Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Intramucosal podning af pladecellekræft celler i mus til Tumor immun profilering og behandling svar vurdering

Published: April 22, 2019 doi: 10.3791/59195
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1
1Department of Radiation Oncology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus, 2Department of Anesthesiology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus, 3Division of Radiology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus

Summary

Her præsenterer vi en reproducerbar metode til at udvikle en orthotopic murine model af hoved og hals planocellulært karcinom. Tumorer påvise klinisk relevante histopatologiske funktioner af sygdom, herunder nekrose, dårlig differentiering, nodal metastaser og immun infiltration. Tumor-bærende mus udvikler klinisk relevante symptomer herunder dysfagi, kæben forskydning og vægttab.

Abstract

Hoved og hals planocellulært karcinom (HNSCC) er en invaliderende og dødbringende sygdom med høj prævalens af gentagelse og behandling fiasko. For at udvikle bedre terapeutiske strategier, forståelse tumor microenvironmental faktorer, der bidrager til behandling modstanden er vigtig. En større hindring for forståelse sygdomsmekanismer og forbedre terapi har været en mangel på murine cellelinjer, der ligner den aggressive og metastatisk karakter af menneskelig HNSCCs. Derudover beskæftiger et flertal af murine modeller subkutane implantations af tumorer, der mangler vigtige fysiologiske funktioner af hoved og hals region, herunder høj kar densitet, omfattende lymfe vaskulatur og bosiddende slimhinde flora. Formålet med denne undersøgelse er at udvikle og beskrive en orthotopic model af HNSCC. Vi anvender to genetisk forskellige murine cellelinjer og etablerede tumorer i buccale slimhinden i mus. Vi optimere collagenase-baserede tumor fordøjelsen metoder til optimal genopretning af enkelt celler fra etablerede tumorer. De data præsenteres her viser, at mus udvikler meget vaskulariserede tumorer, der metastaserer til regionale lymfeknuder. Encellede multiparametric masse flowcytometri analyse viser tilstedeværelsen af forskellige immun befolkningsgrupper med myeloide celler der repræsenterer størstedelen af alle immunceller. Den model, der foreslås i denne undersøgelse har applikationer i kræft biologi, tumor immunologi og prækliniske udvikling af nye lægemidler. Ligheden af orthotopic modellen til kliniske tegn på sygdom hos mennesker vil være et redskab for øget oversættelse og bedre patienternes resultater.

Introduction

HNSCC er den femte mest almindelige malignitet globalt, med over 600.000 patienter diagnosticeres årligt1. Trods aggressiv behandling med kemoterapi og strålebehandling (RT), forbliver den samlede overlevelse (OS) satsen for HNSCC patienter uden humant papillomvirus (HPV) infektion under 50% efter 5 år2. Dette er i vid udstrækning tilskrives en yderst komplekse tumor mikromiljø som tumorer kan stamme fra flere forskellige anatomiske steder i regionen hoved og hals, herunder buccale slimhinde, tungen, gulvet i munden, næsehulen, mundhulen, svælg, oropharynx og hypopharynx. Derudover regionen hoved og hals er meget vaskulariserede og indeholder næsten halvdelen af alle lymfeknuder i kroppen3. Et flertal af studier undersøger hoved og hals tumor biology stole på tumor modeller i regionen flanke. Sådanne modeller kan tilbyde indsigt i tumor-iboende mekanismer, men manglen på den indfødte hoved og hals mikromiljø kan betydeligt påvirke translationel potentialet i sådanne resultater. En metode, der er blevet brugt til at fremkalde mundtlige tumorer er gennem eksponering for kræftfremkaldende 9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene (DMBA)4. Dog, denne metode er forbundet med en langvarig proces, fremkalder tumorer hos rotter og hamstere men ikke i mus, og de resulterende tumorer ikke besidder mange af de histologiske funktioner af differentierede SCCs5,6. Indførelsen af carcinogen4-nitroquinoline 1-oxid (4-NQO), et vandopløseligt quinolon derivat, resulterede i mus mundtlige tumorer når de anvendes oralt, men også lidt fra lange eksponeringstider (16 uger) og en begrænset tage sats inden for og mellem partier mus7,8,9. For at udvikle klinisk relevante modeller, udnyttede flere grupper gensplejsede modeller der involverer manipulation af driver onkogener eller tumor suppressor gener, herunder TP53, TGFB, KRAS, HRAS og SMAD410. Disse modeller kan tilbyde indsigt i tumorer med kendte driver gener men sammenfatte ikke de komplekse heterogenitet af menneskelige HNSCCs.

I dette arbejde demonstrere vi muligheden for at udføre en intramucosal podning af pladecellekræft celler i mus. Podede cellerne udvikle sig til aggressive tumorer senest 1 uge efter injektion. Svarende til menneskets HNSCCs, tumorer metastaserer til de regionale lymfeknuder. Vi karakteriserer histologiske og kliniske funktioner af sygdommen og give indsigt i tumor immun mikromiljø. Vi foreslår, at denne orthotopic model af HNSCC har applikationer i kræft biologi, tumor immunologi og prækliniske undersøgelser. Mekanismer af immun unddragelse, tumor progression, behandling modstand og metastaser repræsenterer områder af klinisk betydning, der kan adresseres ved hjælp af den foreslåede model.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr procedurer blev udført i overensstemmelse med en godkendt institutionelle dyrs pleje og brug udvalg (IACUC) protokol af University of Colorado Denver (protokol # 00250).

1. tumor cellekultur

Bemærk: B4B8 og LY2 cellelinjer blev brugt til at generere orthotopic HNSCC tumorer: B4B8 tumorceller blev afledt fra kræftfremkaldende-omdannet slimhinde keratinocytter (fra BALB/C mus)11. LY2 tumorceller blev afledt fra lymfeknude metastaser på et spontant omdannes BALB/C keratinocytter linjen (Pam 212)12,13. Begge cellelinjer blev venligst leveret af Dr. Nadarajah Vigneswaran (UTHealth, Houston, TX, USA).

  1. Brug Dulbecco ændrede Eagle's medium (DMEM) F/12 suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% antimikrobiel reagens for linjevedligeholdelse celle. Opretholde disse cellelinjer i en steril inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Celler skal bruges til podning før overstiger 15 passager.
  2. Plade 2 x 106 til 4 x 106 celler i 175 cm2 celle kultur kolber.
    Bemærk: Sikre, at cellerne er mindre end 90% sammenflydende at undgå at fremkalde en stressrespons.
  3. Når cellerne er 70% sammenflydende (~ 48 h), kolben fjernes fra rugemaskinen, og vaske cellerne 3 x med kolde fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
  4. Frigør cellerne fra kolben ved hjælp af 0,25% trypsin, nok til at dække overfladen af pladen.
    1. For at gøre dette, se bort fra 4 mL trypsin i en 175 cm2 kolbe indeholdende 70% sammenflydende celler. Inkuber celler med trypsin i 3-4 min. i celle kultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
    2. Visualisere cellerne under et mikroskop for at sikre celle detachement.
    3. Tilføj 12 mL af DMEM F/12 medier indeholdende FBS for at neutralisere trypsin aktivitet.
  5. Opsug cellesuspension og læg det i en 50 mL konisk slange.
  6. Ryst glasset med cellerne af invertere det 3 x-4 x.
  7. Valgfrit, bland en 10 µL alikvot af cellesuspension med 10 µL af Trypan blå i et microcentrifuge rør og tælle de celler ved hjælp af en hemocytometer. Bestemme cellernes levedygtighed ved at fratrække antallet af Trypan-blå-positive celler fra det samlede antal celler og dividerer med det samlede antal celler.
  8. Centrifugeres cellesuspension ved 300 x g i 5 min. ved 4 ° C.
  9. Resuspend celler i serumfrit og antibiotika-gratis DMEM på en passende mængde, således at 1 x 106 celler findes i 50 µL af medier.
    Bemærk: Baseret på in vivo celle linje aggressivitet (bestemt empirisk), 1 x 106 celler pr. injektionsstedet pr. mus anset for passende til B4B8 og LY2 celler.
  10. Sted hætteglasset indeholdende cellesuspension på is.
  11. Sted pre optøede basalmembranen matrix på is.
    Bemærk: Matrixen basalmembranen blev optøet natten over ved 4 ° C.

2. celle indsprøjtning i mus

  1. Forbered en 1:1 blanding af celler: kælderen membran matrix (50 µL).
  2. Tilføje cellerne først; derefter afpipetteres gradvist matrixen basalmembranen. Undgå at indføre luftbobler. Sikre, at blandingen er umiddelbart før den animalske injektion. Føje celler til basalmembranen matrix for en længere periode kan resultere i celle i matrix blanding, hvilket gør blandingen svært at ryste grundigt. Dette vil medføre en betydelig variation i tumorstørrelse mellem mus.
  3. Bland forsigtigt. Sikre, at alle skridt involverer matrix er udført på is. Basalmembranen matrix vil polymerisere ved stuetemperatur.
  4. Forberede sprøjter til podning.
  5. Indlæse 0,5 mL insulin sprøjter (23 G) med 100 µL af celle/kælder membran matrix løsning.
  6. Holde sprøjter på isen for at undgå basalmembranen matrix polymerisering.
  7. Bedøver mus ved at placere dem i et kammer med isofluran og ilt (2,5%).
  8. Sikre, at musene er dybt bedøvede før du udfører injektion (ved at sikre en mangel på svar på en tå knivspids).
  9. Indsætte nålen ind i højre eller venstre buccale regionen. Dette er udført gennem de tilgængelige friarealer på begge sider af munden.
  10. Sikre, at musens tunge ikke er på måde.
    Bemærk: Det er nemt at stikke tungen, hvilket vil resultere i tungen tumorer. Flytte tungen til den modsatte side, hvis det er nødvendigt.
  11. Hold sprøjten parallelt med regionen buccale mens inde i mundhulen.
  12. Når du er klar til at injicere, trække sprøjten tilbage og langsomt Sæt sprøjten på en vinkel på 10°.
  13. Indsprøjtes 100 µL af celle/kælder membran matrix affjedring over en periode på 5 s.
  14. Hold sprøjten på plads til en ekstra 5 s til at sikre alle materiale sprøjtes.
    Bemærk: For kontrol nontumor-bærende mus, indsprøjtes en blanding af serum-frie medier og matrix (som beskrevet ovenfor) uden tumorcellerne.
  15. Trække sprøjten forsigtigt.
  16. Fortsætte den ovenfor fremgangsmåde med de resterende mus.
  17. Mulighed for 1 uge indtil tumorer begynder at dukke groft (50-200 mm3 for B4B8 og LY2 celler).

3. med musen kontrol

  1. Udføre den første måling med calipre på 1 uge efter tumor celle indsprøjtning. Til beregning af tumor volumen ved hjælp af eksterne calipre, bestemme den største langsgående diameter (længde) og den største transverse diameter (bredde) og bruge modificerede elliptisk formel14,15.
    Equation
  2. Fortsætte med at udføre regelmæssig skydelære målinger for tumor volumen (1 x-2 x pr. uge med jævne mellemrum).
  3. Måle dyrenes vægt til at vurdere virkningerne af tumorvækst på fodring.

4. høst tumorer

  1. Når den eksperimenterende slutpunkt er nået, aflive dyrene ved hjælp af passende foranstaltninger (f.eks. CO2 kvælning, Halshugning, eller cervikal dislokation).
    Bemærk: I denne undersøgelse, endpoint var nået hvis musene blev døende (med et vægttab på > 15% af deres oprindelige vægt, en mangel på grooming, kakeksi) og/eller hvis tumorstørrelse nået 1,000 mm3.
  2. Begynde at dissekere dyret ved at skabe en lang snit gennem midterlinjen i halsregionen.
    1. Bruge stump pincet til at få fat i huden og skarpe saks til at skære huden.
  3. Indsætte saks forsigtigt under huden dækker tumor og oprette luftlommer ved at skubbe saks på tværs og ind i huden.
  4. Når huden er tilstrækkeligt adskilt fra tumor, identificere afdrypning lymfeknuder (DLNs) og punktafgifter dem for at undgå, at tumor væv beskæmmet ved tilstedeværelsen af lymfeknuder.
    Bemærk: Store tumorer kan nå og/eller dække DLN. Afhængigt af analysen udføres er isolationen af intakt lymfeknuder afgørende for at undgå spild af immunceller ind i tumoren, som vil resultere i skævvridning assay resultater.
  5. Skære igennem grænser af svulsten, indtil hele diskenheden er afmonteret.

5. tumor behandling for Downstream applikationer

  1. Til efterfølgende histologisk undersøgelse, skal du placere tumorer i 10% formalin ved stuetemperatur. For at undgå overfixation, skal du erstatte formalin med 70% ethanol. Af analysen af handelsstrømmen flowcytometri, behandle tumorer som beskrevet nedenfor.
    Bemærk: Vævet kan opbevares i formalin i 72 timer, før overfixation kan blive problematisk for visse typer af farvning.
  2. Skær tumor i 1 – 2 mm-størrelse stykker med en steril barberblad eller skarp saks.
  3. Placer cut tumor stykker i en 50 mL konisk slange med collagenase III (4.250 enheder pr. prøve), DNase jeg (0,1 mg per prøve), og trypsin inhibitor (1 mg pr. prøve).
  4. Der inkuberes ved 37 ° C i 30 min. under omrystning hver 10 min.
    Bemærk: Prøverne kan placeres i en genlukkelig pose, steriliseret med 90% ethanol, og placeret i en celle kultur inkubator.
  5. Efter 30 min, tilsættes 20 mL af Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) og spin på 300 x g i 5 min.
    Bemærk: HBSS består af kaliumchlorid, natriumchlorid, natrium bicarbonat, natrium fosfat dibasiske, natrium fosfat monobasic og glukose.
  6. Supernatanten og resuspenderes i 2-3 mL af røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer. Der afpipetteres nøje.
    Bemærk: RBC lysisbuffer består af ammoniumklorid, natriumhydrogencarbonat og dinatrium.
  7. Der inkuberes i 2 min. ved stuetemperatur.
    Bemærk: Længere inkubation kan være giftige for andre cellepopulationer.
  8. Der tilsættes 20 mL af HBSS til at neutralisere effekten af lysisbuffer.
  9. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 min og supernatanten.
  10. Resuspenderes i 10 mL af HBSS.
  11. Passere gennem en 70 µm nylon Tilbageholderen og centrifugeres ved 300 x g i 5 min. supernatanten.
  12. Gentag trin 5.8 – 5.10 og passere cellesuspension gennem en 40 µm nylon Tilbageholderen at sikre yderligere snavs er fjernet fra suspension.

6. celle farvning og dataopsamling

  1. Celle resuspenderes i 1 mL af HBSS.
  2. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer eller en automatiseret celle counter, som beskrevet i trin 1,7
  3. Fastlægge samlede celle nummer og passende koncentration til farvning.
    Bemærk:     den ideelle celle koncentration af flow flowcytometri farvning er 1 – 2 millioner celler. For eksempel, hvis farvning er udført i en 96-brønd plade, og der er 10 millioner celler resuspend prøven i 1 mL og pladen 100 µL for 1 million celler pr. brønd.
  4. Tilføje Fc blok (CD16/CD32) ved en koncentration på 1: 100 for at forhindre nonantigen-specifik binding af immunoglobuliner på FcγIII og FcγII receptorer. Inkuber i 5 min ved stuetemperatur.
    1. Der centrifugeres og celle resuspenderes i 100 µL af flow flowcytometri celle farvning buffer (består af saltopløsning indeholdende 5% FBS, 2% EDTA og 1% HEPES).
  5. Udføre celleoverfladen farvning ifølge leverandøren-forudsat instruktioner (tilføje hver antistof på den passende fortynding). Inkuber i 60 min. ved stuetemperatur.
    1. Der centrifugeres og celle resuspenderes i 100 µL af HBSS. Gentag 2 x for at slippe af med overskydende antistof.
  6. Køre prøver på et passende flow Flowcytometret.
    1. Hvis analysere intracellulære markører (f.eks. foxp3), udføre celle permeabilization og farvning efter leverandørens anvisninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In vitro-vurdering af LY2 og B4B8 celleproliferation viste, at begge cellelinjer har lignende fordobling gange (21 og 23 h, henholdsvis). In vivo, begge cellelinjer dannede en enkelt, synlig og håndgribelig masse senest 1 uge efter podning (figur 1A). I mus forsynet med LY2 tumorer, blev kæben fordrevet af 3 uger på grund af tumor byrde (figur 1A). Control mus, der ikke modtog tumorceller udvikler ikke tumorer som forventet. LY2 tumorer voksede på et højere tempo i forhold til B4B8 tumorer. Den gennemsnitlige tumor volumen på dag 21 i LY2 tumor-bærende mus var 632 ± 10 mm3 i forhold til 162 ± 4 mm3 i B4B8 tumorer (figur 1B). Mus udstiller kæben forskydning hurtigt udviklet vægttab på grund af dysfagi (figur 1 c). Mus udviser betydelige vægttab defineret som > 15% af deres oprindelige vægt og/eller har en tumor volumen af > 1 cm3 blev aflivet inden for 1 dag for den noterede observation. Den mediane overlevelse i LY2 mus var 22,5 dage, sammenlignet med 52,0 dage i B4B8 tumor-bærende mus (fig. 1 d).

Magnetisk resonans imaging (MR) af tumor-bærende mus viste godt afgrænsede tumorer strækker sig ind i det inderste lag af buccale slimhinden (figur 2A). Tumorer ikke invadere ind i tungen eller andre nærliggende organer (spiserøret, bronkier, thymus) som vist med histologisk vurdering. Signal heterogenitet på hr. billeder var repræsentant for tilstedeværelsen af vaskulariserede hyperintense (angivet med V) og nekrotiske hypointense regioner (angivet med N) (figur 2A). En makropatologiske test viste udvidet DLNs (figur 2B). Vi vurderede yderligere tumor volumen med computertomografi (CT) at fastslå pålideligheden af skydelære målinger. Tumorer blev afgrænset ved hjælp af en digital imaging og kommunikation i medicine (DICOM) billede analyse software16. Vurdering af LY2 tumor volumen af calipers og CT billeddannelse viste en god korrelation mellem de to metoder (R2 = 0.8493; Figur 2 c). Dette angiver, at tumorvækst er primært exophytic og caliper måling er en pålidelig metode til vurdering af tumorvækst. Histologisk undersøgelse viste, at alle LY2 tumor-bærende mus udviklet dårligt differentieret planocellulært karcinom (figur 2D). Ni ud af ni LY2 tumor-bærende mus udviklet metastaser til første og anden echelon lymfeknuder. Nodal metastaser var primært subkapsulær (med syv ud af ni mus) og inden for bihuler (med fem ud af ni mus), med to ud af ni mus demonstrerer intracapsular invasion. Derimod mus forsynet med B4B8 tumorer udviklet moderat differentieret planocellulært karcinom (figur 2E) og ikke metastaserer til regionalt eller fjerne websteder, herunder DLNs. nekrose blev vurderet baseret på en tidligere etableret tre-grade skala: 0 = ingen synlig nekrose, 1 = ringe, 2 = moderat, og 3 = svær17. Alle LY2 tumor-bærende mus havde histologisk bekræftet nekrose med flertal (syv ud af ti) viser moderat til svær nekrose (figur 2F). Ingen tegn på nekrose blev observeret i B4B8 tumorer.

Vi fokuserede på LY2 tumor model for yderligere karakterisering af tumor-immune mikromiljø. Tumorer blev høstet på 3 uger efter tumor podning og fordøjet ved hjælp af collagenase III, efterfulgt af farvning af celleoverfladen og intracellulære markører for flow/masse flowcytometri (figur 3A). Prøverne blev behandlet, ved hjælp af en masse forskellige, på University of Colorado Denver Flow flowcytometri delt ressource. Gating og data analyse blev udført ved hjælp af flow flowcytometri kommerciel software. Oplysningerne viste tilstedeværelsen af talrige immun celle befolkninger i varierende grad. Total immun celler (CD45+) repræsenteret 7,3% af den samlede tumor (figur 3B). I absolutte tal, vi observerede, gennemsnitligt 26 CD45+ celler (SD = 0,81) pr milligram af tumor væv (figur 3B). Myeloide celler (CD11b+) tegnede sig for 37,8% af alle CD45+ celler (figur 3 c). Myeloide celler blev i vid udstrækning består af makrofager (F4 / 80 +, 63.0%), efterfulgt af myeloide-afledte suppressor celler (MDSCs) (Gr1 +, 8,51%) og neutrofile (Ly6G +, 5,87%). Samlede T celler består 15,9% af CD45+ celler med CD4+ T celler, der omfatter størstedelen af alle T-celler (79,4%), af hvilke 53,4% var regulerende T celler (Tregs) (CD4+FoxP3+) (figur 3D). Naturlige dræberceller (NK) udgjorde 1,75% af alle CD45+ celler. Disse data fremhæve tilstedeværelsen af forskellige immun infiltrater i LY2 orthotopic HNSCC tumorer, som sandsynligvis spiller en rolle i mægle tumor progression og immun unddragelse.

Figure 1
Figur 1: overvågning mus forsynet med orthotopic HNSCC tumorer. (A) repræsentative billeder af tumor-bærende mus. Den podede buccale udvikler en tumor senest 1 uge efter podning. På 3 uger, er forskydning af kæben observeret. (B) Tumor vækst i B4B8 og LY2 tumor-bærende mus som fastlagt af skydelære målinger. (C) ændringer i kropsvægt af mus forsynet med B4B8 eller LY2 tumorer. (D) overlevelse af B4B8 og LY2 tumor-bærende mus. Søjlerne repræsenterer standard fejlen af middelværdien (SEM) af 7 – 10 mus pr. gruppe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Imaging og histologiske funktioner af murine HNSCC tumorer. (A) repræsentative koronale hr. billede af en LY2 tumor-bærende mus. Anatomiske steder er mærket. Områder af signal hyperintensity repræsenterer vaskulariserede regioner (betegnes V). Regioner af signal hypointensity repræsenterer nekrotisk områder (betegne N). (B) repræsentative gross billedet af en dissekeret tumor-holdige region. Hvide pile peger på udvidede afdrypning lymfeknuder (DLNs). (C) korrelation af tumor volumen som vurderet af caliper måling versus computertomografi (CT)-baseret vurdering. Hældning, korrelationskoefficient (R2) og bedste pasform linje er vist. (D) repræsentative hæmatoxylin og eosin (H & E) billedet af LY2 tumor. (E) repræsentant H & E billede af B4B8 tumor. (F) kvantificering af nekrose i LY2 tumorer, baseret på en H & E fire-grade pointsystem. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: analyse af baseline intratumoral immun populationer med flowcytometri ved time of flight (CyTOF). Tumorer blev forarbejdet til en enkelt celle suspension ved hjælp af collagenase-baserede enzymatisk fordøjelse og derefter farves med cellens overflade og intracellulære markører. (A) masse flowcytometri blev udført ved hjælp af CyTOF platform. (B) absolutte og relative kvantitativ vurdering af samlede immunceller (CD45+). (C) kvantificering af myeloide-immune delpopulationer. (D) kvantificering af lymfoide immun delpopulationer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Grundig analyse og karakterisering af tumor mikromiljø repræsenterer en vigtig strategi for forståelse mekanismer af tumor udvikling, progression og metastaser og udvikling af effektive behandlinger. Hoved og hals kræft er en kompliceret sygdom, der kan stamme fra flere anatomiske steder inden for regionen hoved og hals. En større hindring for forståelse sygdomsmekanismer og forbedre terapi har været en mangel på murine mus cellelinjer, der ligner den aggressive og metastatisk karakter af menneskelig HNSCCs. Desuden ansætte talrige murine modeller en subkutan implantation af svulster, der mangler vigtige fysiologiske funktioner i regionen hoved og hals, herunder en høj kar densitet, omfattende lymfe vaskulatur og bosiddende slimhinde flora.

I denne undersøgelse karakteriseret vi en orthotopic model af murine HNSCC. Vi valgte buccale slimhinden som stedet for tumor podning af en række grunde, herunder nem adgang til regionen uden behovet for billede vejledning, evnen til at vurdere tumorvækst ved hjælp af calipre, tilstedeværelsen af tumor inden for slimhinde flora, det tilstedeværelsen af omkringliggende lymfevejene, og lethed, hvormed reproducerbarhed. Selvom indsprøjtning af celler i buccale slimhinden er ligetil, placering af nålen og dybde af penetration er afgørende for at forhindre punktering gennem huden og sikre celler ikke er injiceres subkutant. Vi anbefaler indsætte nålen intra-oralt, mens det er helt parallel til regionen bukkal og vippe i en vinkel på højst 10 ° når du er klar til at injicere.

De cellelinjer, vi brugte var murine cellelinjer tillader deres implantation i immunkompetente mus af den belastning, de blev afledt fra. Der er over 39 HNSCC menneskelige cellelinjer, der er blevet undersøgt i litteraturen, men kan ikke bruges i en native mikromiljø18. Seneste udvikling tilladt for udformningen af humaniseret musemodeller, der integrerer menneskelige knogle-marv-afledte kimærer i NOD scid gamma mus (også kendt som NSG mus), giver mulighed for udvikling af en menneskelige immunsystem, der kan interagere med menneskelige tumorer i en immundefekte musen model19. Men sådanne modeller er dyre, kræver besværlige forædlingsmetoder, og sammenfatte ikke alle komponenter af tumor mikromiljø, herunder endothelial celler, fibroblaster og lymphatics. Murine musemodeller vi ansat i denne undersøgelse sammenfatte kritiske komponenter af menneskelig HNSCCs, herunder tilstedeværelsen af forskellige immun infiltrater. For at sikre maksimal hentning af levedygtige enkelt celler fra tumorer, er brugen af fordøjelsen enzymer nødvendige. Collagenase-baserede fordøjelsen enzymer kan være barske på celler og optimering af koncentrationen og type af collagenase kan være nødvendigt for forskellige tumortyper. Vi sammenlignede fem fordøjelsen enzymer før det besluttes at collagenase III, som blev brugt i denne undersøgelse, er den optimale metode for fordøjelsen af squamous celletumorer.

Tumor modeller i denne undersøgelse er særligt nyttigt for at studere mekanismer af HNSCC immun unddragelse og prækliniske vurdering af forskellige behandlingsformer. Vi viste tidligere, at både B4B8 og LY2 tumorer er radioresistant og ildfaste immun checkpoint hæmmer anti-PD-L120. Dette er i overensstemmelse med fleste af menneskelige HNSCCs. Nylige kliniske undersøgelser viste, at mindre end 15% af HNSCC patienter er lydhøre over for anti-PD-1/PD-L1 terapi21,22,23,24,25. Derudover er det godt etableret, at HNSCCs er radioresistant26,27. Målretning veje ansvarlig for radioresistance i HNSCC er et vigtigt skridt for at øge behandlingsrespons. Skelsættende Bonner et al. undersøgelse viste en betydelig fordel i samlet overlevelse med tilsætning af cetuximab til RT i forhold til RT alene i lokalt fremskreden HNSCC patienter28. De seneste data viser, at hæmning af EphB4-Ephrin-B2 signalering i orthotopic HNSCCs yderligere kan forbedre svar til RT eller cetuximab-RT ved at fremme tumor apoptose og hæmme tumor spredning29,30. Derudover kan kombinerer RT med rationel immun behandlingsformer forøge antitumor immunrespons og forbedre både lokale tumor kontrol og control af distant metastaser31. Vi har for nylig påvist, at målrette Tregs i kombination med immun checkpoint blokade og RT resulterer i tumor udryddelse og immunologiske hukommelse32. Fremtidige undersøgelser beskæftiger orthotopic modeller af HNSCC bliver bedre informere udformningen af kliniske forsøg og forbedre forståelsen af mekanismer af tumor immun unddragelse og behandling modstand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Ingen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase III Worthington Biochemical Corp. LS004183
DNase I Worthington Biochemical Corp. LS006328
Fc Block (CD16/32) BD Biosciences 553141  Clone 2.4G2 
Flow Cytometry Staining Buffer eBioscience 00-4222-26
HBSS ThermoFisher Scientific 14175079 no calcium, no magnesium, no pheno red
Helois mass cytometer Fluidigm NA
Matrigel membrane matrix Corning  CB-40234B
MRI Scanner Bruker NA 7.4 Tesla
RBC lysis buffer BioLegend 420301
Trypsin inhibitor Worthington Biochemical Corp. LS002830

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chaturvedi, A. K., et al. Worldwide trends in incidence rates for oral cavity and oropharyngeal cancers. Journal of Clinical Oncology. 31 (36), 4550-4559 (2013).
  2. Ang, K. K., Sturgis, E. M. Human papillomavirus as a marker of the natural history and response to therapy of head and neck squamous cell carcinoma. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 128-142 (2012).
  3. Amin, M. B., et al. The Eighth Edition AJCC Cancer Staging Manual: Continuing to build a bridge from a population-based to a more "personalized" approach to cancer staging. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (2), 93-99 (2017).
  4. Salley, J. J. Experimental carcinogenesis in the cheek pouch of the Syrian hamster. Journal of Dental Research. 33 (2), 253-262 (1954).
  5. Morris, A. L. Factors influencing experimental carcinogensis in the hamster cheek pouch. Journal of Dental Research. 40, 3-15 (1961).
  6. MacDonald, D. G. Comparison of epithelial dysplasia in hamster cheek pouch carcinogenesis and human oral mucosa. Journal of Oral Pathology & Medicine. 10 (3), 186-191 (1981).
  7. Hawkins, B. L., et al. 4NQO carcinogenesis: a mouse model of oral cavity squamous cell carcinoma. Head & Neck. 16 (5), 424-432 (1994).
  8. Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
  9. Vered, M., Yarom, N., Dayan, D. 4NQO oral carcinogenesis: animal models, molecular markers and future expectations. Oral Oncology. 41 (4), 337-339 (2005).
  10. Bornstein, S., et al. Smad4 loss in mice causes spontaneous head and neck cancer with increased genomic instability and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 119 (11), 3408-3419 (2009).
  11. Thomas, G. R., Chen, Z., Oechsli, M. N., Hendler, F. J., Van Waes, C. Decreased expression of CD80 is a marker for increased tumorigenicity in a new murine model of oral squamous-cell carcinoma. International Journal of Cancer. 82 (3), 377-384 (1999).
  12. Yuspa, S. H., Hawley-Nelson, P., Koehler, B., Stanley, J. R. A survey of transformation markers in differentiating epidermal cell lines in culture. Cancer Research. 40 (12), 4694-4703 (1980).
  13. Chen, Z., Smith, C. W., Kiel, D., Van Waes, C. Metastatic variants derived following in vivo tumor progression of an in vitro transformed squamous cell carcinoma line acquire a differential growth advantage requiring tumor-host interaction. Clinical & Experimental Metastasis. 15 (5), 527-537 (1997).
  14. Euhus, D. M., Hudd, C., LaRegina, M. C., Johnson, F. E. Tumor measurement in the nude mouse. Journal of Surgical Oncology. 31 (4), 229-234 (1986).
  15. Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).
  16. Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. NeuroImage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
  17. Dutta, S., et al. The relationship between tumour necrosis, tumour proliferation, local and systemic inflammation, microvessel density and survival in patients undergoing potentially curative resection of oesophageal adenocarcinoma. Britisch Journal of Cancer. 106 (4), 702-710 (2012).
  18. Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research. 12 (4), 571-582 (2014).
  19. Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
  20. Oweida, A., et al. Ionizing radiation sensitizes tumors to PD-L1 immune checkpoint blockade in orthotopic murine head and neck squamous cell carcinoma. OncoImmunology. 6 (10), e1356153 (2017).
  21. Ferris, R., et al. Further evaluations of nivolumab (nivo) versus investigator’s choice (IC) chemotherapy for recurrent or metastatic (R/M) squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN): CheckMate 141. Journal of Clinical Oncology. 34, (2016).
  22. Ferris, R. L., et al. Nivolumab for Recurrent Squamous-Cell Carcinoma of the Head and Neck. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1856-1867 (2016).
  23. Harrington, K. J., et al. Nivolumab versus standard, single-agent therapy of investigator's choice in recurrent or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck (CheckMate 141): health-related quality-of-life results from a randomised, phase 3 trial. The Lancet Oncology. 18 (8), 1104-1115 (2017).
  24. Kiyota, N., et al. A randomized, open-label, Phase III clinical trial of nivolumab vs. therapy of investigator's choice in recurrent squamous cell carcinoma of the head and neck: A subanalysis of Asian patients versus the global population in checkmate 141. Oral Oncology. 73, 138-146 (2017).
  25. Ling, D. C., Bakkenist, C. J., Ferris, R. L., Clump, D. A. Role of Immunotherapy in Head and Neck Cancer. Seminars in Radiation Oncology. 28 (1), 12-16 (2018).
  26. Perri, F., et al. Radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma: Biological bases and therapeutic implications. Head & Neck. 37 (5), 763-770 (2015).
  27. Yamamoto, V. N., Thylur, D. S., Bauschard, M., Schmale, I., Sinha, U. K. Overcoming radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 63, 44-51 (2016).
  28. Bonner, J. A., et al. Radiotherapy plus cetuximab for locoregionally advanced head and neck cancer: 5-year survival data from a phase 3 randomised trial, and relation between cetuximab-induced rash and survival. The Lancet Oncology. 11 (1), 21-28 (2010).
  29. Bhatia, S., et al. Inhibition of EphB4-Ephrin-B2 Signaling Enhances Response to Cetuximab-Radiation Therapy in Head and Neck Cancers. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4539-4550 (2018).
  30. Bhatia, S., et al. Enhancing radiosensitization in EphB4 receptor-expressing Head and Neck Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 6, 38792 (2016).
  31. Tang, C., et al. Combining radiation and immunotherapy: a new systemic therapy for solid tumors? Cancer Immunology Research. 2 (9), 831-838 (2014).
  32. Oweida, A., et al. Resistance to radiotherapy and PD-L1 blockade is mediated by TIM-3 upregulation and regulatory T-cell infiltration. Clinical Cancer Research. , (2018).

Tags

Kræftforskning spørgsmålet 146 hoved og hals kræft orthotopic model tumor mikromiljø immun unddragelse flowcytometri masse flowcytometri
Intramucosal podning af pladecellekræft celler i mus til Tumor immun profilering og behandling svar vurdering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oweida, A. J., Bhatia, S., Van… More

Oweida, A. J., Bhatia, S., Van Court, B., Darragh, L., Serkova, N., Karam, S. D. Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment. J. Vis. Exp. (146), e59195, doi:10.3791/59195 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter