Summary
Wir schlagen ein standardisiertes Protokoll zur Charakterisierung der zellulären Zusammensetzung der Spätphase murinen atherosklerotische Läsionen einschließlich systematische Methoden der tierischen Dissektion, Gewebe einbetten, schneiden, Färbung und Analyse der Brachiocephalic Arterien Atheroprone glatten Muskulatur Zelle Abstammung Ablaufverfolgung Mäuse.
Abstract
Atherosklerose ist die häufigste Todesursache weltweit und, trotz unzähligen präklinischen Studien vielversprechende therapeutische Ziele beschreiben, neue Interventionen blieben schwer. Dies ist wahrscheinlich wegen, unter anderem zu einer Abhängigkeit von präklinischen Prävention Modelle untersucht die Auswirkungen der genetischen Manipulationen oder pharmakologische Behandlungen auf die Atherosklerose-Entwicklung als die etablierten Krankheit. Ergebnisse dieser Studien sind oft durch die Verwendung von oberflächlichen Läsion Analysen und mangelnder Charakterisierung der Läsion Zellpopulationen verwirrende. Um diese translationalen Hürden überwinden zu helfen, schlagen wir eine erhöhte Abhängigkeit von der Intervention-Modelle, die Untersuchung von Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung auf eine einzelne Zellenebene von immunofluorescent Färbung und konfokalen Mikroskopie beschäftigen. Zu diesem Zweck beschreiben wir ein Protokoll in einem murinen Interventionsmodell, einschließlich eines systematischen Ansatzes für tierische Dissektion, einbetten, schneiden, färben und Quantifizierung der Brachiocephalic Arterie Läsionen zu Testzwecken eine vermeintliche Therapeutikum. Darüber hinaus aufgrund der phänotypische Vielfalt von Zellen im Spätstadium atherosklerotische Läsionen beschreiben wir die Bedeutung des Einsatzes zellspezifische, induzierbaren Abstammung Ablaufverfolgung Maus Systeme und wie dies für unvoreingenommene Charakterisierung der genutzt werden kann atherosklerotischen Läsionen Zellpopulationen. Zusammen, diese Strategien können vaskuläre Biologen genauer therapeutische Interventionen zu modellieren und analysieren von atherosklerotischen Krankheit helfen und werden hoffentlich in eine höhere Erfolgsquote in klinischen Studien zu übersetzen.
Introduction
Atherosklerose ist die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität, die weltweit die Mehrheit der koronaren Herzkrankheit, periphere Arterie Erkrankungen und Schlaganfall zugrunde liegen. Spätstadium koronaren Atherosklerose führen zu schweren Komplikationen einschließlich myokardiale Verletzung Bilanzierung von fast 16 % der Welt Bevölkerung Mortalität1,2. Durch ihre verheerenden Auswirkungen auf die öffentliche Gesundheit wurden erheblicher Anstrengungen unternommen, zu entschlüsseln, die Mechanismen fahren Fortschreiten der Atherosklerose sowie neue therapeutische Strategien zu entwickeln. Allerdings ist die Wahrscheinlichkeit der Zulassung (LOA) bei klinischen Studien für Herz-Kreislauf-Krankheit zu den niedrigsten im Vergleich mit anderen klinischen Bereichen (nur 8,7 % für phase-I-)3. Dies lässt sich teilweise durch viele Hindernisse, dass Atherosklerose für effiziente Medikamentenentwicklung einschließlich fast allgegenwärtige Natur, klinisch stumm fortschreiten, und bedeutende Krankheit Heterogenität darstellt. Darüber hinaus kann die suboptimale Gestaltung der präklinischen Untersuchungen an Tieren auch für den mangelnden Erfolg in klinischen Übersetzung berücksichtigt werden. Speziell, glauben wir, dass Interventionsstudien wann immer möglich zu untersuchen, die Wirksamkeit der therapeutischen Strategien umsetzen muss. Außerdem gibt es standardisierte Verfahren für Läsion Analysen einschließlich erweiterte Charakterisierung der Spätphase atherosklerotischen Läsion zelluläre Zusammensetzung von Schicksal-Mapping und Phänotypisierung ausführen müssen.
Die überwiegende Mehrheit der Atherosklerose Studien konzentrieren sich auf Modelle der Atherosklerose Prävention bestehend aus Medikament Behandlung oder gen Manipulation (Ko oder Knock-in) bei gesunden jungen Mäusen, vor der Krankheit Initiation und Progression. Diese Studien haben eine große Anzahl von Genen und Signalmoleküle, die eine in der Entwicklung von Arteriosklerose Rolle entdeckt. Jedoch nicht die meisten dieser Ziele, um effiziente Therapien beim Menschen zu übersetzen. In der Tat ist es schwierig, den Effekt zu extrapolieren, die, den eine Therapie auf gesunde junge Mäuse an älteren Patienten mit fortgeschrittenen atherosklerotische Läsionen hat. Als solche bietet die Durchführung von Interventionsstudien in der präklinischen experimentelle Pipeline wahrscheinlich eine genauere Darstellung der Relevanz und Wirksamkeit eines neuen therapeutischen. Die Idee wird durch die auffallend unterschiedlichen Auswirkungen der Hemmung der Pro-inflammatorischen Zytokin Interleukin-1β (IL-1β) bei einer Prävention4,5,6 oder Intervention Strategie7unterstützt. Unterschiede zwischen Prävention und Interventionsstudien deuten darauf hin, dass verschiedene zelluläre Prozesse auftreten in verschiedenen Phasen der Entwicklung von Atherosklerose und betont, dass Vorbeugung Studien dürften nicht ausreicht, um die klinische Szenario modellieren angemessen.
Die American Heart Association veröffentlichte kürzlich eine wissenschaftliche Erklärung Empfehlungen für geeignete Versuchsanordnung, prozedurale Standardisierung, Analyse und Berichterstattung über tierische Atherosklerose Studien8Detaillierung. Es zeigt die vor- und Nachteile der vorherrschenden Techniken in der Praxis eingesetzt. De Gesicht Sudan IV Färbung der Aorta wird beispielsweise häufig als erste Auslesen durchgeführt. Obwohl de Gesicht Sudan IV Färbung Lipid Ablagerungsrate eine geeignete Methode zur Beurteilung der globalen Plaque Belastung ist, kann er Frühstadium fatty Streak Läsionen von fortgeschrittenen späten Läsionen zu unterscheiden. Als solche ist die Interpretation der En Gesicht Färbung oft mehrdeutig und oberflächliche9. Eine sorgfältige Analyse des Gewebes Querschnitte unter Verwendung der morphologischen Parameter Schiff, Läsion und Lumen Größe und Quantifizierung von Indizes der Läsion Stabilität ermöglicht ein genaueres Verständnis der Wirkung eines Experiments.
Schließlich haben menschliche histopathologische Studien vorgeschlagen, dass zelluläre Zusammensetzung ein besserer Prädiktor der Bruch als die Größe der Läsion, mit Läsionen Armen in glatten Muskelzellen (SMC) und reich an Makrophagen wird anfälliger ist für10Bruch, 11. Diese Beobachtungen beruhten auf Färbung für Markierungen, die klassisch für Zelle Identifikation verwendet (z.B. ACTA2 für SMC und LGALS3 oder CD68 für Makrophagen). Jedoch beschränkt sich der Ausdruck dieser Marker nicht streng auf eine einzelne Zelle in atherosklerotischen Läsionen aufgrund der Plastizität mehrere Linien wie SMC, Endothelzellen und myeloische Zellen12. Insbesondere war die eindeutige Identifizierung des SMC in atherosklerotischen Läsion praktisch unmöglich bis zu den letzten zehn Jahren aufgrund der Eigenschaft dieser Zellen zu Gewebestammzelle und zu unterdrücken ihre Abstammung-spezifische Markergene (ein Prozess bezeichnet als phänotypische Schaltung) verletzten oder erkrankten Gefäße13. Diese Einschränkung bei SMC Identifikation hat durch die Entwicklung der Linie Ablaufverfolgung7,14,15,16,17,18, umgangen worden 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. es besteht aus dauerhaft Kennzeichnung SMC und deren Nachkommen, um ihr Schicksal und phänotypische Evolution während Progression der Atherosklerose zu verfolgen, durch eine Kombination des Ausdrucks der Cre-Rekombinase angetrieben von SMC-spezifische Promotoren (d. h. Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24, Acta225,26 und SM22α14,16) und die Aktivierung der Reporter (z. B. fluoreszierende Proteine, β-Galaktosidase) [überprüft in Bentzon und Majesky 2018-27]. In einer der ersten Studien mit SMC Abstammung Ablaufverfolgung außerhalb der Embryogenese Einstellung lieferte Speer Et Al.14 Beweis, dass SMC ihren Phänotyp und Transdifferentiate in Chondrogenic Zellen während der Gefäßverkalkung mittels modulieren kann ein SM22α Cre R26R LacZ Abstammung Ablaufverfolgung Modell. Obwohl diese Studien SMC Abstammung Ablaufverfolgung Pionierarbeit geleistet, waren sie teilweise nicht eindeutig, dass bestimmten nicht-SMC mit dem Ausdruck ihrer SM22α in der Umgebung von der Krankheit des Reporters beschriftet werden würde. Diese Einschränkung hat durch die Entwicklung und Verwendung von Tamoxifen-induzierbaren Cre ERT/LoxP ermöglicht eine zeitliche Steuerung der Zelle Kennzeichnung umgangen wurden. Zelle Kennzeichnung tritt ausschließlich während Tamoxifen Lieferung und wird auf die Zelle mit dem Ausdruck des Zelle typspezifische Projektträgers fahren Cre ERT Ausdruck zum Zeitpunkt der Tamoxifen Exposition vermeiden Verfolgung alternativer Zelltypen aktivieren Cre in begrenzt sein, die Einstellung des Fortschreitens der Krankheit. Für die Linie Ablaufverfolgung des SMC in Atherosklerose, die Tamoxifen-induzierbaren Myh11- Cre/ERT2 Transgen verbunden mit fluoreszierenden Reporter (eYFP7,15,17,18 , 21, mTmG19,25, Konfetti20,22,23 für klonale Expansion Studien) zeigte eine bemerkenswerte Effizienz und Spezifität in SMC-labeling und hat zum Schicksal Karte SMC Populationen in atherosklerotischen Läsionen in neueren Studien verwendet worden. Wichtig ist, diese Studien ergab, dass: 1) 80 % der SMC in fortgeschrittene atherosklerotische Läsionen tun nicht ausdrücklich alle herkömmlichen SMC-Marker (ACTA2, MYH11) Immunohistologische Analyse verwendet und daher haben würde ohne Abstammung Ablaufverfolgung misidentified wurden 17; (2) Teilmengen von SMC express Marker für andere Zelltypen einschließlich Makrophagen Marker oder mesenchymalen Stammzell-Marker16,17,19; und 3) SMC investieren und bevölkern die atherosklerotische Läsion durch den Oligoclonal Ausbau und SMC Klone behalten Plastizität, Übergang zum phänotypisch verschiedenen Populationen20,23. Zusammenfassend lässt sich sagen, ist es nun klar, dass die glatten Muskelzellen in atherosklerotischen Läsionen eine bemerkenswerte phänotypische Vielfalt zu präsentieren und können vorteilhafte oder nachteilige Rollen auf Läsion Pathogenese abhängig von der Art ihrer phänotypischen Übergänge. Diese Entdeckungen sind eine bemerkenswerte neue therapeutische Allee für targeting SMC Athero-Förderung phänotypische Übergängen in fortgeschrittenen Atherosklerose.
Hier schlagen wir ein standardisiertes Protokoll für die Analyse der Spätphase murinen atherosklerotischer Läsionen einschließlich systematische Methoden für tierischen Dissektion, einbetten, schneiden, färben und Quantifizierung der Brachiocephalic Arterie Läsionen. Um die Wirkung von Interleukin-1β Hemmung auf SMC Schicksal und Phänotyp bestimmen, haben wir SMC Linie nachzeichnen ApoE- / - Mäusen eine westliche Diät gefüttert, für 18 Wochen vor Erhalt wöchentliche Injektionen eines Anti-IL1β Antikörper oder angepasst Isotype IgG-Steuerelements verwendet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tierzucht, Handling und Verfahren wurden von der University of Virginia und der University of Pittsburgh institutionelle Tierpflege und Use Committee genehmigt.
1. Generation der SMC Abstammung Ablaufverfolgung Mäuse
- Myh11- Cre/ERT2 Männer28 zu züchten (Jackson Laboratory; #019079) mit R26R EYFP Weibchen (Jackson Laboratory; #006148) zu Myh11- Cre/ERT2+ R26R EYFP+ / + Männchen.
- Züchten die Myh11- Cre/ERT2+ R26R EYFP+ / + Männchen mit ApoE- / - weiblichen Mäusen (Jackson Laboratory; #002052). Überqueren Sie die Nachkommen und wählen Sie durch Genotypisierung Myh11- Cre/ERT2+ R26R EYFP+ / + ApoE- / - männlich und R26R EYFP+ / + ApoE- / - weibliche Mäuse als letzte Züchter. Clip-Enden und Genotypisierung auf Wurfgeschwistern durchführen. Alle männliche Mäusen sollte Myh11- Cre/ERT2+ R26R EYFP+ / + ApoE- / - und kann als experimentellen Mäuse (Abb. 1A) verwendet werden.
Hinweis: Genotypisierung Protokolle finden Sie auf der Website von Jackson Laboratory. Das Myh11 Cre/ERT2 Transgen befindet sich auf dem y-Chromosom, entgegensteht, die Verwendung von Weibchen. Andere Linie Tracing-Systeme verwendet werden, aber dieses System ist bis heute die zuverlässigste Abstammung Ablaufverfolgung Strategie Schicksal Karte SMC in Atherosklerose.
2. glatte Muskulatur Zelle Abstammung-Ablaufverfolgung Maus Diät und Behandlungen
- Haben männliche Myh11- Cre/ERT2+ R26R EYFP+ / + ApoE- / - Mäusen erhalten eine Reihe von 1 mg Tamoxifen Injektionen von sechs bis acht Wochen alt sein, um dauerhaft beschriften Myh11+ SMC mit YFP und ihr Schicksal (Abbildung 1 zu verfolgen ( A).
- Erdnuss-Öl erhitzen bei 55 ° C.
- Fügen Sie Tamoxifen in vorgewärmten Erdnussöl, bereiten die Lösung 10 mg/ml und bis zur vollständigen Auflösung von Tamoxifen bei 55 ° C inkubieren.
- Führen Sie eine intraperitoneale Injektion mit 0,1 mL 10 mg/mL Tamoxifen Lösung für eine Serie von zehn Injektionen mehr als zwei Wochen.
Hinweis: Tamoxifen ist ein Biohazard und muss mit Vorsicht behandelt werden.
- Fünf bis sieben Tage nach der letzten Injektion mit Tamoxifen, ersetzen Chow Ernährung mit hohen Fett-Diät (z. B. westliche Ernährung, 42 % kcal aus Fett, 0,2 % Gesamt-Cholesterin) für eine Dauer von 18 Wochen für die Entwicklung von fortschrittlichen atherosklerotische Läsionen, die konsequent entwickelt sich in mehreren vaskulären Betten einschließlich der Aortenbogen, Aortenwurzel, Brachiocephalic Arterie und der Bauchaorta.
- 18 Wochen fettreiche Ernährung Fütterung beginnen Sie therapeutischen Intervention für die gewünschte Dauer (Abbildung 1B).
Hinweis: Als Beispiel führten wir wöchentliche intraperitoneale Injektionen mit Antikörpers Anti-IL1β oder ein angepasst Isotype IgG-Steuerelement zwischen 18 und 26 Wochen der fettreichen Diät. - Entfernen Sie Lebensmittel auf schnelle Mäuse für 8 bis 16 Uhr vor dem Gewebe Ernte um genaue Messwerte für Plasma-Cholesterin und Triglyceride durchzuführen.
3. die Ernte der Brachiocephalic Arterie (BCA)
- Tierische Euthanasie sollte Animal Care und Nutzung Ausschuss (ACUC) Anforderungen und Vorschriften folgen. Einschläfern Sie der experimentellen Mäuse CO2 Erstickungstod für ca. 5 Minuten und überprüfen Sie Tod durch Zehe Prise.
- Wiegen Sie die Maus und sammeln Sie Blut zu.
- Wiegen Sie die Maus
- Sprühen Sie die Unterseite der Maus mit 70 % Ethanol
- Führen Sie Herzpunktion durch eine 25G Nadel angeschlossen an eine 1 mL Spritze in der Herzkammer von der linken Seite der Brusthöhle. 0,1 bis 1 mL Blut kann abgeholt werden.
- Das Blut einer EDTA-Vakuum-Röhre durch Spülen die Spritze und das Rohr auf einer Wippe oder Rotator für 10-15 min.
- Übertragen von Blut eine 1,5 mL Tube und Zentrifuge für 10 Minuten 250 X g bei 4 ° C. Vorsichtig abheben der oberen Plasma-Phase mit einer Pipette und entsprechende Tipps, und übertragen auf einen neuen Schlauch. Lagerung bei-20 ° C vor der Messung von Cholesterin und Triglyceriden.
Hinweis: Vollblut kann für zusätzliche Studien einschließlich Blutbild und übrigen Blutbestandteilen einschließlich Zytokine oder Immunzelle Profilerstellung verwendet werden.
- Machen Sie ein Schnitt von ca. 2 cm in der Haut in der Mitte des Bauches mit Schere und ziehen Sie die Haut um die Bauchhöhle verfügbar zu machen. Schneiden Sie das Peritoneum bis zum Brustbein ohne schädliche Gewebe. Machen Sie zwei Einschnitte in der Mitte axillaris-Linie durch den Brustkorb, wobei Sie darauf achten, nicht auf das Herz und die Lunge schädigen.
- Heben Sie das Brustbein mit einer Pinzette und schneiden Sie die Membran, die das Herz teilweise aussetzen. Wenn das Herz nicht leicht zugänglich ist, schneiden Sie den Brustkorb genug, den rechten Vorhof zu erreichen.
- Durchspülen der Maus mit einem Schwerpunkt Perfusion System (Abb. 2A). Installieren Sie die Schwerkraft Perfusion System, so dass der Druck der Flüssigkeit Perfusion der murinen mittlere Blutdruck (Abbildung 2B) entspricht. Dieses System ermöglicht die Konsistenz der Perfusion und beide unterhält das Schiff Morphologie und Flushes roten Blutkörperchen.
Hinweis: Als Referenz, C57Bl6 Mäuse haben einen physiologischen Blutdruck zwischen 120 MmHg (mittlere systolische Blutdruck) und 70 MmHg (durchschnittliche diastolische Blutdruck)29,30. Durchschnittlichen systolischen und diastolischen Blutdruck kann mit der Maus genetischen Hintergrund variieren.- Schließen Sie ein 23 oder 25G Schmetterling Nadel, um die Schwerkraft Perfusion System und führen Sie Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) durch die Nadel, die Luft aus den Rohren zu vertreiben. Stechen Sie die Nadel in die linke Herzkammer und sichern Sie die Nadel im Ort zu. Mit Iris-Schere, machen Sie einen kleinen Schnitt (< 2 mm) in den rechten Vorhof oder der Aorta ascendens.
- Durchspülen Sie mit 5 mL PBS, dann 10 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) Lösung, dann 5 mL PBS. Verwenden Sie PBS und 4 % PFA-Lösung bei Raumtemperatur.
- Sammeln Sie die Gewebe von Interesse (z. B. Leber, Lunge, Milz) und legen Sie sie in die 4 % PFA-Lösung.
- Aussetzen der BCA
- Reinigen Sie den Hals-Bereich durch Entfernen der Haut und Speicheldrüsen.
- Führen Sie eine abgespeckte der Mittellinie des Brustbeins durch das Manubrium mit einer Schere. Achten Sie darauf, dass die Schere in der Nähe von der Rückseite des Brustbeins zu beschädigen das Gefäßsystem befindet sich genau unter dem Brustbein bleiben. Ziehen Sie beide Seiten des Brustkorbs mit der Pinzette die Brusthöhle zu öffnen. Halsschlagadern ist teilweise sichtbar.
- Bereinigen Sie durch Ziehen von Muskeln und Bindegewebe und Fett mit einer feinen Pinzette entfernen, bis die richtige carotis, die Brachiocephalic Arterie der subclavian Bifurkation und der Aortenbogen gereinigt und der umliegenden Bindegewebe und Fett (Abbildung isoliert sind 2C).
- Entfernen der BCA
- Mit Pinzette, schnappen Sie sich die richtige carotis unterhalb der Bifurkation und machen Sie einen erste Schnitt oberhalb der Zange (Abb. 2D).
- Machen Sie noch in der Hand der carotis, einen zweiten Schnitt durch die subclavia. Die letzten zwei Kürzungen sind durch den Aortenbogen, auf beiden Seiten der Brachiocephalic Arterie (Abbildung 2D).
- Sammeln Sie andere Vascular Gewebe von Interesse (z. B. Bauchaorta, überlegenen Teil des Herzens, die die Aortenwurzel enthalten).
- Legen Sie die BCA und anderen Geweben in 4 % PFA Lösung über Nacht bei Raumtemperatur.
Hinweis: Die Fixierzeit sollte während der gesamten Studie konsistent gehalten werden.
(4) Gewebe Verarbeitung und Schnitt
- Entfernen Sie das Gewebe aus 4 % PFA und in einer beschrifteten Gewebe Kassette(Abbildung 3). Einsatz-Schaumstoff-Pads in der Kassette um das Gewebe zu gewährleisten behalten ihre Ausrichtung und bleibt in der Kassette durch den Verarbeitungsschritt (Abbildung 3B). Schließen Sie die Kassetten und tauchen ein in 70 % igem Ethanol bis Gewebe Verarbeitung (24 bis 72 h).
- Prozess-BCA und anderen Geweben gesammelt für histologische und immunofluorescent Färbung wie folgt (Beispiel für Übernachtung Routineverfahren mit einem Prozessor mit Vakuum Penetration): 10 % Neutral gepufferte Formalin für 30 min bei Raumtemperatur (2 X), 75 % Ethanol für 60 min. bei 30 ° C (1 X), 90 % Ethanol für 60 min. bei 30 ° C (1 X), 95 % igem Ethanol für 60 min. bei 30 ° C (1 X), 100 % Ethanol für 60 min. bei 30 ° C (3 X), Xylol für 60 min. bei 30 ° C (3 X) und Paraffin fur 80 min auf 62 ° C (3 X).
- BCA vertikal, mit dem Aortenbogen am nächsten an den Block Gesicht (Abb. 3C) einbetten.
- Schnitt durch den Paraffinblock auf einer rotierenden Mikrotom (10 µm Dicke) bis zum Erreichen der eingebetteten Gewebe.
- Sobald das Gewebe sichtbar ist, untersuchen Sie einen Abschnitt unter dem Mikroskop zur Positionsbestimmung. Wenn der Aortenbogen noch sichtbar ist, entfernen Sie nacheinander, Prüfung einen Abschnitt bei jedem Intervall bis zu zehn 10 µm.
- Wenn der Aortenbogen durch geschnitten wurde hat und die Brachiocephalic Arterie sichtbar ist, passen Sie die Ausrichtung des Blocks, das Gewebe vollständig senkrecht auf dem Mikrotom Klinge zu positionieren.
- Schneiden Sie die BCA eine Dicke von 10 µm. An diesem Punkt werden alle Abschnitte seriell mit drei Abschnitte pro Folie gesammelt. Sammeln Sie bis zum Erreichen der subclavian Bifurkation (Abbildung 3D).
Hinweis: Es ist wichtig, die BCA auf eine Dicke von 10 µm für nachfolgende Z-Stapel konfokale Bildaufnahme und einzelne Zellzählung schneiden. Diese Stärke wird die strenge und nicht cofounding Bewertung der Vereinigung zwischen einem einzelnen Kern und zytoplasmatischen oder Membran Färbung aber die Tiefe des Querschnitts ermöglichen.
5. Immunofluorescent Färbung
Hinweis: Eine vollständige Charakterisierung von atherosklerotischen Läsionen umfasst Bewertung der morphologischen Parametern und Indizes der Plaque Stabilität oder Instabilität und zelluläre Zusammensetzung, die nicht im Mittelpunkt dieses Protokolls werden. Läsion Morphologie, Kollagengehalt und Intraplaque Blutungen können durch Movat7,17, PicroSirius rot 7,31, Ter119 Färbung 7,18, analysiert werden. Hier beschreiben wir das Protokoll für die Analyse der zellulären Zusammensetzung der Läsionen.
- Inkubieren Sie die Folien in den folgenden Lösungen bei Raumtemperatur unter einer chemischen Haube: Xylol für 5 min (2 X), 100 % Ethanol für 5 min (2 X), 95 % igem Ethanol für 5 min (2 X), 70 % Ethanol für 5 min (2 X) und deionisiertes H2O (DiH2O) für 5 min (2 X).
- Inkubieren Sie Folien in Antigen Retrieval Lösung gemäß Anweisungen des Herstellers.
- Mit Zitronensäure-basierten Antigen Demaskierung Lösung (siehe Tabelle der Materialien), 3 mL der Lösung in 320 mL DiH2O. Ort der Folien in einer Färbung Behälter und füllen an die Spitze mit der vorbereiteten Antigen Retrieval Lösung verdünnen.
- Füllen Sie keine leeren Slots in der Dia-Rack mit leeren Folien zu gewährleisten gleichmäßige Erwärmung. Decken Sie den Container mit einem Deckel zum Antigen Retrieval Lösung ohne Verdampfung aufkochen lassen.
- Erhitzen Sie die Folien in einer Mikrowelle für 20 min bei ca. 675-700 Watt. Überprüfen Sie die Folien regelmäßig und ersetzen Sie verdunstet Flüssigkeit mit DiH2O solche, die Abschnitte bleiben in getaucht Demaskierung Lösung jederzeit.
- Lassen Sie Folien in Lösung für 1 h bei Raumtemperatur abkühlen.
- 6 g Haut Fischgelatine (FSG) in 1 L des PBS auflösen. PBS/FSG dient als Waschpuffer. Bereiten Sie eine blockierende Lösung 10 % normalen Serum in PBS/FSG.
Hinweis: Fischgelatine Haut wird bei der Vorbereitung des Puffers blockierende verwendet. FSG enthält keine Serum-Proteine, die mit Säugetieren Antikörpern Kreuzreaktion können Hintergrundgeräusche zu minimieren. Jedoch vorzuziehen andere blocking-Option mit Biotin Nachweissysteme da FSG endogene Biotin enthält. Die Art der normalen Serum verwendet basiert auf den sekundären Antikörper verwendet. Wenn Esel Sekundärantikörper verwendet werden, sollte normales Pferd Serum für die Sperrung und Antikörper-Verdünnungen gewählt werden. - Inkubieren Sie Folien mit PBS-Puffer für 5 min bei Raumtemperatur. Kreis Gewebeschnitte mit einem hydrophoben Stift. Sollte in den Kapiteln mit den blockierenden Puffer PBS/FSG/Normal Serum für 1 h bei Raumtemperatur. Bereiten Sie die Primärantikörper Lösung im PBS/FSG/Normal Serum während dieses Schrittes, während das Gewebe blockieren.
- Brüten Sie mit Primärantikörpern verdünnt in PBS/FSG/Normal Serum über Nacht bei 4 ° C in einer feuchten Kammer. Einen Abschnitt pro Folie sollte mit einer Mischung aus Kontrolle-IgG-Antikörper bei der gleichen Konzentration als der primäre Antikörper zu Steuerung für Primärantikörper Spezifität inkubiert werden.
- Waschen Sie die Folien wie folgt bei Raumtemperatur: PBS/FSG für 5 min (3 X), dann PBS für 5 min (1 X).
- Inkubieren Sie mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) und Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Kern Gegenfärbung verdünnt in PBS/FSG/Normal Serum für 1 h bei Raumtemperatur. Schützen Sie Folien vor Licht.
- Waschen Sie Folien, wie im Schritt 5.6 beschrieben.
- Folien mit Einbau Medien geeignet für Fluoreszenz zu montieren (siehe Tabelle der Materialien).
6. der konfokalen Mikroskopie
Hinweis: Die Verwendung von einem confocal Mikroskop und Z-Stapel-Akquisition ist entscheidend für einzellige zählen.
- Erwerb Parameter während der gesamten Studie verwendet werden: Bild-Auflösung (1024 x 1024 oder 2048 x 2048 Pixel); Strahlengang und Anzahl der Kanäle, die eine Funktion aus der Kombination der Sekundärantikörper ausgewählt sind; Scan-Geschwindigkeit (empfohlen, Scan-Geschwindigkeit: 7-8); und differential Interferenz-Kontrast (DIC)-Kanal.
- Stellen Sie Abschnitte, befleckt mit dem primären Antikörper und IgG-Steuerelement verwenden, Detektorempfindlichkeit, Laserleistung und Offset für jeden einzelnen Kanal. Das IgG-Steuerelement wird verwendet, um das Hintergrundsignal zu minimieren.
- Richten Sie den oberen und unteren Positionen für Z-Stapel-Erwerb. Bestimmen Sie die Stärke und Anzahl der Stapel zu erwerben. Diese Parameter sollten während der gesamten Studie konsistent bleiben.
Hinweis: Wir empfehlen bildgebenden 8 bis 10 Stapel von 1 µm Dicke. Bleiben Sie konsequent in die Anzahl der Stapel abgebildet während der gesamten Studie. - Bild Gewebeschnitte mit primären Antikörper und IgG-Kontrolle für alle Kanäle, einschließlich DIC befleckt.
- Beschriften Sie mindestens ein Bild mit einen Maßstab für die Bild-Kalibrierung während der einzelnen Zelle zählen.
7. einzelne Zellzählung
- Installieren Sie und öffnen Sie ImageJ. Falls erforderlich, download Plugins im Abschnitt Herunterladen > Input/Output die ImageJ Website, um die Image-Datei öffnen erzeugt je nach Format der Bilder durch das konfokale Mikroskop erzeugt.
- Öffnen Sie die Bilddatei in ImageJ.
- Kalibrieren Sie das Bild mit einem Bezugsmaßstab bar mit dem Bild in 6.6erzeugt.
- Abzugrenzen Sie die Region von Interesse in dem einzigen Zellzählung mit durchgeführt wird des DIC-Kanals (Abbildung 4).
Hinweis: Eine Region kann zu einem Zeitpunkt abgegrenzt werden. Abhängig von den experimentellen Fragen, einzelne Zelle zählen kann erfolgen im Bereich der gesamten Läsion (siehe 7.3.1) und/oder in eine weitere der Läsion. (Siehe 7.3.2) ist beispielsweise Untersuchung des Bereichs fibröse Kappe besonders relevant da die zelluläre Zusammensetzung ein wichtiger Index der Läsion Neigung ist zu Bruch.- Abzugrenzen Sie Bereich der Läsion nach der Lumen-Grenze (Abbildung 4A; weiße Pfeile) und der internen elastischen Lamina (Abbildung 4A, gelbe Pfeile) sichtbar auf das DIC-Bild.
- Bestimmen Sie für die Analyse des Gebiets fibröse Kappe die Grenze von 30 µm aus dem Lumen entfernte und nachzeichnen Sie die Begrenzung ( Abbildung 4B-D).
Hinweis: Die fibröse Kappe Bereich klassisch der Region bereichert in ACTA2 + Zellen und Kollagen unterlegen das Lumen (Abbildung 4B) bezeichnet. Die Anreicherung in ACTA2 + Zellen und Kollagen spielt eine entscheidende Rolle in der Läsion Stabilität. Frühere Studien haben festgestellt, dass die ACTA2 + Reich fibröse Kappe Zellbereich eine Dicke von 30 µm aus dem Lumen in SMC-Linie im Durchschnitt tracing ApoE- / - Mäusen gefüttert eine fettreiche Diät für 18 bis 26 Wochen (Abbildung 4C). Akribische Charakterisierung der Auswirkungen der Genmanipulation oder pharmakologische Behandlung auf die fibröse Kappe Bereich zelluläre Zusammensetzung ist so bemerkenswert relevant.
- Öffnen Sie die Kanäle Werkzeugbedienfeld (Bild > Farbe > Kanal Tools) und die anderen Pseudo-Farbe färben Kanäle (Abbildung 5A; Kasten 1).
- Verschmelzen die Farbkanäle (Bild > Farbe > Zusammenführen Farben) (Abb. 5A; Kasten 2). Alle Kanäle sollten auf dem gleichen Bild (Abb. 5B) sichtbar. Aktivieren Sie und Deaktivieren einzelner Farbkanäle im Bedienfeld Werkzeuge Kanal (Abb. 5A; Kasten 1).
- Richten Sie die Zählung Werkzeug.
- Rechtsklick auf das Counting -Symbol in der Symbolleiste (Abbildung 5C; Kasten 1) und Multi-Point-Werkzeugauswählen.
- Klicken Sie doppelt auf das gleiche Symbol öffnen Sie den Punkt Tool -Fenster (Abbildung 5C; Kasten 2).
- Wählen Sie die Art und Größe der Elemente verwendet, um Zellen zu zählen.
- Überprüfen Sie Alle anzeigen.
- DAPI-Kanal nur im Kanal Werkzeugfenster aktivieren Sie und wählen Sie den Zähler-Kanal 0 (Abbildung 5C; Kasten 3). Klicken Sie auf einzelne Kerne, die markiert werden (z. B. gelbe Punkte in Abbildung 5C-D). Blättern Sie Z-Stapel zählen alle Kerne gebeizt in der Region von Interesse. Die Anzahl der Ereignisse ist unter dem Ladentisch Kanal in Point Tool -Fenster (Abbildung 5C; Kasten 4) angegeben.
- Eine andere Färbung Kanal schalten (z. B. eYFP Färbung). Wählen Sie den Zähler-Kanal 1. Klicken Sie auf Zellen, in denen gibt es eine NS1 zwischen DAPI und Färbung. Für zytoplasmatischen Färbung, wählen Sie Zellen mit Färbung umgibt den Kern über die gesamte Tiefe des Kerns (überprüfen Sie mehrere Z-Stapel).
- Wiederholen Sie durch Änderung der Färbung Kombinationen und Auswahl neuer Zähler Kanäle, die Zell-Populationen von Interesse zu zählen. Jeder Punktfarbe repräsentiert eine andere Zellenbevölkerung (Abbildung 5D). Ergebnisse können als Anzahl der Zellen, die Gesamtzahl der DAPI oder Anzahl der Zellen zu Gebiet ausgedrückt werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - Mäuse wurden injiziert mit Tamoxifen zwischen sechs und acht Wochen alt vor, eine fettreiche Diät gefüttert. 18 Wochen fettreiche Ernährung Fütterung wurden zwei Gruppen von acht Mäuse wöchentlich mit einer Maus monoklonalen Anti-IL-1β Antikörper oder ein angepasst Isotype IgG-Kontrolle bei 10 mg/kg für 8 Wochen (Abbildung 1)7behandelt. Mäuse wurden geopfert und mit 4 % PFA-PBS-Lösung durchströmt. Brachiocephalic Arterien wurden seziert, bearbeitet und geschnitten wie beschrieben (Abbildung 2 und Abbildung 3).
Nach immunofluorescent Färbung mit Antikörpern auf die Linie Ablaufverfolgung Reporter (YFP) und phänotypische Markierungen (ACTA2, LGALS3, RUNX2), einer Dicke von 8 bis 10 µm des BCA Querschnitte abgebildet mit einem konfokalen Mikroskop war. Bilder von jedem einzelnen Färbung, DAPI (nukleare Färbung) und DIC erworben wurden. Abgrenzung der Regionen von Interesse für einzelne Zelle zählen (Läsion, fibröse Kappe) erfolgte mittels DIC-Bilder (Abbildung 4). Einzelne Zelle zählen, um festzustellen, die Fülle der verschiedenen SMC stammenden Populationen erfolgte mittels ImageJ (Abbildung 5).
Wir präsentieren zwei repräsentative immunofluorescent Färbung und Einfachzählung Beurteilung der Wirkung von IL-1β Hemmung auf zelluläre Zusammensetzung in fortgeschrittene atherosklerotische Läsionen. Färbung zuerst für die SMC Abstammung Ablaufverfolgung Reporter YFP, SMC-Marker ACTA2 und Makrophagen Marker LGALS3 in Querschnitten an zwei verschiedenen Standorten des BCA (480 µm und 780 µm aus dem Aortenbogen) durchgeführt wurde (Abbildung 6). Einzelne Zelle zählen Analyse dieser Querschnitt fibröse Kappe und Umgebung wurden durchgeführt, und bemerkenswerte Unterschiede fanden sich in die zelluläre Zusammensetzung des Gebiets faserige GAP zwischen Mäusen behandelt mit dem Antikörper Anti-IL-1β und behandelten Mäuse mit der Isotype abgestimmt IgG Kontrolle(Abbildung 6). Hemmung der IL-1β war verbunden mit einem Rückgang der YFP + SMC und eine Zunahme der LGALS3 + Zellen (Abb. 6B). Über die Phänotypen der SMC Populationen wurde ein Rückgang der Zahl der YFP + ACTA2 + SMC beobachtet, während die relative Anzahl der SMC-abgeleiteten Makrophagen (YFP + LGALS3 +) wurde an beiden Standorten BCA (Abbildung 6C) deutlich erhöht.
Zu guter Letzt haben wir die Wirkung von IL-1β Hemmung auf den SMC phänotypischen Übergang in den Chondrogenic Zellen. Dieser phänotypischen Übergang ist ein wichtiger Treiber der Gefäßverkalkung, wesentliches Merkmal des fortgeschrittenen Atherosklerose14,32,33. BCA Querschnitte wurden für die SMC Abstammung Ablaufverfolgung Reporter YFP, Osteochondrogenic Marker RUNX2 und Makrophagen Marker LGALS3 gefärbt(Abbildung 7). Die Fülle und die Herkunft der Chondrogenic Zellen RUNX2 + zeichneten sich im Bereich der Läsion in unseren zwei Versuchsgruppen. Wir fanden, dass die Hemmung der IL-1β keinen Einfluss auf die Gesamtzahl der RUNX2 +-Zellen in der Läsion, noch der Anteil der SMC abgeleitet (YFP + RUNX2 +) und Makrophagen abgeleitet (YFP-LGALS3 + RUNX2 +) Chondrogenic Zellen (Abb. 7B).
Abbildung 1 : Interventionsstudien in glatten Muskulatur Zell-Linie Ablaufverfolgung Mäuse. (A) schematische Darstellung der Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - Tamoxifen-induzierbaren SMC spezifische Linie Ablaufverfolgung Mausmodell. Behandlung mit Tamoxifen induziert Rekombination von R26R-YFP Locus und die Exzision der ein Stopcodon und dauerhaften Ausdruck YFP von SMC. (B) schematische Darstellung der Intervention Studien, in denen Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - Mäusen eine westliche Diät gefüttert, für 18 Wochen mit der IL-1β-Antikörper oder ein angepasst Isotype IgG Kontrolle Antikörper in einer Konzentration von 10 mg pro Woche injiziert wurden / kg für 8 Wochen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Brachiocephalic Arterie Dissektion. (A) schematische Darstellung einer Schwerkraft angetrieben Perfusion System. Das System ist in einer genauen Höhe ermöglicht Perfusion bei einem Druck in der Nähe der mittlere systolische Blutdruck bei Mäusen eingerichtet. Der Druck variiert leicht mit Volumen Höhe als Flüssigkeit, während der Perfusion zwischen Höhe h verwendet wird1 und h2. (B) Gleichung für die Berechnung von dem Druck der statischen Flüssigkeiten und Bestimmung der Höhe zu einen Druck von Perfusion gleich der C57Bl6 Maus mittlere systolische Blutdruck zu erreichen. (C) Bilder von der proximalen Aorta und verzweigte Arterien in C57Bl6 Maus ein Chow-Diät (linkes Bild) und Apoe- / - Maus gefüttert eine fettreiche Ernährung für 26 Wochen (rechtes Bild). Das Sternchen zeigt das Vorhandensein von atherosklerotischen Läsionen. (D) schematische Darstellung der proximalen Aorta und verzweigte Arterien. Rote Pfeile zeigen die Kürzungen für die Isolierung von der rechten Halsschlagader und Brachiocephalic Arterie Isolation und Zahlen geben die Reihenfolge der Kürzungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Gewebe Verarbeitung, einbetten und schneiden. (A) Foto einer Einbettung Kassette mit BCA Gewebe. Das BCA befindet sich auf einem Schaumstoff-Pad. (B) Zoom-in des BCA auf die Schaumstoffmatte positioniert. Das BCA orientiert sich mit der Aortenbogen nah an der Bezeichnungsteil der Kassette und der a. carotis vertikal ausgerichtet. Maßstab: 1 cm. (C) schematische Darstellung der Paraffin block nach dem Einbetten der Brachiocephalic Arterie. (D) schematische Darstellung der seriellen Folien mit 10 µm dicken Schnittserien mit Angabe der Entfernung von der Aortenbogen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Abgrenzung der atherosklerotischen Läsion und fibröse Kappe. (A) repräsentative Mikrographen DIC Bild atherosklerotischen Läsion in Brachiocephalic Arterie Querschnitten aus Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / -. Der luminalen und die internen elastischen Lamina Grenzen sind lokalisiert durch weiße und gelbe Pfeile, bzw. (linken). Bereich der Läsion ist abgegrenzt durch eine gestrichelte Linie (rechte Abbildung) Maßstabsleiste: 100 µm. (B) repräsentative Mikrographen DIC und ACTA2 Färbung. Doppel-Kopf Pfeile zeigen die Dicke der ACTA2 Färbung im Bereich unterlegen das Lumen Definition des fibrösen Kappe. (C) Quantifizierung der Subluminal ACTA2+ Dicke in Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - 18, 21 und 26 Wochen eine fettreiche Diät gefüttert. Mit dieser Stamm von Mäusen hat die fibröse Kappe eine durchschnittliche Dicke von 25-30 µm in atherosklerotischen Läsionen voraus. Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM (D) Abgrenzung von einem festen 30 µm dicken fibrösen Kappe Bereich für einzelne Zelle zählen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Einzelne Zellzählung mit ImageJ. Screenshots zur Veranschaulichung Hauptschritte der einzelnen Zelle zählen mit ImageJ auf Bilder von konfokalen Mikroskopie erworben. (A) jedes einzelnen Färbung Kanal und einzelnen Z-Stapel durch Scrollen c: und z: Balken am unteren Rand des Bildes sichtbar sind. Retikuläres Kanäle sind Pseudo-gefärbt mit der Channel-Leiste (1) färben Kanäle (YFP, LGALS3, ACTA2, DAPI für nukleare Färbung und DIC) werden zusammengeführt mit dem Merge-Kanal-Panel (2). (B) Ergebnisse des Kanals für YFP, LGALS3, ACTA2, DAPI und DIC zusammenführen. (C) Kern zählen basierend auf DAPI Färbung mit dem zählen Symbol (1) und Punkt-Tool-Fenster (2). Ein anderen Schalter Kanal wird für jede Zellpopulation (3) verwendet. Die Anzahl der Ereignisse gezählt wird unter dem Ladentisch Kanal (4) angezeigt. Weißes Rechteck: Region vergrößert auf der rechten Seite. (D) repräsentatives Bild der einzelnen Zelle zählen im Bereich fibröse Kappe (gestrichelte Linie) für mehrere Zellpopulationen einschließlich DAPI (gelbe Punkte), YFP+ Zellen (Magenta Punkte), YFP–LGALS3+ Zellen (Cyan Punkte), YFP+LGALS3+ Zellen (orange Punkte), YFP+ACTA2+ Zellen (grüne Punkte) und YFP–ACTA2+ Zellen (dunkle blaue Punkte). Weißes Rechteck: Region vergrößert auf der rechten Seite. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Charakterisierung der Effekte von IL-1β Hemmung auf die zelluläre Zusammensetzung des Gebiets fibröse Kappe an zwei unterschiedliche BCA-Standorten der SMC-Linie nachzeichnen Apoe/Mäuse. (A) BCA Querschnitte bei 480 µm und 780 µm aus dem Aortenbogen von Mäusen, die mit der IL-1β Antikörper behandelt oder die IgG-Steuerung, wie in Abbildung 1 gezeigt wurden für YFP, LGALS3, gebeizt und DAPI (nukleare Färbung) und der Abschnitt wurde durch DIC abgebildet. Immunofluorescent Kanäle wurden zusammengeführt (untere richtige Platten). Die gestrichelten Linien umreißen die fibröse Kappe Regionen. Skalieren Sie Bars: 100 µm. (B) einzelne Zelle zählen geht hervor, dass die Hemmung der IL-1β verbunden mit einer signifikanten Abnahme der YFP+ -Zellen und eine Zunahme der LGALS3 ist+ Zellen im Bereich fibröse Kappe. ( C) innerhalb der YFP+ Zelle Bevölkerung, eine Abnahme der YFP+ACTA2+ und eine Zunahme der YFP+LGALS3+ Populationen beobachtet. Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM statistische Analyse: ungepaarte mehrere t-Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7 : Wirkung von IL-1β Hemmung auf die Anzahl der RUNX2 + Chondrogenic Zellen mit fortgeschrittene atherosklerotische Läsionen. A) BCA Querschnitte sind für YFP, LGALS3, RUNX2 und DAPI (nukleare Färbung) gefärbt, und alle Sender wurden zusammengelegt (untere Verkleidungen). Die gestrichelten Linien abzugrenzen Bereich Läsion. Skalieren Sie Bars: 100 µm. B) Einzelzelle zählen zeigt, dass die Hemmung der IL-1β nicht die Gesamtzahl der RUNX2 beeinflusst+ Zellen innerhalb der Läsion noch der Anteil der RUNX2+ Zellen von SMC Ursprung (YFP+RUNX2+; YFP+LGALS3+RUNX2+) und myeloischer Herkunft (YFP–LGALS3+RUNX2+). Ergebnisse werden als Mittelwert SEM statistische Analyse ausgedrückt: ungepaarte mehrere t-Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trotz jahrzehntelanger Forschung und technische Fortschritte in der Atherosklerose zu studieren hat das Feld eine enttäuschende Geschichte der Übersetzung wissenschaftlicher Erkenntnisse auf Therapien34,35. Dieses Phänomen kann teilweise durch Diskrepanzen in Tiermodellen, experimentellen Designs und Läsion Analysen erklärt werden. Hier beschreiben wir eine experimentelle-Pipeline, die wir, die zelluläre Zusammensetzung in fortgeschrittene atherosklerotische Läsionen mit Abstammung Ablaufverfolgung Mäuse7analysieren. Diese Methode ermöglicht eine sorgfältige Untersuchung der Zelle Schicksal Mapping und Phänotypisierung, die Schlüsselparameter von möglichen Mechanismen gesteuert sind fortgeschrittene atherosklerotische Läsionen spielen.
Die SMC-Linie-Ablaufverfolgung-Maus-Modell ist ein mächtiges Werkzeug um genau das Schicksal und die phänotypische Modulationen von dieser Linie und ihren Beitrag zur Pathogenese der Atherosklerose verfolgen. Tamoxifen-induzierbaren Cre-LoxP -System ermöglicht die Kennzeichnung von Reifen vaskulären SMC mit dem Ausdruck MYH11 vor Einleitung der Atherosklerose. Zwingende Beweise mit diesem System hat gezeigt, dass arteriosklerotische Plaques sehr plastisch sind und vaskuläre SMC phänotypischen wechseln unterziehen kann, verlieren ihre kontraktilen Phänotyp und SMC-spezifische Marker, wuchernden, Migration und sogar Transdifferentiating in Makrophagen-Like cells17,18. In diesem Protokoll zeigen wir wie Abstammung-Tracing-Erkennung und immunofluorescent Färbung für Marker von Interesse kann integriert werden, um genau festzustellen, phänotypische Übergänge von SMC und ihre relative Häufigkeit unter anderen SMC-Populationen durchgeführt.
Diese Methode ist sehr komplementär mit anderen Assays meistgespielten im Feld. Erstens ist die Bewertung der atherosklerotischen Läsion Belastung durch En Gesicht Aorten Präparate kombiniert mit Lipid Färbung von Sudan IV aufgrund seiner Bequemlichkeit und Geschwindigkeit verbreitet. Dies ist jedoch eine unzureichende Maßnahme wichtige morphologische Parameter wie Größe der Läsion, Lumen Größe und Schiff umgestaltet. Färbung von de Gesicht Aorten Vorbereitung von Sudan IV, Lipid-Abscheidung zu visualisieren kann verwendet werden, um relative Läsion Bereich innerhalb der Aorta zu quantifizieren, aber es kann inkonsistente Färbung der Läsionen, als nur die neutral Lipidkomponente wird visualisiert während andere Bestandteile, wie z. B. extrazelluläre Matrix, besetzte Gebieten sind in der Regel vernachlässigt8. Darüber hinaus de Gesicht Färbung ist nicht in der Lage, über die Morphologie der Läsion zu informieren und kann nicht unterscheiden zwischen fetthaltige Streifen und erweiterte Läsionen. Schiff-Morphologie ist ein wichtiger Parameter für die Bühne und Bruch Risiko Arteriosklerose, einschließlich der Größe der Läsion, Lumen Durchmesser, Schiff Umbau7,36,37Beurteilung herangezogen. Diese Analysen erfordern die Erhaltung des Schiffes Morphologie für korrekte Quantifizierung. Wichtig ist, überschneiden sich Protokolle für die Untersuchung der morphologischen Parametern stark mit dem Protokoll hier. Insbesondere, verlassen sie sich auf die Verwendung eines Schwerkraft angetrieben vaskuläre Perfusion für PBS und Fixativ Durchblutung mehr Kohärenz in den Druck geben. Die Schwerkraft angetrieben Versickerungsanlage garantiert eine konstante Strömungsgeschwindigkeit und Druck zwischen jeder unabhängige Maus und verhindert die Inkonsistenz der manuelle Kraft angetriebenen Perfusion zwischen unabhängigen Experimenten oder Forscher. Die Schwerkraft Perfusion System sollte induzieren Perfusion bei einem Druck in der Nähe der murinen mittlere Blutdruck (70-120 MmHg) eingerichtet werden. Zweitens haben wir eine standardisierte und systematische Methode der Einbettung und Schnitt für die Brachiocephalic Arterie. Startseite-Schnitt und Quantifizierung der Läsion Bereich an mehreren Standorten in der Brachiocephalic Arterie zu definieren, können wir die Zufallsvariation beschränken, die mit begrenzten Stichprobe kommt.
Durchflusszytometrie ist eine andere Technik sehr komplementäre mit immunofluorescent beflecken mit einzelnen Zellzählung gekoppelt, die am meisten benutzt gewesen, bei der Zell-Populationen in atherosklerotischen Läsionen38Quantifizierung. Es besteht aus der Verdauung der Maus Aorta und Kennzeichnung der freigesetzten Zellen mit fluoreszierenden Antikörpern. Durchflusszytometrie bietet eine Quantitative Analyse der zellularen Bevölkerungen anwesend in der Aorta. Wie alle Technologien hat die Durchflusszytometrie jedoch Einschränkungen. Trotz der deutlichen Vorteil Einbau einer großen Anzahl von gleichzeitigen Marker gibt es ein vollständigen Verlust der räumlichen Auflösung und wird es unklar, ob eine Zellpopulation im fibrösen Kappe oder den nekrotischen Kern angereichert wird. Darüber hinaus gibt es ein Risiko der Verwässerungseffekt da Durchflusszytometrie eine große Anzahl von Zellen erfordert und oft nicht nur auf atherosklerotischen Bereiche zu konzentrieren. Aus diesem Grund können Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie komplementär verwendet werden, um hohe dreidimensionale Profilierung und Lokalisierung der Läsion zu ermöglichen.
Schließlich konzentriert sich das Protokoll auf die Quantifizierung der SMC-Populationen in BCA erweiterte Läsion mit Paraformaldehyd fixiert und Paraffin-eingebetteten Gewebeschnitten. Jedoch kann dieses Protokoll verwendet werden, um anderen vaskulären Betten einschließlich der Aortenwurzel oder der Bauchschlagader zwei vaskulären Territorien unter Arteriosklerose-Entwicklung zu untersuchen. Systematische Bearbeitung und Schnitt von der Aortenwurzel wurden gut beschriebenen8,39. Wie Atherosklerose an verschiedenen Standorten entwickelt und die Genmanipulation oder therapeutische Intervention kann nicht homogen diese Seiten21auswirken, ist es wichtig, möglichst viele vaskuläre Betten möglichst genaue Rückschlüsse zu untersuchen. Immunofluorescent Färbung und einzelne Zelle zählen können auch mit Gefrierschnitte durchgeführt werden. Dies kann aufgrund der Unvereinbarkeit von Antikörpern mit Paraffin Abschnitte erforderlich sein. Obwohl die tierischen Perfusion und Gewebe Einbetten von dieses Protokolls abweichen, können Ermittler den Rest der hier beschriebenen experimentellen Verfahren folgen.
Abschließend beschriebenen die Techniken hier Gliederung ein systematischer Ansatz zur Analyse der Läsion Zellpopulationen und Phänotypen im Spätstadium murinen Atherosklerose. Dieses Protokoll dient als Vorlage, um die Läsion Populationen von immunofluorescent Färbung in allen Arten von experimentellen Designs einschließlich der frühen und fortgeschrittenen Atherosklerose sowie Prävention und Intervention Studien untersuchen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken die Mitte für biologische Bildgebung (unterstützt von NIH 1S10OD019973-01) an der University of Pittsburgh für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch stützt sich auf wissenschaftliche Development Grant 15SDG25860021 von der American Heart Association, D.G. R.A.B wurde durch NIH gewähren F30 HL136188.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Tissue perfusion and fixation |
| 23G butterfly needle | Fisher | BD367342 | |
| 25G needle | Fisher | 14-821-13D | |
| A1 Confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| ACTA2-FITC antibody (mouse) | Sigma Aldrich | F3777 | Primary Antibody |
| Alexa-647 anti goat | Invitrogen | A-21447 | Secondary antibody |
| Antigen Unmasking solution, Citric acid based | Vector Labs | H-3300 | Antigen retrieval solution |
| Chow Diet | Harlan Teklad | TD.7012 | |
| Coverslip | Fisher | 12-544-14 | Any 50 x 24 mm cover glass |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Nucleus fluorescent counterstaining |
| Donkey Alexa-488 anti-rabbit | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody |
| Donkey Alexa-555 anti-rat | Abcam | ab150154 | Secondary antibody |
| DPBS 10X without Calcium and Magnesium | Gibco | 14200166 | PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water |
| Embedding cassette | Fisher | 15-182-701D | |
| ETDA vacuum tube | Fisher | 02-685-2B | |
| Ethanol 200 proof | Decon | 2701 | |
| Foam pad | Fisher | 22-222-012 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7765 | |
| GFP antibody (goat) | abcam | ab6673 | Primary antibody |
| goat IgG control | Vector Labs | I-5000 | IgG control |
| High Fat Diet | Harlan Teklad | TD.88137 | |
| ImageJ | NIH | Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LGALS3 antibody (rat) | Cedarlane | CL8942AP | Primary antibody |
| LSM700 confocal microscope | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microscope Slides, Superfrost Plus | Fisher | 12-550-15 | |
| Microtome blades | Fisher | 30-538-35 | |
| Mouse IgG control | Vector Labs | I-2000 | IgG control |
| NIS element imaging software | Nikon | Imaging software for z-stack image acquisition | |
| Normal Horse serum | Sigma Aldrich | H1270 | |
| Pap Pen | Fisher | 50-550-221 | |
| Peanut oil | Sigma | P2144 | |
| Prolong gold Antifade mountant | Invitrogen | P36930 | Mounting medium |
| Rabbit IgG control | Vector Labs | I-1000 | IgG control |
| Rat IgG control | Vector Labs | I-4000 | IgG control |
| RUNX2 antibody (rabbit) | Abcam | ab192256 | Primary Antibody |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml syringe |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Xylene | Fisher | X55K-4 | |
| Zen imaging software | Zeiss | Imaging software for z-stack image acquisition |
References
- GBD DALYs and HALE Collaborators. Global, regional, and national disability-adjusted life-years (DALYs) for 315 diseases and injuries and healthy life expectancy (HALE), 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet. 388 (10053), 1603-1658 (2016).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137 (12), 67-92 (2018).
- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32 (1), 40-51 (2014).
- Bhaskar, V., et al. Monoclonal antibodies targeting IL-1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in Apolipoprotein E-deficient mice. Atherosclerosis. 216 (2), 313-320 (2011).
- Isoda, K., et al. Lack of interleukin-1 receptor antagonist modulates plaque composition in apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (6), 1068-1073 (2004).
- Kirii, H., et al. Lack of interleukin-1beta decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (4), 656-660 (2003).
- Gomez, D., et al. Interleukin-1β has atheroprotective effects in advanced atherosclerotic lesions of mice. Nature Medicine. 24, 1418-1429 (2018).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 121 (6), 53-79 (2017).
- Baylis, R. A., Gomez, D., Owens, G. K. Shifting the Focus of Preclinical, Murine Atherosclerosis Studies From Prevention to Late-Stage Intervention. Circulation Research. 120 (5), 775-777 (2017).
- Kolodgie, F. D., et al. Pathologic assessment of the vulnerable human coronary plaque. Heart. 90 (12), 1385-1391 (2004).
- Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20 (5), 1262-1275 (2000).
- Gomez, D., Owens, G. K. Smooth muscle cell phenotypic switching in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 95 (2), 156-164 (2012).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).
- Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circulation Research. 104 (6), 733-741 (2009).
- Gomez, D., Shankman, L. S., Nguyen, A. T., Owens, G. K. Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections. Nature Methods. 10 (2), 171-177 (2013).
- Feil, S., et al. Transdifferentiation of vascular smooth muscle cells to macrophage-like cells during atherogenesis. Circulation Research. 115 (7), 662-667 (2014).
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nature Medicine. 21, 628 (2015).
- Cherepanova, O. A., et al. Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective. Nature Medicine. 22, 657 (2016).
- Albarran-Juarez, J., Kaur, H., Grimm, M., Offermanns, S., Wettschureck, N. Lineage tracing of cells involved in atherosclerosis. Atherosclerosis. 251, 445-453 (2016).
- Chappell, J., et al. Extensive Proliferation of a Subset of Differentiated, yet Plastic, Medial Vascular Smooth Muscle Cells Contributes to Neointimal Formation in Mouse Injury and Atherosclerosis Models. Circulation Research. 119 (12), 1313-1323 (2016).
- Newman, A. A., et al. Irradiation abolishes smooth muscle investment into vascular lesions in specific vascular beds. JCI Insight. 3 (15), (2018).
- Dobnikar, L., et al. Disease-relevant transcriptional signatures identified in individual smooth muscle cells from healthy mouse vessels. Nature Communications. 9 (1), 4567 (2018).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 regulates clonality and fate of smooth muscle-derived atherosclerotic plaque cells. Nature Communications. 9 (1), 2073 (2018).
- Majesky, M. W., et al. Differentiated Smooth Muscle Cells Generate a Subpopulation of Resident Vascular Progenitor Cells in the Adventitia Regulated by Klf4. Circulation Research. 120 (2), 296-311 (2017).
- Herring, B. P., Hoggatt, A. M., Burlak, C., Offermanns, S. Previously differentiated medial vascular smooth muscle cells contribute to neointima formation following vascular injury. Vascular Cell. 6, 21 (2014).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Science Translational Medicine. 7 (308), (2015).
- Bentzon, J. F., Majesky, M. W. Lineage tracking of origin and fate of smooth muscle cells in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 114 (4), 492-500 (2018).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nature Medicine. 14 (1), 64-68 (2008).
- Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14 (5), Pt 1 405-408 (2001).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2408-2415 (2004).
- Durgin, B. G., et al. Smooth muscle cell-specific deletion of Col15a1 unexpectedly leads to impaired development of advanced atherosclerotic lesions. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 943-958 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Lin, M. E., et al. Runx2 Deletion in Smooth muscle Cells Inhibits Vascular Osteochondrogenesis and Calcification but not Atherosclerotic Lesion Formation. Cardiovascular Research. , (2016).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Nishioka, T., et al. Contribution of inadequate compensatory enlargement to development of human coronary artery stenosis: An in vivo intravascular ultrasound study. Journal of the American College of Cardiology. 27 (7), 1571-1576 (1996).
- Pasterkamp, G., et al. Paradoxical Arterial-Wall Shrinkage May Contribute to Luminal Narrowing of Human Atherosclerotic Femoral Arteries. Circulation. 91 (5), 1444-1449 (1995).
- Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
- Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative analysis and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus. Journal of Visual Experiments. (82), 50933 (2013).
