Summary
Hier presenteren we een reproduceerbare methode voor het ontwikkelen van een model orthotopic lymfkliertest van hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom. Tumoren tonen klinisch relevante histopathologische kenmerken van de ziekte, met inbegrip van necrose, arme differentiatie, knooppunten metastasen en immuun infiltratie. Tumor-dragende muizen ontwikkelen klinisch relevante symptomen zoals dysfagie, verplaatsing van de kaak en gewichtsverlies.
Abstract
Hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) is een slopende en dodelijke ziekte met een hoge prevalentie van herhaling en falen van de behandeling. Als u wilt betere therapeutische strategieën te ontwikkelen, begrip tumor microenvironmental factoren die bijdragen aan de weerstand van de behandeling is belangrijk. Een belangrijke belemmering voor begrip van de mechanismen van de ziekte en verbetering van de therapie is een gebrek aan lymfkliertest cellijnen die lijken op de agressieve en metastatische aard van menselijke HNSCCs. Bovendien, een meerderheid van lymfkliertest modellen dienst subcutane implantaties van tumoren die geen belangrijke fysiologische functies van het hoofd en de nek regio, met inbegrip van hoge vasculaire dichtheid, uitgebreide lymfatische therapieën en resident mucosal flora. Het doel van deze studie is om te ontwikkelen en karakteriseren van een orthotopic model van HNSCC. We gebruiken twee genetisch verschillende lymfkliertest cellijnen en gevestigde tumoren in de buccale mucosa van muizen. Wij optimaliseren collagenase gebaseerde tumor spijsvertering methoden voor de optimale terugwinning van afzonderlijke cellen uit gevestigde tumoren. De hier gepresenteerde gegevens laten zien dat muizen ontwikkelen hoogst gevacuoliseerd tumoren die naar regionale lymfeklieren metastaseren. Eencellige multiparametric massa cytometry analyse toont de aanwezigheid van diverse immuun populaties met myeloïde cellen die de meerderheid van alle immuuncellen. Het model voorgesteld in deze studie kent toepassingen in Kankerbiologie Tumorimmunologie en preklinische ontwikkeling van roman therapeutics. De gelijkenis van het orthotopic-model aan klinische kenmerken van ziekten bij de mens zorgt een hulpmiddel voor verbeterde vertaling en verbeterde patiëntenoutcomes.
Introduction
HNSCC is de vijfde meest voorkomende maligniteit wereldwijd, met meer dan 600.000 patiënten gediagnosticeerd jaarlijks1. Ondanks agressieve behandeling met chemotherapie en radiotherapie (RT), blijft de totale (OS) overlevingskansen voor HNSCC patiënten zonder infectie van het humaan papillomavirus (HPV) minder dan 50% na 5 jaar2. Dit wordt grotendeels toegeschreven aan een zeer complexe tumor communicatie als tumoren afkomstig van verschillende verschillende anatomische sites in het hoofd en de nek gebied zijn kunnen, waaronder de buccale mucosa, de tong, de verdieping van de mond, de neusholte, de mondholte, de keelholte, orofarynx en hypopharynx. Bovendien, het hoofd en de nek regio is zeer gevacuoliseerd en bevat bijna de helft van alle lymfeklieren in het lichaam3. Een meerderheid van de studies die onderzoeken van hoofd en nek tumor biologie is afhankelijk van tumor modellen in de flank gebied. Dergelijke modellen kunnen bieden inzicht in tumor-intrinsieke mechanismen, maar het gebrek aan de inheemse hoofd en nek communicatie kan beduidend beïnvloeden het translationeel potentieel van deze bevindingen. Een methode die is gebruikt voor het opwekken van mondelinge tumoren is door blootstelling aan de kankerverwekkende stof 9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene (DMBA)4. Deze methode is echter gekoppeld aan een langdurig proces, induceert tumoren in ratten en hamsters, maar niet in muizen, en de resulterende tumoren niet beschikken over veel van de histologische kenmerken van gedifferentieerde SCCs5,6. De invoering van de carcinogen4-nitroquinoline 1-oxide (4-NQO), een in water oplosbare quinolone derivaat, resulteerde in mondelinge tumoren van de muis wanneer toegepast mondeling maar ook te lijden hebben onder lange belichtingstijden (16 weken) en een beperkte nemen tarief binnen en tussen partijen van muizen7,8,9. Verscheidene groepen gebruikt om het ontwikkelen van klinisch relevante modellen, genetisch gemanipuleerde modellen waarbij de manipulatie van stuurprogramma oncogenen of tumor suppressor genen, inclusief TP53, TGFB, KRAS, HRAS en SMAD410. Deze modellen bieden inzicht in tumoren met bekende stuurprogramma genen maar doen niet recapituleren de complexe heterogeniteit van menselijke HNSCCs.
In dit werk tonen we de haalbaarheid van het uitvoeren van een intramucosal inenting van plaveiselcelcarcinoom cellen in muizen. Geënte cellen uitgroeien tot agressieve tumoren binnen 1 week na de injectie. Vergelijkbaar met menselijke HNSCCs, de tumoren metastaseren naar de regionale lymfeklieren. We karakteriseren histologische en klinische kenmerken van de ziekte en de tumor immuun communicatie inzicht verschaffen. Wij stellen voor dat dit model van de orthotopic van HNSCC toepassingen in Kankerbiologie, tumorimmunologie en preklinische studies kent. Mechanismen van immuun belastingontduiking, tumor progressie, behandeling weerstand en metastasen vertegenwoordigen inzake klinische betekenis die kunnen worden aangepakt met behulp van het voorgestelde model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd overeenkomstig een goedgekeurde institutionele dierlijke zorg en gebruik Comité (IACUC) protocol van de Universiteit van Colorado Denver (protocol # 00250).
1. tumor celkweek
Opmerking: B4B8 en LY2-cellijnen werden gebruikt voor het genereren van orthotopic HNSCC tumoren: B4B8 tumorcellen waren afgeleid van mucosal keratinocyten carcinogeen-getransformeerd (van BALB/C muizen)11. LY2 tumorcellen waren afgeleid van lymfeknoop metastasen van een spontaan getransformeerde BALB/C Keratinocyt lijn (Pam 212)12,13. Beide cellijnen werden beschikbaar gesteld door Dr Nadarajah Vigneswaran (UTHealth, Houston, TX, Verenigde Staten).
- Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) F/12 aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% antimicrobiële reagens voor het onderhoud van de lijn cel gebruiken Deze cellijnen in een steriele incubator bij 37 ° C en 5% CO2handhaven. Cellen moeten worden gebruikt voor inoculatie voor meer dan 15 passages.
- Plaat 2 x 10,6 tot en met 4 x 106 cellen in 175 cm2 cel cultuur kolven.
Opmerking: Controleer de cellen minder dan 90% heuvels te vermijden inducerende een stress-respons. - Wanneer de cellen zijn 70% heuvels (~ 48 h), verwijder de kolf uit de incubator en wassen van de cellen 3 x met koude-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Loskoppelen van de cellen van de kolf met behulp van 0,25% trypsine, genoeg ter dekking van het oppervlak van de plaat.
- Om dit te doen, afzien 4 mL trypsine in een maatkolf van 175 cm2 met 70% confluente cellen. Incubeer de cellen met trypsine gedurende 3-4 min. in de cel cultuur incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
- Visualiseer de cellen onder een microscoop om mobiele-detachement.
- Voeg 12 mL DMEM F/12 media met FBS te neutraliseren trypsine activiteit.
- De celsuspensie gecombineerd en leg deze in een conische tube van 50 mL.
- Schudden van de buis met de cellen die door het omkeren van het 3 x-4 x.
- Optioneel, een aliquoot 10 µL celsuspensie meng met 10 µL van Trypan blauw in een microcentrifuge buis en met behulp van een hemocytometer cellen tellen. Levensvatbaarheid van cellen bepalen door het aantal Trypan-blauw-positieve cellen van het totale aantal cellen af te trekken en gedeeld door het totale aantal cellen.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de cellen in serumvrij en antibiotica-vrij DMEM op een passende omvang zodat 1 x 106 cellen in 50 µL van media aanwezig zijn.
Opmerking: Op basis van de in vivo cel lijn agressiviteit (empirisch bepaald), 1 x 106 cellen per injectieplaats per muis werd geacht voor B4B8 en LY2 cellen. - Plaats de ampul met de celsuspensie op ijs.
- Plaats de vooraf ontdooide kelder membraan matrix op ijs.
Opmerking: De kelder membraan matrix was's nachts ontdooid bij 4 ° C.
2. cel injectie in muizen
- Voorbereiden van een 1:1-mengsel van cellen: basement membraan matrix (van elk 50 µL).
- Voeg de cellen eerst; daarna Pipetteer geleidelijk de kelder membraan-matrix. Vermijd invoering van luchtbellen. Zorgen ervoor dat het mengsel is onmiddellijk vóór de dierlijke injectie. Cellen toevoegen aan kelder membraan matrix voor een langere periode van tijd kan resulteren in cel zich vestigen in het mengsel van de matrix, waardoor het mengsel moeilijk is te schudden rigoureus. Hierdoor wordt een aanzienlijke variabiliteit in de grootte van de tumor tussen muizen.
- Meng voorzichtig. Zorgen dat alle maatregelen met betrekking tot de matrix worden uitgevoerd op het ijs. Kelder membraan matrix zal polymeriseren bij kamertemperatuur.
- Spuiten voorbereiden door inoculatie.
- 0,5 mL insuline spuiten (23 G) laden met 100 µL van de cel/kelder membraan matrix oplossing.
- Houd de spuiten op ijs te vermijden kelder membraan matrix polymerisatie.
- Anesthetize muizen door ze te plaatsen in een kamer met Isofluraan en zuurstof (2,5%).
- Zorgen dat de muizen zijn diep verdoofd alvorens de injectie uit te voeren (door te zorgen voor een gebrek aan respons naar een snuifje teen).
- Steek de naald in de linker- of buccale regio. Dit gebeurt via de beschikbare open ruimte aan weerszijden van de mond.
- Ervoor zorgen dat de tong van de muis niet op de manier.
Opmerking: Het is gemakkelijk om te porren van de tong, die in tong tumoren resulteren zal. De tong naar de overkant verplaatsen indien nodig. - Houd de injectiespuit parallel aan de buccale regio terwijl hij in de mondholte.
- Als u klaar bent om te injecteren, terugtrekken van de spuit en voeg langzaam de spuit in een hoek van 10°.
- Injecteren van 100 µL van de cel/kelder membraan matrix schorsing gedurende een periode van 5 s.
- De spuit op zijn plaats voor een extra 5 houden s om al het materiaal wordt geïnjecteerd.
Opmerking: Voor controle nontumor-bevattende muizen, injecteren een mengsel van serum-vrije media en matrix (zoals hierboven beschreven) zonder de tumorcellen. - De spuit zachtjes trekken.
- De bovenstaande procedure met de resterende muizen voortzetten.
- Voorzien van 1 week tot tumoren beginnen te verschijnen grove (50 – 200 mm3 voor B4B8 en LY2 cellen).
3. de controle muis
- De eerste meting met behulp van remklauwen op 1 week na de injectie van de cel tumor uit te voeren. Oog op de berekening van het volume van de tumor met behulp van externe remklauwen, bepalen de grootste longitudinale diameter (lengte) en de grootste dwarse diameter (breedte) en gebruik de gemodificeerde ellipsvormige formule14,15.
- Blijven metingen uit te voeren regelmatig remklauw voor tumor volume (1 x-2 x per week op gezette tijden).
- Dierlijke gewicht te beoordelen van de gevolgen van de tumorgroei op het vervoederen aan te meten.
4. het oogsten van tumoren
- Wanneer de experimentele eindpunt wordt bereikt, euthanaseren de dieren met behulp van passende maatregelen (bijvoorbeeld CO2 verstikking, onthoofding of cervicale dislocatie).
Opmerking: In deze studie was het eindpunt bereikt als de muizen werd stervende (met een gewichtsverlies van > 15% van hun begingewicht, een gebrek aan verzorging, cachexia) en/of als de grootte van de tumor 1.000 mm3bereikt. -
Begin ontrafeling van het dier door het creëren van een lange incisie door de middellijn in de nek regio.
- Botte pincet gebruiken om te grijpen van de huid en scherpe schaar te snijden van de huid.
- Invoegen van schaar voorzichtig onder de huid over de tumor en maak luchtzakken door duwen de schaar over en in de huid.
- Zodra de huid voldoende losgemaakt van de tumor is, identificeren de zuig lymfklieren (DLNs) en de accijnzen hen om te voorkomen dat de tumor weefsel verward door de aanwezigheid van lymfklieren.
Opmerking: Grote tumoren kunnen bereiken en/of dekking van de DLN. Afhankelijk van de soort test wordt uitgevoerd, is het isolement van intact lymfklieren essentieel om te vermijden morsen van immune cellen in de tumor, die resulteren zal in het scheeftrekken van de resultaten van de test. - Snijden door de grenzen van de tumor totdat het gehele volume is losgekoppeld.
5. de verwerking voor Downstream toepassingen tumor
- Voor de downstream histologische onderzoek, tumoren in 10% formaline bij kamertemperatuur te plaatsen. Om te voorkomen dat overfixation, door de formaline te vervangen door 70% ethanol. Voor stroom cytometry analyse, door de tumoren te verwerken zoals hieronder beschreven.
Opmerking: Het weefsel kan worden gehouden in formaline gedurende 72 uur voordat de overfixation kan worden problematisch voor bepaalde soorten vlekken. - Snijd de tumor in 1 – 2 mm-gerangschikte stukken met behulp van een steriele scheermesje of scherpe schaar.
- Leg de gesneden tumor stukjes in een conische buis van 50 mL met collagenase III (4.250 eenheden per monster), DNase ik (0.1 mg per monster) en trypsine remmer (1 mg per monster).
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten met schudden elke 10 min.
Opmerking: De monsters kunnen worden geplaatst in een hersluitbare zak, gesteriliseerd met 90% ethanol, en geplaatst in een cel cultuur incubator. - Na 30 min, Voeg 20 mL Henks evenwichtig zoutoplossing (HBSS) en spin bij 300 x g gedurende 5 min.
Opmerking: HBSS bestaat uit kaliumchloride, natriumchloride, natriumbicarbonaat, sodium fosfaat dibasische, natriumfosfaat monobasisch en glucose. - Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 2 – 3 mL lysis-buffermengsel van rode bloedcellen (RBC). Pipetteer rigoureus.
Opmerking: RBC lysis-buffermengsel bestaat uit ammoniumchloride, natriumbicarbonaat en dinatrium. - Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: Langere incubatietijd kunnen giftig voor andere cel populaties. - Voeg 20 mL HBSS te neutraliseren van het effect van lysis buffer.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet in 10 mL HBSS.
- Laat de oplossing door een 70 µm nylon afdekking en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
- Herhaal stap 5.8 – 5.10 en doorgeven van de celsuspensie via een afdekking nylon 40 µm om ervoor te zorgen dat elke extra vuil wordt verwijderd uit de suspensie.
6. cel kleuring en Data-acquisitie
- Resuspendeer de cel pellet in 1 mL HBSS.
- De cellen met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde cel teller, tellen, zoals beschreven in stap 1.7
-
Bepaal het totale celaantal en juiste concentratie voor kleuring.
Opmerking: de ideale cel concentratie voor stroom cytometry kleuring is 1-2 miljoen cellen. Bijvoorbeeld, als de kleuring wordt uitgevoerd in een 96-wells-plaat en er zijn 10 miljoen cellen, resuspendeer de steekproef in 1 mL en plaat 100 µL voor 1 miljoen cellen per putje. -
Voeg Fc blok (CD16/CD32) met een concentratie van 1:100 om te voorkomen dat nonantigen-specifieke binding van immunoglobulinen aan de FcγIII en FcγII-receptoren. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeren en resuspendeer de pellet cel in 100 µL van stroom cytometry cel kleuring buffer (bestaat uit zoutoplossing met 5% FBS, EDTA van 2% en 1% HEPES).
-
Uitvoeren celoppervlak kleuring volgens leverancier geleverde instructies (het toevoegen van elke antilichaam bij de juiste verdunning). Incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeren en resuspendeer de pellet cel in 100 µL van HBSS. Herhaal 2 x om zich te ontdoen van overtollige antilichaam.
-
Voorbeelden van op een passende stroom cytometer uitvoeren.
- Als het analyseren van intracellulaire markeringen (bijvoorbeeld foxp3), voert u cel permeabilization en kleuring volgens de instructies van de leverancier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De in vitro beoordeling van LY2 en B4B8 celproliferatie bleek dat beide cellijnen soortgelijke verdubbeling keer hebben (21 h en 23 h, respectievelijk). In vivo beide cellijnen gevormd binnen 1 week na inoculatie (figuur 1A) de massa van een enkele, zichtbaar en voelbaar. In muizen die LY2 tumoren, was de kaak verdreven door 3 weken als gevolg van de tumor last (figuur 1A). Controle muizen die geen tumorcellen heb niet de ontwikkeling van tumoren als verwachte. LY2 tumoren groeide met een hogere snelheid in vergelijking met B4B8 tumoren. Het volume van de gemiddelde tumor op dag 21 in LY2 tumor-dragende muizen werd 632 ± 10 mm3 -in vergelijking met 162 ± 4 mm3 in B4B8 tumoren (figuur 1B). Muizen exposeren kaak verplaatsing snel ontwikkeld gewichtsverlies als gevolg van dysfagie (Figuur 1 c). Muizen exposeren significant gewichtsverlies gedefinieerd als > 15% van hun begingewicht en/of met een volume van de tumor van > 1 cm3 waren euthanized binnen 1 dag na de bekende waarneming. De mediane overleving bij LY2 muizen was 22.5 dagen, vergeleken met 52.0 dagen in B4B8 tumor-dragende muizen (Figuur 1 d).
Magnetische resonantie beeldvorming (MRI) van tumor-dragende muizen bleek goed afgebakende tumoren uit te breiden in de binnenste laag van de buccale mucosa (figuur 2A). Tumoren deed niet binnenvallen in de tong of andere nabijgelegen organen (slokdarm, bronchiën, zwezerik) zoals met histologische beoordeling. Signaal heterogeniteit op heer beelden was vertegenwoordiger van de aanwezigheid van gevacuoliseerd hyperintense (aangeduid met V) en necrotische hypointense regio's (aangeduid met N) (figuur 2A). Een bruto pathologisch onderzoek toonde uitgebreide DLNs (figuur 2B). We verder beoordeeld tumor volume met de computertomografie (CT) om de betrouwbaarheid van de remklauw metingen. Tumoren zijn afgebakend met behulp van een digitale imaging en communicatie in de geneeskunde (DICOM) beeld analyse software16. Beoordeling van LY2 tumor volume door remklauwen en CT beeldvorming bleek een uitstekende correlatie tussen de twee methoden (R2 = 0.8493; Figuur 2C). Dit betekent dat de tumorgroei voornamelijk exophytic is en remklauw meting een betrouwbare methode voor de beoordeling van de tumorgroei is. Histologische onderzoek toonde aan dat alle LY2 tumor-dragende muizen ontwikkeld slecht gedifferentieerd plaveiselcelcarcinoom (figuur 2D). Negen van de negen LY2 tumor-dragende muizen ontwikkeld uitzaaiingen naar de lymfklieren van de eerste en tweede echelon. Knooppunten uitzaaiingen waren voornamelijk subcapsular (met zeven van de negen muizen) en binnen sinussen (met vijf van de negen muizen), met twee van de negen muizen aan te tonen intracapsular invasie. In tegenstelling, muizen die B4B8 tumoren ontwikkeld matig gedifferentieerd plaveiselcelcarcinoom (figuur 2E) en niet metastaseren naar regionale of verre sites, inclusief DLNs. necrose werd beoordeeld op basis van een eerder vastgestelde drie-grade schaal: 0 = geen zichtbare necrose, 1 = weinig, 2 = matig, en 3 = ernstige17. Alle LY2 tumor-dragende muizen had histologisch bevestigde necrose met de meerderheid (zeven van de tien) demonstreren van matige tot ernstige necrose (figuur 2F). Geen bewijs van necrose werd waargenomen in B4B8 tumoren.
We gericht op de LY2 tumor model voor verdere karakterisering van de tumor-immuun-communicatie. Tumoren zijn geoogst op 3 weken na inoculatie van de tumor en verteerd met behulp van collagenase III, gevolgd door de kleuring van het celoppervlak en intracellulaire markers voor stroom/massa cytometry (figuur 3A). Monsters werden verwerkt, met behulp van een massa cytometer, aan de Universiteit van Colorado Denver Stroom Cytometry gedeelde Resource. Gating en data analyse werden uitgevoerd met behulp van stroom cytometry commerciële software. De verkregen gegevens bleek de aanwezigheid van talrijke immuun cel populaties in verschillende mate. Total immuuncellen (CD45+) vertegenwoordigd 7,3% van de totale tumor (figuur 3B). In absolute aantallen, we waargenomen, gemiddeld 26 CD45+ cellen (SD = 0.81) per milligram tumor weefsel (figuur 3B). Myeloïde cellen (CD11b+) vertegenwoordigd 37,8% van alle CD45+ cellen (Figuur 3 c). Myeloïde cellen werden grotendeels samengesteld van macrofagen (F4 / 80 +, 63,0%), gevolgd door suppressor myeloïde-afgeleide cellen (MDSCs) (Gr1 + 8.51%) en neutrofielen (Ly6G +, 5.87%). Totaal aantal T-cellen bestaat 15,9% van CD45+ cellen met CD4+ T cellen bestaande uit het merendeel van alle T-cellen (79,4%), van welke 53,4% waren regelgevende T cellen (Tregs) (CD4+FoxP3+) (figuur 3D). Natural killer (NK) cellen bestaat 1,75% van alle CD45+ cellen. Het hoogtepunt van deze gegevens de aanwezigheid van verschillende immuun infiltreert in LY2 orthotopic HNSCC tumoren die waarschijnlijk een rol in het bemiddelen van progressie van de tumor en immuun belastingontduiking.
Figuur 1: Monitoring van muizen die orthotopic HNSCC tumoren. (A) representatieve beelden van tumor-dragende muizen. De geënte buccale ontwikkelt een tumor binnen 1 week na inoculatie. 3 weken, wordt verplaatsing van de kaak waargenomen. (B) groei van de Tumor in B4B8 en LY2 tumor-dragende muizen zoals bepaald door metingen van de remklauw. (C) veranderingen in het lichaamsgewicht van muizen die B4B8 of LY2 tumoren. (D) overleven van B4B8 en LY2 tumor-dragende muizen. De staven de standaardfout van het gemiddelde (SEM) van 7 – 10 muizen per groep. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Imaging en histologische kenmerken van lymfkliertest HNSCC tumoren. (A) representatieve coronale heer afbeelding van een LY2 tumor-dragende muis. Anatomische sites worden aangeduid. Gebieden van signaal hyperintensity vertegenwoordigen gevacuoliseerd regio's (aangeduid met V). Regio's van de hypointensity van het signaal vertegenwoordigen necrotische gebieden (duiden N). (B) de vertegenwoordiger bruto beeld van een ontleed tumor-bevattende regio. Witte pijlen wijzen naar uitgebreide zuig lymfeklieren (DLNs). (C) correlatie van tumor volume zoals beoordeeld door meting van de remklauw versus computertomografie (CT)-op basis van de beoordeling. Helling, correlatiecoëfficiënt (R2) en lijn van passend worden weergegeven. (D) vertegenwoordiger haematoxyline en eosine (H & E) beeld van LY2 tumor. (E) vertegenwoordiger H & E afbeelding van B4B8 tumor. (F) kwantificering van necrose in LY2 tumoren, op basis van een H & E vier-grade scoring systeem. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: analyse van basislijn intratumoral immuun populaties cytometry via time-of-flight (CyTOF). Tumoren waren verwerkt tot een schorsing van de eencellige met collagenase gebaseerde enzymatische spijsvertering en, vervolgens, gekleurd met cel oppervlakte en intracellulaire markers. (A) massa cytometry werd uitgevoerd met behulp van het CyTOF platform. (B) Absolute en relatieve kwantitatieve beoordeling van totale immuuncellen (CD45+). (C) kwantificering van myeloïde-immuun subpopulaties. (D) kwantificering van lymfoïde immuun subpopulaties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Strenge analyse en karakterisering van de tumor communicatie vertegenwoordigen een belangrijke strategie voor het begrijpen van mechanismen van ontwikkeling van de tumor, progressie en metastasen en voor de ontwikkeling van effectieve therapieën. Hoofd en nek kanker is een complexe ziekte die afkomstig van meerdere anatomische sites binnen het hoofd en de nek regio zijn kan. Een belangrijke belemmering voor begrip van de mechanismen van de ziekte en verbetering van de therapie is een gebrek aan lymfkliertest muis cellijnen die lijken op de agressieve en metastatische aard van menselijke HNSCCs. Bovendien talrijke lymfkliertest modellen gebruiken een onderhuidse implantatie van tumoren die geen belangrijke fysiologische functies van het hoofd en de nek regio, met inbegrip van een vasculaire hoge dichtheid, een uitgebreide lymfatische therapieën en resident mucosal flora.
In deze studie werd gekenmerkt we een orthotopic model van lymfkliertest HNSCC. We kozen de buccale mucosa als de plaats van inoculatie van de tumor om een aantal redenen, met inbegrip van gemakkelijke toegang tot de regio zonder de noodzaak voor de oriëntatie van het beeld, de mogelijkheid om te beoordelen van de tumorgroei met remklauwen, de aanwezigheid van de tumor in de mucosal flora, de aanwezigheid van omringende lymfatische, en het gemak van reproduceerbaarheid. Hoewel de injectie van cellen in de buccale mucosa is eenvoudig, de positionering van de naald en de diepte van de penetratie zijn essentieel ter voorkoming van lekke band via de huid en zorgen voor cellen zijn niet subcutaan geïnjecteerd. Het is raadzaam om de naald tijdens mondeling invoegen terwijl het perfect evenwijdig aan de buccale regio en kantelen in een hoek niet groter is dan 10 ° als u klaar bent om te injecteren.
De cellijnen die we gebruikten waren lymfkliertest cellijnen, waardoor hun implantatie in immunocompetent muizen van de stam dat ze waren afgeleid. Er zijn meer dan 39 HNSCC menselijke cellijnen die zijn bestudeerd in de literatuur, maar kunnen niet worden gebruikt in de aanwezigheid van een inheemse communicatie18. Recente ontwikkelingen toegestaan voor het ontwerp van gehumaniseerd Muismodellen die de integratie van menselijk bot-merg-afgeleide Chimaera in KNIPOOG scid gamma muizen (ook bekend als NSG muizen), waardoor de ontwikkeling van een menselijke immuunsysteem interactie met menselijke tumoren in een immunodeficiëntie muis model19. Dergelijke modellen zijn echter kostbaar, moeizame fokken methoden vereisen, en doen niet alle onderdelen van de tumor-communicatie, met inbegrip van de fibroblasten, endotheliale cellen en lymfatische recapituleren. De lymfkliertest Muismodellen die wij werkzaam in deze studie recapituleren kritische componenten van menselijke HNSCCs, waaronder de aanwezigheid van verschillende immuun infiltreert. Om ervoor te zorgen maximale ophalen van levensvatbare enkele cellen van tumoren, is het gebruik van spijsvertering enzymen nodig. Collagenase gebaseerde spijsvertering enzymen kunnen worden hard op de cellen en het optimaliseren van de concentratie en soort collagenase nodig kan zijn voor verschillende tumor typen. Voordat er wordt bepaald dat collagenase III, die in deze studie werd gebruikt, is de optimale methode voor vertering van squamous cel tumoren vergeleken we de vijf spijsvertering enzymen.
De modellen van de tumor die gebruikt worden in deze studie zijn vooral nuttig voor studeren mechanismen van HNSCC immuun belastingontduiking en preklinische evaluatie van verschillende therapieën. Wij eerder aangetoond dat zowel B4B8 als LY2 tumoren radioresistant en vuurvaste aan de immuun checkpoint remmer anti-PD-L120 zijn. Dit komt overeen met de meerderheid van de menselijke HNSCCs. Recente klinische proeven is gebleken dat minder dan 15% van de HNSCC patiënten reageren op anti-PD-1/PD-L1 therapie21,22,23,24,25. Bovendien, het is reeds lang gevestigd dat HNSCCs radioresistant26,27 zijn. Gericht op trajecten die verantwoordelijk is voor radioresistance in HNSCC is een belangrijke stap voor het verbeteren van de reactie van de behandeling. De landmark Bonner et al. studie toonde een significant voordeel in de totale overleving met de toevoeging van cetuximab aan RT vergeleken met RT alleen in lokaal gevorderde HNSCC patiënten28. Recente gegevens laten zien dat de remming van EphB4-Ephrin-B2 signalering in orthotopic HNSCCs verder het antwoord op RT of cetuximab-RT verbeteren kunt door het bevorderen van de tumor apoptosis en remming van tumor proliferatie29,30. Daarnaast kan RT combineren met rationele immuun therapie vergroten antitumorale immuunrespons en verbeteren van zowel lokale tumor controle en controle van verre metastasen31. We hebben onlangs aangetoond dat gericht op Tregs in combinatie met immuun checkpoint blokkade en RT in de uitroeiing van de tumor en immunologische geheugen32 resulteert. Toekomstige studies met orthotopic modellen van HNSCC zal beter informeren van het ontwerp van klinische proeven en verbetering van het inzicht van mechanismen van tumor immuun belastingontduiking en behandeling verzet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Geen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase III | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | |
| DNase I | Worthington Biochemical Corp. | LS006328 | |
| Fc Block (CD16/32) | BD Biosciences | 553141 | Clone 2.4G2 |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no pheno red |
| Helois mass cytometer | Fluidigm | NA | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB-40234B | |
| MRI Scanner | Bruker | NA | 7.4 Tesla |
| RBC lysis buffer | BioLegend | 420301 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington Biochemical Corp. | LS002830 |
References
- Chaturvedi, A. K., et al. Worldwide trends in incidence rates for oral cavity and oropharyngeal cancers. Journal of Clinical Oncology. 31 (36), 4550-4559 (2013).
- Ang, K. K., Sturgis, E. M. Human papillomavirus as a marker of the natural history and response to therapy of head and neck squamous cell carcinoma. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 128-142 (2012).
- Amin, M. B., et al. The Eighth Edition AJCC Cancer Staging Manual: Continuing to build a bridge from a population-based to a more "personalized" approach to cancer staging. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (2), 93-99 (2017).
- Salley, J. J. Experimental carcinogenesis in the cheek pouch of the Syrian hamster. Journal of Dental Research. 33 (2), 253-262 (1954).
- Morris, A. L. Factors influencing experimental carcinogensis in the hamster cheek pouch. Journal of Dental Research. 40, 3-15 (1961).
- MacDonald, D. G. Comparison of epithelial dysplasia in hamster cheek pouch carcinogenesis and human oral mucosa. Journal of Oral Pathology & Medicine. 10 (3), 186-191 (1981).
- Hawkins, B. L., et al. 4NQO carcinogenesis: a mouse model of oral cavity squamous cell carcinoma. Head & Neck. 16 (5), 424-432 (1994).
- Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
- Vered, M., Yarom, N., Dayan, D. 4NQO oral carcinogenesis: animal models, molecular markers and future expectations. Oral Oncology. 41 (4), 337-339 (2005).
- Bornstein, S., et al. Smad4 loss in mice causes spontaneous head and neck cancer with increased genomic instability and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 119 (11), 3408-3419 (2009).
- Thomas, G. R., Chen, Z., Oechsli, M. N., Hendler, F. J., Van Waes, C. Decreased expression of CD80 is a marker for increased tumorigenicity in a new murine model of oral squamous-cell carcinoma. International Journal of Cancer. 82 (3), 377-384 (1999).
- Yuspa, S. H., Hawley-Nelson, P., Koehler, B., Stanley, J. R. A survey of transformation markers in differentiating epidermal cell lines in culture. Cancer Research. 40 (12), 4694-4703 (1980).
- Chen, Z., Smith, C. W., Kiel, D., Van Waes, C. Metastatic variants derived following in vivo tumor progression of an in vitro transformed squamous cell carcinoma line acquire a differential growth advantage requiring tumor-host interaction. Clinical & Experimental Metastasis. 15 (5), 527-537 (1997).
- Euhus, D. M., Hudd, C., LaRegina, M. C., Johnson, F. E.
- Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. NeuroImage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Dutta, S., et al. The relationship between tumour necrosis, tumour proliferation, local and systemic inflammation, microvessel density and survival in patients undergoing potentially curative resection of oesophageal adenocarcinoma. Britisch Journal of Cancer. 106 (4), 702-710 (2012).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research. 12 (4), 571-582 (2014).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
- Oweida, A., et al. Ionizing radiation sensitizes tumors to PD-L1 immune checkpoint blockade in orthotopic murine head and neck squamous cell carcinoma. OncoImmunology. 6 (10), e1356153 (2017).
- Ferris, R., et al. Further evaluations of nivolumab (nivo) versus investigator’s choice (IC) chemotherapy for recurrent or metastatic (R/M) squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN): CheckMate 141. Journal of Clinical Oncology. 34, (2016).
- Ferris, R. L., et al. Nivolumab for Recurrent Squamous-Cell Carcinoma of the Head and Neck. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1856-1867 (2016).
- Harrington, K. J., et al. Nivolumab versus standard, single-agent therapy of investigator's choice in recurrent or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck (CheckMate 141): health-related quality-of-life results from a randomised, phase 3 trial. The Lancet Oncology. 18 (8), 1104-1115 (2017).
- Kiyota, N., et al. A randomized, open-label, Phase III clinical trial of nivolumab vs. therapy of investigator's choice in recurrent squamous cell carcinoma of the head and neck: A subanalysis of Asian patients versus the global population in checkmate 141. Oral Oncology. 73, 138-146 (2017).
- Ling, D. C., Bakkenist, C. J., Ferris, R. L., Clump, D. A. Role of Immunotherapy in Head and Neck Cancer. Seminars in Radiation Oncology. 28 (1), 12-16 (2018).
- Perri, F., et al. Radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma: Biological bases and therapeutic implications. Head & Neck. 37 (5), 763-770 (2015).
- Yamamoto, V. N., Thylur, D. S., Bauschard, M., Schmale, I., Sinha, U. K. Overcoming radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 63, 44-51 (2016).
- Bonner, J. A., et al. Radiotherapy plus cetuximab for locoregionally advanced head and neck cancer: 5-year survival data from a phase 3 randomised trial, and relation between cetuximab-induced rash and survival. The Lancet Oncology. 11 (1), 21-28 (2010).
- Bhatia, S., et al. Inhibition of EphB4-Ephrin-B2 Signaling Enhances Response to Cetuximab-Radiation Therapy in Head and Neck Cancers. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4539-4550 (2018).
- Bhatia, S., et al. Enhancing radiosensitization in EphB4 receptor-expressing Head and Neck Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 6, 38792 (2016).
- Tang, C., et al. Combining radiation and immunotherapy: a new systemic therapy for solid tumors? Cancer Immunology Research. 2 (9), 831-838 (2014).
- Oweida, A., et al. Resistance to radiotherapy and PD-L1 blockade is mediated by TIM-3 upregulation and regulatory T-cell infiltration. Clinical Cancer Research. , (2018).
