Summary
我们提出了一个标准化的方案来表征晚期小鼠动脉粥样硬化病变的细胞组成, 包括动物解剖、组织包埋、切片、染色和腕头动脉分析的系统方法从动脉粥样硬化平滑肌细胞谱系追踪小鼠。
Abstract
动脉粥样硬化仍然是全世界的主要死因, 尽管有无数临床前研究描述了有希望的治疗目标, 但新的干预措施仍然遥遥无期。这在一定程度上可能是由于依赖临床前预防模型, 调查基因操作或药物治疗对动脉粥样硬化发展的影响, 而不是既定疾病。另外, 由于使用了表面病变分析, 缺乏对病变细胞群的定性, 这些研究的结果往往令人困惑。为了帮助克服这些转化障碍, 我们建议更多地依赖干预模型, 利用免疫荧光染色和共聚焦显微镜对单个细胞水平细胞组成的变化进行研究。为此, 我们描述了一种在小鼠干预模型中测试假定治疗药物的方案, 包括动物解剖、嵌入、切片、染色和臂头动脉病变定量的系统方法。此外, 由于晚期动脉粥样硬化病变中细胞的表型多样性, 我们描述了使用细胞特异性、诱导的谱系追踪小鼠系统的重要性, 以及如何利用这种方法对细胞进行无偏见的表征。动脉粥样硬化病变细胞群。总之, 这些策略可以帮助血管生物学家更准确地模拟治疗干预措施和分析动脉粥样硬化疾病, 并有望转化为更高的成功率的临床试验。
Introduction
动脉粥样硬化是全球大多数冠心病、外周动脉疾病和中风的主要发病和死亡原因。晚期冠状动脉粥样硬化可导致严重并发症, 包括心肌梗塞占世界人口死亡人数的近 16% 1,2。由于其对公众健康的破坏性影响, 已经作出了大量的努力, 以破译机制, 推动动脉粥样硬化的进展, 并制定新的治疗策略。然而, 与其他临床领域 (第一阶段仅为 8.7%) 相比, 心血管疾病临床试验的批准可能性 (loa)是最低的。这在一定程度上可以用动脉粥样硬化对有效药物开发构成的许多障碍来解释, 包括其几乎无处不在的性质、临床上沉默的进展和显著的疾病异质性。此外, 临床前动物研究的次优设计也可以解释临床翻译缺乏成功的原因。具体而言, 我们认为有必要尽可能实施干预研究, 以调查治疗策略的疗效。此外, 有一个迫切需要执行标准化的程序, 病变分析, 包括先进的定性后期动脉粥样硬化病变细胞组成的命运图和表型。
绝大多数动脉粥样硬化研究的重点是模型动脉粥样硬化预防包括药物治疗或基因操作 (敲除或敲入) 健康的幼鼠, 在疾病的开始和进展之前。这些研究发现了大量的基因和信号分子, 它们在动脉粥样硬化的发展中起着作用。然而, 这些目标大多未能转化为人类有效的治疗方法。事实上, 很难推断治疗对健康的幼鼠有影响的老年患者的晚期动脉粥样硬化病变。因此, 在临床前实验管道中实施干预研究可能会更准确地描述一种新治疗方法的相关性和有效性。在采用预防 4、5、6或干预策略7时, 抑制促炎性细胞因子白细胞素-1β (il-1β) 的显著发散效应支持了这一想法。预防和干预研究之间的差异表明, 不同的细胞过程发生在动脉粥样硬化发展的不同阶段, 并突出表明预防研究可能不足以模拟临床情景充分。
美国心脏协会最近发表了一份科学声明, 详细介绍了正确的实验设计、程序标准化、分析和报告动物动脉粥样硬化研究的建议 8。报告强调了该领域使用的主要技术的好处和局限性。例如,面对苏丹主动脉的 iv 染色通常作为第一次读出进行。虽然面对苏丹 iv 染色的脂质沉积是一个合适的方法来评估全球斑块负担, 它是无法区分早期阶段脂肪条纹病变和更先进的晚期病变。因此,对面部染色的解释往往是模糊和肤浅的.使用形态参数血管、病变、腔大小和病变稳定性指标的量化对组织横截面进行仔细分析, 可以更准确地了解实验的效果。
最后, 人类组织病理学研究表明, 细胞组合物是一个更好的预测破裂比病变大小本身, 病变在平滑肌细胞 (smc) 和丰富的巨噬细胞更容易破裂10, 11个。这些观察是基于经典用于细胞鉴定的标记的染色 (即 smc 的 acta2 和巨噬细胞的 lgals3 或 cd68)。然而, 由于包括 smc、内皮细胞和骨髓细胞12在内的多种谱系的可塑性, 这些标记的表达并不严格限于动脉粥样硬化病变中的单个细胞类型。特别是, 在过去十年之前, 几乎不可能在动脉粥样硬化病变中明确识别 smc, 因为这些细胞具有去分化和抑制其谱系特异性标记基因的特性 (这一过程称为表型转换) 在受伤或患病的血管13。由于血统追踪7、14、15、16、17、18、19,20,21,22,23,24. 它包括永久标记 smc 及其后代, 以跟踪其在动脉粥样硬化进展过程中的命运和表型演变, 使用 smc 特定启动子驱动的 cre 重组酶的表达组合 (即, myh117、15、17、18、19、20、21、22、23,24, acta225、26和sm2α14、16) 和记者的激活 (例如, 荧光蛋白、β-半乳糖苷酶) [在 btzon 和 majesky 中评论201827]。在最早的一项研究中, speer 等人在胚胎发生环境之外进行了研究, 其中一项研究提供了证据, 证明 smc 可以在胚胎发生过程中调节其表型并转化为软骨细胞, 方法是sm22α cre r26r lacz 谱系追踪模型。尽管这些研究开创了 smc 谱系追踪的先河, 但他们在一定程度上模棱两可, 因为任何在疾病发生时表达 sm2α的给定非 smc 都会被记者标记。通过开发和使用允许对细胞标记进行时间控制的他莫西芬诱导 cre ertlexp, 绕过了这一限制。细胞标记仅在他莫西芬分娩过程中发生, 并将仅限于在他莫西芬接触时表达细胞类型特特的细胞, 从而避免追踪激活 cre 的替代细胞类型。疾病进展的设置。对于动脉粥样硬化中 smc 的谱系追踪, 与荧光记者相关的他莫西芬诱导myh11-cre/ert2转基因 (eyfp7、15、17、18),21、mtmg19、25、五彩食品20、22、23为克隆扩频研究已证明了 smc 标签的显著效率和特异性, 并具有显著的应用效率和特异性。在最近的研究中, smc 种群被用于命运图。重要的是, 这些研究表明: 1) 在晚期动脉粥样硬化病变中, 80% 的 smc 不能表达免疫组织学分析中使用的任何常规 smc 标记物 (acta2, myh11), 因此在没有谱系追踪的情况下, 会被误认错误。17岁;2) 包括巨噬细胞标记或间充质干细胞标记 16、17、19的替代细胞类型 smc 表达标记的子集;smc 通过寡克隆扩张和 smc 克隆体保留可塑性, 过渡到表型不同的 20,23。总之, 现在可以清楚地看到, 平滑肌细胞在动脉粥样硬化病变中具有显著的表型多样性, 并可根据其表型转变的性质对病变发病机制产生有益或有害的作用。这些发现是针对 smc 动脉粥样硬化促进表型转变在晚期动脉粥样硬化中的一个显著的新治疗途径。
在此, 我们提出了一个标准化的程序, 分析晚期小鼠动脉粥样硬化病变, 包括动物解剖, 嵌入, 切片, 染色, 和定量的腕头动脉病变。为了确定白细胞介素-1β抑制 smc 的影响, 我们使用 smc 系追踪 apoe-/-小鼠喂养了18个月的西方饮食, 然后接受每周注射抗 il1 β抗体或同位素匹配的 igg 控制。
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Protocol
弗吉尼亚大学和匹兹堡大学动物护理和使用机构委员会批准了动物育种、处理和程序。
1. smc 系追踪小鼠的生成
- 养殖 myh11-cre/ert2 男性28 (杰克逊实验室; #019079) 与 r26r-eyfp 女性 (杰克逊实验室; #006148) 获得myh11-cre/ert2 + r26r-eyfp+/+男性.
- 用 apoe - ///雌性小鼠养殖 myh11-cre/ert2 + r26r-eyfp+/+雄性 (jackson 实验室; #002052).交叉后代, 并选择基因分型 myh11-cre/ert2 + r26r-eyfp+/+ apoe-//-男性和 r26r-eyfp+/ + apoe-\-雌性小鼠作为最终的繁殖者. 夹尾和执行基因分型的垃圾伙伴。所有雄性小鼠应为 myh11-cre/ert2+ r26r-eyfp+/+ apoe/,并可用作实验性小鼠 (图 1a)。
注: 基因分型协议可在杰克逊实验室网站上找到。myh11 cre/ert2 转基因位于 y 染色体上, 不允许女性使用。其他血统追踪系统可以使用, 但该系统是迄今为止最可靠的血统追踪策略, 以确定动脉粥样硬化中 smc 的命运图。
2. 平滑肌细胞血统追踪小鼠饮食和治疗
- 让男性myh11-ert2+ r26r-eyfp+/+ apoe-\-小鼠从6周到8周接受一系列1毫克他莫西芬注射, 用 yfp 永久贴上 myh11 + smc的标签, 并跟踪它们的命运 (图 1)a)。
- 在55°c 加热花生油。
- 在预热花生油中加入他莫西芬, 在10mgml 时制备溶液, 在55°c 孵育, 直至他莫西芬完全溶解。
- 在两周内, 用 0.1 ml 的 10 mgml 他莫西芬溶液进行腹腔注射。
注: 他莫西芬是一种生物危害, 必须小心处理。
- 最后一次注射他莫西芬后 5至7天, 用高脂肪饮食 (如西餐; 42% 的脂肪; 0.2% 总胆固醇) 代替食物饮食, 为期 18周, 以便发展晚期动脉粥样硬化病变,在包括主动脉弓、主动脉、臂头动脉和腹主动脉在内的多个血管床上不断发展。
- 在18周高脂肪饮食喂养时, 开始在所需时间内进行治疗干预 (图 1b)。
注: 例如, 我们每周在18至26周的高脂肪饮食中, 用抗 il1β抗体或同位素匹配的 igg 控制进行腹腔内注射。 - 在组织采集前, 将食物移给快速小鼠 8至16小时, 以对血浆胆固醇和甘油三酯进行准确的读数。
3. 臂头动脉的采集
- 动物安乐死应遵循动物护理和使用委员会 (acuc) 的要求和规定。用 co2 窒息对实验小鼠进行约5分钟的安乐死, 并通过脚趾夹紧验证死亡情况。
- 称重鼠标并收集血液。
- 称重鼠标
- 用70% 乙醇喷洒小鼠腹侧
- 通过插入25g 针插入从胸腔左侧的心室1毫升注射器进行心脏穿刺。可以收集0.1 到1毫升的血液。
- 通过冲洗注射器将血液输送到 edta 真空管, 并将试管放在摇杆或转子上10-15。
- 在4°c 下将血液输送到 1.5 ml 管和离心机, 时间为 10分钟 250 x g 。小心地取出顶部等离子相位与移液器和足够的尖端, 并转移到一个新的管。在测量胆固醇和甘油三酯之前, 请在-20°c 下存放。
注: 全血可用于其他研究, 包括血细胞计数和其他血液成分, 包括细胞因子或免疫细胞分析。
- 用剪刀在腹部中部的皮肤上做一个大约2厘米的切口, 拉皮肤露出腹腔。在不破坏组织的情况下, 将腹膜切割成胸骨。在腋下中线穿过胸部做两次切割, 注意不要损害心脏和肺。
- 用推子提起胸骨, 并将横隔膜部分暴露心脏。如果心脏不容易进入, 把胸腔剪掉, 足够到达右心房。
- 使用重力灌注系统完美地使用鼠标 (图 2a)。安装重力灌注系统, 使灌注液的压力相当于小鼠的平均血压 (图 2b)。该系统允许在灌注的一致性, 并既保持血管形态和冲洗红血球。
注: 作为参考, c57bl6 小鼠的生理血压在120毫米汞柱 (平均收缩压) 和70毫米汞柱 (平均舒张压)29,30之间。平均收缩压和舒张压可能因小鼠遗传背景而异。- 将23或25g 蝶针连接到重力灌注系统, 并通过针头运行磷酸盐缓冲盐水 (pbs), 将空气从管中排出。将针头插入左心室, 并将针头固定到位。使用虹膜剪刀, 在右心房或上升的主动脉做一个小切口 (< 2 毫米)。
- 用5毫升的 pbs, 然后是10% 的4% 对苯二甲醛 (pfa) 溶液, 然后是5毫升的 pbs。在环境温度下同时使用 pbs 和 4% pfa 溶液。
- 收集感兴趣的组织 (如肝脏、肺、脾脏), 并将其放入 4% pfa 溶液中。
- 公开 bca
- 通过去除皮肤和唾液腺来清洁颈部区域。
- 用剪刀把胸骨的中线通过子剪下。注意剪刀保持靠近胸骨的背面, 以避免损坏位于胸骨下方的血管。用钳子拉住胸腔的两侧, 以完全打开胸腔。颈动脉应该是部分可见的。
- 通过拉扯肌肉和结缔组织, 用精细的推拿器去除脂肪, 直到右颈动脉, 腕头动脉, 锁骨下分叉和主动脉弓被清洗, 周围的结缔组织和脂肪被隔离 (图2c)。
- 删除 bca
- 使用钳子, 抓住它的分叉下方的右颈动脉, 并在钳子上方进行初始切割 (图 2d)。
- 还拿着颈动脉, 第二次穿过锁骨下动脉。最后两次割伤是通过主动脉弓, 在腕头动脉的两侧 (图 2d)。
- 收集其他感兴趣的血管组织 (例如, 腹主动脉, 心脏上半部分包含主动脉根)。
- 在室温下将 bca 和其他组织放入4% 的 pfa 溶液中过夜。
注: 在整个研究过程中, 固定时间应保持一致。
4. 组织加工和切片
- 从4% 的 pfa 中取出组织, 放在贴有标签的纸巾盒中 (图 3a)。在盒式磁带中使用泡沫垫, 以确保纸巾保持其方向, 并在加工步骤中保持在盒式磁带中 (图 3b)。关闭盒式磁带并浸泡在70% 的乙醇中, 直到组织加工 (24 至 72h)。
- 处理 bca 和其他组织收集的组织学和免疫荧光染色如下 (使用真空渗透处理器的常规隔夜程序的例子): 10% 中性缓冲福尔宁在环境温度下 30分钟 (2x), 75%乙醇在 30°c (1x) 下 60分钟, 在 30°c (1x) 下, 90% 乙醇 60分钟, 30°c (1x) 时 60分钟, 30°c (3x) 时100% 乙醇 60分钟, 在 30°c (3倍) 下使用二甲苯 60分钟, 在 30°c (3倍) 下使用二甲苯 60分钟, 在 62°c (3倍) 下使用石蜡, 在80分钟内使用石蜡。
- 垂直嵌入 bca, 主动脉弓最接近块面 (图 3c)。
- 在旋转微孔 (厚度为 10μm) 上穿过石蜡块, 直到到达嵌入的组织。
- 一旦组织可见, 检查显微镜下的部分, 以确定位置。如果主动脉弓仍然可见, 一次最多取出10微米的部分, 在每个间隔检查一个部分。
- 当主动脉弓被分割, 并且臂头动脉是可见的, 调整块的方向, 以定位组织完全垂直于微生物片。
- 在10微米的截面厚度下切割 bca。此时, 将以每张幻灯片三个部分的顺序收集所有部分。收集, 直到达到锁骨下分叉 (图 3d)。
注: 在10微米的截面厚度下切割 bca 对于后续 z 堆栈共聚焦图像采集和单细胞计数非常重要。这种厚度将允许严格和非共同建立评估之间的关联, 单个细胞核和细胞质或膜染色通过横截面的深度。
5. 免疫荧光染色
注: 动脉粥样硬化病变的完整表征包括评估形态参数和斑块稳定性或不稳定性指数和细胞组成, 这将不是本协议的重点。可分别用 movat7、17、p微天狼星 red 7、31、ter119 染色7、18进行分析. 在这里, 我们将描述用于分析病变细胞组成的协议。
- 在室温下, 在化学罩下对以下溶液中的幻灯片进行孵化: 二甲苯 5分钟 (2倍), 100% 乙醇 5分钟 (2倍), 95% 乙醇 5分钟 (2倍), 70% 乙醇 5分钟 (2倍), 去电离 h2o (dih 2x) 5分钟 (2倍).
- 根据制造商的指示, 在抗原检索解决方案中对幻灯片进行孵化。
- 用柠檬酸为基础的抗原解除掩蔽液 (见材料表), 在二至2o 的320 毫升中稀释3毫升溶液, 将幻灯片放入染色储液中, 用准备好的抗原回收溶液填充到顶部。
- 用空白幻灯片填充幻灯片架中的任何空插槽, 以确保均匀加热。用盖子覆盖容器, 使抗原回收溶液在不蒸发的情况下煮沸。
- 在微波炉中加热滑块 20分钟, 约675-700 瓦。定期检查滑梯, 用dih2o 代替蒸发液体, 使切片始终淹没在揭开掩蔽的溶液中。
- 允许滑块在室温下冷却溶液中的1小时。
- 在 pbs 的1升中溶解6克鱼皮明胶 (fsg)。使用 pbsssg 作为洗涤缓冲液。在 pbsssg 中制备10% 正常血清的阻断溶液。
注: 鱼皮明胶用于制备阻滞缓冲液。fsg 不含血清蛋白, 可以与哺乳动物抗体交叉反应, 最大限度地减少背景噪音。然而, 其他阻止选项应首选与生物素检测系统, 因为 fsg 含有内源性生物素。使用的正常血清类型是基于所使用的二级抗体。当使用驴二级抗体时, 应选择正常的马血清进行阻断和抗体稀释。 - 在 pbs 中在室温下将幻灯片孵化5分钟。用疏水的笔环绕组织部分。在室温下, 用阻塞性缓冲液 pbssg 正常血清覆盖部分1小时。在此步骤中, 在组织阻塞期间, 在 pbsssgsp 正常血清中制备主要抗体溶液。
- 在4°c 的湿度室用原代抗体在 pbssgsg/正常血清中稀释过夜。每张幻灯片的一个部分应与与原发抗体浓度相同的 igg 控制抗体混合孵育, 以控制初级抗体特异性。
- 在室温下清洗幻灯片, 如下所示: pbsssg 5分钟 (3倍), 然后 pbs 5分钟 (1x)。
- 用氟结合二级抗体 (见材料表) 和二胺-2-苯林多内 (dapi) 在室温下在 pbssgsg 正常血清中稀释1小时的细胞核反染色。保护幻灯片不受光线影响。
- 按照步骤5.6 中的说明清洗幻灯片。
- 使用适用于荧光的安装介质安装幻灯片 (参见材料表)。
6. 共聚焦显微镜
注: 使用共聚焦显微镜和 z 堆栈采集对于单细胞计数至关重要。
- 设置要在整个研究过程中使用的采集参数: 图像分辨率 (1024x1024 或2048x2048 像素);光学路径和通道数, 这是所选择的二级抗体组合的函数;扫描速度 (推荐扫描速度: 7-8);和差分干扰对比度 (dic) 通道。
- 使用使用主要抗体和 igg 控制染色的部分, 为每个通道设置检测器灵敏度、激光功率和偏移。igg 控件用于最小化背景信号。
- 设置 z 堆栈采集的上、下位置。预先确定要获取的堆栈的厚度和数量。在整个研究过程中, 这些参数应保持一致。
注: 我们建议对8至10个厚度为1μm 的堆栈进行成像。在整个研究过程中, 在成像的堆栈数量上保持一致。 - 图像组织切片染色的原生抗体和 igg 控制的所有渠道, 包括 dic。
- 在单个单元计数过程中, 使用刻度栏标记至少一个图像, 以进行图像校准。
7. 单细胞计数
- 安装并打开 imagej。如有必要, 请下载 imagej 网站的 "下载 > input\ 输出" 部分中的插件, 以打开根据共聚焦显微镜生成的图像格式生成的图像文件。
- 在 imagej 中打开图像文件。
- 使用6.6 中生成的图像使用参考刻度条校准图像。
- 确定将使用 dic 通道执行单个单元计数的感兴趣区域 (图 4)。
注: 一次可以划定一个区域。根据实验问题, 单细胞计数可以在整个病变区域 (见7.3.1) 和/或在病变的升华。例如, 对纤维帽区域的调查 (见7.3.2) 尤其重要, 因为其细胞组成是病变破裂倾向的重要指标。- 通过跟随 dic 图像上可见的流明边界 (图 4a; 白色箭头) 和内部弹性层 (图 4a; 黄色箭头) 来划分病变区域。
- 为了分析纤维帽面积, 确定与流明的边界距离为 30μm, 并追踪边界 (图 4b-d)。
注: 纤维帽面积通常定义为在 acta2 + 细胞中丰富的区域和在腔下的胶原蛋白 (图 4b)。acta2 + 细胞和胶原蛋白的富集在病变稳定性中起着至关重要的作用。先前的研究已经确定, 在 smc 系追踪 apoe-/小鼠喂养高脂肪饮食 18至26周 (图 4c)时, acta2 + 细胞丰富的纤维帽面积平均为30μm。因此, 细致地描述基因操作或药理治疗对纤维帽区细胞组成的影响是非常相关的。
- 打开"通道工具" 面板 ( "图像 > 颜色 > 通道工具工具"), 并在不同的染色通道上使用伪色 (图 5a; 框 1)。
- 合并颜色通道 (图像 > 颜色 > 合并颜色) (图 5a; 框 2)。所有通道都应在同一图像上可见 (图 5b)。使用"通道工具"面板打开和关闭单个颜色通道 (图 5a; 框 1)。
- 设置计数工具。
- 右键单击工具栏中的计数图标 (图 5c; 框 1), 然后选择多点工具。
- 双击同一图标以打开 "点工具"面板 (图 5c; 框 2)。
- 选择用于计数单元格的项的类型和大小。
- 选中"全部显示".
- 仅在"通道工具" 面板中打开 dapi 通道, 然后选择计数器通道 0 (图 5c; 框 3)。单击将标记的单个原子核 (例如, 图 5c-d中的黄点)。滚动 z 堆栈来计算感兴趣区域中所有染色的原子核。事件数显示在点工具面板中的计数器通道下方 (图 5c; 框 4)。
- 打开另一个染色通道 (例如, yafp 染色)。选择计数器通道1。单击 dapi 和染色之间有共聚的单元格。对于细胞质染色, 选择细胞, 以染色包围细胞核的整个深度的细胞核 (检查几个 z 堆栈)。
- 重复此操作, 方法是修改染色组合, 并选择新的计数器通道来计算感兴趣的细胞群。每个点颜色代表不同的细胞群 (图 5d)。结果可以表示为细胞数量与 dapi 总数或区域区域区域的细胞数量的数量。
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Representative Results
myh11-cre/ert2 r26r-yfpapoe---小鼠在6至8周大的时间内注射了他莫西芬, 然后再吃高脂肪饮食。在18周的高脂肪饮食喂养中, 两组八只小鼠每周接受一次小鼠单克隆抗 il-1β抗体或同位素匹配的 igg 对照, 为期 8周 (图 1)7。用4% 的 pfa-pbs 溶液对小鼠进行了牺牲和灌注。如上文所述 (图 2和图 3), 对腕头动脉进行了解剖、处理和分割。
用针对系系追踪报告者 (yfp) 和表型标记 (acta2、lgals3、runx2) 进行免疫荧光染色后, 用共聚焦显微镜对 bca 横截面厚度为8-10μm 进行了成像。获得了每个单独染色、dapi (核染色) 和 dic 的图像。使用 dic 图像对单个细胞计数感兴趣的区域 (病变、纤维帽) 进行了划分 (图 4)。使用 imagej (图 5) 进行单细胞计数, 以确定不同 smc 衍生种群的丰度。
我们提出了两个代表性免疫荧光染色和单计数评估 il-1β抑制对细胞组成的影响, 在晚期动脉粥样硬化病变。首先, 对 smc 系追踪报告人 yfp、smc 标记 acta2 和巨噬细胞标记 lgals3 在 bca 的两个不同位置 (主动脉弓480μm 和780微米) 的横截面进行染色 (图 6)。对这些横截面的纤维帽区进行了单细胞计数分析, 在抗 il-1β抗体治疗的小鼠和经治疗的小鼠之间, 纤维帽区的细胞组成存在显著差异。同位素匹配的 igg 控制 (图 6a)。il-1β的抑制与 yfp + smc 的减少和 lgals3 + 细胞的增加有关 (图 6b)。关于 smc 种群的表型, 观察到 smc YFP+ACTA2+ 数量减少, 而 smc 衍生巨噬细胞的相对数量 (YFP+LGALS3+) 在两个 bca 位置显著增加 (图 6c)。
最后, 我们研究了 il-1β抑制 smc 表型向软骨细胞转变的影响。这种表型转变是血管钙化的重要驱动因素, 是晚期动脉粥样硬化14,32,33的主要特征。对 smc 沿袭记者 yfp、骨细胞发育标记 runx2 和巨噬细胞标记 lgals3 (图 7a) 进行了 bca 横截面染色。在我们两个实验组的病变区内, 对 runx2 + 软骨细胞的丰度和来源进行了表征。我们发现, 对 il-1β的抑制并没有影响病变中 runx2 + 细胞的总数, 也不会影响 smc 衍生 (YFP+RUNX2+) 和巨噬细胞 (yfp-LGALS3+RUNX2+) 软骨细胞的比例 (图 7b)。
图 1: 平滑肌细胞谱系追踪小鼠的干预研究.(a) myh11-cre/ert2 r26r-yfp apoe----他莫克斯芬诱导 smc 特系系跟踪小鼠模型的示意图. 他莫西芬治疗可导致 r26r-yfp 位点的重组和停止密码子的切除, smc 对 yfp 的永久表达。(b) 每周注射浓度为 10 mg/的 myh11-cre/ert2 r26r-eyfpapoe---小鼠注射 il-1β抗体或同位素匹配的 igg 控制抗体, 其中 myh11-cre/ert2 r26r-eyfp apoe---小鼠每周注射 il-1β抗体或同位素匹配抗体. 千克8周。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 腕头动脉解剖.(a) 重力驱动灌注系统示意图。该系统设置在一个精确的高度, 允许在压力接近小鼠的平均收缩压灌注。压力随体积高度的变化而略有变化, 因为在高度 h1和 h2之间的灌注过程中使用液体。(b) 计算静态流体压力和确定高度以达到相当于 c57bl6 的灌注压力的公式。(c) c57bl6 小鼠主动脉近端和分支动脉的图片 (左图) 和 apoe-/--小鼠喂养高脂肪饮食 26周 (右图)。星号表示动脉粥样硬化病变的存在。(d) 主动脉近端和分支动脉示意图。红色箭头代表右颈动脉和臂头动脉隔离的切口, 数字表示切割的顺序。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 组织处理、嵌入和切片.(a) 带有 bca 组织的嵌入盒式磁带的照片。bca 位于泡沫垫上。(b) 放大位于泡沫垫上的 bca。bca 的方向是主动脉弓靠近盒式磁带的标签部分和颈动脉垂直拉直。鳞片条: 1 厘米 (c) 埋有臂头动脉后石蜡阻滞示意图。(d) 具有10μm 厚的串行截面的串行滑块示意图, 并注明与主动脉弓的距离。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 动脉粥样硬化病变和纤维帽区的划分.(a)对myh11-cre/er2 r26r-ayfp apoe-e/的腕头动脉横截面 dic 图像动脉粥样硬化病变的代表性显微镜。流明和内部弹性层界分别由白色和黄色箭头 (左面板) 定位。病变区域由虚线 (右面板) 刻度条 (100μm. (b) dic 和 acca2 染色的代表性显微图像来描绘。双头箭头显示在定义纤维帽面积的腔内的区域内的 acta2 染色的厚度。(c) myh11-cre/ert2 r26r-eyfp apoe---喂养高脂肪饮食18、21和26周的亚叶 acta2 + 厚度的定量. 使用这种菌株的小鼠, 纤维帽的平均厚度为25-30μm 在提前动脉粥样硬化病变。结果表示为平均± sem. (d) 为单细胞计数的固定30μm 厚纤维帽面积的划分。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 使用 imagej 的单用细胞计数.屏幕截图说明了通过共聚焦显微镜获得的图像上使用 imagej 进行单细胞计数的关键步骤。(a) 通过滚动图像底部的 c: 和 z:bar, 可以看到每个单独的染色通道和单个 z 堆栈。染色通道使用通道面板 (1) 染色通道 (yfp、lgals3、acca2、用于核染色的 dapi 和 dic) 使用合并通道面板 (2) 进行合并。(b) yfp、lgals3、acta2、dapi 和 dic 的通道合并结果。(c) 使用计数图标 (1) 和点工具面板 (2) 基于 dapi 染色的核子计数。每个细胞群使用不同的计数器通道 (3)。计数的事件数显示在计数器通道 (4) 下方。白色矩形: 右侧放大的区域。(d) 多个细胞群的纤维帽区域 (虚线) 内单个细胞计数的代表性图像, 包括 dapi (黄点)、yfp+细胞 (品红色点)、yfp-lgars3+细胞 (青色点),yfp+lgals3+细胞 (橙色点)、yfp+acta2+细胞 (绿点) 和yfp-acta2+细胞 (深蓝色点)。白色矩形: 右侧放大的区域。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 表征 il-1β抑制对 smc 系追踪 apoe--m鼠两个不同 bca 位置纤维帽面积细胞组成的影响.(a) 用 il-1β抗体或图1所示 igg 对照处理的小鼠主动脉弓的 bca 横截面为480μm 和780微米, 对 yfp、lgals3 和 dapi (核染色) 进行了染色, 并由 dic 对该截面进行了成像。免疫荧光通道被合并 (右下角的面板)。虚线划定了纤维帽区域。标度条: 100μm. (b) 单细胞计数显示, 对 il-1β的抑制与 yfp+细胞的显著减少和纤维帽区域内 lgals3+细胞的增加有关。c) 在 yfp+细胞群中, yfp+acta2+的减少和 yfp+lgals3+的数量增加。结果表示为平均± sem. 统计分析: 未配对的多 t 检验。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: il-1β抑制对具有晚期动脉粥样硬化病变的 runx2 + 软骨细胞数量的影响.a) 对 yfp、lgals3、runx2 和 dapi (核染色) 进行 bca 横截面染色, 并合并所有通道 (底部面板)。虚线划定了病变区域。标度条: 100μm . b) 单细胞计数表明, 对 il-1β的抑制不会影响病变内 runx2+细胞的总数, 也不会影响 smc 原发 (yfp+runx2 +) 的 runx2+细胞的比例;yfp+lgals3 + runx2+) 和骨髓源 (yfp-lgals3+runx2+).结果表示为平均 sem. 统计分析: 未配对的多 t 检验。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
尽管在动脉粥样硬化的研究方面进行了几十年的研究和技术进步, 但该领域将科学发现转化为临床疗法的历史令人失望,34, 35.这种现象的部分原因可能是动物模型、实验设计和病变分析的差异。在此, 我们描述了一个实验管道, 我们用来分析细胞组成的晚期动脉粥样硬化病变使用谱系追踪小鼠7。这种方法可以对细胞命运图和表型进行细致的研究, 这些都是在晚期动脉粥样硬化病变中由潜在机制控制的关键参数。
smc 谱系追踪小鼠模型是一个强大的工具, 以准确地跟踪命运和表型调节的这一谱系及其对动脉粥样硬化发病机制的贡献。他莫西芬诱导的cre-loxp系统使成熟的血管 smc 在动脉粥样硬化开始之前的标记表达 myh11。使用该系统的有力证据表明, 动脉粥样硬化斑块具有高度的可塑性, 血管 smc 可以进行表型转换, 失去其收缩表型和 smc 特异性标记, 增殖, 迁移, 甚至转移分化成巨噬细胞17,18。在目前的协议中, 我们展示了如何整合林系追踪检测和免疫荧光染色的标志物, 以精确地确定 smc 进行的表型转换及其在其他 smc 人群中的相对频率。
这种方法与在实地经常进行的其他检测有很强的补充。首先,通过表面主动脉制剂联合苏丹 iv 脂质染色来评估动脉粥样硬化病变负担, 由于其方便和快速而得到了广泛的应用。然而, 这是一个不充分的测量关键的形态参数, 如病变大小, 腔大小, 血管重塑。苏丹 iv 对恩脸主动脉制备进行染色, 以显示脂质沉积, 可用于量化主动脉内的相对病变区域, 但它可以提供不一致的病变染色, 因为只有中性脂质成分被可视化, 而被其他成分所占据的区域, 如细胞外基质, 通常被忽略8。此外, en 面染色不能了解病变的形态, 也无法区分脂肪条纹和晚期病变。血管形态是评价动脉粥样硬化分期和破裂风险的重要参数, 包括病变大小、腔直径、血管重塑7、36、37。这些分析要求保持容器形态, 以便进行适当的定量。重要的是, 形态参数调查协议与此处详述的协议有很大的重叠。特别是, 他们依靠使用重力驱动的血管灌注系统的 pbs 和固定灌注, 以提供更大的一致性, 在施加压力。重力驱动的渗透系统保证了每个独立鼠标之间恒定的流速和压力, 并防止独立实验或研究人员之间的手动力驱动灌注不一致。应建立重力灌注系统, 以诱导在压力接近小鼠平均血压 (70-120 毫米汞柱) 的压力下灌注。其次, 我们提供了一个标准化和系统的方法嵌入和切片的腕头动脉。通过定义切片的起始位置和量化整个腕头动脉多个位置的病变区域, 我们可以限制有限采样带来的随机变化。
流式细胞术是另一项技术高度互补的免疫荧光染色结合单细胞计数, 已被广泛用于定量细胞群动脉粥样硬化病变 38。它包括小鼠主动脉的消化和释放细胞的荧光抗体标记。流式细胞术提供了对主动脉中存在的细胞群的定量分析。然而, 与所有技术一样, 流式细胞术也有局限性。尽管安装大量的同步标记有明显的好处, 但空间分辨率完全丧失, 不清楚细胞群是在纤维帽还是坏死的核心中丰富的。此外, 有稀释效应的风险, 因为流式细胞仪需要大量的细胞, 往往不只关注动脉粥样硬化区域。因此, 免疫荧光和流式细胞仪可以以互补的方式使用, 以便进行高维性分析和病变定位。
最后, 该方案的重点是定量 smc 群体的 bca 晚期病变使用对甲醛固定和石蜡嵌入组织切片。然而, 该方案可用于研究其他血管床, 包括主动脉根或腹主动脉, 受动脉粥样硬化发展的两个血管区。主动脉根部的系统处理和切片以前已经很好地描述了8,39。随着动脉粥样硬化在不同地点的发展, 基因操纵或治疗干预可以非同质地影响这些部位21, 重要的是要调查尽可能多的血管床, 以得出准确的结论。免疫荧光染色和单细胞计数也可以使用冷冻切片进行。这可能是必要的, 因为抗体与石蜡切片不兼容。虽然动物灌注和组织嵌入将不同于该协议, 研究人员可以遵循这里描述的其余实验程序。
总之, 这里描述的技术概述了一个系统的方法来分析病变细胞群和表型在晚期小鼠动脉粥样硬化。该方案可作为一个模板, 以免疫荧光染色调查病变人群的所有类型的实验设计, 包括早期和晚期动脉粥样硬化, 以及预防和干预研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢匹兹堡大学生物成像中心 (由 nih 1S10OD019973-01 提供的支持) 的协助。这项工作得到了美国心脏协会科学发展赠款15sdg2580021 的支持, d. g. r. a. b. 得到了国家卫生研究院 f30 hl136188 赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Tissue perfusion and fixation |
| 23G butterfly needle | Fisher | BD367342 | |
| 25G needle | Fisher | 14-821-13D | |
| A1 Confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| ACTA2-FITC antibody (mouse) | Sigma Aldrich | F3777 | Primary Antibody |
| Alexa-647 anti goat | Invitrogen | A-21447 | Secondary antibody |
| Antigen Unmasking solution, Citric acid based | Vector Labs | H-3300 | Antigen retrieval solution |
| Chow Diet | Harlan Teklad | TD.7012 | |
| Coverslip | Fisher | 12-544-14 | Any 50 x 24 mm cover glass |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Nucleus fluorescent counterstaining |
| Donkey Alexa-488 anti-rabbit | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody |
| Donkey Alexa-555 anti-rat | Abcam | ab150154 | Secondary antibody |
| DPBS 10X without Calcium and Magnesium | Gibco | 14200166 | PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water |
| Embedding cassette | Fisher | 15-182-701D | |
| ETDA vacuum tube | Fisher | 02-685-2B | |
| Ethanol 200 proof | Decon | 2701 | |
| Foam pad | Fisher | 22-222-012 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7765 | |
| GFP antibody (goat) | abcam | ab6673 | Primary antibody |
| goat IgG control | Vector Labs | I-5000 | IgG control |
| High Fat Diet | Harlan Teklad | TD.88137 | |
| ImageJ | NIH | Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LGALS3 antibody (rat) | Cedarlane | CL8942AP | Primary antibody |
| LSM700 confocal microscope | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microscope Slides, Superfrost Plus | Fisher | 12-550-15 | |
| Microtome blades | Fisher | 30-538-35 | |
| Mouse IgG control | Vector Labs | I-2000 | IgG control |
| NIS element imaging software | Nikon | Imaging software for z-stack image acquisition | |
| Normal Horse serum | Sigma Aldrich | H1270 | |
| Pap Pen | Fisher | 50-550-221 | |
| Peanut oil | Sigma | P2144 | |
| Prolong gold Antifade mountant | Invitrogen | P36930 | Mounting medium |
| Rabbit IgG control | Vector Labs | I-1000 | IgG control |
| Rat IgG control | Vector Labs | I-4000 | IgG control |
| RUNX2 antibody (rabbit) | Abcam | ab192256 | Primary Antibody |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml syringe |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Xylene | Fisher | X55K-4 | |
| Zen imaging software | Zeiss | Imaging software for z-stack image acquisition |
References
- GBD DALYs and HALE Collaborators. Global, regional, and national disability-adjusted life-years (DALYs) for 315 diseases and injuries and healthy life expectancy (HALE), 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet. 388 (10053), 1603-1658 (2016).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137 (12), 67-92 (2018).
- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32 (1), 40-51 (2014).
- Bhaskar, V., et al. Monoclonal antibodies targeting IL-1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in Apolipoprotein E-deficient mice. Atherosclerosis. 216 (2), 313-320 (2011).
- Isoda, K., et al. Lack of interleukin-1 receptor antagonist modulates plaque composition in apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (6), 1068-1073 (2004).
- Kirii, H., et al. Lack of interleukin-1beta decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (4), 656-660 (2003).
- Gomez, D., et al. Interleukin-1β has atheroprotective effects in advanced atherosclerotic lesions of mice. Nature Medicine. 24, 1418-1429 (2018).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 121 (6), 53-79 (2017).
- Baylis, R. A., Gomez, D., Owens, G. K. Shifting the Focus of Preclinical, Murine Atherosclerosis Studies From Prevention to Late-Stage Intervention. Circulation Research. 120 (5), 775-777 (2017).
- Kolodgie, F. D., et al. Pathologic assessment of the vulnerable human coronary plaque. Heart. 90 (12), 1385-1391 (2004).
- Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20 (5), 1262-1275 (2000).
- Gomez, D., Owens, G. K. Smooth muscle cell phenotypic switching in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 95 (2), 156-164 (2012).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).
- Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circulation Research. 104 (6), 733-741 (2009).
- Gomez, D., Shankman, L. S., Nguyen, A. T., Owens, G. K. Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections. Nature Methods. 10 (2), 171-177 (2013).
- Feil, S., et al. Transdifferentiation of vascular smooth muscle cells to macrophage-like cells during atherogenesis. Circulation Research. 115 (7), 662-667 (2014).
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nature Medicine. 21, 628 (2015).
- Cherepanova, O. A., et al. Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective. Nature Medicine. 22, 657 (2016).
- Albarran-Juarez, J., Kaur, H., Grimm, M., Offermanns, S., Wettschureck, N. Lineage tracing of cells involved in atherosclerosis. Atherosclerosis. 251, 445-453 (2016).
- Chappell, J., et al. Extensive Proliferation of a Subset of Differentiated, yet Plastic, Medial Vascular Smooth Muscle Cells Contributes to Neointimal Formation in Mouse Injury and Atherosclerosis Models. Circulation Research. 119 (12), 1313-1323 (2016).
- Newman, A. A., et al. Irradiation abolishes smooth muscle investment into vascular lesions in specific vascular beds. JCI Insight. 3 (15), (2018).
- Dobnikar, L., et al. Disease-relevant transcriptional signatures identified in individual smooth muscle cells from healthy mouse vessels. Nature Communications. 9 (1), 4567 (2018).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 regulates clonality and fate of smooth muscle-derived atherosclerotic plaque cells. Nature Communications. 9 (1), 2073 (2018).
- Majesky, M. W., et al. Differentiated Smooth Muscle Cells Generate a Subpopulation of Resident Vascular Progenitor Cells in the Adventitia Regulated by Klf4. Circulation Research. 120 (2), 296-311 (2017).
- Herring, B. P., Hoggatt, A. M., Burlak, C., Offermanns, S. Previously differentiated medial vascular smooth muscle cells contribute to neointima formation following vascular injury. Vascular Cell. 6, 21 (2014).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Science Translational Medicine. 7 (308), (2015).
- Bentzon, J. F., Majesky, M. W. Lineage tracking of origin and fate of smooth muscle cells in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 114 (4), 492-500 (2018).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nature Medicine. 14 (1), 64-68 (2008).
- Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14 (5), Pt 1 405-408 (2001).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2408-2415 (2004).
- Durgin, B. G., et al. Smooth muscle cell-specific deletion of Col15a1 unexpectedly leads to impaired development of advanced atherosclerotic lesions. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 943-958 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Lin, M. E., et al. Runx2 Deletion in Smooth muscle Cells Inhibits Vascular Osteochondrogenesis and Calcification but not Atherosclerotic Lesion Formation. Cardiovascular Research. , (2016).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Nishioka, T., et al. Contribution of inadequate compensatory enlargement to development of human coronary artery stenosis: An in vivo intravascular ultrasound study. Journal of the American College of Cardiology. 27 (7), 1571-1576 (1996).
- Pasterkamp, G., et al. Paradoxical Arterial-Wall Shrinkage May Contribute to Luminal Narrowing of Human Atherosclerotic Femoral Arteries. Circulation. 91 (5), 1444-1449 (1995).
- Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
- Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative analysis and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus. Journal of Visual Experiments. (82), 50933 (2013).
