Summary
Enteroids ontstaan als een nieuwe model in de studie van ziekten bij de mens. Het protocol wordt beschreven hoe een enteroid model van menselijke necrotizing enterocolitis met behulp van lipopolysaccharide (LPS) behandeling van enteroids gegenereerd op basis van neonatale weefsel te simuleren. Verzamelde enteroids tonen ontstekingsreactie verwant aan degenen gezien in menselijke necrotizing enterocolitis.
Abstract
Necrotiserende enterocolitis is (NEC) een verwoestende ziekte van pasgeboren zuigelingen. Het wordt gekenmerkt door meerdere pathofysiologische veranderingen in de menselijke darm epitheel, leiden tot verhoogde intestinale permeabiliteit, verminderde teruggave en toegenomen celdood. Hoewel er talrijke diermodellen van NEC, is er mogelijk reactie op letsel en therapeutische interventies zeer variabel tussen soorten. Bovendien is het ethisch uitdagend om te studeren pathofysiologie van de ziekte of nieuwe therapeutische middelen rechtstreeks in menselijke proefpersonen, met name kinderen. Daarom is het wenselijk om een nieuw model van NEC met behulp van menselijke weefsels te ontwikkelen. Enteroids zijn 3-dimensionale organoids afgeleid van intestinale epitheliale cellen. Ze zijn ideaal voor de studie van complexe fysiologische interacties, cel signalering en verdediging van de gastheer-pathogeen. In dit manuscript beschrijven we een protocol dat culturen menselijke enteroids na isoleren van intestinale stamcellen van patiënten die een resectie van de darm. De crypte cellen worden gekweekt in medium met groeifactoren die differentiatie in de verschillende cel typen inwoner van de menselijke intestinaal epitheel aanmoedigen. Deze cellen worden gekweekt in een synthetische, collagene mix van proteïnen toe die als een steiger dienen, het nabootsen van de extra-cellulaire kelder-membraan. Dientengevolge, ontwikkelen enteroids apicale-basolaterale polariteit. Co beheer van lipopolysaccharide (LPS) in media veroorzaakt een ontstekingsreactie in de enteroids, leiden tot histologische, genetische en eiwit expressie veranderingen vergelijkbaar zijn met die in de menselijke NEC gezien. Een experimenteel model van NEC met behulp van menselijk weefsel kan bieden een nauwkeuriger platform voor drugs- en behandeling testen voorafgaand aan de menselijke proeven, als we streven naar een remedie voor deze ziekte te identificeren.
Introduction
Menselijke enteroids zijn een ex vivo 3-dimensionale cultuur systeem gegenereerd op basis van stamcellen van intestinale crypten van menselijke intestinale weefselsteekproeven geïsoleerd. Dit baanbrekende model was baanbrekend werk verricht door Hans Clevers et al. in 2007 na de ontdekking van Lgr5 + stamcellen in de crypten van de dunne darm in muizen1. Hun werk legden de basis voor de vaststelling van een ex vivo intestinale epitheliale cultuur van meerdere celtypen die zonder belangrijke genetische of fysiologische veranderingen2kan worden gepasseerd. Sinds deze ontdekking, hebben enteroids gebruikt als een nieuwe model normale spijsvertering fysiologie, en de pathofysiologie van intestinale ziekten zoals ontstekingsdarmziekte, gastheer-pathogeen interacties en regeneratieve geneeskunde2te gaan studeren.
Het gebruik van enteroids als een ex vivo model voor de studie van intestinale pathofysiologie heeft diverse voordelen ten opzichte van alternatieve technieken. Voor de afgelopen decennia, zijn diermodellen en vereeuwigd intestinale kanker-afgeleide cellijnen gebruikt om te studeren van intestinale fysiologie3,4,5. Eencellige culturen vertegenwoordigen niet de diversiteit van de soorten cellen aanwezig zijn in normale intestinale epitheel, waardoor het ontbreken van cel naar cel cross-talk en segment-specificiteit in eiwit expressie, signalering en pathogene agens veroorzaakte ziekte6. Stamcellen in enteroids onderscheiden in de grote soorten van de epitheliale cellen zoals enterocyten, Paneth cellen, goblet cellen, enteroendocrine cellen en meer3. Ze vertonen polariteit, epitheliale vervoer functies vervullen, en zorgen voor intestinale segment specificiteit6. Sinds enteroids het meerdere celtypen van menselijke intestinaal epitheel recapituleren kan, kunnen zij overwinnen deze erkende beperking van kanker cel-gebaseerde systemen. Na verloop van tijd derivaten van cellijnen zijn subcloned en evolueren tot grotere diversiteit in eiwit expressie en localisatie3vertonen. Integendeel, kan enteroids worden gepasseerd zonder belangrijke genetische of fysiologische veranderingen2. Hoewel talrijke diermodellen voor NEC bestaat, is er wellicht antwoord op letsel en therapeutische interventies zeer variabel tussen soorten. Als gevolg van deze beperkingen, mislukken therapeutics afgeleid van diermodellen 90% van de tijd wanneer het wordt getest in menselijke proeven als gevolg van verschillen in toxiciteit of werkzaamheid3. Enteroids dienen als veelbelovende preklinische modellen die kunnen overwinnen deze tekortkomingen, wat leidt tot een beter begrip van de complexe intestinale pathofysiologie en daarom meer succesvolle en kosteneffectieve therapeutische innovaties. Er zijn ook recente aanwijzingen dat de leeftijd van het weefsel dat een enteroid wordt gegenereerd uit biologisch belangrijke7blijft. Dit is een zeer belangrijk detail voor ons model omdat enteroids zijn gegenereerd op basis van neonatale weefsel, waardoor het behoud van fysiologische relevantie aan patiënten met NEC.
Het nut van enteroids als modellen van aandoeningen bij de mens blijft uitbreiden, in de hoop vinden Vulkaniseert tot ernstige en pervasieve voorwaarden. Necrotiserende enterocolitis (NEC) is een verwoestende intestinale ziekte van pasgeborenen gekenmerkt door intestinale necrose en leidt vaak tot perforatie van de wand van de darm, bloedvergiftiging en dood8. Als gevolg van de complexe en multifactoriële pathofysiologie van NEC, heeft het exacte mechanisme van de ziekte niet nog is volledig toegelicht; verhoogde intestinale permeabiliteit heeft echter duidelijk betrokken bij de ziekte proces8. Aangezien dat de studie van NEC en potentiële therapeutische agenten is ethisch uitdagend bij menselijke proefpersonen, met name kinderen, het is bijzonder wenselijk gebruik te maken van een biologisch relevante enteroid model van NEC met behulp van menselijke neonatale weefsel. Enteroids hebben tot nu toe een beperkte rol in de studie van NEC. Dit protocol beschrijft het gebruik van enteroids die zijn afgeleid van menselijke intestinale weefselsteekproeven als een roman ex vivo model voor de studie van necrotiserende enterocolitis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutionele beoordeling van bestuur goedkeuring was verkregen (IRB #2013-15152) voor het verzamelen van weefselmonsters van patiënten die een resectie van de darm aan Ann en Robert H. Lurie kinder ziekenhuis van Chicago, Chicago, IL. Alle protocollen werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele en nationale richtsnoeren en voorschriften voor het welzijn van de mens. Schriftelijke toestemming van de ouders op de hoogte was nodig en verkregen vóór sample collectie in alle gevallen.
1. reagens voorbereiding
- Bereiden van voedingsbodems stockoplossing voor hele weefsel collectie: 1 L van de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM), 110 mL van foetale boviene Serum (FBS), 11 mL penicilline-streptomycine (eindconcentratie 1%) en 1.1 mL filter-gesteriliseerde insuline (definitieve concentratie van 0,1%.) Stockoplossing van het winkel bij 4 ° C.
- Bereiden van Chelating Buffer #1: 30 mL voedingsbodems (zoals beschreven in punt 1.1), 600 µL 0.5 M ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) (eindconcentratie 10 mM), 300 µL van gentamicine (eindconcentratie 1%) en 60 µL van amfotericine-B (eindconcentratie 0,2%). Stockoplossing van het winkel bij 4 ° C.
- Chelating Buffer #2 bereiden: 30 mL voedingsbodems (zoals beschreven in punt 1.1), 300 µL van 0.5 M EDTA (eindconcentratie 5mM), 300 µL van gentamicine (eindconcentratie 1%) en 60 µL van amfotericine-B (eindconcentratie 0,2%). Stockoplossing van het winkel bij 4 ° C.
- Bereiden van menselijke Minigut Media: 41.4 mL van DMEM/F-12, 5 mL FBS (laatste 10%), 500 µL van penicilline-streptomycine (eindconcentratie 1%), 500 µL van L-glutamine (eindconcentratie 1%), 500 µL van gentamicine (eindconcentratie 1%), 100 µL van amfotericine-B (finale concentratie 0,2%), 500 µL van 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonzuur (HEPES) (eindconcentratie 10 mM), aanvulling van 500 µL van 100 x N-2 en 1 mL 50 x B-27 aanvullen minus vitamine A voor een totaal volume van 50 mL. Stockoplossing van het winkel bij-20 ° C.
- Bereiden van menselijke Minigut Media voltooid: 10 mL van menselijke Minigut Media (bereid in 1.4), 10 µL van 100 µg/mL Wnt3a (eindconcentratie 100 ng/mL), 10 µL van 100 µg/mL Noggin (eindconcentratie 100 ng/mL), 10 µL van 1 mg/mL R-Spondin (eindconcentratie 1 µg/mL) , 10 µL van 500 µg/mL epidermale groeifactor (EGF) (eindconcentratie 50 ng/mL), 10 µL van 1 M N-Acetylcysteïne (eindconcentratie 1 mM), 10 µL van 10 mM Y-27632 (eindconcentratie van 10 µM), 10 µL van 500 µM A-83 (eindconcentratie 500 nM), 10 µL van 10 mM SB202190 (laatste concentratie 10 µM), 100 µL van 1 M Nicotinamide (eindconcentratie 10 mM) en 1 µL van 100 µM [leu] 15-gastrine 1 (eindconcentratie 10 nM). Total volume 10 mL. Stockoplossing van het winkel bij 4 ° C.
Opmerking: Oplossingen moeten gebruikt worden binnen 48 uur.
2. crypt isolatie en beplating van hele weefsel
-
Op het moment van collectie in de operatieve suite, leg het menselijk kleine intestinale weefsel-monster in koude Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS). Het model wassen in koud DPBS tot duidelijk van ontlasting en bloed. Winkel specimen bij 4 ° C in RPMI 1640 Medium tot klaar voor crypt isolatie.
Opmerking: Weefsel kan niet worden opgeslagen meer dan 24u.- Zorg ervoor dat het model duidelijk van ontlasting en bloed. Met behulp van delicate ontleden schaar, verwijder alle overtollige vet of chirurgische clips/nietjes enz. Weeg het model.
Opmerking: Streven naar een stuk ongeveer 0,75-2.5 g.
- Zorg ervoor dat het model duidelijk van ontlasting en bloed. Met behulp van delicate ontleden schaar, verwijder alle overtollige vet of chirurgische clips/nietjes enz. Weeg het model.
-
Snijd het specimen in 0.5 cm stukken en plaats in 30 mL chelaat Buffer #1 (zoals opgesteld in stap 1.2).
- Schudden bij lage snelheid gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.
- Filteren van weefsel door 100 µm cel zeef en stroom door negeren.
-
Meng het weefsel 30 mL chelaat Buffer #2 (zoals opgesteld in stap 1.3).
- Schudden bij lage snelheid gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.
- Filteren van weefsel door een zeef van 100 µm cel en stroom door negeren.
- Ontdooi 500 mL kelder membraan matrix op ijs voor gebruik in stap 2.8.
-
Toevoegen van weefsel tot 10 mL van koude DMEM in een conische tube van 50 mL en schud krachtig met de hand voor 10 s.
- Filtreer door een zeef van 100 µm cel en verzamelen van stroom door (Label #1). Houd buis #1 op het ijs.
- Weefsel toevoegen aan een ander 10 mL koude DMEM in een aparte 50 mL conische buis en schud krachtig met de hand voor 10 s.
- Filtreer door een zeef van 100 µm cel en verzamelen van stroom door (label #2).
- Herhaal dit twee extra keer totdat er vier conische buisjes met stroom door (gelabelde buizen #1-4).
-
Filter tube #1 oplossing via een 100 µm cel zeef en overdracht informatiestroom via in 15 mL conische buis (Label #1). Herhaal deze stappen voor #2-4.
- Centrifuge 15 mL buizen #1-4 bij 200 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.
-
De laminaire flow Hood, verwijder het supernatant uit buizen #1-4 en negeren. Vermijd het verstoren van de wolk van weefsel direct boven de pellet, zelfs als dat betekent dat sommige bovendrijvende vloeistof achterlaat.
- Door het langzaam pipetteren, meng de pellet met de overgebleven supernatant in buizen #1-4.
- Breng het mengsel van buizen #1-4 in één enkel 2 mL conische buis.
- Centrifugeer de conische buis bij 200 x g gedurende 20 min bij 4 ° C.
-
Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 µL van kelder membraan matrix.
Opmerking: houden de kelder membraan matrix op ijs te allen tijde en snel te werken voor de volgende stappen. Dit product polymerizes heel snel bij kamertemperatuur.- Breng 50 µL specimen/kelder membraan matrix schorsing naar het midden van een goed in een 24-well-plate. Dit moet verschijnen koepel-vormige.
Opmerking: Gebruik van gekoelde Pipetteer tips helpt bij overdracht van de vlotter van de schorsing, minimaliseren van de polymerisatie. - Herhaal 9 keer te vullen 10 totale wells.
- Breng 50 µL specimen/kelder membraan matrix schorsing naar het midden van een goed in een 24-well-plate. Dit moet verschijnen koepel-vormige.
- Plaats de plaat 24-well in 37 ° C, 5% CO2 incubator voor 30 min dat polymerisatie.
- Voeg 500 µL van menselijke Minigut Media Complete (zoals opgesteld in stap 1.5) toe aan elk putje. Om de 2 dagen vervangen.
- Verzamelen enteroids na 5-10 dagen, wanneer de ontluikende is gevisualiseerd. Zie stap 4 en 5 voor collectie instructies.
3. de inductie van experimentele NEC
- 10 µL van 5 mg/mL lipopolysaccharide (LPS) aan 500 µL van menselijke Minigut Media Complete (zoals opgesteld in stap 1.5) in elk putje op dag 0 toevoegen. Vervang om de 2 dagen tot de collectie.
4. voorbereiding voor het insluiten van paraffine
-
Zachtjes verwijderen media.
- Voeg 1 mL PBS en zachtjes op en neer te ontbinden de kelder membraan matrix met zorg niet aan de enteroids lyse Pipetteer.
- Centrifugeer het mengsel van PBS/enteroid met < 300 x g voor 5 min pellet en verwijderen van PBS.
- Toevoegen van 4% paraformaldehyde te repareren bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
-
Centrifugeer bij < 300 x g voor 5 min pellet, en vervolgens het verwijderen van PBS.
- Wassen voorzichtig met 1 mL PBS samen en centrifugeer bij < 300 x g voor 5 min pellet, en vervolgens het verwijderen van PBS.
- Herhaal stap 4.3.1.
-
Smelt een voldoende volume van de weefsel gel (ongeveer 300 µL) verwerking door het gewenste bedrag te plaatsen in een conische buis en verwarmen het in een droge Bad incubator bij 65 ° C gedurende 3 tot 10 minuten tot vloeistof.
- Voeg het weefsel verwerking gel om de pellet en meng voorzichtig.
- Een dekglaasje aan, plaats een kleine klonen ring.
- Pipetteer het weefsel verwerking van gel en enteroid mengsel in een klonen ring gemonteerd op een dekglaasje aan.
-
Het weefsel verwerking van gel en enteroid mengsel te stollen bij 4 ° C gedurende 1 h staan.
- De klonen ring met gestolde mengsel onderdompelen in 70% ethanol in voorbereiding voor het insluiten van paraffine.
5. Enteroid collectie voor RNA en eiwit extractie
- Zachtjes verwijderen menselijke Minigut Media volledig uit elk putje.
-
Voeg 1 mL PBS en zachtjes Pipetteer omhoog en omlaag om op te lossen de kelder membraan-matrix. Wees voorzichtig niet te distantiëren van de enteroids.
- Plaats PBS/enteroid mengsel in een steriele 2 mL conische buis.
- Centrifugeer bij < 300 x g gedurende 5 minuten aan pellet.
- Zachtjes verwijderen PBS, verzorgen als u niet wilt verwijderen van de enteroids.
- Herhaal stap-serie 5.2 twee meer tijden.
- Bevriezen in-80 ° C tot klaar voor eiwit en/of RNA extractie.
- Gen expressie en eiwit isolatie van de enteroids met behulp van gevestigde qRT-PCR en westelijke bevlekken technieken uit te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onmiddellijk na de beplating verschijnen de vers geïsoleerde intestinale crypten als verlengde staven. Binnen uur vindt de enteroid op een ronde vormgeving (Figuur 1een). In de komende paar dagen begint de enteroids vormen van bollen, zoals te zien in Figuur 1b. Ontluikende voordoet tussen 5-10 dagen (Figuur 1c) en enteroid collectie moet worden uitgevoerd op dat moment.
De groeiende enteroids zal ook het vertonen van polariteit, met een gecentraliseerde lumen, een apicaal rand en een basolaterale domein (Figuur 2). Enteroids tonen ook structurele integriteit, vertegenwoordigd door een robuuste actine cytoskelet (Figuur 3). Na enkele dagen in de cultuur, de enteroids van de LPS behandeld ervaring meer apoptosis en krijgen een lagere opbrengst dan de controlegroep (Figuur 4). Zoals gezien in de menselijke NEC en lymfkliertest modellen van NEC9, werd een verhoogde expressie van Toll-like receptor 4 (TLR4) gevonden in enteroids van de LPS behandeld in vergelijking met besturingselementen (Figuur 5).
Figuur 1: Crypt cultuur en menselijke enteroid formatie van hele weefsel. de cultuur van (een) dag 0 crypte met ronde, platte vormgeving. (b) dag 4 enteroids met sferoïde vorming. (c) dag 7 enteroids met ontluikende (zwarte pijl). Schaal bars = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Histologische uiterlijk van een enteroid. Haemotoxylin en eosine-kleuring. De enteroid geeft een gecentraliseerde lumen en vertoont polariteit, met zowel een apicale en basolaterale domein. De haemotoxylin (paars) vertegenwoordigt de kern, overwegende dat de eosine (roze) cytosolische onderdelen vertegenwoordigt. Schaal bar = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Enteroid actine cytoskelet. Immunoflorescence opname van een enteroids. De enteroid toont structurele integriteit, zoals blijkt uit de prominente actine-cystoskeleton (magenta). Kernen gekleurd met DAPI (blauw), schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Menselijke enteroid cultuur opbrengst is gedaald met LPS behandeling. Dag 5 enteroids in cultuur, gegroeid uit hetzelfde hele weefsel monster. (een) Enteroids behandeld met controle voedingsbodems. Robuuste groei weergeven (b) Enteroids behandeld met LPS in kweekmedia. Alleen een paar overleven enteroids. Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Verhoogd TLR4 expressie in experimentele NEC enteroids. (een) qRT-PCR toonde verhoogd TLR4 mRNA uitdrukking in enteroids blootgesteld aan LPS (p = 0,03). (b) westelijke vlekkenanalyse weergegeven: verhoogd TLR4 expressie in experimentele menselijke enteroid NEC (p = 0,02). Representatieve westelijke vlek afgebeeld. Waarden zijn middelen ± SEM van 3 monsters per groep. * p < 0.05 door Student t -test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze roman ex vivo menselijke intestinale enteroid model fungeert als een handige methode voor de studie van de intestinale barrière dysfunctie in necrotiserende enterocolitis (NEC). De enteroid verwerkingsmethoden hier gepresenteerd werden aangepast uit de vorige werk van Drs. Misty Good, Michael Helmrath en Jason Wertheim10,11,12.
Details rond de gehele weefsel collectie en timing van de crypte isolatie zijn kritische stappen in dit protocol. Weefsel worden onmiddellijk op het moment van operatieve resectie verzameld en verwerkt voor crypt isolatie zodra het weefsel in het lab aankomt. Wij hebben gekozen weefsel van patiënten minder dan 3 maanden oud voor dit model. Vertraagde verwerking kan optreden binnen de 24u na hele weefsel collectie indien nodig. Bovendien, de kwaliteit van het menselijk weefsel monster sterk van invloed op het rendement van de crypte isolatie. Gezonde dunne darm zonder onderliggende pathologie en van de jongere patiënten (< 2 maanden oud) is gebleken de beste resultaten oplevert. Bovendien moet het verzamelde weefsel worden gekozen uit de gezondste ruimte, meestal aan de distale uiteinden van het resected model. Met behulp van een groter stuk van darm verbetert niet crypt isolatie met de beschreven oplossing volumes in het bovenstaande protocol. Intestinal segmenten ongeveer 1-2 cm in lengte, gewicht 0,75-2.5 g optimaal zijn. De inductie van experimentele NEC via LPS blootstelling was gemodelleerd uit gevestigde cel cultuur en dierlijke modellen. De gevestigde werk van Hackam et al. toonde de kritische rol van TLR4 (LPS receptor) in NEC ontwikkeling9,13,14,15. LPS activering van TLR4 stimuleert proinflammatoire cytokines, een afname van de barrière integriteit en activering van subepithelial leukocyten, die kenmerkend zijn voor de signalering gebeurtenissen betrokken in menselijke NEC. TLR4 heeft als een belangrijk molecuul in bevordering van ontsteking7 en dat gebrek aan functionele TLR4 zijn gebleken dat bescherming tegen de ontwikkeling van NEC15dieren zijn betrokken. Circulerende niveaus van LPS zijn verhoogde bij patiënten met NEC en verhoogde kruk en plasma van diermodellen van NEC. LPS induceert darmontstekingen in dieren die lijkt op de menselijke NEC, waarin wordt gewezen op het belang van ontsteking in dit traject. Spiegeling van de gevestigde celkweek en dierlijke modellen van NEC, wij zijn van mening dat inductie van experimentele NEC via LPS administratie in enteroid cultuur een handig ex vivo menselijke neonatale model voor de studie van NEC is. In overeenstemming met eerdere rapporten in andere gevestigde modellen, onze experimentele NEC enteroids aangetoond verhoogde expressie van TLR4 vergeleken met besturingselementen.
Het protocol voor inductie van experimentele NEC via LPS blootstelling heeft ondergaan verschillende belangrijke wijzigingen en verbeteringen. Enteroids werden aanvankelijk gegroeid voor 5 dagen, dan geënt met LPS gedurende 24 uur en daarna verzameld. Het protocol is nu raadt aan LPS inoculatie op dag 0 met continue blootstelling in elke cultuur media wijziging tot collectie. Bovendien, is de dosering van LPS geoptimaliseerd. Na het uitvoeren van een dosis curve en trialing verscheidene verschillende concentraties van de LPS, werd 5 mg/mL geselecteerd. Experimenteren met LPS inoculatie rechtstreeks in de kelder membraan matrix/enteroid mengsel op het moment van plating was ook trialed; echter, dit was omslachtig en resultaten geen verbetering.
Er zijn beperkingen die moeten worden aangepakt als het gebruik van de menselijke enteroid model evolueert. Sinds de ontdekking in 2007, zijn verscheidene verschillende protocollen gebruikt tot stand brengen en de cultuur van de enteroids. De vele factoren die de groei vereist voor enteroid onderhoud en differentiatie ontbreken normalisatie, die invloed kan hebben op de reproduceerbaarheid. Bovendien ontbreekt de enteroid cultuur mechanische krachten die van invloed zijn op de menselijke intestinaal epitheel in fysiologische omstandigheden. Druk van luminal flow en peristaltiek invloed kan hebben op gen- en eiwit expressie, die niet is verwerkt in dit model. Dit model ontbreekt ook zenuwen, immune cellen, een microbiome, therapieën en mesenchym die aanwezig zijn in de menselijke darm epitheel.
Blootstelling aan LPS in dit model van menselijke intestinale enteroid veroorzaakt een ontstekingsreactie leiden tot histologische, genetische en eiwit expressie veranderingen vergelijkbaar zijn met die gevonden in menselijke NEC. Hoewel er verschillende huidige dierlijke modellen van NEC, varieert reactie op intestinale letsel en therapeutische interventies sterk tussen de soorten. Aangezien het is ethisch uitdagend om te studeren van pathofysiologie van de ziekte of voor het testen van nieuwe therapeutische middelen rechtstreeks bij de mens, met name zuigelingen, is het buitengewoon belangrijk om te blijven kweken van deze roman ex vivo model van NEC met behulp van menselijke weefsels. Menselijke enteroids zijn vatbaar voor genetische modificatie en fundamenteel belang in de ontwikkeling van therapieën voor vele ziekten bij de mens intestinale16kan worden. Toekomstige richtingen moeten streven naar de menselijke enteroids cultuur op een permeabele steiger in een zaal van de perfusie met apicale en basolaterale stroom aan om te reproduceren in vivo crypt-villosités het platform zo goed als fysiologische krachten zoals peristaltiek en luminal stroom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het nationale Instituut van gezondheid Instituut van Diabetes en spijsverterings en nier ziekte Grant (K08DK106450) en de Jay Grosfeld Award van de American Pediatric chirurgische Association aan C.J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | ThermoFisher | AAJ19943K2 | |
| A-83 | R&D Tocris | 2939/10 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher | 15290026 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Basement Membrane Matrix (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher | MT-16-405-CV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11-965-118 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644-.2MG | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Pro | 100-125 | |
| Gentamicin | Sigma | G5013-1G | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | ThermoFisher | 35050-061 | |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | |
| [leu] 15-gastrin 1 | Sigma | G9145-.1MG | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630-25MG | |
| N-2 supplement | ThermoFisher | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | ThermoFisher | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Noggin | R&D Systems INC | 6057-NG/CF | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140-148 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P5368-5X10PAK | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 11875093 | |
| R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
| SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
| Tissue Processing Gel (Histogel) | ThermoFisher | 22-110-678 | |
| Wnt3a | R&D Systems INC | 5036-WN-010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503-1MG |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).
- Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
- In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
- Senger, S., et al. Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC). Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
- Moore, S. A., et al. Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis. Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).
- Neal, M. D., et al. A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).
- Lanik, W. E., et al. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).
- Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Neal, M. D., et al. Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier. The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).
- Sodhi, C. P., et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).
