Summary
نقدم هنا طريقة استنساخه لوضع نموذج أورثوتوبيك مورين من الخلايا الحرشفية الرأس والرقبة. أورام تظهر ميزات نسيجية ذات الصلة سريرياً للمرض، بما في ذلك نخر، والتمايز الفقراء، الانبثاث العقدي، ومحصنة ضد تسلل. الفئران الحاملة للورم أعراض ذات الصلة سريرياً بما في ذلك عسر البلع، والتشريد الفك، وفقدان الوزن.
Abstract
الرأس والعنق الخلايا الحرشفية (HNSCC) مرض المدمرة والفتاكة ذات انتشار المرتفع للتكرار وفشل العلاج. لوضع استراتيجيات علاجية أفضل، المهم فهم الورم ميكرونفيرونمينتال العوامل التي تسهم في مقاومة العلاج. يكن عائقا رئيسيا لفهم آليات المرض وتحسين العلاج من خطوط الخلايا مورين التي تشبه الطابع العدواني والمنتشر من هنسككس البشرية. وعلاوة على ذلك، تستخدم غالبية نماذج موريني عللها تحت الجلد من الأورام التي تفتقر إلى السمات الفسيولوجية الهامة لمنطقة الرأس والرقبة، بما في ذلك كثافة الأوعية الدموية والمفرج اللمفاوية واسعة الفلورا المخاطية. والغرض من هذه الدراسة هو تطوير وتميز طراز أورثوتوبيك من هنسكك. نحن نوظف سطرين خلية موريني متميزة وراثيا وأورام ثابتة في الغشاء المخاطي الشدقى للفئران. كنا تحسين أساليب الهضم الورم كولاجيناز القائم لاستعادة الخلايا المفردة الأمثل من الأورام ثابتة. وتظهر البيانات المقدمة هنا أن الفئران تطوير أورام فاسكولاريزيد العالية التي السرطاني إلى الغدد الليمفاوية الإقليمية. ويبين تحليل الخلوي الشامل مولتيباراميتريك خلية واحدة وجود السكان المناعية المتنوعة مع خلايا النقوي يمثلون أغلبية جميع الخلايا المناعية. النموذج المقترح في هذه الدراسة لها تطبيقات في بيولوجيا السرطان وورم في علم المناعة الإكلينيكية تطوير علاجات جديدة. شبه الطراز أورثوتوبيك إلى المظاهر السريرية للمرض البشري سوف توفر أداة للترجمة المحسنة، وتحسين نتائج المرضى.
Introduction
HNSCC خبيثة الخامس الأكثر شيوعاً على الصعيد العالمي، مع ما يزيد على 600,000 المرضى تشخيص سنوياً1. على الرغم من المعاملة العدوانية التي تنطوي على العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي (RT)، يظل معدل البقاء على قيد الحياة (نظام التشغيل) للمرضى الذين هنسكك دون الإصابة بفيروس الورم الحليمي البشري (فيروس الورم الحليمي البشري) أقل من 50% بعد 5 سنوات2. وهذا يعزى إلى حد كبير إلى معقدة للغاية وورم المكروية كما يمكن أن تنشأ أورام من عدة مواقع تشريحية متميزة داخل منطقة الرأس والرقبة، بما في ذلك الغشاء المخاطي الشدقى، اللسان، الكلمة من الفم، وجوف الآنف، تجويف الفم، البلعوم، بلعوم فموي، وهيبوفارينكس. وبالإضافة إلى ذلك، منطقة الرأس والعنق هو فاسكولاريزيد عالية ويحتوي على ما يقرب من نصف جميع الغدد الليمفاوية في الجسم3. معظم الدراسات التحقيق في البيولوجيا ورم في الرأس والرقبة تعتمد على نماذج ورم في منطقة الجناح. هذه النماذج يمكن أن توفر نظرة ثاقبة آليات الورم الجوهرية، ولكن عدم المكروية الرأس والرقبة الأصلي يمكن أن يؤثر بشكل ملحوظ إمكانات متعدية الجنسيات مثل هذه النتائج. أسلوب واحد التي تم استخدامها للحث على أورام الفم من خلال التعرض لمادة مسرطنة 9 و 10-ثنائي ميثيل-1، 2-بينزانثراسيني (دمبا)4. ومع ذلك، هذا الأسلوب يرتبط بعملية طويلة، يدفع الأورام في الفئران والهامستر ولكن ليس في الفئران، والأورام الناتجة عن ذلك لا تملك العديد من الميزات نسيجية متمايزة SCCs5،6. إدخال carcinogen4-نيتروكوينوليني 1-أكسيد (4-نقو)، مشتق كوينولوني للذوبان في الماء، أدت إلى أورام الفم الماوس عند تطبيق شفويا لكنها تعاني أيضا من التعرض لأوقات طويلة (16 أسبوعا) ومحدودة تأخذ معدل داخل وفيما بين المجموعات من الفئران7،،من89. عدة مجموعات من أجل وضع النماذج ذات الصلة سريرياً، استخدام نماذج المهندسة وراثيا التي تنطوي على التلاعب بسائق المسرطنة أو ورم المكثف الجينات، بما في ذلك TP53، تجفب، كراس، HRAS، و SMAD410. هذه النماذج يمكن أن توفر نظرة ثاقبة الأورام مع الجينات المعروفة سائق ولكن لا الخص تباين هنسككس البشرية المعقدة.
في هذا العمل، ونحن تثبت جدوى القيام تلقيح خلايا الخلايا الحرشفية إينتراموكوسال في الفئران. خلايا الملقحين تتطور إلى أورام عدوانية خلال أسبوع واحد من الحقن. شبيه هنسككس البشرية، الأورام السرطاني إلى الغدد الليمفاوية الإقليمية. نحن توصيف السمات غذائها والسريرية للمرض وتوفير نظرة ثاقبة وورم المكروية محصنة. ونحن نقترح أن هذا النموذج أورثوتوبيك من هنسكك له تطبيقات في بيولوجيا السرطان وورم في علم المناعة، والدراسات السريرية. آليات للتهرب من الحصانة وتطور الورم ومقاومة العلاج والانبثاث تمثل المجالات ذات الأهمية السريرية التي يمكن معالجتها باستخدام النموذج المقترح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع الإجراءات الحيوانية وفقا لمعتمدة مؤسسية حيوان الرعاية واستخدام لجنة (IACUC) بروتوكولا من جامعة كولورادو دنفر (بروتوكول # 00250).
1-ورم الخلايا الثقافة
ملاحظة: واستخدمت خطوط الخلايا B4B8 و LY2 لتوليد الأورام هنسكك أورثوتوبيك: B4B8 ورم الخلايا مستمدة من تحول مسرطن الكيراتينيه المخاطي (من الفئران بالب/ج)11. الخلايا السرطانية LY2 مستمدة من الانبثاث العقدة الليمفاوية تحويلها تلقائياً بالب/ج keratinocyte خط (212 بام)12،13. وقدمت كل من خطوط الخلايا يرجى فيغنسواران هو الدكتور (أوثيالث، هيوستن، تكساس، الولايات المتحدة الأمريكية).
- تعديل استخدام دولبيكو F/12 النسر (دميم) المتوسطة وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) وكاشف الميكروبات 1% لصيانة خط الخلية. المحافظة على هذه الخطوط الخلية في حاضنة عقيمة في 37 درجة مئوية و 5% CO2. وينبغي استخدام الخلايا للتطعيم قبل تتجاوز 15 مقاطع.
- لوحة 2 × 106 4 × 106 خلايا في قوارير الثقافة الخلية2 175 سم.
ملاحظة: التأكد من الخلايا هي أقل من 90% روافد لتجنب حمل استجابة إجهاد. - عندما تكون الخلايا روافد 70% (ح ~ 48)، إزالة قارورة من الحاضنات وتغسل الخلايا 3 x مع المياه المالحة الباردة مخزنة الفوسفات (PBS).
- فصل الخلايا من قارورة استخدام 0.25% التربسين، ما يكفي لتغطية سطح اللوحة.
- للقيام بذلك، الاستغناء عن 4 مل التربسين في قارورة2 سم 175 التي تحتوي على خلايا المتلاقية 70%. احتضان الخلايا مع التربسين لمدة 3-4 دقيقة في حاضنة الثقافة الخلية في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
- تصور الخلايا تحت مجهر للتأكد من مفرزة خلية.
- إضافة 12 مل الوسائط و دميم/12 التي تحتوي على FBS لتحييد نشاط التربسين.
- نضح تعليق خلية ووضعه في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل.
- هز الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا بعكس ذلك 3 x-4 x.
- بشكل اختياري، مزيج من قاسمة 10 ميليلتر من تعليق خلية مع 10 ميليلتر تريبان الأزرق في أنبوب ميكروسينتريفوجي وعد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير. تحديد صلاحية خلية بطرح عدد الخلايا تريبان--الأزرق--الإيجابية في العدد الإجمالي للخلايا والقسمة على العدد الإجمالي للخلايا.
- الطرد المركزي من تعليق خلية في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- ريسوسبيند الخلايا في دميم المصل خالية وخالية من المضادات الحيوية في وحدة تخزين مناسبة حيث أن 1 × 106 خلايا موجودة في 50 ميليلتر من وسائل الإعلام.
ملاحظة: استناداً إلى خط الخلية الحية في العدوانية (يحدد تجريبيا)، كان يعتبر مناسباً للخلايا B4B8 و LY2 1 × 106 خلايا كل موقع الحقنة الواحدة والماوس. - مكان القنينة التي تحتوي على تعليق خلية على الجليد.
- وضع مصفوفة الغشاء المذابة مسبقاً على الجليد.
ملاحظة: تمت إذابة المصفوفة الغشاء بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
2-خلية حقن في الفئران
- إعداد خليط 1:1 من المصفوفة غشاء الخلايا: الطابق السفلي (50 ميليلتر في كل).
- إضافة الخلايا أولاً؛ ثم تدريجيا "الماصة؛" مصفوفة غشاء الطابق السفلي. تجنب إدخال فقاعات الهواء. ضمان جعل الخليط فورا قبل حقن الحيوانات. إضافة خلايا إلى مصفوفة غشاء الطابق السفلي لفترة ممتدة من الوقت يمكن أن ينتج خلية تسوية في الخليط مصفوفة، الذي يجعل من الصعب على اهتزاز دقة الخليط. سيؤدي هذا تباين كبير في حجم الورم بين الفئران.
- المزيج بلطف. كفالة يتم تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على مصفوفة على الجليد. وسوف بلمرة مصفوفة الغشاء في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد المحاقن للتطعيم.
- تحميل 0.5 مل الأنسولين المحاقن (23 G) مع 100 ميليلتر من الحل مصفوفة غشاء الخلية/الطابق السفلي.
- الاحتفاظ الحقن على الجليد لتجنب غشاء بدروم البلمرة مصفوفة.
- تخدير الفئران بوضعها في غرفة مع إيسوفلوراني والأكسجين (2.5%).
- ضمان الفئران يتم تخديره عميقا قبل إجراء الحقن (بضمان عدم الاستجابة إلى رشة تو).
- أدخل الإبرة في منطقة الشدق الأيمن أو الأيسر. وهذا يتم من خلال فتح المساحة المتوفرة على جانبي الفم.
- تأكد أن اللسان الماوس ليس في الطريق.
ملاحظة: فمن السهل لكزه اللسان، مما سيؤدي إلى أورام اللسان. تحريك اللسان إلى الجانب الآخر إذا لزم الأمر. - الاحتفاظ حقنه موازية لمنطقة الشدقى بينما داخل تجويف الفم.
- عندما تكون جاهزاً لحقن، سحب المحاقن وإدراج المحاقن ببطء بزاوية 10°.
- حقن 100 ميليلتر من تعليق مصفوفة غشاء الخلية/الطابق السفلي على مدى فترة 5 s.
- عقد حقنه في مكان 5 إضافية يتم حقن s لتأمين جميع المواد.
ملاحظة: للتحكم نونتومور الحاملة للفئران، حقن خليط من وسائل الإعلام الحرة المصل ومصفوفة (كما هو موضح أعلاه) دون الخلايا السرطانية. - سحب المحاقن بلطف.
- مواصلة الإجراء المذكور أعلاه مع الفئران المتبقية.
- السماح لمدة أسبوع واحد حتى الأورام تبدأ بالظهور في شكل صارخ (50 – 200 ملم3 للخلايا B4B8 و LY2).
3-رصد الماوس
- القيام بقياس الأولى باستخدام الفرجار في أسبوع واحد بعد حقن الخلايا السرطانية. من أجل حساب حجم الورم باستخدام الفرجار الخارجي، تحديد القطر الطولي أكبر (طول) وقطر عرضية أعظم (العرض) واستخدام صيغة ارتفاعات معدلة14،15.
- مواصلة أداء قياسات منتظمة قدمه ذات الورنيّة لحجم الورم (1 x-2 س أسبوعيا على فترات منتظمة).
- قياس وزن الحيوان لتقييم آثار نمو الورم في التغذية.
4-حصاد الأورام
- عند الوصول إلى نقطة النهاية التجريبية، euthanize الحيوانات باستخدام التدابير الملائمة (مثلاً، CO2 خنقاً أو قطع الرأس أو التفكك عنق الرحم).
ملاحظة: في هذه الدراسة، تم التوصل إلى نقطة النهاية في حالة الفئران أصبحت تحتضر (مع فقدان وزن > 15% وزنهم الأولى، نقص في الاستمالة، دنف) و/أو إذا كان حجم الورم بلغ 1000 مليمتر3. -
يبدأ تشريح الحيوان عن طريق إنشاء شق طويل من خلال خط الوسط في منطقة الرقبة.
- استخدام الملقط حادة للاستيلاء على الجلد وحادة مقص قطع الجلد.
- إدراج مقص بلطف تحت الجلد الذي يغطي الورم وإنشاء جيوب الهواء عن طريق دفع المقص عبر وإلى الجلد.
- بمجرد الجلد يتم فصل بما فيه الكفاية من الورم، تحديد الليمفاوية تجفيف (دلنس) والمكوس لهم لتجنب وجود ورم الأنسجة مرتبك بوجود العقد الليمفاوية.
ملاحظة: أورام كبيرة قد تصل إلى و/أو تغطية دلن. اعتماداً على نوع الفحص يجري تنفيذها، عزل الليمفاوية سليمة أمر أساسي لتجنب انسكاب خلايا المناعية إلى الورم، مما سيؤدي إلى انحراف نتائج الفحص. - قطع طريق حدود الورم حتى يتم فصل وحدة التخزين بأكملها.
5-ورم في تجهيز طلبات المتلقين للمعلومات
- لفحص النسجية المصب، مكان الأورام في الفورمالين 10% عند درجة حرارة الغرفة. لتجنب أوفيرفيكسيشن، استبدل في الفورمالين الإيثانول 70%. لتحليل التدفق الخلوي، معالجة الأورام كما هو موضح أدناه.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ الأنسجة في الفورمالين ح 72 قبل أوفيرفيكسيشن يمكن أن تصبح مشكلة بالنسبة لأنواع معينة من تلطيخ. - قطع الورم إلى 1 – 2 مم-الحجم القطع باستخدام شفرة حلاقة العقيمة أو مقص حاد.
- مكان الورم قص القطع في أنبوب 50 مل مخروطية مع كولاجيناز الثالث (وحدة 4,250 في عينة)، الدناز أنا (0.1 مغ كل عينة)، ومثبط التربسين (1 ملغ كل عينة).
- احتضان عند 37 درجة مئوية مدة 30 دقيقة مع الرج كل 10 دقيقة.
ملاحظة: يمكن وضع العينات في كيس resealable، تعقيم مع الإيثانول 90%، ووضعها في حاضنة ثقافة خلية. - وبعد 30 دقيقة، إضافة 20 مل هانك لموازنة الحل الملح (حبس) وتدور في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: هبس يتكون من كلوريد البوتاسيوم وكلوريد الصوديوم، وبيكربونات الصوديوم، وفوسفات الصوديوم مائي، فوسفات الصوديوم مونوباسيك والسكر. - تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 2-3 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء (RBC). "الماصة؛" صارم.
ملاحظة: المخزن المؤقت لتحلل ربك يتكون من كلوريد الأمونيوم وبيكربونات الصوديوم وثنائي. - احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: حضانة أطول يمكن أن تكون سامة للسكان خلية أخرى. - إضافة 20 مل هبس لتحييد أثر تحلل المخزن المؤقت.
- الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه في 10 مل حبس.
- تمرير حل عن طريق 70 ميكرومتر نايلون ريستراينير وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.
- كرر الخطوات من 5.8 – 5.10 وتمرير تعليق خلية عن طريق 40 ميكرومتر نايلون ريسترينير لضمان إزالة أي حطام إضافية من التعليق.
6-خلية تلطيخ والحصول على البيانات
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل هبس.
- عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير أو عداد الآلي خلية، كما هو موضح في الخطوة 1، 7
-
تحديد عدد الخلايا الإجمالي وتركيز مناسب لتلطيخ.
ملاحظة: هو تركيز خلية مثالية للتدفق الخلوي تلطيخ الخلايا 1 مليون. على سبيل المثال، إذا كان تلطيخ تتم في لوحة 96-جيدا، وهناك 10 مليون من خلايا ريسوسبيند العينة في ميليلتر 100 مل 1 ولوحة للخلايا 1 مليون كل بئر. -
إضافة كتلة Fc (CD16/CD32) بتركيز 1: 100 منعا لربط محددة نونانتيجين المناعية لمستقبلات FcγIII و FcγII. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- الطرد المركزي وريسوسبيند بيليه الخلية في 100 ميليلتر من التدفق الخلوي الخلايا تلطيخ المخزن المؤقت (تتألف من المحلول الملحي الذي يحتوي على 5% FBS، يدتا 2% و 1% هيبيس).
-
أداء سطح الخلية تلطيخ وفقا للإرشادات المقدمة من الموردين (إضافة كل جسم في التخفيف المناسبة). احتضان لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- الطرد المركزي وريسوسبيند بيليه الخلية في 100 ميليلتر من حبس. كرر 2 x للتخلص من الأجسام المضادة الزائدة.
-
تشغيل عينات cytometer تدفق مناسب.
- إذا كان تحليل علامات داخل الخلايا (على سبيل المثال، foxp3)، أداء permeabilization الخلية وتلطيخ وفقا لتعليمات المورد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تقييم انتشار الخلايا LY2 و B4B8 في المختبر أظهرت أن كلا من خطوط الخلايا مرات مضاعفة مماثلة (ح 21 و 23 ح، على التوالي). الحية، سواء خطوط الخلايا شكلت كتلة واحدة ومرئية وملموسة خلال أسبوع واحد من التطعيم (الشكل 1A). في الفئران التي تحمل الأورام LY2، تم تشريد الفك 3 أسابيع بسبب العبء الورم (الشكل 1A). لم تضع مكافحة الفئران التي لا تتلقى الخلايا السرطانية الأورام كما كان متوقعا. الأورام LY2 نما بمعدل أعلى بالمقارنة بالأورام B4B8. حجم الورم متوسط في يوم 21 في LY2 الفئران الحاملة للورم كان ± 632 10 ملم3 مقارنة 162 4 مم ±3 في الأورام B4B8 (الشكل 1B). وضعت الفئران العارضة التشرد الفك سرعة فقدان الوزن بسبب عسر البلع (الشكل 1). الفئران العارضة كبيرة الوزن يعرف > 15% من وزنهم الأولى و/أو وجود حجم ورم > قد euthanized 1 سم3 في يوم واحد للمراقبة لوحظ. وكان متوسط بقاء في الفئران LY2 22.5 يوما، مقارنة بالأيام 52.0 في الفئران الحاملة للورم B4B8 (الشكل 1).
وأظهر التصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي) من الفئران الحاملة للورم أورام جيدا حدود تمتد إلى الطبقة الداخلية من الغشاء المخاطي الشدقى (الشكل 2A). تغزو الأورام لا في اللسان أو الأجهزة الأخرى القريبة (المريء، والقصبات الهوائية، والغدة الصعترية) كما هو موضح بالتقييم النسيجي. كانت التغايرية إشارة على صور السيد الممثل لوجود مناطق هايبرينتينسي فاسكولاريزيد (النطاق المرمز إليه بالخامس) ومناطق نخرية هيبوينتينسي (النطاق المرمز إليه بنون) (الشكل 2 أ). وأظهرت دراسة باثولوجية إجمالي دلنس الموسع (الشكل 2). كذلك قمنا بتقييم حجم الورم مع التصوير المقطعي (CT) لتحديد مدى موثوقية القياسات قدمه ذات الورنيّة. كانت تتحدد الأورام باستخدام التصوير الرقمي والاتصالات في الطب (DICOM) صورة تحليل البرمجيات16. أظهر تقييم لحجم الورم LY2 بالفرجار، والتصوير بالأشعة المقطعية علاقة ممتازة بين هاتين الطريقتين (ص2 = 0.8493؛ الشكل 2). وهذا يشير إلى أن نمو الورم أساسا اكسوفيتيك وقياس قدمه ذات الورنيّة طريقة يمكن الاعتماد عليها لتقييم نمو الورم. وأظهرت دراسة نسيجية أن جميع الفئران الحاملة للورم LY2 نمواً ضعيفا يميز الخلايا الحرشفية (الشكل 2D). وضعت الفئران الحاملة للورم LY2 تسعة من أصل تسعة الانبثاث إلى الغدد الليمفاوية المراتب الأولى والثانية. الانبثاث العقدي كان اختلال أساسا (مع سبعة من أصل تسعة الفئران) وداخل الجيوب الأنفية (مع خمسة من أصل تسعة الفئران)، مع اثنين من أصل تسعة الفئران مما يدل على غزو إينتراكابسولار. في المقابل، الفئران تحمل الأورام B4B8 نمواً معتدلاً يميز الخلايا الحرشفية (الشكل 2E) والسرطاني لا للمواقع الإقليمية أو بعيدة، وقيمت نخر دلنس-بما في ذلك استناداً إلى درجة ثلاثة المحددة سابقا النطاق: 0 = لا نخر مرئياً، 1 = الضئيل، 2 = متوسطة، و 3 = شديدة17. وقد أكدت جميع الفئران الحاملة للورم LY2 الأشيع نخر مع الأغلبية (سبعة من أصل عشرة) مما يدل على معتدلة إلى شديدة نخر (الشكل 2 واو). لم يلاحظ أي دليل على وجود نخر في الأورام B4B8.
وركزنا على نموذج الورم LY2 لمزيد من الوصف المكروية الورم المناعي. الأورام كانت تحصد في 3 أسابيع بعد التلقيح الورم وهضمها باستخدام كولاجيناز الثالث، متبوعاً تلطيخ من سطح الخلية وعلامات داخل الخلايا لتدفق/كتلة الخلوي (الشكل 3A). تم تجهيز العينات، استخدام سيتوميتير شامل، في جامعة "كولورادو دنفر التدفق الخلوي الموارد المشتركة". أجريت جاتينج وتحليل البيانات باستخدام التدفق الخلوي البرمجيات التجارية. وأظهرت البيانات التي تم الحصول عليها وجود العديد من السكان الخلايا المناعية بدرجات متفاوتة. مجموع الخلايا المناعية (CD45+) تمثل 7.3% من مجموع الورم (الشكل 3B). بالأرقام المطلقة، لاحظنا، في المتوسط، 26 CD45+ الخلايا (SD = 0.81) كل مليغرام من ورم الأنسجة (الشكل 3B). خلايا النقوي (CD11b+) تمثل 37.8 في المائة من جميع CD45+ الخلايا (الشكل 3). خلايا النقوي تتألف إلى حد كبير من الضامة (F4/80 +، 63.0%)، تليها القامع النقوي المستمدة من الخلايا (مدسكس) (Gr1 +، 8.51%) والعدلات (Ly6G +، 5.87%). يتألف مجموع خلايا تي 15.9 في المائة CD45+ الخلايا مع خلايا CD4 خلايا+ تي تضم أغلبية جميع خلايا تي (79.4 في المائة)، ومن 53.4 في المائة التي كانت التنظيمية خلايا T (تريجس) (CD4+FoxP3+) (الشكل 3D). الخلايا القاتلة الطبيعية (ناغورني كاراباخ) تتألف 1.75 في المائة من جميع CD45+ الخلايا. تسليط الضوء على هذه البيانات وجود المناعة المختلفة تتسرب في أورثوتوبيك LY2 هنسكك الأورام التي تلعب دوراً في الوساطة تطور الورم ومحصنة ضد التهرب من المحتمل.
رقم 1: رصد الفئران التي تحمل أورثوتوبيك الأورام هنسكك. (أ) صور الممثل من الفئران الحاملة للورم. الملقحين الشدقى تطور ورم خلال أسبوع واحد من التطعيم. ويلاحظ في 3 أسابيع، التشرد في الفك. (ب) معدل نمو الورم في الفئران الحاملة للورم B4B8 و LY2 كما حددتها قياسات قدمه ذات الورنيّة. (ج) التغيرات في وزن الجسم من الفئران تحمل الأورام B4B8 أو LY2. (د) البقاء على قيد الحياة من B4B8 و LY2 الفئران الحاملة للورم. تمثل الأشرطة الخطأ المعياري للوسط (SEM) من 7 – 10 الفئران كل مجموعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: ميزات التصوير ونسيجية مورين HNSCC الأورام. (أ) صورة السيد الممثل الاكليلية الماوس الحاملة للورم LY2. تتم تسمية المواقع التشريحية. تمثل مناطق hyperintensity إشارة المناطق فاسكولاريزيد (الإشارة إلى الخامس). مناطق هيبوينتينسيتي إشارة تمثل مناطق نخرية (الدلالة N). (ب) صورة إجمالية الممثل تشريح المنطقة المحتوية على الورم. تشير الأسهم البيضاء إلى استنزاف تضخم الغدد الليمفاوية (دلنس). (ج) العلاقة بين حجم الورم حسب تقييم قياس قدمه ذات الورنيّة مقابل التصوير المقطعي (CT)-على أساس التقييم. يتم عرض المنحدر، ومعامل الارتباط (ص2)، وخط للاحتواء الأفضل. (د) ممثل الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) صورة والورم LY2. (ه) ممثل ح & ه صورة الورم B4B8. (و) التحديد الكمي نخر في الأورام LY2، استناداً ح & ه الصف أربع سجل النظام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 3: تحليل لخط الأساس intratumoral محصنة ضد السكان استخدام الخلوي بوقت الطيران (سيتوف). الأورام تم تجهيزها في تعليق خلية واحدة باستخدام المستندة إلى كولاجيناز الهضم الأنزيمي، وثم، ملطخة بخلية علامات سطح وداخل الخلايا. (أ) أجرى قياس الكتلة باستخدام منصة سيتوف. (ب) تقييم كمي المطلق والنسبي لمجموع الخلايا المناعية (CD45+). (ج) التحديد الكمي للفئات السكانية الفرعية النقوي المناعي. (د) القياس الكمي للفئات السكانية الفرعية المناعية اللمفاوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحليل دقيق وتوصيف وورم المكروية يمثل استراتيجية هامة لفهم آليات التنمية الورم والتدرج، والانبثاث ولتطوير علاجات فعالة. سرطان الرأس والعنق هو أمراض معقدة التي يمكن أن تنشأ من عدة مواقع التشريحية داخل منطقة الرأس والرقبة. يكن عائقا رئيسيا لفهم آليات المرض وتحسين العلاج من خطوط الخلايا الماوس مورين التي تشبه الطابع العدواني والمنتشر من هنسككس البشرية. وعلاوة على ذلك، تستخدم العديد من النماذج مورين غرس الأورام التي تفتقر إلى السمات الفسيولوجية الهامة لمنطقة الرأس والرقبة، بما في ذلك ارتفاع كثافة الأوعية الدموية والمفرج اللمفاوية واسعة النطاق والفلورا المخاطية تحت الجلد.
في هذه الدراسة، ونحن يتسم نموذج أورثوتوبيك من هنسكك موريني. لقد اخترنا في الغشاء المخاطي الشدقى كموقع الورم التطعيم لعدد من الأسباب، بما في ذلك سهولة الوصول إلى المنطقة دون الحاجة إلى توجيه الصورة، القدرة على تقييم نمو الورم باستخدام الفرجار، وجود الورم داخل النباتات المخاطية، وجود اللمفاوي المحيطة بها، والسهولة في إمكانية تكرار نتائج. على الرغم من أن حقن الخلايا في الغشاء المخاطي الشدقى مباشرة، وضع الإبرة وعمق الاختراق أمرا حاسما لمنع ثقب الجلد وضمان لا يتم حقن الخلايا تحت الجلد. نوصي بإدخال الإبرة داخل شفويا في حين أنها متوازية تماما إلى منطقة الشدقى وآماله بزاوية لا تزيد عن 10 ° عندما تكون جاهزاً لحقن.
وكانت الخطوط الخلية استخدمنا خطوط الخلايا مورين السماح غرس في الفئران الأشخاص لأنها مستمدة من السلالة. هناك ما يزيد على 39 خطوط الخلايا البشرية HNSCC قد درست في الأدب ولكن لا يمكن استخدام حضور المكروية أصلية18. التطورات الأخيرة سمح لتصميم نماذج الماوس أنسنة التي تدمج التركيبات المشتقة من نخاع العظام البشرية في إيماءة مشمولان غاما الفئران (يعرف أيضا باسم الفئران مجموعة موردي المواد النووية)، مما يسمح تطوير نظام المناعة البشرية التي يمكن أن تتفاعل مع الأورام البشرية في نموذج الماوس العوز19. ومع ذلك، هذه النماذج مكلفة وتتطلب أساليب تربية شاقة، ولا الخص جميع مكونات وورم المكروية، بما في ذلك خلايا بطانية والليفية واللمفاوي. نماذج الماوس موريني استخدمنا في هذه الدراسة تلخيص العناصر الحاسمة في هنسككس البشرية، بما في ذلك وجود تتسرب المناعية المختلفة. لضمان استرداد الحد الأقصى من خلايا مفردة قابلة للاستمرار من الأورام، استخدام الإنزيمات الهضم أمر ضروري. إنزيمات الهضم على أساس كولاجيناز يمكن أن تكون قاسية على الخلايا والاستفادة المثلى من التركيز ونوع من كولاجيناز قد تكون ضرورية لأنواع مختلفة من الأورام. أننا بالمقارنة مع إنزيمات الهضم الخمسة قبل تحديد هذا كولاجيناز الثالث، الذي كان يستخدم في هذه الدراسة، هو الأسلوب الأمثل لهضم أورام الخلايا الحرشفية.
ورم النماذج المستخدمة في هذه الدراسة مفيدة بشكل خاص لآليات HNSCC محصنة ضد التهرب من الدراسة والتقييم السريري للعلاجات المختلفة. أظهرنا سابقا أن الأورام B4B8 و LY2 من راديوريسيستانت وصهر إلى مكافحة-PD-L1 المانع محصنة ضد حاجز20. وهذا يتسق مع أغلبية هنسككس البشرية. الأخيرة من التجارب السريرية أظهرت أن أقل من 15% مرضى هنسكك تستجيب للعلاج المضادة-PD-1/PD-L121،،من2223،،من2425. وباﻹضافة إلى ذلك، ثبت أن هنسككس هي راديوريسيستانت،من2627. استهداف مسارات المسؤولة عن راديوريسيستانسي في هنسكك خطوة هامة لتعزيز الاستجابة للمعالجة. التاريخي دراسة بونر et al. وأظهر فائدة كبيرة في البقاء على قيد الحياة عموما بالإضافة إلى سيتوكسيماب إلى الرايت الرايت وحدها في متقدمة محلياً HNSCC المرضى28بالمقارنة. وتظهر البيانات الأخيرة أن تثبيط الإشارات EphB4-إفرين-B2 في هنسككس أورثوتوبيك يمكن زيادة تحسين الاستجابة ل RT أو سيتوكسيماب-RT بتشجيع المبرمج ورم ويحول دون انتشار الورم29،30. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين RT مع العلاجات المناعية الرشيد زيادة الاستجابات المناعية انتيتومور وتعزيز مراقبة الورم المحلي والسيطرة على الانبثاث البعيدة31. ونحن قد أثبتت مؤخرا أن استهداف تريجس في تركيبة مع نقطة تفتيش محصنة ضد الحصار و RT يؤدي إلى استئصال الورم والذاكرة المناعية32. وسوف أفضل إبلاغ تصميم التجارب السريرية الدراسات المستقبلية التي تستخدم نماذج أورثوتوبيك من هنسكك وتحسين فهم آليات التهرب الورم المناعي ومقاومة العلاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
لا شيء
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase III | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | |
| DNase I | Worthington Biochemical Corp. | LS006328 | |
| Fc Block (CD16/32) | BD Biosciences | 553141 | Clone 2.4G2 |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no pheno red |
| Helois mass cytometer | Fluidigm | NA | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB-40234B | |
| MRI Scanner | Bruker | NA | 7.4 Tesla |
| RBC lysis buffer | BioLegend | 420301 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington Biochemical Corp. | LS002830 |
References
- Chaturvedi, A. K., et al. Worldwide trends in incidence rates for oral cavity and oropharyngeal cancers. Journal of Clinical Oncology. 31 (36), 4550-4559 (2013).
- Ang, K. K., Sturgis, E. M. Human papillomavirus as a marker of the natural history and response to therapy of head and neck squamous cell carcinoma. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 128-142 (2012).
- Amin, M. B., et al. The Eighth Edition AJCC Cancer Staging Manual: Continuing to build a bridge from a population-based to a more "personalized" approach to cancer staging. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (2), 93-99 (2017).
- Salley, J. J. Experimental carcinogenesis in the cheek pouch of the Syrian hamster. Journal of Dental Research. 33 (2), 253-262 (1954).
- Morris, A. L. Factors influencing experimental carcinogensis in the hamster cheek pouch. Journal of Dental Research. 40, 3-15 (1961).
- MacDonald, D. G. Comparison of epithelial dysplasia in hamster cheek pouch carcinogenesis and human oral mucosa. Journal of Oral Pathology & Medicine. 10 (3), 186-191 (1981).
- Hawkins, B. L., et al. 4NQO carcinogenesis: a mouse model of oral cavity squamous cell carcinoma. Head & Neck. 16 (5), 424-432 (1994).
- Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
- Vered, M., Yarom, N., Dayan, D. 4NQO oral carcinogenesis: animal models, molecular markers and future expectations. Oral Oncology. 41 (4), 337-339 (2005).
- Bornstein, S., et al. Smad4 loss in mice causes spontaneous head and neck cancer with increased genomic instability and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 119 (11), 3408-3419 (2009).
- Thomas, G. R., Chen, Z., Oechsli, M. N., Hendler, F. J., Van Waes, C. Decreased expression of CD80 is a marker for increased tumorigenicity in a new murine model of oral squamous-cell carcinoma. International Journal of Cancer. 82 (3), 377-384 (1999).
- Yuspa, S. H., Hawley-Nelson, P., Koehler, B., Stanley, J. R. A survey of transformation markers in differentiating epidermal cell lines in culture. Cancer Research. 40 (12), 4694-4703 (1980).
- Chen, Z., Smith, C. W., Kiel, D., Van Waes, C. Metastatic variants derived following in vivo tumor progression of an in vitro transformed squamous cell carcinoma line acquire a differential growth advantage requiring tumor-host interaction. Clinical & Experimental Metastasis. 15 (5), 527-537 (1997).
- Euhus, D. M., Hudd, C., LaRegina, M. C., Johnson, F. E. Tumor measurement in the nude mouse. Journal of Surgical Oncology. 31 (4), 229-234 (1986).
- Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. NeuroImage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Dutta, S., et al. The relationship between tumour necrosis, tumour proliferation, local and systemic inflammation, microvessel density and survival in patients undergoing potentially curative resection of oesophageal adenocarcinoma. Britisch Journal of Cancer. 106 (4), 702-710 (2012).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research. 12 (4), 571-582 (2014).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
- Oweida, A., et al. Ionizing radiation sensitizes tumors to PD-L1 immune checkpoint blockade in orthotopic murine head and neck squamous cell carcinoma. OncoImmunology. 6 (10), e1356153 (2017).
- Ferris, R., et al. Further evaluations of nivolumab (nivo) versus investigator’s choice (IC) chemotherapy for recurrent or metastatic (R/M) squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN): CheckMate 141. Journal of Clinical Oncology. 34, (2016).
- Ferris, R. L., et al. Nivolumab for Recurrent Squamous-Cell Carcinoma of the Head and Neck. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1856-1867 (2016).
- Harrington, K. J., et al. Nivolumab versus standard, single-agent therapy of investigator's choice in recurrent or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck (CheckMate 141): health-related quality-of-life results from a randomised, phase 3 trial. The Lancet Oncology. 18 (8), 1104-1115 (2017).
- Kiyota, N., et al. A randomized, open-label, Phase III clinical trial of nivolumab vs. therapy of investigator's choice in recurrent squamous cell carcinoma of the head and neck: A subanalysis of Asian patients versus the global population in checkmate 141. Oral Oncology. 73, 138-146 (2017).
- Ling, D. C., Bakkenist, C. J., Ferris, R. L., Clump, D. A. Role of Immunotherapy in Head and Neck Cancer. Seminars in Radiation Oncology. 28 (1), 12-16 (2018).
- Perri, F., et al. Radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma: Biological bases and therapeutic implications. Head & Neck. 37 (5), 763-770 (2015).
- Yamamoto, V. N., Thylur, D. S., Bauschard, M., Schmale, I., Sinha, U. K. Overcoming radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 63, 44-51 (2016).
- Bonner, J. A., et al. Radiotherapy plus cetuximab for locoregionally advanced head and neck cancer: 5-year survival data from a phase 3 randomised trial, and relation between cetuximab-induced rash and survival. The Lancet Oncology. 11 (1), 21-28 (2010).
- Bhatia, S., et al. Inhibition of EphB4-Ephrin-B2 Signaling Enhances Response to Cetuximab-Radiation Therapy in Head and Neck Cancers. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4539-4550 (2018).
- Bhatia, S., et al. Enhancing radiosensitization in EphB4 receptor-expressing Head and Neck Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 6, 38792 (2016).
- Tang, C., et al. Combining radiation and immunotherapy: a new systemic therapy for solid tumors? Cancer Immunology Research. 2 (9), 831-838 (2014).
- Oweida, A., et al. Resistance to radiotherapy and PD-L1 blockade is mediated by TIM-3 upregulation and regulatory T-cell infiltration. Clinical Cancer Research. , (2018).
