Summary
هذا الأسلوب يوفر وسيله للزوجين optogenetics والمشفرة وراثيا مجسات الكالسيوم إلى مستويات الكالسيوم القاعدية صوره الأساس والتغيرات في العابرين الكالسيوم أثارت في عضلات الجسم الجدار من الكائن الحي النموذجي c. اليجنتس.
Abstract
يوفر نموذج الكائن الحي c. اليجانقاف نظاما ممتازا لأداء التصوير بالكالسيوم في الجسم. وتسمح هيئته الشفافة وقدرته علي التلاعب الوراثي بالتعبير المستهدف لأجهزه استشعار الكالسيوم المشفرة وراثيا. يحدد هذا البروتوكول استخدام أجهزه الاستشعار هذه لتصوير ديناميات الكالسيوم في الخلايا المستهدفة ، وعلي وجه التحديد عضلات جدار الجسم في الديدان. من خلال الاستفادة من التعبير المشترك لل بريسينابتيك تشانيلروبوبسين, تحفيز الإفراج عن استيل من الخلايا العصبية الحركية المثيرة يمكن ان يكون مستحثا باستخدام نبضات الضوء الأزرق, مما ادي إلى الاستقطاب العضلات والتغييرات القابلة للتكرار في الكالسيوم سيتوبلازمي مستويات. يتم مناقشه اثنين من تقنيات التجميد دوده مع مستويات متفاوتة من الصعوبة. وتبين المقارنة بين هذه التقنيات ان كلا النهجين يحافظان علي فسيولوجيا التقاطع العصبي العضلي ويسمح بالكمية القابلة للتكرار لعابري الكالسيوم. عن طريق الاقتران optogenetics والتصوير الوظيفي الكالسيوم ، ويمكن تقييم التغييرات في التعامل مع الكالسيوم بوستسينابتيك والتوازن في مجموعه متنوعة من الخلفيات متحولة. البيانات المقدمة بالتحقق من صحة كل من تقنيات التعبئة ويفحص علي وجه التحديد ادوار ساركو سي (اندو) بلازمي شبكي الكالسيوم ATPase وقناه البوتاسيوم BK تنشيط الكالسيوم في الجسم جدار العضلات تنظيم الكالسيوم.
Introduction
تقدم هذه الورقة طرقا لتصوير الكالسيوم في الجسم باستخدام عضلات جدار الهيكل c. التي تستخدم تحفيز الخلايا العصبية أوبتوجينيتيك. الاقتران العضلات التي أعرب عنها وراثيا المشفرة مؤشر الكالسيوم (جيكط) مع الضوء الأزرق أثارت الاستقطاب العصبية ويوفر نظاما لمراقبه بوضوح العابرين الكالسيوم التي أثيرت بعد المتشابك. هذا يتجنب استخدام التحفيز الكهربائي, السماح للتحليل غير الغازية من المسوخ التي تؤثر علي ديناميات الكالسيوم بوستمتشابك.
واحد-فلوكوفيري جيكسيس ، مثل gcamp ، يستخدم جزيء بروتين فلوري واحد تنصهر في مجال M13 من سلسله الضوء ميوسين كيناز في نهايته N-الطرفية و كالموديولين (CaM) في C-المحطة. علي الكالسيوم ملزمه ، والمجال كام ، والتي لديها تقارب عاليه للكالسيوم ، يخضع لتغيير المطابقة يحفز تغيير المطابقة اللاحقة في البروتين الفلورسنت مما يؤدي إلى زيادة في كثافة مضان1. ومتحمس GCaMP مضان في 488 نانومتر ، مما يجعلها غير صالحه لاستخدامها بالتزامن مع تشانيلروببسين ، الذي يحتوي علي الطول الموجي الاثاره مماثله من 473 نانومتر. التالي ، من أجل القياسات الكالسيوم زوجين مع تحفيز تشانيلروببسين ، البروتين الفلوري الأخضر من GCaMP يحتاج إلى استبداله ببروتين فلوري احمر ، mRuby (ركامب). باستخدام العضلات وأعرب RCaMP, في تركيبه مع التعبير العصبية الحركية الكوليني من تشانيلروبيبسين, يسمح الدراسات في تقاطع العصبية العضلية (NMJ) مع الاستخدام المتزامن لoptogenetics والتصوير الوظيفي داخل نفس الحيوانية 2-
استخدام تشانيلروبوبسين يتجاوز الحاجة إلى التحفيز الكهربائي لتشويه الوصلات العصبية العضلية من c. اليجانيس، والتي يمكن ان تتحقق الا في الاستعدادات تشريح ، مما يجعل هذه التقنية علي حد سواء أسهل لتوظيف وأكثر دقه عند استهداف انسجه معينه. علي سبيل المثال, وقد استخدمت في السابق تشانيلروببسين في c. اليجنس لتنشيط الخلايا العصبية المحددة بشكل عكسي, مما يؤدي إلى تنشيط قويه من الخلايا العصبية مثير أو المثبطة3,4. كما ان استخدام الاستقطاب المحفز للضوء يلتف أيضا علي مساله تلف الخلايا العصبية بسبب التحفيز الكهربائي المباشر. وهذا يوفر فرصه لدراسة اثار العديد من بروتوكولات التحفيز المختلفة, بما في ذلك المحفزات المستمرة والمتكررة, علي ديناميات الكالسيوم بوستمتشابك4.
ان الطبيعة الشفافة لل c. اليجايليس تجعله مثاليا للتحليل الوظيفي للتصوير الفلوري. ومع ذلك, عند تحفيز الخلايا العصبية المثيرة استيل في NMJ, ومن المتوقع الحيوانية للرد مع انكماش العضلات الفورية4, مما يجعل من تجميد الديدان الحرجة في تصور تغيرات الكالسيوم منفصلة. تقليديا ، وقد استخدمت وكلاء الدوائية لشل الماشية. واحد مثل هذه المخدرات المستخدمة هو levamisole, وهو اتروبين مستقبلات استيل الكولين5,6,7. منذ الليفاميزول يؤدي إلى التنشيط المستمر لنوع فرعي من مستقبلات العضلات مثير, هذا الكاشف غير مناسب لدراسة ديناميات الكالسيوم العضلات. العمل ليفيسيزول يدفع الاستقطاب بوستسينابتيك ، ورفع الكالسيوم عصاري خلوي ، والملاحظات انسداد بعد التحفيز بريسينابتيك. لتجنب استخدام الادويه المشلولة ، قمنا بفحص طريقتين بديلتين لتعبئة c. اليجايليس. تم لصقها الحيوانية اما أسفل ومن ثم تشريح مفتوحة لفضح عضلات الجسم الجدار ، علي غرار القائمة c. اليجانقاف nmj الكهربائية الطريقة8، أو استخدمت نانوبيادس لشل الكائنات السليمة9. سمح كلا الإجراءات للقياسات استنساخه من يستريح وأثار العضلات الكالسيوم العابرين التي كانت قابله للقياس بسهوله.
الطرق في هذه الورقة يمكن استخدامها لقياس مستويات الكالسيوم القاعدية السيتووليك والعابرين في خلايا العضلات الجدار الجسم بوستمتشابك في c. الايليسين. وترد أمثله للبيانات التي تستخدم التقنيتين المختلفتين للتعبئة. كلا التقنيتين الاستفادة من optogenetics لتشويه الخلايا العضلية دون استخدام التحفيز الكهربائي. وتبين هذه الامثله جدوى هذه الطريقة في تقييم الطفرات التي تؤثر علي معالجه الكالسيوم بعد المتشابك في الديدان وتشير إلى إيجابيات وسلبيات النهجين التجميد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الاعداد المجهر
- استخدام المجهر المركب مع قدرات مضان. لهذه الدراسة ، تم جمع البيانات علي المجهر تستقيم (جدول المواد) مزوده المصابيح لأثاره.
- من أجل تصور بشكل صحيح التغيرات الفلورية في عضلات جدار الجسم ، واستخدام هدف التكبير عاليه.
- للتحضيرات تشريح ، استخدام 60x NA 1.0المياه الغمر الهدف (جدول المواد).
- للتحضيرات باستخدام نانوبيادس ، استخدام 60x NA 1.4 النفط الغمرالهدف (جدول المواد). هذا التكبير يضمن دقه كافيه من العضلات علي جهاز استشعار الكاميرا.
- استخدام كاميرا عاليه الحساسية تعلق علي المجهر للتقاط الصور بمعدل الإطار عاليه من أجل تتبع التغيرات السريعة في مستويات الكالسيوم. لهذه الدراسة ، صوره مع نظام sCMOS (جدول المواد) قادره علي التصوير الإطار الكامل في 100 هرتز ، والأوقات المرتفعة للإشارات Ca2 + يمكن ان تكون سريعة مثل عشرات من مللي ثانيه.
- السيطرة علي اكتساب الكاميرا والاثاره مضان الصمام مع برنامج المدير الصغير الذي يعمل في ImageJ10 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).
- استخدام البرنامج المساعد منصة الكترونيه مفتوحة المصدر ، والذي يربط الخارجية المفتوحة المصدر المجلس متحكم (جدول المواد) ، لأداره نبضات التوقيت الخارجي للسيطرة علي الاثاره مضان.
ملاحظه: تتوفر عموميات رقميه من الدبابيس الرقمية 8 إلى 13 توفير بت الإخراج 0 إلى 5. ويمكن معالجه هذه القيم باعتبارها القيمة الاساسيه 2 من 1 ، 10 ، 100 ، الخ. يتم الاشاره إلى إعدادات المنفذ التسلسلي في الجدول 1 وتتوفر من موقع المدير المصغر (جدول المواد). البرامج الثابتة للمجلس متحكم متاحه بالمثل في هذا الموقع. - للسيطرة علي منطق توقيت ، وتفعيل بروتوكول الاستحواذ الجزئي في البرنامج وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).
ملاحظه: هذا يبدا في وقت واحد مده اطار الكاميرا مسبقا وعدد الإطارات التي سيتم تنشيطها ، فضلا عن مصراع المنطقية والعنبر مسبقا LED لأثاره الفلورية. في هذه الحالة ، يتم التحكم في العنبر الصمام الحالة الصلبة التبديل بواسطة بت متحكم 1 الإخراج من خلال دبوس 9. الإطارات الكاميرا خارج TTL (لوحه الخلفي من 3 موصل) بتشغيل محفز. هذا بالبالضبط الأوقات تفعيل الضوء الأزرق الصمام لتفعيل تشانيلروبيبسين في وقت معين بعد تفعيل تسلسل التصوير. - لتحفيز تشانيلروببسين مع الضوء الأزرق وسجل التغييرات RCaMP ، استخدم اثنين من المصابيح. تنشيط تشانيلروبوبسين مع LED مع ذروه الانبعاثات الموجي من 470 nm ومرشح ممر (455 إلى 490 nm) وتثير RCaMP مع LED مع ذروه الانبعاثات الطول الموجي من 594 نانومتر ومرشح ممر (570 إلى 600 nm).
- من أجل تنشيط في وقت واحد تشانيلروفوبسين والتقاط التغييرات في مستويات الفلورسنت RCaMP ، والمشاركة في أناره كل من المصابيح ونقل الضوء إلى نفس المسار البصري باستخدام الموحدة شعاع ديشروريك.
- التحكم في توقيت أضاءه LED مع مفاتيح الحالة الصلبة (جدول المواد) التي تسيطر عليها إشارات TTL (الحد الأقصى تصنيف بدوره في الوقت المحدد ، 1 مللي ثانيه ، بدوره قباله الوقت 0.3 ms: 0 إلى 90 ٪ بدوره علي وإيقاف الوقت من ال< 100 μs).
- تعيين كثافة LED مع إمدادات الطاقة الخطية منخفضه الضوضاء الحالية الخاضعةللرقابة (جدول المواد).
- لضمان التوقيت الدقيق للضوء الأزرق LED ، تنشيطه مباشره بواسطة نبض TTL إلى مرحل الحالة الصلبة من محفز. برنامج الضوء الأزرق بروتوكول التحفيز إلى محفز (جدول المواد) ، والذي يعمل بمثابه المؤقت دقيقه من بداية اكتساب الصورة إلى أضاءه LED الزرقاء. في هذه التجربة ، بدوره علي تحفيز الضوء الأزرق بعد 2 ثانيه من التقاط الفلورية RCaMP فقط واستخدام قطار من 5 ، 2 ms الضوء الأزرق البقول مع فواصل 50 ms interpulse لتنشيط تشانيلروبوبسين.
ملاحظه: يمكن تعيين التاخير قبل نبضات الضوء الأزرق ، ومده نبضات الضوء الأزرق ، والوقت بين البقول ، وعدد البقول في القطار في هذه المرحلة ، وينبغي ان تعكس المعلمات المحددة للفائدة التجريبية.
2.c. اعداد العينات اليجس والحصول علي البيانات
- لتحفيز بصريا الخلايا العصبية بريسينابتيك, الحصول علي الحيوانية التعبير عن تشانيلروبوبسين في الخلايا العصبية اتروبين مثير, مدفوعا مع المنطقة المروج unc-17 , وأعرب عن rcamp في جميع عضلات جدار الجسم مدفوعا مع المروج ميو-3 المنطقة2.
ملاحظه: ينصح فقط استخدام الكائنات مع الجينات المتكاملة ومستويات قويه من الفلورية كما التعبير متغير في أنواع الخلايا المقابلة قد تؤثر علي موثوقيه الحصول علي البيانات. - جعل الأسهم العاملة من جميععبر الشبكية عن طريق تمييع مسحوق الشبكية (جدول المواد) في الايثانول لإنشاء تركيز النهائي من 100 mM وتخزين في-20 درجه مئوية. سيكون هذا المخزون العامل مستقرا لمده سنه واحده تقريبا.
- إنشاء مخزون من OP50 e. القولونية، نمت في وسائل الاعلام LB ، تستكمل مع جميعترانس الشبكية من الأسهم العاملة المحرز في الخطوة 2.2 ، في التركيز النهائي من 80 μM. سيعتمد الحجم المستخدم لمخزون الشبكية OP50 + علي عدد اللوحات اللازمة للتجربة.
- البذور الديدان الخيطية وسائل الاعلام النمو (NGM) لوحات مع ما يقرب من 300 μL من الأسهم OP50 + الشبكية والسماح لوحات لتجف بين عشيه وضحيها في درجه حرارة الغرفة في الظلام.
- تنمو سلالات c. اليجان إلى العمر المطلوب في الظلام علي OP50 + لوحات ngm الشبكية في 20 ° c. لهذه التجربة ، استخدم الديدان البالغة.
- للتجربة باستخدام اعداد تشريح ، فقط استخدام الديدان البالغين البيض كما أداء تشريح علي الأصغر سنا ، والحيوانية الصغيرة هي صعبه للغاية. ترك الكائنات علي لوحات OP50-الشبكية لمده لا تقل عن 3 أيام لتنشيط تشانيلروبيبسين فعاله.
- في حاله استخدام الاعداد الذي تم تشريحه8،11 (الشكل 1ا) ، قم باجراء التفكيك في الاضاءه الخافتة.
- وضع الحيوانية في طبق تشريح مع قاعده المشبك المغلفة سيليكون التي تمتلئ 1 مم Ca2 + حل خارج الخلية تتالف من 150 mm كلوريد الصوديوم ، 5 ملم kcl ، 1 مم cacl2، 4 مم mgcl2، 10 ملم الجلوكوز ، 5 مم السكروز ، و 15 مم hepes (pH 7.3 ،-340 الوسم).
- الغراء أسفل الحيوانية باستخدام لاصق الجلد الموضعي السائل مع التلوين الأزرق علي طول الجانب الظهري من الدودة واجراء شق اهاب الجانبي علي طول الغراء/دوده واجهه باستخدام الابر الزجاجية.
- استخدمي ماصه الفم لمسح الأحشاء الداخلية من تجويف الدودة.
- الغراء أسفل رفرف اهاب من الحيوانية لفضح عضلات جدار الجسم الإنسي البطني للتصوير.
- في حاله استخدام الاعداد الخاص بالنانو (الشكل 1ب)
- جعل المنصهر 5 ٪ محلول اجنشا باستخدام ddH2O إلى حجم النهائي من 100 mL.
- باستخدام ماصه باستور ، ضع قطره من المحلول المصهور المنصهر علي شريحة زجاجيه وضع علي الفور شريحة زجاجيه ثانيه فوق الأعلى ، متعامدة مع الاولي ، باستخدام ضغط لطيف لإنشاء لوحه حتى اجثار. قم بازاله الشريحة العلوية قبل الاستخدام.
- أضافه ما يقرب من 4 μL من النانو البوليسترين (جدول المواد) إلى منتصف لوحه اجبرزت.
- في الضوء المنخفض ، اختر 4-6 c. الاناقه في محلول نانبياد ، والتاكد من عدم وضع الكائنات علي راس بعضها البعض ، ووضع بعناية علي القمه.
- ضع الشريحة المعدة أو طبق التشريح علي المجهر ، واعثر وركز علي الدودة باستخدام التكبير 10x وأضاءه الحقل الساطع الخافتة.
- التبديل إلى 60x التكبير والاثاره الفلورية RCaMP لتحديد العضلات جدار الجسم الذي هو الامامي إلى الفرج وفي المستوي البؤري الصحيح.
ملاحظه: يتم تحديد العضلات الاماميه للفرج كما انها تعكس العضلات التي تحفز عاده في التجارب الكهربية. - تغيير مسار الصورة من العدسة إلى الكاميرا عن طريق سحب التبديل والنقر المباشر داخل برنامج الحصول علي البيانات (جدول المواد).
ملاحظه: تاكد من إيقاف تشغيل مسار تحفيز الضوء الأزرق عند هذه النقطة للتاكد من انه لا يتم تنشيط تشانيلروبيبسين قبل التقاط الصور. - التركيز علي الصورة داخل البرمجيات الحصول علي البيانات باستخدام المجهر التركيز الدقيق.
- مره واحده في العضلات من الواضح في التركيز, إيقاف الصورة الحية عن طريق إلغاء النقر علي زر لايف .
- انقر فوق زر ROI في برنامج الحصول علي البيانات وإنشاء مربع حول العضلات التي تركز علي.
- علي المحفز ، قم بالتبديل علي مسار تحفيز الضوء الأزرق الذي تم برمجته مسبقا في الخطوة 1.10.
- انقر فوق اكتساب في برنامج التصوير للتقاط الصورة من خلال كاميرا CMOS. للقيام بذلك ، تعيين وقت التعرض ل 10 s مع إطارات 1,000 و 2x التسلق.
3-تحليل البيانات
- افتح ملف البيانات في برنامج التصوير (جدول المواد) ، وباستخدام أداه المضلع، الخطوط العريضة للعضلات الفائدة. هذا هو عائد الاستثمار.
- انتقل إلى الصورة | مداخن | المؤامرة Z-المحور الملف الشخصي وتصدير نقاط البيانات الناتجة في برنامج الجداول (جدول المواد). تقوم هذه الوظيفة بتحديد قيمه متوسط العائد علي الاستثمار مقابل النقطة الزمنيه.
- نقل العضلات العائد علي الاستثمار التي تم إنشاؤها باستخدام أداه المضلع خارج الحيوانية للحصول علي قياس مضان الخلفية بواسطة الخطوات المبينة في 3.2. تصدير البيانات الناتجة إلى مصنف جدول البيانات.
- في مصنف جدول البيانات ، اطرح القيم الفلورية الخلفية من قيم مضان العضلات في كل نقطه زمنيه. وهذا يوفر الخلفية طرح اشاره الفلورسنت.
- متوسط الخلفية طرح فلوري لأول 2 s من نقاط البيانات. وهذا سيعطي قياس الخط القاعدي ، F.
- استخدم قياس الخط القاعدي لحساب مستوي المضان المعياري في كل نقطه زمنيه. للقيام بذلك ، استخدم المعادلة (ΔF/F) + 1. ΔF يمثل (F (t)-F) ، حيث F (t) هو قياس مضان في اي نقطه زمنيه معينه و F هي القيمة الاساسيه. يتم أضافه + 1 كازاحه محور ص.
- كرر الخطوات 3.2-3.6 لكل صوره العضلات التي يتم تجميعها. استخدام خلايا عضلية واحده أو متعددة لكل صوره هو وفقا لتقدير الباحث. يمكن تحديد n من التجربة من خلال اجراء تحليل الطاقة.
- استخدم البيانات المعالجة من الخطوات 3.2-3.6 لاجراء تتبع للقيم الفلورية في برامج الرسوم البيانية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).
- من هذا التتبع ، وقياس حركيه عابره الكالسيوم ، مثل الارتفاع إلى وقت الذروة ونصف وقت الاضمحلال ، وذلك باستخدام الاداات المتوفرة في الرسوم البيانية البرمجيات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قيمت هذه التقنية التغيرات في المسوخ التي يعتقد انها تؤثر علي معالجه الكالسيوم أو الاستقطاب العضلي. وقد تم تصور مستويات الخط القاعدي والعابرات الفلورية وتم تقييم الكالسيوم السيتووليك وحركيه الكالسيوم داخل العضلات. ومن المهم ان تزرع الماشية علي الشبكية المتحولة لمده ثلاثه أيام علي الأقل لضمان الإدماج الناجح لشبكيه الصدر ، التالي تنشيط تشانيلروبيبسين (الشكل 2ا). إذا لم تتعرض الحيوانية لجميع عبر الشبكية ، لا يتم تشغيل العضلات عابر الكالسيوم (الشكل 2ب). علي الرغم من ان هذه الكائنات لا يزال يمكن استخدامها لتقييم مستويات الكالسيوم السيتووليك الاساسيه ، لن يتم التقاط اي تغييرات ديناميكية في الكالسيوم. بالاضافه إلى ذلك ، كمراقبه داخلية لصحة الماشية أو التشريح ، سيقوم الحيواني بالتعاقد بعد تحفيز الضوء الأزرق. تم اختيار تسجيل مع انكماش العضلات الذي يسبب الحد الأدنى من الحركة الاجماليه للجسم الدودة لجمع البيانات عند استخدام نانوبيادس لتجميد. إذا كانت العضلات المستخدمة لجمع القيم فلوري الخام العقود بقوة ، مما تسبب في الجسم كله من الدودة للتحرك ، فان تتبع عابر تعكس هذه القطعة الاثريه الحركة (الشكل 2ج) وينبغي التخلص من القياس الكمي.
تم عزل رسم الخرائط لموضع الجينات sca-1 من شاشه للتحولات التي تؤثر علي تعريب مستقبلات النيكوتين العضلية. والجينات c. ايليستس sca-1 الرموز الوحيدة homolog من ساركو (اندو) الكالسيوم شبكي بلازميه atpase (serca) في الدودة وهي مضخة serca الوحيدة الموجودة في الجسم العضلات الجدار12,13. وكان من المتوقع فقدان الوظيفة sca-1 المسوخ لإظهار التغييرات في التعامل مع الكالسيوم العضلات علي أساس الدور المهم serca يلعب في الحفاظ علي التوازن الكالسيوم في عضلات الثدييات14,15,16 و17و18. تم التعبير عن RCaMP في الجسم العضلات الجدار والضوء الأزرق المنشطة تشانيلروبيبسين وأعرب في الخلايا العصبية اتروبين مثير لتقييم كل من الكالسيوم خط الأساس داخل الخلايا وديناميكيات الكالسيوم في sca-1 المسوخ. مع تقنيه التحضير التشريح ، لوحظت زيادات في مستويات خط الأساس من فلوري RCaMP في متحولة sca-1 بالمقارنة مع السيطرة (الشكل 3ا ، ب) ، مما يوحي بان فقدان وظيفة serca يؤدي إلى مستويات مرتفعه من الكالسيوم السيتوبلازمي اليستريح. عندما تم فحص ديناميات الكالسيوم ، وبعد تحفيز بريسينابتيك الناجمة عن قطار من 5 ، 2 ms نبضات الضوء الأزرق (الشكل 3ج) ، كان هناك انخفاض كبير في مستويات الكالسيوم الذروة في المسوخ sca-1 (tm5339) كما مقارنه مع السيطرة (الشكل 3د) ، والتي قد تعكس انخفاض مخازن الكالسيوم في SR. مهما رايت ما من تغير كان في الارتفاع إلى قمة وقت أو النصفية انحلال وقت (شكل 3[ا], [ف]). وهذا يوحي بان اثار التغييرات في الكالسيوم السيتووليك من اي مصدر خارجي مثل دخول الكالسيوم من خلال مستقبلات استيل و/أو قنوات الكالسيوم الجهد بوابات وكذلك من المتاجر الداخلية لا تتاثر في sca-1 (tm5339) المسوخ . ويمكن ملاحظه نتائج مماثله باستخدام اعداد النابواد ، كما هو مبين في الشكل 419. هذا التلخيص للبيانات يوفر أدله علي ان كلا من هذه التقنيات هي الفسيولوجية لقياس العضلات جدار الجسم يستريح مستويات الكالسيوم سيتوبلازمي وكذلك مراقبه العابرين الكالسيوم حفز. وهذا يدل أيضا علي ان تشريح الدودة لا يسبب ضررا للحيوان الذي يغير التعامل مع الكالسيوم أو القدرة علي تشويه عضلات ما بعد المتشابك.
ويمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لفحص المسوخ التي تؤثر بشكل غير مباشر علي التعامل مع الكالسيوم في c. اليجايليس. فقدان وظيفة المتحولين (eg142) تم تقييم المسوخ لإثبات هذا. المورثة [ سلو-1 ] يرموز [ب] كالسيوم ينشط [BK] بوتاسيوم قناه, اي يكون عبر عن في كلا خلايا عصبيه وعضلات20,21. وقد وصفت الدراسات في السابق دورا لبطيئه-1 في عضلات الجسم الجدار, مما يدل علي ان فقدان وظيفة المسوخلديها عيب في أعاده الاستقطاب بوستسينابتيك بعد العضلات العملالإمكانات 20,21. وقد تم فحص التغيرات المحتملة في مستويات الكالسيوم الاساسيه وديناميكيات الكالسيوم العابرة بسبب هذه الاستثارة المفرطة باستخدام التجميد المجهري. عندما تم قياس مستويات خط الأساس من RCaMP ، المتحولين البطيءه النمو-1 (eg142) عرض زيادة الفلوري بالمقارنة مع الضوابط (الشكل 5ا ، ب)19. وهذا يوحي بان قنوات BK قد تنظم أيضا مستويات خط الأساس من الكالسيوم السيتووليك. لم يتم النظر إلى اي تغييرات في ذروه مستويات الكالسيوم بالمقارنة مع السيطرة (الشكل 5ج ، د) عند تقييم حركيه الكالسيوم المثارة عابره. ومع ذلك ، أظهرت طفرات (eg142) البطيءه الارتفاع زيادة كبيره إلى وقت الذروة بالمقارنة مع السيطرة (الشكل 5ه). وهذا قد يعكس زيادة المبلغ عنها سابقا في الاستثارة بريسينابتيك20,21. ومع ذلك ، لم يطرا اي تغيير يذكر في نصف وقت الاضمحلال في المتحولين (eg142) بالمقارنة مع التحكم (الشكل 5و). معا, هذه البيانات تثبت ان هذه الطريقة يمكن استخدامها لتقييم اثار الطفرات قبل وبعد المتشابك علي كل من يستريح وحفز الجسم العضلات الجدار الكالسيوم.
| الاعداد التسلسلي | قيمه |
| مهله الاجابه | 500 |
| سرعه البث بالباود | 57600 |
| ديلايبيتوينتشارسمس | 0 |
| المصافحه | قباله |
| التكافؤ | اي |
| المنفذ | 1 |
| مطول | 0 |
الجدول 1: إعدادات المنفذ التسلسلي للمكون المساعد المتحكم ، والذي يتحكم في لوحه تحكم خارجيه صغيره. ويستخدم هذا لبرمجه نبضات التوقيت الخارجي للسيطرة علي الاثاره الفلورية.
الشكل 1: التمثيل الرسومي لتقنيات التجميد المختلفة. (ا) يدل هذا الرسم علي تقنيه التشريح لتجميد الحركة. يتم لصقها الجسم من دوده أسفل (الأزرق) حول الجانب الظهري من الحيوانية. الشق الظهري علي طول البشرة يولد رفرفا للبشرة. تم لصقها هذا رفرف أسفل لفضح NMJs سليمه شكلت بين الاشتباكات العصبية للسلك العصب البطني باللون الأخضر (تشانيلروبوبسين) و RCaMP التعبير عن العضلات باللون الأحمر. (ب) هذا الرسم يدل علي تقنيه التعبئة النانويه. الدودة سليمه محاطه بتمثيل النانو في الحل ، انه عندما ضغطت من قبل coverslip الفوقية ، وشل الدودة. نظرا لشفافية c. اليجانيس، يمكن تصور الحبل العصبي بطني باللون الأخضر (تشانيلروبوبسين) و rcamp التعبير عن العضلات يمكن تصور باللون الأحمر. الفراغ في منتصف الدودة يمثل الفرج ، الذي هو علامة بارزه تحديد عضلات جدار الجسم البطني. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الآثار التمثيلية لعابري الكالسيوم. (ا) واحده تتبع التمثيل من عابر الكالسيوم التي اثارها قطار من 5, 2 ms نبضات الضوء الأزرق في الفواصل الزمنيه 50 ms البينية, سجلت في الحيوانية مع حركه الجسم محدوده (-حركه) نمت في وجود كلعبر الشبكية (+ all- عبر الشبكية). القطع الاثريه هي نبضات تحفيز الضوء الأزرق ، حيث ان كلا المصابيح مضاءه بشكل مشترك في نفس الوقت. (ب) واحده تتبع التمثيل تبين عدم وجود عابر الكالسيوم استجابه لقطار من 5 ، 2 ms نبضات الضوء الأزرق مع فترات التداخل ms 50 في الحيوانية التي لم تتعرض لجميععبر الشبكية (-جميعالعابرة الشبكية ، الحركة). (ج) واحده تتبع التمثيل من عابر الكالسيوم التي تم التي أثيرت من قبل قطار من 5, 2 ms نبضات الضوء الأزرق مع فترات التداخل ms 50, سجلت في الحيوانية التي كان لها تقلص العضلات الكبيرة مما يؤدي إلى حركه التحف (+ حركه, + جميععبر الشبكية). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مستويات الكالسيوم الاساسيه والآثار الناجمة عن الكالسيوم من التحكم وعينات sca-1 (tm5339) المعدة باستخدام تقنيه التشريح. (ا) صور تمثيليه لمقياس الخط القاعدي rcamp في المسوخ (tm5339) والضوابط. شريط مقياس = 50 μm. (ب) المستويات الفلورية الاساسيه للقياس الكمي في tm5339 (العدد = 13) والتحكم (ن = 9). (ج) الفرقة متوسط اثار العابرين الكالسيوم المثارة لل sca-1 (tm5339) المسوخ والسيطرة علي الماشية. (د) القياس الكمي للمضان الذروة rcamp من تشانيلروبيسين اثار ردود الكالسيوم في sca-1 (tm5339) المسوخ (ن = 12) والضوابط (ن = 9). (ه) القياس الكمي للارتفاع إلى وقت الذروة من تشانيلروبيسين اثار العابرين الكالسيوم في sca-1 (tm5339) المسوخ (ن = 12) والضوابط (ن = 8). (و) نصف وقت الاضمحلال الكمي من تشانيلروبوبسين أثارت العابرين الكالسيوم في sca-1 (tm5339) المسوخ (ن = 12) والضوابط (ن = 7). وكانت القيم الهامه إحصائيا: لا كبيره p > 0.05 ، * p ≤ 0.05 ، * * p ≤ 0.01 ، * * * p ≤ 0.001. أشرطه الخطا تمثل يعني ± SEM. وتم تطبيع البيانات باستخدام اختبارات شابيرو-ويلكي وتم تحديد الاهميه باختبار مان-ويتني للتوزيع غير العادي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مستويات الكالسيوم الاساسيه والآثار الناجمة عن الكالسيوم من التحكم وعينات sca-1 (tm5339) التي أعدت باستخدام التعبئة النانويه. (ا) الصور التمثيلية لخط الأساس في المسوخ tm5339 والضوابط ، شريط مقياس 50 μm. (ب) القياس الكمي للمستويات الفلورية لخط الأساس في المستويين الأولوالثاني( tm5339) من المسوخ (العدد = 14) وعنصر التحكم (n = 13) . (ج) في المتوسط من المتحولين الكالسيوم التي أثيرت لمسوخ sca-1 (tm5339) والضوابط. (د) القياس الكمي لمستوي ذروه الجريان الفلوري بعد استجابه الكالسيوم التي أثيرت في المتحولين من طراز sca-1 (tm5339) (n = 14) والضوابط (ن = 13). (ه) القياس الكمي للارتفاع إلى وقت الذروة لعابرات الكالسيوم المثارة في المسوخ ( tm5339) (العدد = 14) والضوابط (ن = 12). (و) التحديد الكمي لنصف زمن اضمحلال الكالسيوم الذي أثاره المتحولون في المسوخ ( tm5339) (n = 14) والتحكم (n = 13). تم تكييف الشكل من19. وكانت القيم الهامه إحصائيا: ليست كبيره ف > 0.05 ، * p ≤ 0.05 ، * * p ≤ 0.01 ، * * * p ≤ 0.001. أشرطه الخطا تظهر يعني ± SEM. وتم تقييم البيانات الطبيعية باستخدام اختبارات شابيرو-ويلكي وتم تحديد الاهميه باختبار مان-ويتني للتوزيع غير العادي. وقد تم تعديل هذا الرقم باذن من19. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مستويات الكالسيوم الاساسيه والآثار الناجمة عن الكالسيوم من التحكم والعينات البطيءه-1 (eg142) التي تم اعدادها باستخدام التجميد المجهري. (ا) الصور التمثيلية لخط الأساس في المتحولين (eg142) والضوابط ، ومقياس شريط 50 μm. (ب) القياس الكمي للمستويات الفلورية لخط الأساس في المتحولين ( eg142) البطيئين (العدد = 29) وعنصر التحكم (ن = 13). (ج) متوسط الآثار التي اثارتها الكالسيوم لمتحولي الeg142 البطيءه الامتصاص والضوابط. (د) القياس الكمي لمستوي ذروه الجريان الفلوري بعد استجابه الكالسيوم التي أثيرت في المتحولين ( eg142) (العدد = 29) والضوابط (ن = 13). (ه) القياس الكمي للارتفاع إلى وقت الذروة لعابري الكالسيوم المثارين في المتحولين (eg142) (العدد = 29) والضوابط (ن = 13). (و) التحديد الكمي لنصف زمن اضمحلال الكالسيوم الذي أثاره المتحولون في الeg142 (العدد = 11) والضوابط (ن = 13). تم تكييف الشكل من19. وكانت القيم الهامه إحصائيا: ليست كبيره ف > 0.05 ، * p ≤ 0.05 ، * * p ≤ 0.01 ، * * * p ≤ 0.001. أشرطه الخطا تظهر يعني ± SEM. وتم تقييم البيانات الطبيعية باستخدام اختبارات شابيرو-ويلكي وتم تحديد الاهميه باختبار مان-ويتني للتوزيع غير العادي. وقد تم تعديل هذا الرقم باذن من19. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
جيكاس هي أداه قويه في البيولوجيا العصبية c. اليجس . وقد استخدمت الاعمال السابقة تقنيات تصوير الكالسيوم لفحص مجموعه واسعه من الوظائف في كل من الخلايا العصبية والعضلات ، بما في ذلك الاستجابات الحسية والسلوكية ، مع أساليب متنوعة من التحفيز. وقد استخدمت بعض الدراسات المحفزات الكيميائية لتحريك العابرين الكالسيوم في الخلايا العصبية الرماد الحسي22,23 أو للحث علي موجات الكالسيوم في عضلات البلعوم24. واستخدمت مجموعه أخرى التحفيز الميكانيكي في حين عقدت الديدان في رقائق ميكروفلويديك لفحص ردود الكالسيوم في الخلايا العصبية مستقبلات اللمس25. لا يزال, وقد استخدم آخرون التحفيز الكهربائي لتصور التغيرات في الكالسيوم في كل من الخلايا العصبية26 وعضلات جدار الجسم27. ما هو شائع بين هذه الدراسات هو متطلبات المحفزات الخارجية ، مثل الحلول أو المعدات ، لتحريك العابرين الكالسيوم. البروتوكول المبين هنا تستفيد من السيطرة المكتسبة من التحفيز أوبتوجينيتيك ، الذي يوفر خصوصية الخلايا العصبية ، إلى جانب التحليل الوظيفي للعضلات التي أعرب عنها جيكسيس2 في نفس النموذج التجريبي.
ويرد وصف لشكلين من اشكال الدودة المتنقلة ، وفي حين ينبغي تقييم كل طريقه عند معالجه الاحتياجات التجريبية ، فان كلا من المستحضرات التي يتم تشريحها والتحضيرات السليمة من الناحية الفسيولوجية تنتج نتائج تكميليه تسمح للمحققين باستخدام اي من النهجين في أبحاثهم. هناك زيادة التحدي التقني لاستخدام تقنيه التشريح ، مع المستخدم المطلوبة لإتقان كل من الاستخدام الدقيق لل الغراء الجراحية والتشريح المجهري دون الاضرار الحبل العصبي أو العضلات. بالاضافه إلى ذلك ، ونظرا لمستوي صعوبة تشريح ، يجب استخدام البالغين فقط البيض ، والتي يمكن ان تحد من النقاط الزمنيه التجريبية. وعلاوة علي ذلك ، فان تقنيه التشريح هو أيضا أصعب بكثير لأداء علي المسوخ التي تنتج الصغيرة ، رقيقه ، أو الحيوانية غث ، وربما مره أخرى الحد من المعلمات التجريبية. ميزه هذا الأسلوب هو انه يحد من الجسم الاصطناعي حركه الناتجة عن الاستقطاب ، التصاق يمنع الحركة الزائدة للجسم الدودة ، ويوفر أيضا الوصول إلى NMJ للتغييرات الحل وتطبيقات المخدرات. بالاضافه إلى ذلك ، كل اعداد الكشف عن نفس المنطقة من الدودة ، والتي تضمن العضلات جدار الجسم سيتم باستمرار في التركيز. التقنية الثانية ، باستخدام نانوبيادس لشل الديدان ، اقل مشاركه ويمكن تعلمها بسرعة. أيضا ، يمكن استخدام اي الحيوانية العمر مع هذا الأسلوب ، مما يسمح للتغيرات في مناوله الكالسيوم من خلال التنمية ليتم رصدها. الرعاية لا تحتاج إلى اتخاذها عند وضع الديدان في الحل nanعبيدات ، كما الإفراط في التلاعب من الحيوانية قد تسبب لهم بالانفجار. أيضا ، يجب ان لا يتم نقل كوفيرسليب مره واحده وضعت علي راس الماشية ، لان هذا قد يسبب الكائنات للفه أو تحريف علي أنفسهم ، مما يؤدي مره أخرى إلى الضرر. علي الرغم من ان استخدام نانوبيادس يمكن ان توفر فحص عاليه الانتاجيه التي يمكن ان تكون الكائنات التي يمكن استردادها ، وليس هناك توحيد لموقف الجسم الحيواني ، التالي قد لا يكون كل الحيوانية عضلات الجسم الجدار في المستوي البؤري واضحة. إذا كانت التجربة تستدعي عددا كبيرا من الماشية ، فقد تكون هناك حاجه إلى أساليب مختلفه للتعبئة ، مثل الآبار الصغرى القائمة علي أجار ، والتي تسمح بتصوير الكالسيوم بالجملة28. بغض التحديد عن القيود المفروضة علي هاتين التقنيتين ، اما يمكن استخدامها للحصول علي موثوق بها ، وقابله للقياس الكمي بسهوله العابرين الكالسيوم داخل عضلات الجسم الجدار c. اليجانتس .
C. اليجايليس توفير العديد من المزايا كنظام الجسم الخارجي للدراسات التصويرية الوظيفية. الحيوانية شفافة, يسمح الاقتران من أوبتوجينيتيك الخلايا العصبية الاستقطاب من خلال استخدام تشانيلروبوبسين مع RCaMP جيكبي لقياس الناتجة العابرين الكالسيوم الناجمة في العضلات. ويمكن أيضا ان تستخدم مستويات ما قبل التحفيز من فلوري RCaMP لتقييم مستويات الكالسيوم القاعدية السيتووليك. القابلية الوراثية لل c. اليجايليس يجعل دراسة الطفرات الجديدة التي قد تؤثر علي التوازن الكالسيوم أو التعامل معها سهله المتابعة ، في كثير من الأحيان مع المتاحة بسهوله الاليل متحولة. باستخدام التقنيات المبينة في هذا البروتوكول ، يمكن الحصول علي بيانات التصوير بالكالسيوم بعد المتشابك بكفاءة وبتكلفه منخفضه نسبيا ، مما يجعل هذا النظام جذابا لمجموعه واسعه من تجارب التصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ويشكر المؤلفان الدكتور الكسندر غورسكهالك علي ZX1659 ، والمعسكر الذي يحتوي علي سلاله دوده ، والدكتور هونغكيون كيم لسلاله الدودة البطيءه-1 (eg142) ، والمشروع الوطني للموارد البيولوجية لسلاله الدودة sca-1 (tm5339) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Nagel, G., et al. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Liewald, J. F., et al.
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Lewis, J. A., et al. Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using umanager. Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).
- Richmond, J. Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction. Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).
- Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans. Gene. 261, 211-219 (2000).
- Zwaal, R. R., et al. The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).
- Stammers, A. N., et al. The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).
- Clapham, D. E.
- Hovnanian, A. Serca pumps and human diseases. Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).
- Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease. Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).
- Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation. International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).
- Martin, A. A., Richmond, J. E. The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16. Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).
- Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction. Neuron. 32, 867-881 (2001).
- Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).
- Gourgou, E., Chronis, N. Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans. Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).
- Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).
- Nekimken, A. L., et al. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).
- Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).
- Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).
- Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , 1-26 (2015).
