdom er blandt de laveste sammenlignet med andre kliniske felter (kun 8,7% for fase I)3. Dette kan forklares i en del af mange hindringer at åreforkalkning udgør for effektive stof udvikling herunder dens næsten allestedsnærværende, klinisk tavs progression og betydelig sygdom heterogenitet. Suboptimal udformningen af prækliniske dyreforsøg kan desuden også være regnskabsmæssigt manglende succes i klinisk oversættelse. Specifikt, mener vi, at det er nødvendigt at gennemføre intervention undersøgelser når det er muligt at undersøge effekten af terapeutiske strategier. Der er også et kritisk behov for at udføre standardiserede procedurer for læsion analyser herunder avancerede karakterisering af sene aterosklerotisk læsion cellulære sammensætning af skæbne kortlægning og fænotyper.
Langt størstedelen af åreforkalkning studier fokusere på modeller af åreforkalkning forebyggelse bestående af narkotika behandling eller gen manipulation (knockout eller knock-in) i sunde unge mus, inden sygdommen indledningen og progression. Disse undersøgelser har afsløret en lang række gener og signalering molekyler, der spiller en rolle i udvikling af åreforkalkning. Men de fleste af disse mål ikke at oversætte til effektive behandlinger i menneskelige. Det er vanskeligt at ekstrapolere den effekt en terapi har på sunde unge mus til ældre patienter med avanceret aterosklerotiske læsioner. Som sådan, giver gennemførelsen af intervention undersøgelser i prækliniske eksperimentelle rørledningen sandsynligvis en mere præcis skildring af relevans og effektivitet af en ny terapeutisk. Ideen er støttet af de påfaldende divergerende virkningerne af hæmme det pro-inflammatoriske cytokine Interleukin-1β (IL-1β), når ansætte en forebyggelse4,5,6 eller intervention strategi7. Forskelle mellem forebyggelse og intervention undersøgelser tyder på, at forskellige cellulære processer forekomme på forskellige faser af udvikling af åreforkalkning og fremhæver, at forebyggende undersøgelser er sandsynligvis utilstrækkelig til at modellere den kliniske scenario tilstrækkeligt.
American Heart Association for nylig offentliggjort en videnskabelig udtalelse beskriver anbefalinger for ordentlig eksperimentelle design, proceduremæssige standardisering, analyse og rapportering af animalske åreforkalkning undersøgelser8. Det fremhæver de fordele og begrænsninger af dominerende teknikker, der anvendes i feltet. For eksempel, er da ansigt Sudan IV farvning af aorta ofte udført som en første udlæsning. Selv om en ansigt Sudan IV farvning af lipid deposition er en velegnet metode til vurdering af globale plaque byrde, er det ude af stand til at skelne debuterende fede streak læsioner fra mere avancerede sene læsioner. Som sådan er er fortolkningen af en ansigt farvning ofte tvetydige og overfladiske9. Omhyggelig analyse af væv tværsnit ved hjælp af morfologiske parametre fartøj, læsion og lumen størrelse og kvantificering af indeks af læsion stabilitet giver en mere præcis forståelse af effekten af et eksperiment.
Endelig, menneskelige histopatologiske undersøgelser har antydet, at cellulære sammensætning er en bedre indikator for brud end læsion størrelse, med læsioner fattige i glatte muskelceller (SMC), rige i makrofager at være mere modtagelige for briste10, 11. Disse observationer blev baseret på farvning for markører klassisk bruges til celle identifikation (dvs. ACTA2 for SMC og LGALS3 eller CD68 til makrofager). Udtryk for disse markører er imidlertid ikke strengt begrænset til en enkelt celletype i aterosklerotiske læsioner på grund af plasticitet af flere slægter herunder SMC, endotelceller og myeloide celler12. Den entydige identifikation af SMC inden for aterosklerotisk læsion var især næsten umuligt indtil det seneste årti på grund af egenskaben for disse celler til dedifferentiate og undertrykke deres slægt-specifikke markørgener (en proces, der er nævnt som fænotypisk switching) i tilskadekomne eller syge fartøjer13. Denne begrænsning i SMC identifikation er omgået ved udviklingen af afstamning sporingen7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. det består af permanent mærkning SMC og deres afkom for at spore deres skæbne og fænotypiske evolution under åreforkalkning progression ved hjælp af en kombination af udtryk af Cre recombinase drevet af SMC-specifikke initiativtagere (dvs., Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24, Acta225,26 og SM22α14,16) og aktivering af journalister (fx fluorescerende proteiner, β-galactosidase) [gennemgik i Bentzon og Majesky 201827]. I en af de første undersøgelser beskæftiger SMC afstamning sporingen uden for embryogenese indstilling, Speer et al.14 fremlagde beviser for, at SMC kan modulere deres fænotype og transdifferentiate i chondrogenic celler under vaskulære forkalkning ved hjælp af en SM22α Cre R26R LacZ afstamning sporingen model. Selv om disse undersøgelser banebrydende SMC afstamning sporingen, var de delvist tvetydige, idet enhver given ikke-SMC udtrykker SM22α i fastsættelsen af sygdommen vil være mærket af journalisten. Denne begrænsning er blevet omgået af udvikling og brug af tamoxifen-inducerbar Cre ERT/LoxP tillader en tidsmæssig kontrol af celle mærkning. Celle mærkning forekommer udelukkende i tamoxifen levering og vil være begrænset til cellen at udtrykke celle type-specifikke promotor kørsel Cre ERT udtryk samtidig med tamoxifen eksponering, undgå sporing af alternative celletyper aktivering Cre i den indstilling af sygdomsprogression. For afstamning sporingen af SMC i åreforkalkning, tamoxifen-inducerbar Myh11– Cre/ERT2 transgenet forbundet med fluorescerende journalister (eYFP7,15,17,18 , 21, mTmG19,25, konfetti20,22,23 for klonal ekspansion studier) har udvist en bemærkelsesværdig effektiviteten og specificiteten i SMC mærkning og har været brugt til skæbne kort SMC populationer i aterosklerotiske læsioner i nyere undersøgelser. Vigtigere, disse undersøgelser viste, at: 1) 80% af SMC inden for avanceret aterosklerotiske læsioner ikke udtrykke nogen konventionel SMC markører (ACTA2, MYH11) bruges i immunohistological analyse og derfor ville have været fejlidentificerede uden afstamning sporingen 17; 2) delmængder af SMC express markører for alternative celletyper, herunder makrofag markører eller mesenkymale stamceller markører16,17,19; og 3) SMC investere og udfylde den aterosklerotiske læsion af oligoklonale ekspansion og SMC kloner bevarer plasticitet til overgangen til fænotype forskellige populationer20,23. For at opsummere, er det nu klart, at glatte muskelceller præsentere en bemærkelsesværdig fænotypiske mangfoldighed i aterosklerotiske læsioner og kan have gavnlige eller skadelige roller på læsion patogenese afhængigt af arten af deres fænotypiske overgange. Disse opdagelser repræsenterer en bemærkelsesværdig nye terapeutiske avenue til målretning SMC athero-fremme fænotypiske overgange i sene åreforkalkning.
Heri, foreslår vi en standardiseret protokol til at analysere sene murine aterosklerotiske læsioner herunder systematiske metoder til animalsk dissektion, indlejring, skæring, farvning og kvantificering af brachiocephalic arterie læsioner. For at bestemme virkningen af Interleukin-1β hæmning på SMC skæbne og fænotype, brugte vi SMC lineage sporing ApoE– / – mus fodret en vestlig kost for 18 uger før modtager ugentlige injektioner af en anti-IL1β antistof eller isotype-matchede IgG kontrol.
Trods årtiers forskning og tekniske fremskridt i at studere åreforkalkning, har feltet en skuffende historie omsætte videnskabelige resultater til klinisk terapier34,35. Dette fænomen kan forklares tildels ved uoverensstemmelser i dyremodeller, eksperimenterende design og læsion analyser. Heri, beskriver vi en eksperimentel rørledning, som vi brugte til at analysere den cellulære sammensætning i avancerede aterosklerotiske læsioner ved hjælp af afstamni…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker centrum for biologiske Imaging (støttet af NIH 1S10OD019973-01) på University of Pittsburgh for deres bistand. Dette arbejde blev støttet af er understøttet af videnskabelige udvikling Grant 15SDG25860021 fra American Heart Association til D.G. R.A.B. blev støttet af NIH give F30 HL136188.
16% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Tissue perfusion and fixation |
23G butterfly needle | Fisher | BD367342 | |
25G needle | Fisher | 14-821-13D | |
A1 Confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
ACTA2-FITC antibody (mouse) | Sigma Aldrich | F3777 | Primary Antibody |
Alexa-647 anti goat | Invitrogen | A-21447 | Secondary antibody |
Antigen Unmasking solution, Citric acid based | Vector Labs | H-3300 | Antigen retrieval solution |
Chow Diet | Harlan Teklad | TD.7012 | |
Coverslip | Fisher | 12-544-14 | Any 50 x 24 mm cover glass |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Nucleus fluorescent counterstaining |
Donkey Alexa-488 anti-rabbit | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody |
Donkey Alexa-555 anti-rat | Abcam | ab150154 | Secondary antibody |
DPBS 10X without Calcium and Magnesium | Gibco | 14200166 | PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water |
Embedding cassette | Fisher | 15-182-701D | |
ETDA vacuum tube | Fisher | 02-685-2B | |
Ethanol 200 proof | Decon | 2701 | |
Foam pad | Fisher | 22-222-012 | |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7765 | |
GFP antibody (goat) | abcam | ab6673 | Primary antibody |
goat IgG control | Vector Labs | I-5000 | IgG control |
High Fat Diet | Harlan Teklad | TD.88137 | |
ImageJ | NIH | Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ | |
LGALS3 antibody (rat) | Cedarlane | CL8942AP | Primary antibody |
LSM700 confocal microscope | Zeiss | Confocal microscope | |
Microscope Slides, Superfrost Plus | Fisher | 12-550-15 | |
Microtome blades | Fisher | 30-538-35 | |
Mouse IgG control | Vector Labs | I-2000 | IgG control |
NIS element imaging software | Nikon | Imaging software for z-stack image acquisition | |
Normal Horse serum | Sigma Aldrich | H1270 | |
Pap Pen | Fisher | 50-550-221 | |
Peanut oil | Sigma | P2144 | |
Prolong gold Antifade mountant | Invitrogen | P36930 | Mounting medium |
Rabbit IgG control | Vector Labs | I-1000 | IgG control |
Rat IgG control | Vector Labs | I-4000 | IgG control |
RUNX2 antibody (rabbit) | Abcam | ab192256 | Primary Antibody |
Syringe | BD | 309628 | 1 ml syringe |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
Xylene | Fisher | X55K-4 | |
Zen imaging software | Zeiss | Imaging software for z-stack image acquisition |