Summary
Burada bir orthotopic fare modeli baş ve boyun Skuamöz Hücre Karsinomu geliştirmek için tekrarlanabilir bir yöntem mevcut. Tümör nekroz, zavallı farklılaşma, nodal metastaz ve bağışıklık infiltrasyon gibi hastalığın klinik histopatolojik özellikler göstermektedir. Tümörü taşıyan fareler disfaji, çene deplasman ve kilo kaybı gibi klinik belirtiler geliştirmek.
Abstract
Baş ve boyun Skuamöz Hücre Karsinomu (HNSCC) ile yineleme ve başarısız tedavi yüksek yaygınlık zayıflatıcı ve ölümcül bir hastalıktır. Daha iyi tedavi stratejileri geliştirmek için tedavi direnci katkıda anlayış tümör microenvironmental faktör olması önemlidir. Hastalık mekanizmaları anlama ve tedavi geliştirmek için önemli bir engeli insan HNSCCs agresif ve metastatik doğası benzer fare hücre hatları eksikliği oldu. Ayrıca, fare modelleri çoğunluğu yüksek vasküler yoğunluk, geniş lenfatik damarlara ve ikamet Mukozal flora da dahil olmak üzere baş ve boyun bölgesinin önemli fizyolojik özellikleri eksikliği tümörlerin subkutan takılan istihdam. Bu çalışmanın amacı geliştirmek ve HNSCC bir orthotopic model karakterize olmaktır. Biz iki genetik olarak farklı fare hücre satır ve farelerin yanak mukozasında kurulan tümörler istihdam. Collagenase tabanlı tümör sindirim yöntemleri kurulan tümörler tek hücre en iyi kurtarma için en iyi duruma getirme. Burada sunulan veriler fareler geliştirmek bölgesel lenf düğümlerine metastaz son derece bozukluklarına tümörler göstermektedir. Tek hücreli multiparametric kitle Sitometresi Analizi myeloid hücrelerin tüm bağışıklık hücreleri çoğunluğu temsil eden çeşitli bağışıklık nüfus varlığı gösterir. Bu çalışmada önerilen model kanser biyoloji, tümör İmmünoloji ve roman therapeutics preklinik geliştirme uygulamaları vardır. Orthotopic modeli insan hastalığın klinik özelliklerine benzerlik gelişmiş çeviri ve geliştirilmiş hasta sonuçları için bir araç sağlar.
Introduction
HNSCC en sık beşinci malignite dünyanın her yerinde mi, fazla 600.000 hastalarda her yıl1tanısı. Kemoterapi ve radyoterapi (RT) içeren agresif tedavi rağmen insan Papilloma Virus (HPV) enfeksiyonu olmadan HNSCC hastalar için genel sağkalım (OS) oranı % 50'in altında 5 yıl2' den sonra kalır. Tümör mukozasinin, dil, ağız, burun, ağız boşluğu, yutak katında da dahil olmak üzere baş ve boyun bölgesi içinde birkaç farklı anatomik sitelerden gerçekleşebilir gibi bu büyük ölçüde son derece karmaşık tümör microenvironment atfedilir, mastoidi ve hypopharynx. Buna ek olarak, baş ve boyun bölgesinin son derece skarların ve yaklaşık yarım vücut3tüm lenf düğümleri içerir. Baş ve boyun tümörü Biyoloji Araştırma çalışmaları bir çoğunluğu itimat gögüs bölgesinde tümör modellerde. Modelleri gibi tümör iç mekanizmaları içgörü sunabilir, ancak yerel baş ve boyun microenvironment eksikliği gibi bulgular translasyonel potansiyelini önemli ölçüde etkileyebilir. Sözlü tümörler ikna etmek için kullanılan bir yöntem kanserojen 9,10-Dimetil-1,2-benzanthracene (DMBA)4maruz geçer. Ancak, bu yöntem ile ilişkilidir uzun bir süreç, fareler ve hamster ama değil farelerde tümör indükler ve elde edilen tümör farklılaştırılmış SCCs5,6histolojik özellikleri birçok sahip değilsin. Carcinogen4-nitroquinoline 1-oksit (4-NQO), suda çözünen kinolon türevi, sözlü olarak uygulandığında fare sözlü tümörleri içinde sonuçlandı ama aynı zamanda uzun pozlama süreleri (16 hafta) ve sınırlı bir zarar giriş almak oranı içinde ve arasında toplu işlemleri Fareler7,8,9/. Klinik modellerinin geliştirilmesi amacıyla, genetiği modelleri sürücü oncogenes veya Tümör baskılayıcı genler TP53, TGFB, KRAS, HRAS ve SMAD410da dahil olmak üzere, manipülasyon içeren çeşitli grupları kullanılmıştır. Bu modellerin bilinen sürücü genler ile tümör içgörü sağlayabilir ama insan HNSCCs karmaşık heterojen özetlemek değil.
Bu çalışmada, Skuamöz Hücre Karsinomu hücre intramucosal bir aşı farelerde gerçekleştirme fizibilite göstermek. Aşısını hücreleri agresif tümör enjeksiyon 1 hafta içinde geliştirmek. İnsan HNSCCs benzer, tümör bölgesel lenf düğümlerine metastaz. Hastalığın klinik ve histolojik özellikler karakterize ve tümör bağışıklık microenvironment içgörü sağlamak. Önerdiğimiz bu orthotopic model HNSCC, kanser biyoloji, tümör İmmünoloji ve preklinik çalışmaları uygulamaları vardır. Bağışıklık kaçırma, tümör ilerleme, tedavi direnci ve metastaz mekanizmaları alanlar önerilen modelini kullanarak ele alınması klinik önem gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan yordamları bir onaylanmış kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) iletişim kuralı Colorado Üniversitesi, Denver (iletişim kuralı # 00250) uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. tümör hücre kültürü
Not: B4B8 ve LY2 hücre hatları orthotopic HNSCC tümör oluşturmak için kullanılmıştır: B4B8 tümör hücreleri kanserojen dönüştürülmüş Mukozal keratinositler (BALB/C fareler)'dan11' den elde. LY2 tümör hücreleri bir kendiliğinden dönüştürülmüş BALB/C keratinosit hattı (Pam 212)12,13lenf nodu Metastazlari elde edilmiştir. Her iki hücre hatları tür Dr. Nadarajah Vigneswaran (UTHealth, Houston, TX, ABD) tarafından temin edilmiştir.
- Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) F/12% 10 fetal sığır serum (FBS) ve hücre hat bakım için % 1 antimikrobiyal reaktif ile takıma kullanın. Bu hücre satırları 37 ° C ve % 5 CO2steril bir kuluçka korumak. Hücreleri 15 pasajlar aşan önce aşılama için kullanılmalıdır.
- 2 x 106 175 cm2 hücre kültür şişeler 4 x 106 hücrelere plaka.
Not: Hücreleri daha az % 90 emin olmak bir stres tepkisi inducing önlemek için birleşmesi. - Hücreleri % 70 birleşmesi (~ 48 h) olduğunda, şişeye kuluçka makinesi kaldır ve hücreleri 3 yıkama x soğuk fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile.
- % 0.25 Tripsin, yeterince plaka yüzeyi kullanacak şişeye hücrelerden bağlantısını kesin.
- Bunu yapmak için 4 mL % 70 Konfluent hücreleri içeren bir 175 cm2 şişe tripsin dağıtmak. 3-4 dk 37 ° C ve % 5 CO2hücre kültür kuluçka tripsin hücrelerle kuluçkaya.
- Hücreleri hücre dekolmanı sağlamak için mikroskop altında görselleştirin.
- Tripsin etkinlik nötralize etmek için FBS içeren DMEM F/12 medya 12 mL ekleyin.
- Hücre süspansiyon Aspire edin ve 50 mL konik tüp içine yerleştirin.
- 3 x-4 ters çevirme tarafından hücreleri içeren tüp sallamak x.
- İsteğe bağlı olarak, hücre süspansiyon 10 µL aliquot Trypan mavi bir microcentrifuge tüp 10 µL karıştırın ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Trypan mavi pozitif hücreleri hücre toplam sayısı üzerinden çıkararak hücre canlılığı belirlemek ve hücrelerin toplam sayıya bölme.
- 300 x g 4 ° C'de 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi
- Böylece 1 x 106 hücre mevcut içinde Medya 50 µL serum ve antibiyotik özgür DMEM uygun bir ses seviyesinde hücrelerde resuspend.
Not: İçinde vivo hücre satırı saldırganlık (ampirik olarak belirlenir) bağlı olarak, enjeksiyon yeri fare başına başına 1 x 106 hücre kabul B4B8 ve LY2 hücreler için uygun. - Buz üzerinde hücre süspansiyon içeren flakon yerleştirin.
- Önceden çözdürülen membran matris Buza koyun.
Not: Membran matris gecede 4 ° C'de çözdürülen yapıldı.
2. hücre enjeksiyon fareler içine
- Hücreler: Bodrum membran matris (50 µL her) 1:1 karışımı hazırlayın.
- Hücreleri önce ekleyin; sonra yavaş yavaş membran matris pipette. Hava kabarcıkları tanıtan kaçının. Hemen önce hayvan enjeksiyon yapılmış bir karışım olduğunu emin olun. Hücre membran matris ekleme uzun bir süre için karışım titizlikle titremeye zorlaştırır matris karışımı yerleşme hücre neden olabilir. Bu tümör boyutu fareler arasında hatırı sayılır bir değişkenlik neden olur.
- Hafifçe karıştırın. Buz üzerinde gerçekleştirilen tüm adımlar matris içeren emin olun. Membran matris oda sıcaklığında polimerize.
- Şırınga aşılama için hazırlayın.
- 0.5 mL insülin şırınga (23 G) hücre/Bodrum membran matris çözüm 100 µL ile yükleyin.
- Şırıngaları membran matris polimerizasyon önlemek için buz üzerinde tutun.
- Fareler isoflurane ve oksijen (% 2.5) ile bir odaya yerleştirerek anestezi.
- Fareler (yanıt-e doğru ayak parmağı çimdik eksikliği sağlayarak) enjeksiyon gerçekleştirmeden önce derin anestezi emin olun.
- İğne sağ veya sol yanak bölgesine ekleyin. Bu ağız her iki tarafında kullanılabilir açık alan aracılığıyla gerçekleştirilir.
- Fare dili engel olmadığından emin olun.
Not: Dil tümör neden olur dilin poke kolaydır. Dil diğer tarafa için gerekirse hareket. - Şırınga süre oral kavite içinde yanak bölgesine paralel tutun.
- Enjekte etmek hazır olduğunuzda şırıngayı geri çekmek ve yavaş yavaş şırınga 10 ° açıyla yerleştirin.
- 5 bir süre içinde hücre/Bodrum membran matris süspansiyon 100 µL enjekte s.
- Bir ek 5 için yerinde şırınga tutun tüm malzeme sağlamak için s enjekte edilir.
Not: Denetim nontumor taşıyan fareler için tümör hücreleri (yukarıda açıklandığı gibi) serum-Ücretsiz medya ve matris karışımı enjekte et. - Şırıngayı yavaşça geri alıyorum.
- Kalan fareler ile yukarıdaki yordama devam edin.
- Fena halde görünmesini tümörler başlar 1 hafta için izin (50-200 mm3 B4B8 ve LY2 hücreler için).
3. fare izleme
- Çap pergeli, 1 hafta sonra tümör hücre enjeksiyon kullanarak ilk ölçüm gerçekleştirin. Dış Çap pergeli kullanarak tümör birimi hesaplamak için en büyük boyuna çapı (uzunluk) ve en büyük transvers çapı (genişlik) belirlemek ve değiştirilmiş ellipsoidal formül14,15kullanın.
- Tümör birim (1 x-2 x haftada-düzenli aralıklarla) için düzenli Kaliper ölçümleri gerçekleştirmek için devam.
- Tümör büyüme beslenme üzerinde etkilerini değerlendirmek için hayvan ağırlık ölçmek.
4. hasat Tümörleri
- Deneysel bitiş noktası ulaşıldığında, uygun önlemleri (örneğin, CO2 boğulma, işten çıkarma veya servikal çıkığı) kullanarak hayvanlara ötenazi.
Not: Fareler can çekişen olursam bu çalışmada, bitiş noktası ulaşılmıştır (kilo kaybı > a-sizlik çekmek-in damat, kaşeksi ilk kendi ağırlığının % 15) ve/veya tümör boyutu 1000 mm3olsa. -
Boyun bölgesinde orta hat boyunca uzun bir kesi oluşturarak hayvan dissekan başlamak.
- Künt forseps cilt kapmak ve deriyi kesme makası keskin için kullanın.
- Makas yavaşça tümör kapsayan deri altında takıp makas genelinde ve cilt içine iterek hava cepleri oluşturabilirsiniz.
- Cilt tümör yeterince müstakil, drenaj lenf düğümleri (DLNs) tanımlamak ve lenf düğümleri varlığı ile şaşırmış tümör doku sahip önlemek için tüketim.
Not: Büyük tümör ulaşmak ve/veya DLN kapak. Gerçekleştirilen tahlil türüne bağlı olarak, yalıtım bozulmadan lenf nodlarının tahlil sonuçları eğriltme sonuçlanır tümör içine bağışıklık hücrelerinin dökülmeyi önlemek için önemlidir. - Birimin tümü ayrılana kadar tümörün sınırları ile kesti.
5. tümör aşağı akım için işleme uygulamaları
- Aşağı akım histolojik muayene için tümörlerin % 10 formalin oda sıcaklığında yerleştirin. Overfixation önlemek için formalin % 70 etanol ile değiştirin. Akış Sitometresi Analizi için aşağıda açıklandığı gibi tümör işlemek.
Not: Overfixation boyama belirli türleri için sorunlu olabilmesi için önce doku 72 h için formalin içinde tutulabilir. - Tümörün 1-2 mm kesme-steril jilet veya keskin makas kullanarak parçaları boyutlu.
- Collagenase III ile 50 mL konik tüp kesme tümör alin (4,250 adet örnek başına), Dnaz ben (örnek başına 0.1 mg) ve tripsin inhibitörü (örnek başına 1 mg).
- Her 10 min sallayarak ile 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
Not: % 90 etanol ile sterilize ve bir hücre kültür kuluçka makinesine yerleştirilen bir resealable çanta örnekleri yerleştirilebilir. - 30 dakika sonra Hank'in 20 mL dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ve 300 x g 5 min için spin ekleyin.
Not: HBSS Potasyum klorür, Sodyum Klorür, sodyum bikarbonat, sodyum fosfat dibasic, sodyum fosfat yem mono ve glikoz oluşur. - Süpernatant atın ve Pelet 2-3 mL kırmızı kan hücresi (RBC) lizis arabellek resuspend. Titizlikle pipet.
Not: RBC lizis arabellek amonyum klorür, sodyum bikarbonat ve disodyum oluşur. - Oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.
Not: Daha uzun kuluçka diğer hücre popülasyonlarının toksik olabilir. - 20 mL HBSS lizis arabellek etkisini nötralize etmek için ekleyin.
- 300 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
- Pelet 10 mL HBSS resuspend.
- Çözüm 70 µm naylon restrainer üzerinden geçmek ve 5 dakika süreyle 300 x g , santrifüj süpernatant atın.
- 5.8-5.10 adımları yineleyin ve hücre süspansiyon süspansiyon ek herhangi bir enkaz kaldırılır emin olmak için 40 µm naylon restrainer üzerinden geçmek.
6. hücre boyama ve veri toplama
- Hücre Pelet 1 mL HBSS resuspend.
- 1.7. adımda açıklandığı gibi bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak
-
Toplam cep telefonu numarasını ve boyama için uygun konsantrasyonu belirlemek.
Not: 1-2 milyon hücre Akış Sitometresi boyama için ideal hücre toplama olduğunu. Örneğin, boyama bir 96-şey tabak içinde gerçekleştirilir ve 10 milyon hücre varsa, 1 mL ve plaka 100 µL iyi başına 1 milyon hücre için de örnek resuspend. -
FC blok (CD16/CD32) 1: 100 bir konsantrasyon FcγIII ve FcγII reseptörleri nonantigen özel bağlama immünglobulin önlemek için ekleyin. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
- Santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet Akış Sitometresi hücre arabellek boyama 100 µL içinde resuspend (%5 FBS, % 2 EDTA ve % 1'i içeren tuzlu çözüm oluşan HEPES).
-
Hücre yüzeyine (her antikor uygun seyreltme ekleme) tedarikçi tarafından sağlanan yönergelere göre boyama gerçekleştirmek. Oda sıcaklığında 60 dk için kuluçkaya.
- Santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet HBSS 100 µL içinde resuspend. 2 x aşırı antikor kurtulmak için yineleyin.
-
Örnekler uygun Akış Sitometresi üzerinde çalıştırın.
- Hücre içi işaretleri (örneğin, foxp3) analiz, hücre permeabilization ve üreticinin yönergelerine göre boyama gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her iki hücre hatları benzer katlama kez var LY2 ve B4B8 hücre çoğalması tüp bebek değerlendirilmesi gösterdi (21 h ve 23 h, sırasıyla). İn vivo, her iki hücre hatları bir tek, görünür ve palpabl kitle aşılama (şekil 1A) 1 hafta içinde kurdu. LY2 tümörü taşıyan farelerde tümör yükü (şekil 1A) nedeniyle 3 hafta çene yerlerinden. Tümör hücreleri almadıysanız kontrol fareler tümörler olarak beklenen geliştirmek değil. LY2 tümörler B4B8 tümörü kıyasla daha yüksek bir hızda büyüdü. LY2 tümörü taşıyan fareler yapıldı 162 ± 4 mm3 ' te B4B8 tümörler (şekil 1B) göre 632 ± 10 mm3 21 günde ortalama tümör birimde. Çene deplasman hızla sergilenmesi fareler kilo kaybı nedeniyle disfaji (şekil 1 c) geliştirdi. Önemli sergilenmesi fareler kilo kaybı olarak tanımlanan > başlangıç ağırlıklarını ve/veya tümör hacmi olan % 15 > 1 cm3 kaydetti gözlem 1 gün içinde euthanized. LY2 farelerde medyan sağkalım 22.5 52.0 gün B4B8 tümörü taşıyan farelerde (şekil 1 d) göre gündü.
Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) tümör taşıyan fareler iyi belirlenmis tümörler mukozasinin (şekil 2A) iç tabaka uzanan gösterdi. Tümör içine dil ya da yakınlardaki diğer organlara (yemek borusu, bronş, timus) ile histolojik değerlendirme gösterildiği gibi işgal değil. Sinyal heterojenite Bay görüntülerde yapıldı (V ile gösterilir) bozukluklarına hyperintense bölgeler ve nekrotizan hypointense bölgeler (N ile gösterilir) varlığı temsilcisi (şekil 2A). Brüt bir patolojik muayene genişlemiş DLNs (şekil 2B) gösterdi. Daha fazla tümör güç Bilgisayarlı Tomografi (CT Kaliper ölçümleri güvenilirliğini belirlemek için) ile değerlendirildi. Tümör bir dijital görüntüleme ve iletişim Tıp (DICOM) görüntü analiz yazılımı16' kullanarak tarif. LY2 tümör hacimce Çap pergeli ve CT görüntüleme değerlendirilmesi gösterdi iki yöntem arasındaki mükemmel bir korelasyon (R2 = 0.8493; Şekil 2C). Bu tümör büyüme öncelikle exophytic ve Halife ölçüm tümör büyüme değerlendirilmesi için güvenilir bir yöntem olduğunu gösterir. Histolojik muayene kötü geliştirilen tüm LY2 tümörü taşıyan fareler Skuamöz Hücre Karsinomu (2D rakam) ayrıştırılan gösterdi. 9 dışarı-in dokuz LY2 tümörü taşıyan fareler birinci ve ikinci kademe lenf düğümlerine metastaz geliştirdi. Nodal metastaz (ile yedi dışarı-in dokuz fareler) öncelikle subkapsüler ve juatify işgal gösteren iki dışarı-in dokuz fareler ile (ile beş dışarı-in dokuz fareler), sinüsler içinde. Buna ek olarak, orta derecede geliştirilen B4B8 tümör taşıyan fareler Skuamöz Hücre Karsinomu (şekil 2E) ayrıştırılan ve bölgesel ya da uzak sitelere metastaz değil, dahil olmak üzere DLNs. nekroz daha önce kurulan üç sınıf üzerinde dayalı değerlendirildi Ölçek: 0 hiçbir görünür nekroz = 1 = scant, 2 = Orta ve 3 şiddetli17=. Tüm LY2 tümörü taşıyan fareler histolojik olarak orta şiddetli nekroz (şekil 2F) gösteren nekroz çoğunluğu (onda yedi) ile teyit. Nekroz kanıtı yok B4B8 tümörler gözlendi.
Biz daha fazla tümör-bağışıklık microenvironment karakterizasyonu için LY2 tümör modeli üzerinde duruldu. Tümör tümör aşı sonra 3 hafta hasat edildi ve hücre yüzey boyama tarafından takip collagenase III, kullanılarak sindirilir ve hücre içi işaretler için Akış/Sitometresi (şekil 3A) kütle. Colorado Denver Akış Sitometresi kaynak paylaşılan Üniversitesi'nde bir kitle sitometresi kullanarak örnekleri işlendi. Gating ve veri analizi gerçekleştirilen Akış Sitometresi ticari yazılım kullanarak. Elde edilen veriler çok sayıda bağışıklık hücre popülasyonlarının değişen derecelerde varlığını gösterdi. Toplam bağışıklık hücreleri (CD45+) %7,3 Toplam tümör (şekil 3B) sini temsil etmektedirler. Kesin rakamlar içinde biz, ortalama olarak, 26 CD45 gözlenen+ hücreleri (SD = 0.81) tümör doku (şekil 3B) miligram başına. Myeloid hücrelerin (CD11b+) tüm CD45 37.8 oranında temsil+ hücreleri (şekil 3 c). Myeloid hücrelerin büyük ölçüde makrofajlar oluşan (F4 / 80 +, %63.0), ardından elde edilen Miyeloid bastırıcı hücreleri (MDSCs) (Gr1 +, %8,51) ve nötrofiller (Ly6G +, %5.87). Toplam T hücreleri oluşur CD45 %15,9+ hücreleri CD4 ile+ T hücreleri tüm T hücreleri (%79.4) çoğunluğu oluşan, hangi %53.4 düzenleyici T hücreleri (Tregs) (CD4+FoxP3+) (şekil 3D). Doğal öldürücü (NK) hücreleri oluşur tüm CD45 %1.75+ hücreleri. Bu verileri vurgulamak çeşitli bağışıklık varlığı LY2 orthotopic hangi büyük olasılıkla tümör ilerleme ve bağışıklık kaçırma arabuluculuk bir rol oynamak HNSCC tümör infiltratlar.
Şekil 1: orthotopic HNSCC tümörü taşıyan fareler izleme. (A)tümör taşıyan fareler temsilcisi görüntülerini. Aşısını bukkal bir tümör aşılama 1 hafta içinde gelişir. 3 haftada, deplasman çene görülmektedir. (B) Halife ölçüleri bilgisi tarafından belirtildiği gibi B4B8 ve LY2 tümörü taşıyan farelerde tümör büyüme oranı. (C) B4B8 veya LY2 tümörü taşıyan fareler vücut ağırlığını değişimler. (D) hayatta kalma B4B8 ve LY2 tümörü taşıyan fareler. Çubuklar 7 – 10 fareler grup başına ortalaması (SEM) standart hatasını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: görüntüleme ve histolojik özellikleri fare HNSCC tümörlerin. LY2 tümörü taşıyan fare temsilcisi koronal Bay görüntü(a). Anatomik siteleri etiketlenir. Sinyal hyperintensity alanlarında bozukluklarına bölgeleri (izotopu V) temsil eder. Sinyal hypointensity bölgelerinde temsil nekrotik alanlar (göstermek N). (B) bir disseke tümör içeren bölge temsilcisi brüt görüntüsü. Beyaz ok genişlemiş drenaj lenf düğümlerine (DLNs) üzerine gelin. (C) korelasyon Halife ölçüm Bilgisayarlı Tomografi (CT) karşı tarafından değerlendirildi gibi tümör birimin-değerlendirme göre. Yamaç, korelasyon katsayısı (R2) ve en uygun çizgi gösterilir. (D) temsilcisi Hematoksilen ve Eozin (H & E) görüntü LY2 tümör. B4B8 tümör (E) temsilcisi H & E görüntüsü. Bir H & E dört dereceli puanlama sistemi temel LY2 tümör nekroz (F) miktar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: temel intratumoral bağışıklık nüfus sitometresi zaman--uçuş tarafından (CyTOF) kullanarak analizini. Tümör Enzimatik sindirim collagenase tabanlı kullanarak bir tek hücre süspansiyon işlenmiş ve, sonra ile lekeli hücre yüzey ve hücre içi işaretleri. (A)kitle sitometresi gerçekleştirilen CyTOF platformu kullanarak. (B) mutlak ve göreli toplam bağışıklık hücreleri kantitatif değerlendirmesi (CD45+). Bağışıklık Miyeloid altgrupları (C) miktar. Lenfoid bağışıklık altgrupları (D) miktar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Titiz analizi ve tümör microenvironment karakterizasyonu için anlayış mekanizmaları tümör gelişimi, ilerleme ve metastaz ve etkili tedaviler gelişimi için önemli bir strateji temsil eder. Baş ve boyun kanseri baş ve boyun bölgesi içinde birden çok anatomik site gerçekleşebilir karmaşık bir hastalıktır. Hastalık mekanizmaları anlama ve tedavi geliştirmek için önemli bir engeli insan HNSCCs agresif ve metastatik doğası benzer fare fare hücre hatları eksikliği oldu. Ayrıca, çok sayıda fare modelleri yüksek vasküler yoğunluğu, bir kapsamlı lenfatik damarlara ve ikamet Mukozal flora da dahil olmak üzere baş ve boyun bölgesinin önemli fizyolojik özellikleri eksikliği tümörler subkutan implantasyonu istihdam.
Bu çalışmada, fare HNSCC bir orthotopic modeli ile karakterizedir. Bukkal mukoza tümör aşılama için birkaç nedeni, bölge görüntü rehberlik, tümör büyüme Çap pergeli, Mukozal flora içinde tümör varlığını kullanarak değerlendirmek için yetenek gerek kalmadan kolay erişim dahil olmak üzere site olarak seçtik Çevredeki Lenfleribile varlığı ve tekrarlanabilirlik kolaylığı. Bukkal mukoza içine hücre enjeksiyon basit olsa da, deri yoluyla ponksiyon önlemek ve hücreleri subkutan enjekte değil emin olmak için kritik iğne ve penetrasyon derinliği konumlandırma. Yanak bölgesine mükemmel paralel iken iğne intra sözlü olarak ekleme ve 10 ° hazır olduğunuzda enjekte etmek büyük bir açıda devirme öneririz.
Biz kullanılan hücre çizgiler onlar elde edilmiştir yük immün farelerde onların implantasyon sağlayan fare hücre hatları vardı. Literatürde inceledik, ancak yerel microenvironment18huzurunda kullanılamaz üzerinde 39 HNSCC insan hücre satırı bulunur. Son gelişmeler NOD scid gamma farelerde (olarak da bilinen NSG fareler), insan kemik iliği türevi chimeras entegre insanlaşmış fare modelleri tasarımı için izin insan tümörleri ile iletişim kurabilirim insan bağışıklık sistemi gelişimi sağlayan bir immünyetmezligi fare modeli19. Ancak, modelleri gibi pahalı, zahmetli ıslah yöntemleri gerektirir ve endotel hücreleri, fibroblastlar ve Lenfleribile gibi tümör microenvironment tüm bileşenleri özetlemek değil. Biz bu çalışmada istihdam fare fare modelleri çeşitli bağışıklık infiltratlar varlığı da dahil olmak üzere insan HNSCCs kritik bileşenleri özetlemek. Tek Kişilik hücrelerin tümör üzerinden en fazla alınmasını sağlamak için sindirim enzimleri kullanımı gereklidir. Collagenase tabanlı sindirim enzimleri hücreleri ve konsantrasyonu optimizasyonu üzerinde sert olabilir ve collagenase türü farklı tümör türleri için gerekli olabilir. Biz beş sindirim enzimleri bu collagenase III, bu çalışmada kullanılan Skuamöz hücreli tümörlerin sindirim için en iyi yöntem olduğunu belirleme önce göre.
Bu çalışmada kullanılan tümör modelleri HNSCC bağışıklık kaçırma eğitim mekanizmaları ve çeşitli terapiler preklinik değerlendirilmesi için özellikle yararlıdır. Biz daha önce B4B8 ve LY2 tümörler olup ve refrakter bağışıklık denetim noktası inhibitörü anti-PD-L120olduğunu gösterdi. Bu insan HNSCCs çoğunluğu ile tutarlıdır. Son klinik çalışmalar HNSCC hastaların % 15'den az anti-PD-1/PD-L1 terapi21' e,22,23,24,25duyarlı olduğunu gösterdi. Buna ek olarak, iyi HNSCCs olup26,27olduğunu kurulur. Yolları HNSCC radioresistance sorumlu hedefleme tedaviye yanıt güçlendirmeye yönelik önemli bir adımdır. Landmark RT yerel olarak gelişmiş HNSCC hastaların28yılında tek başına göre RT için önemli bir yararı cetuximab ilavesi ile genel sağkalım gösterdi Bonner vd. çalışma. Son veri orthotopic HNSCCs EphB4-Ephrin-B2 sinyal inhibisyon daha fazla tümör apoptosis teşvik ve tümör yayılması29,30inhibe RT veya cetuximab-RT yanıtı artırabilir göstermektedir. Buna ek olarak, RT rasyonel bağışıklık terapileri ile birleştirerek antitümör bağışıklık yanıtı çoğaltmak ve yerel tümör kontrolü ve uzak metastaz31kontrolünü geliştirmek. Biz son zamanlarda sonuçlar tümör ortadan kaldırılması ve immünolojik bellek32Tregs bağışıklık denetim noktası abluka ve RT ile birlikte hedef gösterdi. Gelecekteki çalışmaları HNSCC orthotopic modelleri istihdam daha iyi klinik tasarım bilgilendirmek ve tümör bağışıklık kaçırma ve tedaviye direnç mekanizmaları anlayış geliştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Hiçbiri
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase III | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | |
| DNase I | Worthington Biochemical Corp. | LS006328 | |
| Fc Block (CD16/32) | BD Biosciences | 553141 | Clone 2.4G2 |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no pheno red |
| Helois mass cytometer | Fluidigm | NA | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB-40234B | |
| MRI Scanner | Bruker | NA | 7.4 Tesla |
| RBC lysis buffer | BioLegend | 420301 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington Biochemical Corp. | LS002830 |
References
- Chaturvedi, A. K., et al. Worldwide trends in incidence rates for oral cavity and oropharyngeal cancers. Journal of Clinical Oncology. 31 (36), 4550-4559 (2013).
- Ang, K. K., Sturgis, E. M. Human papillomavirus as a marker of the natural history and response to therapy of head and neck squamous cell carcinoma. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 128-142 (2012).
- Amin, M. B., et al. The Eighth Edition AJCC Cancer Staging Manual: Continuing to build a bridge from a population-based to a more "personalized" approach to cancer staging. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (2), 93-99 (2017).
- Salley, J. J. Experimental carcinogenesis in the cheek pouch of the Syrian hamster. Journal of Dental Research. 33 (2), 253-262 (1954).
- Morris, A. L. Factors influencing experimental carcinogensis in the hamster cheek pouch. Journal of Dental Research. 40, 3-15 (1961).
- MacDonald, D. G. Comparison of epithelial dysplasia in hamster cheek pouch carcinogenesis and human oral mucosa. Journal of Oral Pathology & Medicine. 10 (3), 186-191 (1981).
- Hawkins, B. L., et al. 4NQO carcinogenesis: a mouse model of oral cavity squamous cell carcinoma. Head & Neck. 16 (5), 424-432 (1994).
- Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
- Vered, M., Yarom, N., Dayan, D. 4NQO oral carcinogenesis: animal models, molecular markers and future expectations. Oral Oncology. 41 (4), 337-339 (2005).
- Bornstein, S., et al. Smad4 loss in mice causes spontaneous head and neck cancer with increased genomic instability and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 119 (11), 3408-3419 (2009).
- Thomas, G. R., Chen, Z., Oechsli, M. N., Hendler, F. J., Van Waes, C. Decreased expression of CD80 is a marker for increased tumorigenicity in a new murine model of oral squamous-cell carcinoma. International Journal of Cancer. 82 (3), 377-384 (1999).
- Yuspa, S. H., Hawley-Nelson, P., Koehler, B., Stanley, J. R. A survey of transformation markers in differentiating epidermal cell lines in culture. Cancer Research. 40 (12), 4694-4703 (1980).
- Chen, Z., Smith, C. W., Kiel, D., Van Waes, C. Metastatic variants derived following in vivo tumor progression of an in vitro transformed squamous cell carcinoma line acquire a differential growth advantage requiring tumor-host interaction. Clinical & Experimental Metastasis. 15 (5), 527-537 (1997).
- Euhus, D. M., Hudd, C., LaRegina, M. C., Johnson, F. E.
- Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. NeuroImage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Dutta, S., et al. The relationship between tumour necrosis, tumour proliferation, local and systemic inflammation, microvessel density and survival in patients undergoing potentially curative resection of oesophageal adenocarcinoma. Britisch Journal of Cancer. 106 (4), 702-710 (2012).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research. 12 (4), 571-582 (2014).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
- Oweida, A., et al. Ionizing radiation sensitizes tumors to PD-L1 immune checkpoint blockade in orthotopic murine head and neck squamous cell carcinoma. OncoImmunology. 6 (10), e1356153 (2017).
- Ferris, R., et al. Further evaluations of nivolumab (nivo) versus investigator’s choice (IC) chemotherapy for recurrent or metastatic (R/M) squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN): CheckMate 141. Journal of Clinical Oncology. 34, (2016).
- Ferris, R. L., et al. Nivolumab for Recurrent Squamous-Cell Carcinoma of the Head and Neck. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1856-1867 (2016).
- Harrington, K. J., et al. Nivolumab versus standard, single-agent therapy of investigator's choice in recurrent or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck (CheckMate 141): health-related quality-of-life results from a randomised, phase 3 trial. The Lancet Oncology. 18 (8), 1104-1115 (2017).
- Kiyota, N., et al. A randomized, open-label, Phase III clinical trial of nivolumab vs. therapy of investigator's choice in recurrent squamous cell carcinoma of the head and neck: A subanalysis of Asian patients versus the global population in checkmate 141. Oral Oncology. 73, 138-146 (2017).
- Ling, D. C., Bakkenist, C. J., Ferris, R. L., Clump, D. A. Role of Immunotherapy in Head and Neck Cancer. Seminars in Radiation Oncology. 28 (1), 12-16 (2018).
- Perri, F., et al. Radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma: Biological bases and therapeutic implications. Head & Neck. 37 (5), 763-770 (2015).
- Yamamoto, V. N., Thylur, D. S., Bauschard, M., Schmale, I., Sinha, U. K. Overcoming radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 63, 44-51 (2016).
- Bonner, J. A., et al. Radiotherapy plus cetuximab for locoregionally advanced head and neck cancer: 5-year survival data from a phase 3 randomised trial, and relation between cetuximab-induced rash and survival. The Lancet Oncology. 11 (1), 21-28 (2010).
- Bhatia, S., et al. Inhibition of EphB4-Ephrin-B2 Signaling Enhances Response to Cetuximab-Radiation Therapy in Head and Neck Cancers. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4539-4550 (2018).
- Bhatia, S., et al. Enhancing radiosensitization in EphB4 receptor-expressing Head and Neck Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 6, 38792 (2016).
- Tang, C., et al. Combining radiation and immunotherapy: a new systemic therapy for solid tumors? Cancer Immunology Research. 2 (9), 831-838 (2014).
- Oweida, A., et al. Resistance to radiotherapy and PD-L1 blockade is mediated by TIM-3 upregulation and regulatory T-cell infiltration. Clinical Cancer Research. , (2018).
