Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En roman menneskelige epitelial Enteroid Model af nekrotiserende Enterocolitis

Published: April 10, 2019 doi: 10.3791/59194
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Pediatrics, Northwestern University, 2Division of Pediatric Surgery, Ann & Robert H. Lurie Children's Hospital of Chicago

Summary

Enteroids dukker op som en roman model i studiet af menneskers sygdom. Protokollen beskriver hvordan man simulere en enteroid model af menneskelige nekrotiserende enterocolitis ved hjælp af LPS (LPS) behandling af enteroids genereret fra neonatal væv. Indsamlede enteroids vise inflammatoriske forandringer beslægtet med dem, der ses i menneskelige nekrotiserende enterocolitis.

Abstract

Nekrotiserende enterocolitis er (NEC) en ødelæggende sygdom hos nyfødte spædbørn. Det er kendetegnet ved flere patofysiologiske forandringer i den menneskelige intestinale epitel, fører til øget intestinal permeabilitet, nedsat tilbagelevering og øget celledød. Selvom der er adskillige dyremodeller for NEC, kan svar til skade og terapeutiske indgreb være meget varierende mellem arter. Derudover er det etisk udfordrende at studere sygdom Patofysiologi eller roman terapeutiske agenter direkte i forsøgspersoner, især børn. Derfor er det ønskeligt at udvikle en ny model af NEC ved hjælp af menneskelige væv. Enteroids er 3-dimensionel organoids stammer fra tarm epitel celler. De er ideelle til studiet af kompleks fysiologisk interaktioner, celle signalering og vært-patogen forsvar. I dette manuskript beskrive vi en protokol at kulturer menneskelige enteroids efter isolere intestinal stamceller fra patienter i tarm resektion. Krypten celler er kulturperler i medier indeholdende vækstfaktorer, der fremmer differentiering af de forskellige celle typer indfødte af den menneskelige intestinale epitel. Disse celler dyrkes i en syntetisk, kollagen blanding af proteiner, der tjener som et stillads, efterligne den ekstra-cellulære basalmembranen. Som følge heraf udvikle enteroids apikale basolateral polaritet. Fælles administration af LPS (LPS) i medier forårsager en inflammatorisk reaktion i enteroids, fører til Histologisk, genetiske og protein udtryk ændringer ligner dem set i menneskelige NEC. En eksperimentel model af NEC ved hjælp af menneskelige væv kan give en mere nøjagtig platform for narkotika og behandling prøveudtagning før forsøg på mennesker, som vi stræber efter at finde en kur mod denne sygdom.

Introduction

Menneskets enteroids er en ex vivo 3-dimensionelle kultur system genereret fra stamceller isoleret fra tarm Krypter af menneskelige intestinal vævsprøver. Denne banebrydende model var banebrydende ved Hans Clevers et al. i 2007 efter opdagelsen af Lgr5 + stamceller på Krypter af tyndtarmen i mus1. Deres arbejde lagde fundamentet for etablering af en ex vivo intestinale epitel kultur af flere celletyper, der kunne være passaged uden betydelige genetiske eller fysiologiske ændringer2. Siden denne opdagelse, er enteroids blevet brugt som en ny model til at studere normal mave fysiologi og Patofysiologi af tarm sygdomme som inflammatorisk tarmsygdom, vært-patogen interaktioner og regenerativ medicin2.

Brugen af enteroids som en ex vivo model for studiet af intestinal Patofysiologi har flere fordele sammenlignet med alternative teknikker. For de sidste mange årtier, blevet dyremodeller og udødeliggjort tarm kræft-afledte cellelinjer brugt til at studere intestinal fysiologi3,4,5. Encellede kulturer repræsenterer ikke forskellige celletyper findes i normal tarm epitel, dermed mangler celle til celle cross-talk og segment-specificitet i protein udtryk, signalering og patogen-induceret sygdom6. Stamceller i enteroids differentiere i store epitelcelle typer såsom enterocytes, Paneth cellerne, goblet celler, enteroendocrine celler og mere3. De udviser polaritet, udføre epithelial transport funktioner og mulighed for intestinal segment specificitet6. Da enteroids kan sammenfatte de flere celletyper af menneskelige intestinale epitel, er de i stand til at overvinde denne anerkendte begrænsning af kræft celle-baserede systemer. Over tid, derivater af cellelinjer er subcloned og udvikle sig til at udvise større mangfoldighed i protein udtryk og lokalisering3. Tværtimod, kan enteroids være passaged uden betydelige genetiske eller fysiologiske ændringer2. Selv om adskillige dyremodeller for NEC findes, kan svar til skade og terapeutiske indgreb være meget varierende mellem arter. Som følge af disse begrænsninger, therapeutics udledes fra dyremodeller mislykkes 90% af tiden når testet i menneskelige forsøg på grund af forskelle i toksicitet eller virkning3. Enteroids tjene som lovende prækliniske modeller, der kan afhjælpe disse mangler, hvilket fører til en bedre forståelse af komplekse intestinal Patofysiologi og derfor, mere vellykket og omkostningseffektivt terapeutiske nyskabelser. Der er også de seneste beviser på, at alder af væv, der en enteroid genereres fra forbliver biologisk vigtige7. Dette er en specielt vigtig detalje for vores model da enteroids er genereret fra neonatal væv, dermed bevare fysiologisk relevans for patienter med NEC.

Nytte af enteroids som modeller for humane sygdomme fortsætter med at udvide, i håb om at finde kur alvorlige og udbredte betingelser. Nekrotiserende enterocolitis (NEC) er en ødelæggende tarm sygdom hos nyfødte karakteriseret ved tarm nekrose og ofte fører til perforering af tarmvæggen, sepsis og død8. På grund af den komplekse og multifaktoriel Patofysiologi af NEC, har den nøjagtige mekanisme af sygdommen ikke endnu blevet fuldt belyst; imidlertid har øget intestinal permeabilitet klart været impliceret i sygdom proces8. Da studiet af NEC og potentielle terapeutiske agenter er etisk udfordrende på mennesker, især børn, er det ønskeligt at udnytte en biologisk relevante enteroid model af NEC ved hjælp af menneskelige neonatal væv. Hidtil har enteroids en begrænset rolle i studiet af NEC. Denne protokol beskriver brugen af enteroids stammer fra menneskelige intestinal vævsprøver som en roman ex vivo model for studiet af nekrotiserende enterocolitis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Institutionelle review board godkendelse blev opnået (IRB #2013-15152) til samling af vævsprøver fra patienter i tarm resektion ved Ann og Robert H. Lurie children's Hospital i Chicago, Chicago, IL. Alle protokoller blev udført i overensstemmelse med institutionelle og nationale retningslinjer og forordninger for menneskelig velfærd. Skriftlig informeret forældresamtykke var påkrævet og fremstillet før prøvetagning i alle tilfælde.

1. reagens

  1. Forberede hele væv samling dyrkningsmedier stamopløsning: 1 L af Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM), 110 mL af føtal bovin Serum (FBS), 11 mL af Penicillin-Streptomycin (slutkoncentration 1%) og 1,1 mL af filter-steriliseret insulin (endelig koncentration 0,1%.) Gemme stamopløsning ved 4 ° C.
  2. Forberede Chelating Buffer #1: 30 mL kultur medier (som beskrevet i punkt 1.1), 600 µL af 0,5 M ethylendiamintetra syre (EDTA) (slutkoncentration 10 mM), 300 µL af Gentamicin (slutkoncentration 1%) og 60 µL af Amphotericin B (slutkoncentration 0,2%). Gemme stamopløsning ved 4 ° C.
  3. Forberede Chelating Buffer #2: 30 mL kultur medier (som beskrevet i punkt 1.1), 300 µL af 0,5 M EDTA (slutkoncentration 5mM), 300 µL af Gentamicin (slutkoncentration 1%) og 60 µL af Amphotericin B (slutkoncentration 0,2%). Gemme stamopløsning ved 4 ° C.
  4. Forberede menneskelige Minigut medier: 41,4 mL af DMEM/F-12, 5 mL FBS (sidste 10%), 500 µL af Penicillin-Streptomycin (slutkoncentration 1%), 500 µL af L-glutamin (slutkoncentration 1%), 500 µL af Gentamicin (slutkoncentration 1%), 100 µL af Amphotericin B (endelig koncentration 0,2%), 500 µL 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane ethylbenzthiazolinsulfonsyre syre (HEPES) (slutkoncentration 10 mM), 500 µL af 100 x N-2 supplement, og 1 mL af 50 x B-27 supplere minus a-vitamin for en samlet maengde paa 50 mL. Gemme stamopløsning ved-20 ° C.
  5. Forberede menneskelige Minigut Media komplet: 10 mL af Human Minigut medier (forberedt i 1,4), 10 µL af 100 µg/mL Wnt3a (slutkoncentration 100 ng/mL), 10 µL af 100 µg/mL Noggin (slutkoncentration 100 ng/mL), 10 µL af 1 mg/mL R-Spondin (slutkoncentration 1 µg/mL) , 10 µL af 500 µg/mL Epidermal vækstfaktor (EGF) (slutkoncentration 50 ng/mL), 10 µL 1 M N-acetylcystein (slutkoncentration 1 mM), 10 µL af 10 mM Y-27632 (slutkoncentration 10 µM), 10 µL af 500 µM A-83 (slutkoncentration 500 nM), 10 µL af 10 mM SB202190 (endelige koncentration 10 µM), 100 µL 1 M nicotinamid (slutkoncentration 10 mM) og 1 µL af 100 µM [leu] 15-gastrin 1 (slutkoncentration 10 nM). Samlede volumen 10 mL. Gemme stamopløsning ved 4 ° C.
    Bemærk: Løsninger skal bruges inden for 48 timer.

2. krypt Isolation og Plating fra hele væv

  1. På tidspunktet for indsamlingen i den operative suite, placere den menneskelige lille tarm vævsprøve i kolde Dulbecco phosphat bufferet saltvand (DPBS). Vask modellen i kolde DPBS indtil clear afføring og blod. Opbevare prøvemateriale ved 4 ° C i RPMI 1640 Medium indtil klar til krypten isolation.
    Bemærk: Væv kan ikke gemmes mere end 24 timer.
    1. Sørg for, at modellen er klart afføring og blod. Bruger fine dissekere saks, fjerne eventuelle overskydende fedt eller kirurgiske clips/hæfteklammer osv. Veje modellen.
      Bemærk: Målet for et stykke ca 0,75-2,5 g.
  2. Skære modellen i 0,5 cm stykker og placere i 30 mL chelaterende Buffer #1 (som udarbejdet i trin 1.2).
    1. Ryst ved lav hastighed i 15 min. ved 4 ° C.
    2. Filtrer væv gennem 100 µm celle si og kassér gennemstrømningen.
  3. Tilføje vævet til 30 mL chelaterende Buffer #2 (som udarbejdet i trin 1.3).
    1. Ryst ved lav hastighed i 15 min. ved 4 ° C.
    2. Filtrer væv gennem en 100 µm celle si og kassér gennemstrømningen.
  4. Tø 500 mL af basalmembranen matrix på is til brug i trin 2.8.
  5. Tilføje væv til 10 mL af kold DMEM i en 50 mL konisk slange og rystes kraftigt med Haanden for 10 s.
    1. Der filtreres gennem en 100 µm celle si og indsamle flow gennem (etiket #1). Holde røret #1 på is.
    2. Tilføjer væv til en anden 10 mL af kold DMEM i en separat 50 mL konisk slange og rystes kraftigt med Haanden for 10 s.
    3. Der filtreres gennem en 100 µm celle si og indsamle flow gennem (etiket #2).
    4. Gentag to yderligere gange indtil der er fire koniske rør med flow gennem (mærket rør #1-4).
  6. Filter tube #1 løsning gennem en 100 µm celle si og overføre strøm gennem ind 15 mL konisk tube (etiket #1). Gentag for #2-4.
    1. Centrifuge 15 mL rør #1-4 på 200 x g i 15 min. ved 4 ° C.
  7. I laminar flow hood, Fjern supernatanten fra rør #1-4 og kassér. Undgå at forstyrre sky af væv umiddelbart over pellet, selv hvis det betyder efterlod nogle supernatanten.
    1. Af pipettering langsomt, blandes sammen pellet med levn supernatanten i rør #1-4.
    2. Overfør blandingen fra rør #1-4 i én enkelt 2 mL konisk tube.
    3. Centrifugeres den koniske rør på 200 x g i 20 min. ved 4 ° C.
  8. Fjern supernatanten og genopslæmmes pellet i 500 µL af basalmembranen matrix.
    Bemærk:     holde basalmembranen matrix på is på alle tidspunkter og arbejde hurtigt for de næste skridt. Dette produkt polymeriserer meget hurtigt ved stuetemperatur.
    1. Anvend 50 µL af prøven/kælder membran matrix suspension til midten af en brønd i en 24-godt plade. Dette skal vises kuppel-formet.
      Bemærk: Brug af kølet pipette tips aids i glattere overførsel af suspensionen, minimere polymerisering.
    2. Gentag 9 gange til at fylde 10 samlede brønde.
  9. 24-godt pladen anbringes i 37 ° C, 5% CO2 inkubator for 30 min til at tillade polymerisering.
  10. Tilsæt 500 µL af menneskelige Minigut Media komplet (som udarbejdet i trin 1,5) til hver brønd. Erstatte hver 2 dage.
  11. Indsamle enteroids efter 5-10 dage, når spirende er visualiseret. Se trin 4 og 5 for samling instruktioner.

3. induktion af eksperimentelle NEC

  1. Tilføje 10 µL af 5 mg/mL af LPS (LPS) til 500 µL af menneskelige Minigut Media komplet (som udarbejdet i trin 1,5) i hver brønd på dag 0. Erstatte hver 2 dage indtil samling.

4. forberedelse til Paraffin indlejring

  1. Forsigtigt fjerne medier.
    1. Der tilsættes 1 mL PBS og forsigtigt pipetteres op og ned for at opløse basalmembranen matrix med omhu for ikke at lyse på enteroids.
    2. Centrifugeres PBS/enteroid blanding på < 300 x g for 5 min pellet og fjerne PBS.
  2. Tilføj 4% PARAFORMALDEHYD at fastsætte ved stuetemperatur i 1 time.
  3. Der centrifugeres ved < 300 x g for 5 min til pellet, og fjern derefter PBS.
    1. Vask forsigtigt med 1 mL PBS og centrifugeres ved < 300 x g for 5 min til pellet, og fjern derefter PBS.
    2. Gentag trin 4.3.1.
  4. Smelt en tilstrækkelig mængde af væv behandling gel (ca. 300 µL) ved at placere det ønskede beløb i en konisk slange og opvarmning det i en tør bad inkubator ved 65 ° C i 3-10 min. indtil væsken.
    1. Tilføj væv behandling gel til pellet og bland forsigtigt.
    2. En coverslip, placere en lille kloning ring.
    3. Med pipette udtages væv forarbejdning gel og enteroid blandingen til en kloning ring monteret på en coverslip.
  5. Tillad væv behandling gel og enteroid blandingen til at størkne ved 4 ° C i 1 time.
    1. Dykke kloning ringen med størknede blandingen ind i 70% ethanol i forberedelse til integrering af paraffin.

5. Enteroid samlingen for RNA og Protein udvinding

  1. Forsigtigt fjerne menneskelige Minigut Media komplet fra hver brønd.
  2. Der tilsættes 1 mL PBS og forsigtigt pipetteres op og ned for at opløse matrixen basalmembranen. Vær omhyggelig med ikke at adskille enteroids.
    1. Placere PBS/enteroid blanding i en steril 2 mL konisk slange.
    2. Der centrifugeres ved < 300 x g for 5 min til pellet.
    3. Forsigtigt fjerne PBS, pas på ikke for at fjerne enteroids.
  3. Gentag trin serie 5,2 to gange mere.
  4. Fryse i-80 ° C indtil klar til protein og/eller RNA udvinding.
  5. Udføre gen expression og protein isolation af enteroids ved hjælp af veletablerede qRT-PCR og Western Blotting teknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Umiddelbart efter plating vises frisk isolerede intestinal Krypter som aflange stænger. Inden for timer, vil enteroid tage på en runde udseende (figur 1en). Over de næste mange dage, vil enteroids begynde formning kugler, som det ses i figur 1b. Spirende bør opstå mellem 5-10 dage (figur 1c) og enteroid samling skulle opstå på tidspunktet.

Den stigende enteroids vil også udstille polaritet, der indeholder en centraliseret lumen, en apikale grænse og en basolateral domæne (figur 2). Enteroids viser også strukturelle integritet, repræsenteret af en robust actin cytoskeleton (figur 3). Efter flere dage i kultur, LPS behandlede enteroids opleve flere apoptose og vil have et lavere udbytte end kontrolgruppen (figur 4). Som det ses i menneskelige NEC og murine modeller af NEC9, blev øget udtryk for Toll-lignende receptor 4 (TLR4) fundet i LPS behandlede enteroids i forhold til kontrol (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Krypt kultur og menneskelige enteroid dannelse fra hele væv. (en) dag 0 krypt kultur med runde, flade udseende. (b) dag 4 enteroids med klumpformet dannelse. (c) dag 7 enteroids med spirende (sort pil). Skalere barer = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 2
Figur 2 : Histologisk udseende af en enteroid. Haemotoxylin og Eosin pletter. Enteroid viser en centraliseret lumen og udstiller polaritet, med både en apikale og basolateral domæne. Haemotoxylin (lilla) repræsenterer kernen, mens eosin (pink) repræsenterer cytosole komponenter. Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Enteroid actin cytoskeleton. Immunoflorescence Mikrograf af en enteroids. Enteroid viser strukturelle integritet, som det fremgår af fremtrædende actin cystoskeleton (magenta). Cellekerner farves med DAPI (blå), skala bar = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Menneskelige enteroid kultur udbytte er faldet med LP'ER behandling. Dag 5 enteroids i kultur, vokset fra den samme hele vævsprøve. (en) Enteroids behandlet med kontrol kultur medier. Vise robuste vækst. (b) Enteroids behandlet med LPS i dyrkningsmedier. Kun få overlevende enteroids. Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Steg TLR4 udtryk i eksperimentel NEC enteroids. (en) qRT-PCR viste øget TLR4 mRNA udtryk i enteroids udsat for LP'ER (p = 0,03). (b) Western blot analyse viser øget TLR4 udtryk i eksperimentel human enteroid NEC (p = 0,02). Repræsentative vestlige skamplet afbildet. Værdierne er middel ± SEM af 3 prøver pr. gruppe. * p < 0,05 af Student's t -test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne roman ex vivo menneskelige tarm enteroid model fungerer som en nyttig metode til undersøgelse af intestinal barriere dysfunktion i nekrotiserende enterocolitis (NEC). Enteroid forarbejdningsmetoderne præsenteres her var tilpasset fra den tidligere arbejde af Drs. Misty Good, Michael Helmrath og Jason Wertheim10,11,12.

Detaljer omkring hele væv samling og timing crypt isolationsniveauet er vigtige skridt i denne protokol. Væv skal indsamles umiddelbart i forbindelse med operative resektion og forarbejdet til krypten isolation som vævet ankommer i laboratoriet. Vi valgte væv fra patienter mindre end 3 måneder gammel for denne model. Forsinket behandling kan forekomme inden for 24 timer efter hele væv samling hvis nødvendigt. Derudover påvirker kvaliteten af den menneskelige vævsprøve høj grad udbyttet af crypt isolation. Sund tyndtarmen uden underliggende patologi og fra yngre patienter (< 2 måneder) har vist sig for at give de bedste resultater. Desuden, bør at indsamlet væv vælges fra det sundeste området, typisk i distale enderne af resektion modellen. Ved hjælp af et større stykke af tarmen forbedrer ikke crypt isolation beskrevet løsning mængder i ovennævnte protokol. Intestinal segmenter ca 1-2 cm i længden, vejer 0,75-2,5 g er optimal. Induktion af eksperimentelle NEC via LP'ER eksponering var modelleret fra veletablerede celle kultur og dyre modeller. Den etablerede arbejde af Hackam et al. viste den kritiske rolle, TLR4 (LP'ER receptor) i NEC udvikling9,13,14,15. LP'ER aktivering af TLR4 stimulerer proinflammatoriske cytokiner, en reduktion i barriere integritet, og aktivering af subepithelial leukocytter, der karakteriserer de signalering begivenheder involveret i menneskelige NEC. TLR4 har været impliceret som et centralt molekyle for fremme inflammation7 og dyr at mangler funktionelle TLR4 er har påvist beskyttelse mod udviklingen af NEC15. Cirkulerende niveauer af LP'ER er forhøjet hos patienter med NEC og forhøjet i fæces og plasma af dyremodeller for NEC. LP'ER inducerer tarmbetændelse i dyr, der ligner menneskets NEC, som fremhæver betydningen af betændelse i denne vej. Spejling etablerede cellekultur og dyremodeller for NEC, mener vi, at induktion af eksperimentelle NEC via LP'ER administration i enteroid kultur er en nyttig ex vivo menneskelige neonatal model for studiet af NEC. I overensstemmelse med tidligere betænkninger i andre etablerede modeller påvist vores eksperimentelle NEC enteroids øget udtryk for TLR4 i forhold til kontrol.

Protokol for induktion af eksperimentelle NEC via LP'ER eksponering har gennemgået flere vigtige ændringer og forbedringer. I første omgang, blev enteroids dyrket i 5 dage, så podes med LPS i 24 timer og derefter samles. Protokollen anbefaler nu LP'ER podning på dag 0 med fortsatte eksponering i hver kultur medier ændring indtil samling. Desuden, var doseringen af LP'ER optimeret. Efter at have udført en dosis kurve og trialing flere forskellige LP'ER koncentrationer, blev 5 mg/mL valgt. Eksperimenter med LP'ER podning direkte i basalmembranen matrix/enteroid blandingen på tidspunktet af plating var også trialed; dog det var besværligt og bedre ikke resultater.

Der er begrænsninger, der bør behandles som udnyttelse af den menneskelige enteroid model udvikler. Siden opdagelsen i 2007, har været brugt flere forskellige protokoller at etablere og kultur enteroids. De talrige vækstfaktorer kræves til enteroid vedligeholdelse og differentiering manglende standardisering, som kan påvirke reproducerbarhed. Derudover mangler enteroid kultur mekaniske kræfter, der påvirker den menneskelige intestinale epitel i fysiologiske forhold. Pres fra luminale flow og peristaltik kan påvirke gen- og protein udtryk, som ikke tegner sig i denne model. Denne model også mangler nerver, immunceller, microbiome, vaskulatur og udkom, som er til stede i human intestinale epitel.

Eksponering for LP'ER i denne menneskelige tarm enteroid model forårsager en inflammatorisk reaktion fører til Histologisk, genetiske, og protein udtryk ændringer svarende til dem fundet i menneskelige NEC. Selv om der er flere aktuelle dyremodeller for NEC, varierer svar på tarm skade og terapeutiske indgreb meget mellem arter. Da det er en etisk udfordring at studere sygdom Patofysiologi eller til at teste nye terapeutiske agenter direkte hos mennesker, især spædbørn, er det overordentlig vigtigt at fortsætte med at dyrke denne roman ex vivo model af NEC ved hjælp af menneskelige væv. Menneskets enteroids er indstillet til genetisk modifikation og kan være afgørende for udviklingen af terapier for mange menneskelige tarmsygdomme16. Fremtidige retninger bør sigte mod at kultur menneskelige enteroids på en gennemtrængelig stillads i en perfusion kammer med apikale og basolateral flow til at reproducere in vivo krypt-villus arkitektur såvel som fysiologisk styrker som peristaltik og luminale flow.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af det nationale institut sundhed Institut for Diabetes og Digestive og nyre sygdom Grant (K08DK106450) og Jay Grosfeld Award fra den amerikanske Pediatric kirurgisk forening til C.J.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde ThermoFisher AAJ19943K2
A-83 R&D Tocris 2939/10
Amphotericin B ThermoFisher 15290026
B-27 supplement minus Vitamin A ThermoFisher 17504-044
Basement Membrane Matrix (Matrigel) Corning CB-40230C
DMEM/F-12 ThermoFisher MT-16-405-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher 11-965-118
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14190-144
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma E9644-.2MG
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Pro 100-125
Gentamicin Sigma G5013-1G
GlutaMAX (L-glutamine) ThermoFisher 35050-061
Insulin Sigma I9278-5mL
[leu] 15-gastrin 1 Sigma G9145-.1MG
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L2630-25MG
N-2 supplement ThermoFisher 17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) ThermoFisher 15630-080
N-Acetylcysteine Sigma A9165-5G
Nicotinamide Sigma N0636-100G
Noggin R&D Systems INC 6057-NG/CF
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140-148
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P5368-5X10PAK
RPMI 1640 Medium Invitrogen 11875093
R-Spondin PEPROTECH INC 120-38
SB202190 Sigma S7067-5MG
Tissue Processing Gel (Histogel) ThermoFisher 22-110-678
Wnt3a R&D Systems INC 5036-WN-010
Y-27632 Sigma Y0503-1MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  2. Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  3. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).
  4. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).
  5. Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
  6. In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
  7. Senger, S., et al. Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC). Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
  8. Moore, S. A., et al. Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis. Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).
  9. Neal, M. D., et al. A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).
  10. Lanik, W. E., et al. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).
  11. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).
  12. Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).
  13. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).
  14. Neal, M. D., et al. Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier. The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).
  15. Sodhi, C. P., et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).
  16. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmålet 146 Enteroid epithelial organoid nekrotiserende Enterocolitis LP'ER model intestinal krypt stamceller humane væv model
En roman menneskelige epitelial Enteroid Model af nekrotiserende Enterocolitis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., … More

Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (146), e59194, doi:10.3791/59194 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter