Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Data-acquisitie en analyse in hersenstam evoked respons-Audiometrie bij muizen

Published: May 10, 2019 doi: 10.3791/59200
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 3, 4, 5, 5, 6, 1,7, 1, 1
1Experimental Neuropsychopharmacology, Federal Institute for Drugs and Medical Devices, 2KBRwyle GmbH, 3Cognitive Neurophysiology, Department of Psychiatry and Psychotherapy, Faculty of Medicine, University of Cologne, 4Molecular and Cellular Cognition, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 5Institute of Neurophysiology, Faculty of Medicine, University of Cologne, 6Federal Institute for Drugs and Medical Devices (BfArM), 7Thescon GmbH

Summary

Hersenstam Evoked Response audiometrie is een belangrijk hulpmiddel in de klinische neurofysiologie. Tegenwoordig is Brain stem Evoked Response audiometrie ook toegepast in de basiswetenschap en preklinische studies waarbij zowel farmacologische als genetische diermodellen betrokken zijn. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van hoe auditieve hersenstam reacties met succes kunnen worden opgenomen en geanalyseerd in muizen.

Abstract

Hersenstam Evoked Response audiometrie (BERA) is van centraal belang in de klinische neurofysiologie. Zoals andere Evoked potential (EP)-technieken, zoals visueel Evoked mogelijkheden (veps) of somatosensorische Evoked mogelijkheden (SEPS), worden de auditieve Evoked mogelijkheden (aeps) veroorzaakt door de repetitieve presentatie van identieke stimuli, de elektro-encefalografische (EEG) respons daarvan wordt vervolgens gemiddeld resulterend in uitgesproken positieve (p) en negatieve (n) afbuigingen. Bij de mens kunnen zowel de amplitude als de latentie van individuele pieken worden gebruikt om veranderingen in synchronisatie-en geleidings snelheid in de onderliggende neuronale circuits te karakteriseren. Belangrijk is dat AEPs ook wordt toegepast in de basis-en preklinische wetenschap om de auditieve functie in farmacologische en genetische diermodellen te identificeren en te karakteriseren. Nog meer, diermodellen in combinatie met farmacologische testen worden gebruikt om te onderzoeken op mogelijke voordelen bij de behandeling van Sensorineuraal gehoorverlies (bijv. leeftijd-of lawaai-geïnduceerde gehoor tekorten). Hier bieden we een gedetailleerde en integratieve beschrijving van het opnemen van auditieve hersenstam-Evoked Reacties (Abr's) in muizen met behulp van click en Tone-Burst applicatie. Een specifieke focus van dit protocol ligt op pre-experimentele dieren huis, anesthesie, ABR-opname, ABR-filterprocessen, geautomatiseerde, op wavelet gebaseerde amplitude-groei functie-analyse en latentie detectie.

Introduction

Een centraal aspect van hersen fysiologie is de mogelijkheid om milieu-informatie te verwerken die resulteert in verschillende intrinsieke of extrinsieke output, zoals leren, geheugen, emotionele reacties of motorische reacties. Verschillende experimentele en diagnostische benaderingen kunnen worden gebruikt om te karakteriseren de elektrofysiologische responsiviteit van individuele neuronale celtypen of clusters/ensembles van neuronen binnen een stimulus-gerelateerde neuronale circuits. Deze elektrofysiologische technieken beslaan verschillende spatiotemporele afmetingen op de micro-, meso-en macroscale1. Het micro schaalniveau omvat spanning en stroomtang benaderingen in verschillende Patch-clamp modi met, bijvoorbeeld, gekweekte of acuut gezien neuronen1. Deze in-vitro technieken maken de karakterisering van individuele huidige entiteiten en hun farmacologische modulatie2,3mogelijk. Een essentieel nadeel is echter het gebrek aan systemische informatie met betrekking tot de integratie en verwerking van micro-en macrocircuitry informatie. Deze stoornis wordt gedeeltelijk overwonnen door in vitro technieken van de MESOSCHAAL, zoals multi elektrode arrays die gelijktijdige extracellulaire multi elektrode opnames mogelijk maken, niet alleen in gekweekte neuronen maar ook in acute hersen sneden4, 5. overwegende dat micro circuits in de hersen segmenten in een bepaalde mate kunnen worden bewaard (bijvoorbeeld in de hippocampus), lange-afstand interconnecties zijn meestal verloren6. Uiteindelijk, om de functionele onderlinge verbindingen binnen neuronale circuits te bestuderen, zijn systemische in vivo elektrofysiologische technieken op de macro schaal de methode van keuze7. Deze benaderingen omvatten onder andere oppervlakte (epidurale) en diepe (intracerebrale) EEG-opnames die worden uitgevoerd in zowel mens als diermodellen1. EEG-signalen zijn voornamelijk gebaseerd op de gesynchroniseerde synaptische input op piramidale neuronen in verschillende corticale lagen die kunnen worden remmende of excitatory in hoofdsom, ondanks de algemene overwicht van excitatory input8. Bij synchronisatie, excitatory postsynaptisch potentiële-gebaseerde verschuivingen in extracellulaire elektrische velden worden samengevat om een signaal van voldoende sterkte te worden opgenomen op de hoofdhuid met behulp van oppervlakte-elektroden te vormen. Met name een detecteerbare hoofdhuid opname van een individuele elektrode vereist de activiteit van 10000 van piramidale neuronen en een complex armamentarium van technische apparaten en verwerkingshulpmiddelen, waaronder een versterker, filterprocessen (low-pass filter, High-Pass filter, notch filter), en elektroden met specifieke conductor eigenschappen.

Bij de meeste experimentele diersoorten (d.w.z. muizen en ratten) is de mens gebaseerde hoofdhuid EEG-aanpak technisch niet toepasbaar, omdat het signaal dat door de onderliggende cortex wordt gegenereerd te zwak is vanwege het beperkte aantal gesynchroniseerde piramidale neuronen9, 10,11. Bij knaagdieren, oppervlakte (hoofdhuid) elektroden of subdermale elektroden zijn dus ernstig verontreinigd door elektrocardiogram en overwegend elektromyogramartefacten die kwalitatief hoogwaardige EEG opnames onmogelijk9,11maken, 12. bij het gebruik van de vrij bewegende muizen en ratten met een unanesthetized is het daarom verplicht om rechtstreeks op te nemen van de cortex via epidurale elektroden of van de diepe, intracerebrale structuren om de directe fysieke verbinding van de sensing tip te waarborgen van de lood/geïmplanteerde elektrode aan de signaal genererende neuronale celclusters. Deze EEG benaderingen kunnen worden uitgevoerd hetzij in een fixatie tethered systeem Setup of met behulp van de niet-beteugeling implanteerbare EEG radio telemetrie aanpak9,10,11. Beide technieken hebben hun voor-en nadelen en kunnen een waardevolle benadering zijn in de kwalitatieve en kwantitatieve karakterisering van epileptische susceptibiliteit/epileptische activiteit, circadiane ritmische, slaap architectuur, oscillerende activiteit en synchronisatie, inclusief tijdfrequentieanalyse, bron analyse, etc.9,10,13,14,15,16,17.

Terwijl Tethering-systemen en radiotelemetriegegevens EEG-opnames toestaan onder respectievelijk fixatie-/semifixatie-of niet-fixatie omstandigheden, komen gerelateerde experimentele omstandigheden niet overeen met de vereisten voor ABR-opnames. De laatstgenoemde vraag naar gedefinieerde akoestische stimuli die herhaaldelijk in de loop van de tijd worden gepresenteerd met gedefinieerde posities van een luidspreker en een experimenteel dier en gecontroleerde geluidsdrukniveaus (Spl's). Dit kan worden bereikt door middel van hoofd fixatie onder fixeren omstandigheden of na anesthesie18,19. Om de experimentele stress te verminderen, worden dieren normaalgesproken verdoving tijdens ABR-experimenten, maar het moet worden beschouwd als anesthesie kan interfereren met ABrs19,20.

Als een algemeen kenmerk is het EEG opgebouwd uit verschillende frequenties in een spanningsbereik van 50-100 μV. achtergrond frequenties en amplitudes zijn sterk afhankelijk van de fysiologische toestand van het experimentele dier. In de wakker staat overheerderen bèta (β) en gamma (γ) frequenties met een lagere amplitude. Wanneer dieren slaperig worden of in slaap vallen, ontstaan Alfa (α), theta (θ) en Delta (δ) frequenties, met verhoogde EEG-amplitude21. Zodra een sensorisch kanaal (bijv. de akoestische route) wordt gestimuleerd, wordt informatieverspreiding gemedieerd via Neuronale activiteit via het perifere en centrale zenuwstelsel. Dergelijke sensorische (bijv. akoestische) stimulatie activeert zogenaamde EPs of opgeroepen reacties. Met name, event-gerelateerde mogelijkheden (Erps) zijn veel lager in amplitude dan de EEG (dat wil zeggen, een paar dBμV alleen). Zo zou elke individuele ERP op basis van een enkele stimulans verloren gaan tegen de achtergrond van de EEG met hogere amplitude. Daarom vereist een registratie van een ERP de repetitieve toepassing van identieke stimuli (bijv. klikken in ABR-opnames) en daaropvolgende gemiddelden om eventuele EEG-achtergrondactiviteit en-artefacten te elimineren. Als ABR opnames worden gedaan in verdoofd dieren, het is gemakkelijk om te gebruiken subdermale elektroden hier.

In hoofdzaak zijn AEPs korte-latency EPs, die normaalgesproken gerelateerd zijn aan ABRs of BERA, en verdere, later beginnende potentialen zoals midlatency EPs (midlatency Responses [MLR]) en Long-latency EPs22. Belangrijk is dat verstoring van de informatieverwerking van de auditieve informatie vaak een centraal kenmerk is van neuropsychiatrische ziekten (demyelinerende ziekten, schizofrenie, enz.) en geassocieerd met AEP-wijzigingen23,24 ,25. Terwijl gedrags onderzoeken alleen kunnen onthullen functionele bijzondere waardevermindering, AEP studies toestaan voor nauwkeurige spatiotemporale analyse van auditieve dysfunctie gerelateerd aan specifieke neuroanatomische structuren26.

ABRs als vroege, korte-latentie akoestisch EPs worden normaalgesproken gedetecteerd bij matige tot hoge-intensieve Klik toepassing en er kunnen maximaal zeven ABR-pieken (WI-wVII) optreden. De belangrijkste golven (Wi-wV) zijn gerelateerd aan de volgende neuroanatomische structuren: Wi tot de gehoorzenuw (distale portie, binnen het binnenoor); WII naar de cochlear Nucleus (proximale deel van de gehoorzenuw, hersenstam beëindiging); WIII van het superieure olivary complex (SOC); WIV op het laterale lemniscus (LL); WV tot de beëindiging van het laterale lemniscus (LL) binnen het inferieure colliculus (IC) op de contralaterale zijde27 (aanvullend figuur 1). Opgemerkt moet worden dat WII-wV waarschijnlijk meer dan één anatomische structuur heeft van de opgaande auditieve route die aan hen bijdraagt. Met name de precieze correlatie van pieken en onderliggende structuren van het gehoorkanaal is nog steeds niet volledig verduidelijkt.

In de Audiologie kunnen abr's worden gebruikt als screenings-en diagnose hulpmiddel en voor chirurgische monitoring28,29. Het is van het grootste belang voor de identificatie van dysacusis, hypacusis en anacusis (bijv. in leeftijdsgebonden gehoorverlies, lawaai-geïnduceerde gehoorverlies, metabole en aangeboren gehoorverlies, en asymmetrisch gehoorverlies en gehoor tekorten als gevolg van misvormingen of misvormingen, verwondingen en Neoplasmata)28. Abr's zijn ook relevant als screeningstest voor hyperactieve, intellectueel gehandicapte kinderen of voor andere kinderen die niet zouden kunnen reageren op conventionele audiometrie (bijv. bij neurologische/psychiatrische aandoeningen zoals ADHD, MS, Autisme enz.29 , 30) en in de ontwikkeling en chirurgische montage van cochleaire implantaten28. Ten slotte kan ABrs waardevol inzicht bieden in de potentiële ototoxische neveneffecten van neuropsychopharmaceuticals, zoals anti-epileptica31,32.

De waarde van de vertaling van neurofysiologische kennis, verkregen uit farmacologische of transgene muismodellen aan mensen, is aangetoond in talrijke instellingen, met name op het niveau van Erp's in auditieve paradigma's bij muizen en ratten33, 34,35. Nieuw inzicht in veranderde vroege AEPs en bijbehorende veranderingen in auditieve informatieverwerking bij muizen en ratten kan dus worden vertaald naar mensen en is van centraal belang bij de karakterisering en endophenotyping van auditieve, neurologische en neuropsychiatrische ziekten in de toekomst. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van hoe Abr's met succes kunnen worden geregistreerd en geanalyseerd in muizen voor elementaire wetenschappelijke, toxicologische en farmacologische doeleinden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dier procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Duitse Raad voor Dierverzorging en alle protocollen werden goedgekeurd door het lokale institutionele en nationale Comité voor de verzorging van dieren (Landesamt für Natur, Umwelt, und Verbraucherschutz, staat Kantoor van Noordrijn-Westfalen, departement natuur, milieu en consumerisme [LANUV NRW], Duitsland). De auteurs verklaren verder dat alle dier experimenten zijn uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (NIH Publications No. 80-23) herziene 1996 of de Britse dieren (wetenschappelijke procedures) Act 1986 en bijbehorende richtsnoeren, of de richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschappen van 24 november 1986 (86/609/EEG) en 22 september 2010 (2010/63/EU). Er werd specifieke inspanning geleverd om het aantal gebruikte dieren en hun lijden te minimaliseren (3R [vervanging, reductie, en verfijning] strategie).

1. proefdieren

  1. Selectie van proefdieren en diersoorten
    1. Voer ABR-studies uit bij knaagdieren/knaagdieren (d.w.z. muizen of ratten) die voldoen aan de vereisten van homologie, isomorfisme en voorspelbaarheid met betrekking tot een specifieke menselijke ziekte. Dit is van specifiek belang in termen van fundamentele aspecten in translationele neurowetenschappen.
      Opmerking: Houd er rekening mee dat beschikbare overige muis-en rat stammen verschillen in fysiologische en pathofysiologische kenmerken kunnen vertonen36,37,38. Bij de experimentele planning moet rekening worden gehouden met deze specifieke kenmerken van de muis/rat-lijn.
    2. Overweeg muis-en Rat-Strain-specifieke veranderingen in de Fysiologie en farmacologie die een impact kunnen hebben op elektrofysiologische experimenten (bijv. veranderde verdovings gevoeligheden, circadiane ritmische, [audiogene] convulsie gevoeligheid, leeftijd, en genetische achtergrond)39,40,41,42.
    3. De genderspecifieke stratificatie in het studie ontwerp opnemen. Vergeet niet dat de oestrische cyclus kan ernstige invloed op verdoving gevoeligheid, centrale ritmisch, circadiane afhankelijkheid, en inbeslagneming activiteit (auditieve aanvallen) en sensorische (auditieve) informatieverwerking43,44 , 45. Voer dus een genderspecifieke analyse uit.
      Opmerking: beperken tot mannelijke muizen als de financiële en experimentele capaciteit beperkt is, hoewel verschillende neurofysiologische parameters van normaal fietsen vrouwtjes lijken niet te vertonen verhoogde variabiliteit in vergelijking met mannetjes46.
  2. Huisvesting en hantering van dieren
    1. Huis muizen of ratten in een individueel geventileerde kooi in een dieren faciliteit.
    2. Verplaats de proefdieren van de dieren faciliteit naar geventileerde kasten die zich in speciale laboratorium ruimten bevinden die bestemd zijn voor anesthesie, ABR-elektrode plaatsing en ABR-opnames.
    3. Zorg ervoor dat de dieren zijn ondergebracht in een geventileerde kast onder standaard omgevingscondities (d.w.z. met een temperatuur van 21 ± 2 °C, 50%-60% relatieve vochtigheid en een conventionele licht/donker cyclus van 12/12 uur). Laat de dieren te acclimatiseren en aan te passen aan deze circadiane patroon voor ten minste 14 dagen voorafgaand aan de daaropvolgende experimenten.
    4. Gebruik helder polycarbonaat kooien type II (26,7 cm x 20,7 cm x 14,0 cm, een oppervlakte van 410 cm2) voor het huisvesten van muizen in groepen van 3-4 en gebruik heldere polycarbonaat kooien type III (42,5 cm x 26,6 cm x 18,5 cm, een oppervlakte van 800 cm2) voor ratten. Geef ad libitum toegang tot drinkwater en standaard voedsel pellets.
    5. Vermijd scheiding/isolatie van de proefdieren vóór en na ABR-opnames, omdat isolatie ernstige stress kan uitoefenen die de experimentele resultaten beïnvloedt. Plaats de dieren dus terug in hun huis kooi na anesthesie, ABR-elektrode plaatsing en ABR-opnames.
    6. Breng geen open huisvestings condities aan omdat ze onderhevig zijn aan een verscheidenheid aan experimentele nadelen, met name in auditieve studies. Geventileerde kasten, in plaats daarvan, beschermen tegen akoestische stress vóór en tussen experimentele gehoor procedures die anders kunnen leiden tot Sensorineuraal gehoorverlies (bijv. lawaai-geïnduceerde gehoorverlies) en dus de resultaten beïnvloeden.
    7. Gebruik muis-en rat-specifieke sanitaire, anestheticum, en technische apparatuur, zodat noch muizen noch ratten de aanwezigheid van elkaar kunnen voelen als wederzijdse zintuiglijke perceptie van rivaliserende soorten kan aanleiding geven tot vermijdbare verstorende factoren in de studies.

2. muis anesthesie

  1. Uitvoeren van anesthesie met behulp van injecteerbare anesthetica. Bereid een combinatie van ketamine hydrochloride (knaagdier dosering: 100 mg/kg) en xylazine hydrochloride (knaagdier dosering: 10 mg/kg) in 0,9% NaCl of Ringer oplossing en Injecteer het dier intraperitoneaal op basis van het lichaamsgewicht.
    Opmerking: inhalatie narcose via Isofluraan wordt niet aanbevolen, omdat de ABR-procedure normaalgesproken een geluiddempende kast en Faraday-kooi vereist, wat leidt tot ruimtelijke beperkingen binnen de opname-instelling. Hoewel veel anesthetica handelen op het NMDA-systeem en uiteraard de ABR-opnameresultaten beïnvloeden, wordt een niet-anesthetische fixatie benadering in ABR-opnames niet aanbevolen omdat fixatie procedures onder bewustzijn dramatische stress veroorzaken voor het dier, met ernstige daaropvolgende artefact vorming in Abr's.
  2. Observeer de dieren zorgvuldig voor de diepte van de anesthesie door het uitvoeren van een staart knijpen, voet knijpen, en monitoring ademhaling tarief (Muizen: 150-220 Adems/min). Controleren op mogelijke proestend en indien nodig tegengaan.
    Opmerking: verschillende muis lijnen of farmacologische Muismodellen kunnen verschillende gevoeligheden vertonen anesthesie. Hetzelfde geldt voor Mutante Muismodellen. Endotracheale intubatie is geen must in deze experimentele setting en wordt niet aanbevolen. Aangezien intubatie het risico op trauma van de luchtpijp en infectie verhoogt, is het voordeel/risico van Endotracheale intubatie tijdens de ABR-procedure negatief.

3. algemene aspecten van perianesthetische regelingen en instrumentatie

  1. Breng extra warmte aan tijdens en na ABR-opnames met behulp van een homeothermic verwarmings deken om de lichaams kerntemperatuur van het dier te behouden. Houd deze laatste bij 36,5-38,0 °C (98.6-100.4 °F).
    Opmerking: hypothermie is een risicofactor bij kleine knaagdieren vanwege hun hoge verhouding van lichaamsoppervlak (lichaamsoppervlak van de muis = 10,5 x (gewicht in g)2/3; lichaamsoppervlak rat = 10,5 x (gewicht in g)2/3) aan het lichaams volume.
  2. Bedek de ogen van het dier met een op petroleum gebaseerde kunstmatige scheur zalf of 5% dexpanthenol gedurende het gehele ABR-opnameproces om de uitdroging van de cornea te voorkomen. Ga door met deze procedure totdat de knipperende reflex volledig is hersteld.
  3. Steriliseren de experimentele instrumenten (Zie de tabel van de materialen) met behulp van een autoclaaf of ontsmettingsmiddelen.
    Opmerking: het gebruik van een warmtegebaseerde chirurgische instrument sterilisator met glas parels wordt aanbevolen.
  4. Gebruik voor de exacte plaatsing van de ABR-elektrode een binoculaire chirurgische vergrotings Microscoop met een koude lichtbron voor de intense verlichting via flexibele of zelfdragende beweegbare lichtgeleiders.
  5. Gebruik een schone laboratoriumcoat, een gelaatsmasker, een hoofddeksel en steriele handschoenen tijdens experimentele dier hantering en experimenten.
    Opmerking: optimale instrumenten en benodigdheden kunnen variëren tussen laboratoria en moeten voldoen aan labspecifieke en institutionele normen.

4. ABR-opnames

Opmerking: het hier beschreven protocol is gebaseerd op een in de handel verkrijgbaar ABR-systeem voor mono-en binaurale opnames. Belangrijk is dat de wetenschappelijke vraag die moet worden behandeld, voldoet aan de technische specificaties van het gebruikte ABR-systeem. ABR-analyse van binaurale opnames, bijvoorbeeld, kan worden gebruikt om de laterale codering van auditieve stimuli in het gehoor traject te onderzoeken en om perifere laterale asymmetrie in neuropsychiatrische ziekten te bestuderen.

  1. Voer op elke dag van de opname een kalibratie van de stimulatie frequenties uit door een microfoon te plaatsen die is aangesloten op een voorversterker en het verwerkingssysteem (Zie de tabel met materialen) in de geluiddempende ligcel op de locatie met de juiste Oriëntatie waar het experimentele muriene oor wordt gepositioneerd.
    1. Schakel de voorversterker die op de microfoon is aangesloten ten minste 5 minuten vóór de kalibratie in om de evenwichts regeling van het systeem mogelijk te maken.
    2. Zet de oscilloscoop aan.
    3. Plaats de microfoon aangesloten op een voorversterker in de geluiddempende kast om het experimentele muriene oor na te bootsen.
    4. Open de commercieel verkrijgbare verwerkings-en acquisitie software (Zie de tabel met materialen).
    5. Selecteer het kalibratie Cal200K bestand in de software om de kalibratie-configuratiemodus te activeren en kies parameters volgens de experimentele omstandigheden.
    6. Gebruik het processor systeem om de kalibratieprocedure uit te voeren. Zorg ervoor dat de technische specificaties van de microfoon en luidspreker in termen van SPL limieten, frequentiebereik en distributie harmoniëren.
    7. Selecteer en start het vooraf gedefinieerde Click stimulatie protocol.
    8. Voer een enkele klik SPL (bij voorkeur, de maximale SPL) om te controleren of het spectrum van geluid stimuli zoals geanalyseerd door online Fast Fourier transformatie (FFT) van de oscilloscoop voldoet aan de eisen (substantieel energiebereik).
    9. Selecteer en start het vooraf gedefinieerde Tone-Burst-stimulatie protocol binnen het bereik van de interesse (bijv. 1-42 kHz).
    10. Bevestig het frequentiespectrum van de opgenomen akoestische test stimuli met behulp van een oscilloscoop en online FFT.
      Opmerking: de dagelijkse kalibratie van het systeem en de stimulatie frequenties is noodzakelijk om te garanderen dat de stimulatie frequenties en Spl's binnen acceptabele werk bereiken vallen.
  2. Plaats de verdoofd Mouse in een geluiddempende kast bekleed met akoestisch schuim.
    Opmerking: de gehele ligplaat moet worden bedekt door een kooi van Faraday (op maat gemaakt metaal of een commercieel) om de ABR-opnames te beschermen tegen externe elektrische interferentie en deze te beveiligen tegen lawaai.
  3. Voor de opname van mono-hersenstam-Evoked auditieve potentials, plaatst u subdermale roestvast stalen elektroden op de vertex, axiaal van de vormige (positieve [+] elektrode) en ventrolaterale van de rechter of linker Pinna (negatieve [-] elektrode), afhankelijk van de te meten oor. Voor binaurale opnames, plaats de negatieve elektroden aan de rechter en linker pinnae. Plaats de aardelektrode op de heup van het dier (aanvullend figuur 1).
    1. Voorafgaand aan het inbrengen, vormen een haak vorm aan de punt van de roestvrijstalen elektrode, zodat de subdermale fixatie van de elektroden is gegarandeerd47.
  4. Voer vóór elke opname impedantie metingen uit van alle elektroden om de juiste elektrode positionering/geleidbaarheid te controleren. Gebruik de knop voor het controleren van de impedantie op de hoofdfase met vier kanalen om elk elektrode impedantie niveau te controleren.
    Opmerking: de impedantie moet minder zijn dan 5 kΩ.
  5. Neem ABRs onder vrije veldomstandigheden op met behulp van een enkele luidspreker (frequentie bandbreedte, bijvoorbeeld bij 1-65 kHz), geplaatst 10 cm tegenover het rostrum van de dieren (de leidende rand van de luidspreker loodrecht op de interaurale as van de muis). Zorg ervoor dat de positie van de muis hoofd/muis oren is die van de kalibratie microfoon, afhankelijk van de gekozen specifieke afstand tussen de luidspreker en de microfoon tijdens de kalibratie.
    Opmerking: in plaats van vrije veldomstandigheden kan ook oorslang worden gebruikt. Er zijn echter speciale voorzorgsmaatregelen en tests nodig om de Spl's in deze instellingen te bepalen.
  6. Program meer de stimulus-protocollen voor de clicks en Tone-uitbarstingen met behulp van zelf-geprogrammeerde of commercieel verkrijgbare software (Zie de tabel met materialen). De hieronder vermelde individuele stimulerings parameters moeten worden toegevoegd aan de gerelateerde grafische gebruikersinterface.
    1. Begin met de configuratie van de Click stimulus-entiteit (d.w.z. een 100 μs duur stimulans met wisselende polariteit [schakelen tussen condensatie en verdunning] en de gedefinieerde substantiële energie. Gebruik deze stimulus-entiteit om te analyseren en te bepalen Klik drempels, ABR symmetrie van het linker-en rechteroor, ABR W (I-IV) amplitudes, en W (I-IV) latenties later.
    2. Start de software en gebruik het configuratievenster om de Click stimulus parameters toe te voegen. Klik op uitvoeren om het protocol uit te voeren.
    3. Ga verder met de configuratie van de tweede stimulus-entiteit, dat is een 4,5 MS Toon Burst (voorbijgaande sinusoïdale puls) van afwisselend polariteit met Hann envelop stijgen en dalen van 1,5 MS elk (Gate/oprit tijdsduur). Overweeg een minimale Tone Burst-duur van 3 MS, met name voor laagfrequente Toon uitbarstingen. Gebruik deze stimulans om frequentiespecifieke gehoor drempels in alle genotypes te analyseren en te identificeren.
    4. Net als bij stap 4.6.2, gebruikt u de configuratievenster om toe te voegen Tone Burst stimulus parameters en klik op uitvoeren om het protocol uit te voeren (zoals aangegeven door de fabrikant48).
    5. Voor Tone Burst-studies, programmeer het juiste frequentiebereik dat moet worden getest, afhankelijk van de wetenschappelijke vraag (bijvoorbeeld van 1-42 kHz in stappen van 6 kHz). Zorg ervoor dat de frequentiebereiken die moeten worden toegepast, voldoen aan de technische mogelijkheden van de luidspreker (in dit geval een magnetische luidspreker met meerdere velden met een frequentie bandbreedte van 1-65 kHz voor vrije of gesloten veldomstandigheden).
    6. Voor het gemiddelde, stel het aantal sequentiële akoestische stimuli (klikken of Toon uitbarstingen), bijvoorbeeld, op 300x met een snelheid van 20 Hz.
    7. Verhoog de Spl's in stappen van 5 dB voor klikken en 10 dB stappen voor Toon uitbarstingen, beginnend vanaf 0 dB tot 90 dB (toenemende SPL-modus).
      Opmerking: zowel de toenemende en afnemende SPL-modi zijn beschreven in de literatuur. De SPL-stapgrootte kan worden aangepast als gevolg van wetenschappelijke vragen.
  7. Bepaal een ABR-gegevens acquisitie duur van 25 MS, beginnend met een baseline periode van 5 MS voorafgaand aan de individuele akoestische stimulus-aanvang (pre-ABR baseline) en meer dan een ABR-sectie van 10 MS met een andere baseline van 10 MS (post-ABR baseline) (aanvullend figuur 1 ).
  8. Pas een geschikte bemonsteringsfrequentie toe voor ABR-gegevensverzameling (bijv. 24,4 kHz) en band pass-filter (High Pass: 300 Hz, low pass: 5 kHz) met een 6-polig Butterworth-filter. Activeer indien nodig het Inkeping-filter.
    Opmerking: de bemonsteringsfrequentie en filterkenmerken kunnen worden aangepast als gevolg van experimentele vereisten.
  9. Breng de resulterende bioelektrische signalen van de subdermale elektroden over naar een kopfase en ga verder naar een voorversterker met passende versterking (bijv. 20-voudig).
  10. Gebruik een specifieke ABR-systeemverwerkings software om de controle van de luidsprekers en ABR-acquisitie, verwerking, Middelings-en gegevensbeheer te coördineren.
  11. Probeer de volledige ABR-protocollen uit te voeren (voor de Click-en Tone Burst-opgeroepen gehoor drempels, piek amplitude en piek latentie-analyse, enz.) binnen ongeveer 45 min. Dit komt overeen met de tijd van diepe narcose met behulp van 100/10 mg ketamine/xylazine intraperitoneally.
  12. Zorg ervoor dat de kalibratie, programmering/aanpassingen voor stimulus presentatie en overname, filterinstellingen, etc. werken zoals verwacht voorafgaand aan het verdovingsmiddel van het dier en het uitvoeren van de werkelijke opname.

5. ABR-analyse

  1. Click-en Tone Burst-Evoked ABR-gehoor drempelwaarde analyse
    1. Voer automatische drempel detectie uit op basis van eerdere publicaties om mogelijke inconsistenties in de ABR-drempel bepaling te voorkomen door visuele inspectie/raming49,50,51,52.
    2. Definieer drie verschillende tijdvensters (TWs) om de signaal-ruis verhouding (SNR) te berekenen: TW1 (0-5 MS), TW2 (5-15 MS) en TW3 (15-25 MS) (aanvullende figuur 1).
    3. Bereken de standaarddeviatie van de ruis van de baseline binnen de twee verschillende TWs (d.w.z. TW1 en TW3) waar geen aeps wordt waargenomen. Deze berekening kan worden uitgevoerd met behulp van zelf-geprogrammeerde software.
    4. Bereken voor elke SPL-meting binnen een ABR-record zowel het gemiddelde als de standaarddeviatie voor de samengevoegde gegevens van TW1 en TW3.
    5. Reset alle opname monsters afzonderlijk door het corresponderende berekende gemiddelde om een DC-offset te verwijderen.
    6. Voor de bepaling van de gehoor drempel, identificeert u de laagste SPL (dB) waarbij ten minste één Golf amplitude (WI-wIV) in het ABR-responstijd venster (TW2) de viervoudige van de eerder berekende standaarddeviatie overschreed.
      Opmerking: als er geen ABR-Golf werd gedetecteerd voor de Click-en frequentiedrempelwaarde analyse bij de maximale SPL, wordt een nominaal drempelniveau van 100dB toegewezen aan het oor.
  2. ABR Golf amplitude en Wave latency analyse
    1. Voer een op wavelet gebaseerde benadering uit met de Mexican Hat wavelet om de temporele sequentiële schikking van positieve (p) golven (pieken) en de negatieve (n) golven (kuilen) te bepalen met behulp van een standaard wavelet door de continue wavelet Transform (CWT)-gebaseerde patroon-matching-algoritme52 (aanvullend figuur 1).
      1. Wiskundig gezien wordt de CWT als volgt weergegeven53.
        Equation
        Hier, s (t) is het signaal, a is de schaal, b is de vertaling, ψ(t) is de moeder wavelet, ψa, b(t) is de geschaalde en vertaalde wavelet, en C is de 2D matrix van Wavelet coëfficiënten.
    2. Gebruik in eerste instantie de 55-dB-meting van elke ABR-run om de beste parameters te identificeren voor elke golf die moet worden doorgegeven aan de CWT, wat resulteert in drie klassen: schaal 0,5-4 voor alle n-Waves, 0,5-6 voor alle p-Waves en 0,5-12 voor WIV omdat dit de breedste Golf binnen de samples.
      Opmerking: de 55 dB SPL werd gekozen omdat golven over het algemeen het meest prominent aanwezig zijn en betrouwbaar kunnen worden gedetecteerd.
    3. Bewijs alle klassen om op betrouwbare wijze de juiste temporele collocatie van WI-wIV binnen alle 55 dB metingen te detecteren.
    4. Om te bepalen ABR WI-wIV in de nauwkeurige temporele volgorde binnen de 55 dB meting, p-pieken en n-pieken (putten) worden geïdentificeerd in een vaste volgorde met behulp van relatieve posities van eerder geïdentificeerde pieken om te beperken van de tijdvenster van daaropvolgende scans.
    5. Zodra alle negen pieken zijn geïdentificeerd op 55 dB, gebruikt u gerelateerde waarden als uitgangspunten voor het temporele Zoek frame voor de aangrenzende geluidsdruk metingen (50 dB en 60 dB) voordat de pieken 1-9 herhaald wordt.
    6. Bepaal op deze manier de p-en n-pieken van alle dB-niveaus (55-0 dB en 60-90 dB) indien mogelijk. Zodra een p-en n-piek niet meer wordt geïdentificeerd door de wavelet-analyse, wordt de temporele regeling bepaald door de temporele offset van de piek te berekenen aan een andere piek die in het vorige dB-niveau is geïdentificeerd.
    7. Het toepassen van de temporele verschuiving op pieken naar een andere p-en n-piek binnen het huidige decibel niveau resulteert in een maximum van acht bepaalde tijdelijke posities voor de ongedefinieerde pieken waarvan het gemiddelde wordt genomen als de dichtstbijzijnde benadering.
    8. Voor het evalueren van de amplitude groei functie en latentie vergelijking van alle golven (WI-wIV), karakteriseren de maximale amplituden en gemiddelde latenties van elk van de p-pieken binnen het tijdsbestek van de gerelateerde n-pieken.
    9. Controleer daarna alle resultaten op basis van het zelf geprogrammeerde automatische wavelet-gereedschap en sluit, indien nodig, individuele ABR-runs uit van de statistieken als ze niet voldoen aan de strenge criteria voor inclusie/kwaliteit.
      Opmerking: in zowel geautomatiseerde analyse als visuele inspectie van Abr's wordt een dubbelblinde aanpak aanbevolen.

6. postoperatieve zorg en POSTABR-behandeling

  1. Houd de dieren continu in de gaten totdat ze het bewustzijn hebben herwonnen en in staat zijn borstbeen recumbency te handhaven.
  2. Retourneer geen dier dat ABR-opnames heeft ondergaan aan het gezelschap van andere dieren totdat het volledig is hersteld.
  3. Injecteer carprofen (muis: 1x 5-10 mg/kg, subcutaan; rat: 1x 2,5-5,0 mg/kg, subcutaan) voor behandeling na operatieve pijn.
    Opmerking: langdurige pijnbehandeling is niet vereist, omdat ABR-opname-elektroden subcutaan worden ingebracht.
  4. Postoperatief, voer bevochtigde pellets om de voedselopname te vergemakkelijken. Zorgvuldig observeren van voedsel (~ 15 g/100 g lichaamsgewicht/dag; ~ 5 g/24 h) en water (~ 15 mL/100 g lichaamsgewicht/dag; ~ 5 mL/24 h) verbruik.
  5. Houd de dieren nauwlettend in de gaten voor de terugkeer van hun normale houdingen en gedrag.
    Opmerking: systemische toediening van antibiotica zoals enrofloxacine of trimethoprim-sulfonamide wordt hier niet aanbevolen, aangezien plaatsing van de subdermale elektrode slechts minimale invasiviteit heeft. Toepassing van antibiotica moet worden beperkt, tenzij er tekenen van lokale of gegeneraliseerde ontsteking optreden.
  6. Follow-up postexperimenteel herstel na ABR-opnames door het lichaamsgewicht van het dier te beheersen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Click-and-tone burst-opgeroepen ABR-opnames kunnen worden gebruikt om gehoor drempel verschillen, amplitude groei functie en latentie vergelijking te evalueren. Click-Evoked Abr's in de SPL-stijgend modus worden afgebeeld in afbeelding 1 voor besturingselementen en twee voorbeeldige Mutante muis lijnen die een tekort hebben aan de cav3,2 T-type voltage-gated CA2 + kanaal (d.w.z. cav3,2+/- en ca v3,2 null mutanten [CAv3,2-/-]). Zoals hierboven uiteengezet, wordt in het algemeen een genderspecifiek onderzoek aanbevolen, vanwege geslachtsspecifieke verschillen in auditieve parameters bij mensen54,55 en muizen56,57. ABRs naar Free-Field Click (0,1 MS) en Tone Burst (1 – 42 kHz in stappen van 6 kHz, 4,5 ms in totaal met een aanlooptijd van 1,5 MS) akoestische stimuli werden opgenomen zoals beschreven in het protocol. Merk op dat de vertex-positieve potentialen worden uitgezet als opwaartse afbuigingen zoals afgebeeld in representatieve Click-Evoked opnames voor vrouwelijke CAv3,2+/+ (Figuur 1a), CAv3,2+/- (Figuur 1b ) en CAv3,2-/- muizen (figuur 1c). In deze setting suggereerden representatieve Abr's bij vrouwtjes een verhoogde door Click opgeroepen ABR-gehoor drempel en veranderde amplitude groei functie bij vrouwelijke CAv3,2-/- muizen in vergelijking met CAv3,2+/+ en CAv 3,2+/- dieren. Dezelfde neiging werd waargenomen voor mannen die een verhoogde Click-Evoked ABR drempels en verminderde amplituden in CAv2,3-/- vergeleken met besturingselementen en heterozygoot CAv3,2+/- muizen gesuggereerd. Voorbeeldige Tone Burst-Evoked Abr's zijn afgebeeld in Figuur 2 voor vrouwelijke cav3,2+/+,CA v3,2+/-en CAv3,3-/- muizen (alle dieren waren 20 weken oud).

Als eerste stap bij het analyseren van de algemene hoorprestaties werden door Click-Evoked Abr's voor verschillende Spl's (0 – 90 dB) onderzocht met behulp van het geautomatiseerde ABR-drempel detectiesysteem zoals beschreven in punt 5 van het Protocol (Figuur 3). De geanalyseerde dieren waren leeftijdsgebonden omdat veroudering een dramatische impact kan hebben op perceptief gehoorverlies58,59. Vervolgens werden mogelijke veranderingen in ABR-drempelniveaus opgeroepen door verschillende Tone Burst-frequenties (1 – 42 kHz, Figuur 4) geanalyseerd. In de voorbeeldige muis lijnen, CAv2,3+/- en CAv3,2-/- vertoonden de toegenomen Click-en Tone Burst-gerelateerde gehoor drempels vergeleken met controles (alle dieren waren 20 weken oud).

Met behulp van de op wavelet gebaseerde benadering die hierboven is beschreven, zijn de groei functie voor de ABR-amplitude van de Click-Evoked en de ABR-Waveform-latentie analyse uitgevoerd (respectievelijkFig . 5 en Fig. 6). De laatste geeft inzicht in de mogelijke spatiotemporele invloed van het gen van belang op auditieve informatieverwerking binnen het binnenoor en de hersenstam.

Figure 1
Figuur 1: Click-Evoked ABRs in Controls en Mutant muizen (CAv3,2+/-, CAv3,2-/-). Representatieve abr's verkregen uit (a) CAv3,2+/+, (B) CAv3,2+/-, en (C) CAv3,2-/- vrouwelijke muizen bij Klik stimulatie in de toenemende spl-modus (van 0 – 90 dB met 5 dB SPL-stappen). Voor het gemiddelde werd elke stimulus-entiteit 300 keer toegepast bij 20 Hz. Het begin van de akoestische stimulans wordt aangegeven door een verticale rode lijn. Dit cijfer wordt gewijzigd van Lundt et al.60. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Tone Burst-Evoked ABRs in Controls en Mutant muizen (CAv3,2+/-, CAv3,2-/-). Representatieve abr's uit (a) CAv3,2+/+, (B) CAv3,2+/-en (C) CAv3,2-/- vrouwelijke muizen volgend op Toon uitbarstingen van 1 – 42 kHz (6 kHz stappen) bij een SPL van 80 dB. Voor het gemiddelde werd elke stimulus-entiteit 300 keer bij 20 Hz gepresenteerd. Het begin van de akoestische stimulans wordt aangegeven door een verticale rode lijn. Dit cijfer wordt gewijzigd van Lundt et al.60. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Click-opgeroepen ABR-gebaseerde gehoor drempels in bedieningsorganen en mutanten muizen (CAv3,2+/-, CAv3,2-/-). Click-Evoked audiometrische gehoor drempel van (a) vrouwelijk en (B) mannelijk CAv3,2+/+ (vrouwelijk: n = 12; mannelijk: n = 13), CAv3,2+/- (vrouwelijk: n = 10; mannelijk: n = 9), en CAv3,2-/- muizen (vrouwelijk: n = 10; mannelijk: n = 9). Gegevens worden getekend als gemiddelde ± SEM. statistische significanties werden bepaald met behulp van α-niveau = 0,05 en p-waarden gedefinieerd als *p < 0,05; * *p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Dit cijfer wordt gewijzigd van Lundt et al.60. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Tone Burst-opgeroepen ABR-gebaseerde gehoor drempels in besturingen en Mutante muizen (CAv3,2+/-, CAv3,2-/-). 1 – 42 kHz (6 kHz stappen) Tone Burst-Evoked ABR-gebaseerde audiometrische drempels voor CAv3,2+/+ (Female: n = 12; mannelijk: n = 12; ▲), CAv3,2+/- (vrouwelijk: n = 10; mannelijk: n = 8; ■), en CAv3,2-/- dieren (vrouwelijk: n = 10; mannelijk: n = 9; ○). Gegevens worden uitgezet als gemiddelde ± SEM. statistische significanties werden bepaald aan de hand van α-niveau = 0,05 en p-waarden gedefinieerd als *p < 0,05; * *p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Dit cijfer wordt gewijzigd van Lundt et al.60. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: amplitude groei functie op op klikken gebaseerde ABR-opnames in besturingselementen en Mutant muizen (CAv3,2+/-, CAv3,2-/-). WI– wIV amplitude (in microvolts) uitgezet tegen een toenemende SPL (in decibels) voor Klik-Evoked ABR wave analyse in CAv3,2+/+ (Female: n = 12; mannelijk: n = 11; zwarte lijn die de benade controle curve inclusief het 95% betrouwbaarheidsinterval in grijs), CAv3,2+/- (vrouwelijk: n = 8; mannelijk: n = 7; ■) en CAv3,2-/- dieren (vrouwelijk: n = 7; mannelijk: n = 9 ; ○). Beide CAv3,2-/- vrouwelijke en mannelijke muizen vertonen een significant vertraagde toename van de amplitude groei over de toenemende SPLS voor (a en B) wI, (C en D) wII, en (G en H) WIV vergeleken met CAv3,2+/+ en CAv3,2+/- muizen. (E en F) Voor WIII, alleen cav3,2-/- mannelijke muizen weergegeven een aanzienlijke vertraging in amplitude groei over de toenemende spl in vergelijking met vrouwelijke CAv3,2-/- dieren. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. statistische significanties werden bepaald met behulp van α-niveau = 0,05 en p-waarden gedefinieerd als *p < 0,05; * *p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Dit cijfer wordt gewijzigd van Lundt et al.60. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: latency analyse bij Click-Evoked ABR opnames in Controls en Mutant muizen (CAv3,2+/-, CAv3,2-/-). Latenties (in milliseconden) voor elke ABR-Golf (wI-w IV) bij 65 dB SPL zijn afgebeeld voor CAv3,2+/+ (Female: n = 12; mannelijk: n = 11), CAv3,2+/- (vrouwelijk: n = 8; mannelijk: n = 7), en Cav3,2-/- muizen (vrouwelijk: n = 8; mannelijk: n = 9). Houd er rekening mee dat latentie analyse ook kan worden uitgevoerd op specifieke sensatie niveaus. Gegevens worden afgebeeld als gemiddelde ± SEM. statistische significanties werden bepaald aan de hand van α-niveau = 0,05 en p-waarden gedefinieerd als *p < 0,05; * *p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Dit cijfer wordt gewijzigd van Lundt et al.60. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullend figuur 1: ABR-architectuur en elektrode positionering. A) representatieve ABR-opname op 65 dB SPL. De initiële Baseline (TW1,5MS) werd gevolgd door de test stimulus (Click of Tone Burst) en TW2 (10 MS) die de vroege hersenstam-evoked potentials bevatten. TW2 werd gevolgd door een andere Baseline (TW3, 10 MS). De basislijn perioden werden gebruikt om de SD van de baseline ruis te berekenen. Wanneer een individuele ABR-Golf (WI-wIV) amplitude de SD van het basisgeluid in viervoudige overschreden, werd de gehoor drempel bereikt. Voor Golf amplitude en latency vergelijking, een "Mexican Hat"-gebaseerde wavelet aanpak werd uitgevoerd om automatisch te detecteren negatieve pieken (blauw-geel gestreepte lijnen) en positieve pieken (rood-grijs gestreepte lijnen). Groene kruisen geven de absolute maximale ABR-Golf amplituden aan en geven geen benaderingswaarden weer op basis van de wavelet-benadering. B) voor de ABR-opnames werden subdermale roestvast stalen elektroden met een haakvormige punt gebruikt. De referentie-elektrode werd geplaatst op de linker heup, de positieve (+) elektrode werd gepositioneerd op de vertex (axiaal van de pinnae), en de negatieve (-) elektrode werd ingebracht ventrolaterale van de rechter Pinna afhankelijk van of een mono-of binaurale opname was Uitgevoerd. Dit cijfer wordt gewijzigd van Lundt et al.60. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol biedt een gedetailleerde en integratieve beschrijving van het opnemen van auditieve Evoked hersenstam reacties bij muizen. Het legt specifieke focus op dier voorbehandeling, anesthesie, en mogelijke methodologische verstorende factoren. Deze laatste omvatten onder meer geslacht, muis lijn, leeftijd en huisvestingsomstandigheden. Opgemerkt moet worden dat al deze factoren een impact kunnen hebben op perceptief gehoorverlies en fundamentele aspecten van auditieve informatieverwerking. Daarom is passende stratificatie van auditieve profilerings studies verplicht.

De instrumentatie van AEP-opnames is in de laatste 50 – 60 jaar enorm geëvolueerd, en tegenwoordig zijn er commerciële ABR-opnamesystemen beschikbaar die de toepassing van de techniek hebben verbeterd en vereenvoudigd, maar ook nieuwe valkuilen hebben geïntroduceerd. Sommige van deze aspecten worden hier besproken. Ten eerste moet de gebruiker wennen aan het ABR-systeem, dat wil doen, de instrumentatie samengesteld uit Desktop-of laptop computer, de voorversterker, de versterker, de elektrode-invoerbox en potentiële transducers (bijv. luidsprekers, insert-oortelefoons, supra-auraal hoofdtelefoons en botoscillatoren). Met name de opnameomstandigheden zijn van centraal belang. Door hun hoge gevoeligheid moeten ABR-opnames worden afgeschermd om ze te beschermen tegen verontreiniging met externe elektrische ruis en om een adequate signaal-ruis verhouding te garanderen.

Een ander belangrijk aspect is de instrumentatie zelf (bijv. de stimulus generator, transducers en triggers). De meest gebruikte soorten stimuli bij muizen zijn 100 μs clicks en Short-duration Tone uitbarstingen met een gemoduleerde amplitude en/of frequentie eigenschappen. Transducers kunnen een verscheidenheid aan akoestische stimuli presenteren aan één oor of aan beide oren. Hier hebben we ABR-resultaten gepresenteerd met behulp van een enkele luidspreker rostrale migratoire voor het experimentele dier. Er zijn echter ook andere benaderingen mogelijk, waaronder Tubal-achtige insert koptelefoon in één oor of beide oren. Supra-aurale hoofdtelefoons zoals gebruikt bij de mens zijn niet haalbaar bij muizen. Zoals de literatuur illustreert, kunnen verschillende benaderingen succesvol zijn en moeten ze worden aangepast aan de experimentele behoeften. Speciale aandacht moet worden besteed aan de accureidenheid van de trigger die essentieel is voor signaal middeling als deze digitale puls bepaalt wanneer elke individuele stimulus wordt gepresenteerd. Voor de juiste opnames moet het begin van de trigger en de stimulans synchroon zijn, wat tijdpunt nul vertegenwoordigt. In de handel verkrijgbare ABR-opnamesystemen omvatten normaalgesproken op zichzelf staande triggers wanneer de individuele prikkels worden gepresenteerd. In veel systemen, er zijn externe ingangen die een verbinding van een externe stimulus generator en een bijbehorende trigger mogelijk te maken. In beide gevallen bleek het waardevol om de stimulus en trigger kenmerken met behulp van een externe oscilloscoop te beheersen. Bijzondere aandacht moet ook worden besteed aan de acquisitie parameters (bijv. differentiële versterking, filtering, analoge versus digitale filters, filter ontwerpen en parameters van signaal gemiddelden). Met name de parameters die in het hier gepresenteerde protocol worden gepresenteerd, passen bij de experimentele vereisten van de voorbeeldige resultaten die hierboven worden afgebeeld. Echter, aanpassingen, bijvoorbeeld in de bemonsteringsfrequentie, het aantal prikkels toegepast voor het gemiddelde, en de frequentie van de toepassing, kan nodig zijn, afhankelijk van de experimentele instellingen.

Tot slot moeten enkele korte opmerkingen worden gemaakt over elektrode impedantie, elektrodetypen en elektrode plaatsing. De elektroden fungeren als antennes, het oppakken van spannings veranderingen van onder de huid. De plaatsing van de subcutane elektrode is verplicht omdat de loutere toepassing van elektroden op de huid of de hoofdhuid niet geschikt is vanwege de weerstand van de buitenste huidlaag (d.w.z. het stratum corneum). Terwijl bij mensen de elektrische geleiding normaalgesproken wordt verbeterd door dode huidcellen te schuren en de toepassing van een elektrolyt gel of-pasta te gebruiken, wordt dit meestal niet gedaan en geschikt in muizen waar subdermale elektroden worden gebruikt. De interface van elektrode en huid vormt de elektrode impedantie die de elektrische eigenschappen van de geleider in totaal omvat. De eigenschappen van de geleider omvatten de materiaaleigenschappen van de elektrode en het oppervlak van de contact-elektrode, eigenschappen van het weefsel, met inbegrip van het puin (olie, vuil, zweet, enz.), en de elektrolytoplossing. Het elektrode materiaal omvat zilver, goud, platina, lood, tin en roestvrijstaal met lage impedantie en lage elektrode potentialen. Er moet worden gezorgd dat het elektrode materiaal inert is onder opnameomstandigheden. Met zilver wordt dit bereikt door het gebruik van zogenaamde complexe elektroden (d.w.z. zilver-zilverchloride [Ag-AgCl] elektroden). In dit geval zorgt de elektrische dubbellaag voor een vrije uitwisseling van ionen die de impedantie verder vermindert. Het wordt vaak aanbevolen dat de elektrode impedantie niet hoger mag zijn dan 5 kΩ en dat de impedantie van de afzonderlijke elektroden (ten minste drie) vergelijkbaar is. Het wordt ook aanbevolen dat de impedantie van de interelektrode lager is dan 2 kΩ. De opname-elektrode vertegenwoordigt een lange metaaldraad met een isolerende coating. De draad elektrode is aangesloten via een stekker op het opnameapparaat, in de meeste gevallen de voorversterker/versterker. Bij muizen is het andere uiteinde van de elektrode draad meestal een ophoping van een naald elektrode die recht of — beter — arcuated kan worden gelaten. Andere elektrode types, zoals schijf-of bekervormige, ongeacht of ze voor hergebruik of voorgelled wegwerpmateriaal zijn, zijn beperkt tot gebruik bij de mens en niet van toepassing op muizen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs willen Dr. Christina Kolb (Duits centrum voor neurodegeneratieve ziekten [DZNE]) en Dr. Robert Stark (DZNE) bedanken voor hun hulp bij de veeteelt en de diergezondheid. Dit werk werd financieel gesteund door het Federaal Instituut voor drugs en medische hulpmiddelen (Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte, BfArM, Bonn, Duitsland).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AEP/OAE Software for RZ6 (BioSigRZ software) Tucker-Davis Technologies (TDT) BioSigRZ
Binocular surgical magnification microscope Zeiss Stemi 2000 0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000
Cages (Macrolon) Techniplast 1264C, 1290D
Carprox vet, 50mg/ml Virbac Tierarzneimittel GmbH PZN 11149509
Cold light source Schott KL2500 LCD 9.705 202
Cotton tip applicators (sterile) Carl Roth EH12.1
Custom made meshed metal Faraday cage (stainless steel, 2 mm thickness, 1 cm mesh size) custom made custom made
5% Dexpanthenole (Bepanthen eye and nose creme) Bayer Vital GmbH PZN: 01578681
Disposable Subdermal stainless steel Needle
electrodes, 27GA, 12mm		 Rochester Electro-Medical, Inc. S03366-18
Surgical drape sheets (sterile) Hartmann PZN 0366787
Ethanol, 70% Carl Roth 9065.5
1/4'' Free Field Measure Calibration Mic Kit Tucker-Davis Technologies (TDT) PCB-378C0
Gloves (sterile) Unigloves 1570
Graefe Forceps-curved, serrated FST 11052-10
GraphPad Prism 6 Software, V6.07 GraphPad Prism Software, Inc. https://www.graphpad.com/
Heat-based surgical instrument sterilizer FST 18000-50
Homeothermic
heating blanked		 ThermoLux 461265 / -67
Ketanest S (Ketamine), 25mg/ml Pfizer PZN 08707288
Ringer’s solution (sterile) B.Braun PZN 01471434
Matlab software MathWorks, Inc. https://de.mathworks.com/products/matlab.html
Medusa 4-Channel Low Imped. Headstage Tucker-Davis Technologies (TDT) RA4LI
Medusa 4-Channel Pre-Amp/Digitizer Tucker-Davis Technologies (TDT) RA4PA
Microphone PCB Pieztronics 378C01
Multi Field Speaker- Stereo Tucker-Davis Technologies (TDT) MF1-S
Oscilloscope Tektronix DPO3012
Optical PC1 express card for Optibit Interface) Tucker-Davis Systems (TDT) PO5e
Askina Braucel pads (cellulose absorbet pads) B.Braun PZN 8473637
Preamplifier PCB Pieztronics 480C02
RZ6 Multi I/O Processor system (BioSigRZ) Tucker-Davis Technologies (TDT) RZ6-A-PI
0.9% saline (NaCl, sterile) B.Braun PZN:8609255
SigGenRZ software Tucker-Davis Technologies (TDT) https://www.tdt.com/
Software R (version 3.2.1) + Reshape 2 (Version 1.4.1) + ggplot 2 (version 1.0.1) + datatable (version 1.9.4), + gdata (version 2.13.3), + pastecs (version 1.3.18), + waveslim (version 1.7.5), + MassSpecWavelet (version 1.30.0) The R Foundation, R Core Team 2015 Open Source Software (freely distributable)
Sound attenuating cubicle Med Associates Inc. ENV-018V
Standard Pattern Forceps, 12cm and 14.5 cm length FST 11000-12, 11000-14
Leukosilk tape BSN medical GmbH & Co. KG PZN 00397109
Tissue Forceps- 1x2 Teeth 12 cm FST 11021-12
Uniprotect ventilated cabinet Bioscape THF3378
Ventilated cabinet Tecniplast 9AV125P
Xylazine (Rompun), 2% Bayer Vital GmbH PZN 1320422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sporns, O., Tononi, G., Kotter, R. The human connectome: A structural description of the human brain. PLOS Computational Biology. 1 (4), e42 (2005).
  2. Bebarova, M. Advances in patch clamp technique: towards higher quality and quantity. General Physiology and Biophysics. 31 (2), 131-140 (2012).
  3. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
  4. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  5. Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
  6. Heuschkel, M. O., Fejtl, M., Raggenbass, M., Bertrand, D., Renaud, P. A three-dimensional multi-electrode array for multi-site stimulation and recording in acute brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 114 (2), 135-148 (2002).
  7. Kimiskidis, V. K. Transcranial magnetic stimulation (TMS) coupled with electroencephalography (EEG): Biomarker of the future. Reviews in Neurology. 172 (2), 123-126 (2016).
  8. Nunez, P. L. Toward a quantitative description of large-scale neocortical dynamic function and EEG. Behavioral Brain Science. 23 (3), 371-437 (2000).
  9. Lundt, A., et al. EEG Radiotelemetry in Small Laboratory Rodents: A Powerful State-of-the Art Approach in Neuropsychiatric, Neurodegenerative, and Epilepsy Research. Neural Plasticity. 2016, 8213878 (2016).
  10. Papazoglou, A., et al. Non-restraining EEG Radiotelemetry: Epidural and Deep Intracerebral Stereotaxic EEG Electrode Placement. Journal of Visualized Experiments. 112 (112), e54216 (2016).
  11. Weiergraber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system. Brain Research Brain Research Protocols. 14 (3), 154-164 (2005).
  12. Kallstrand, J., Nehlstedt, S. F., Skold, M. L., Nielzen, S. Lateral asymmetry and reduced forward masking effect in early brainstem auditory evoked responses in schizophrenia. Psychiatry Research. 196 (2-3), 188-193 (2012).
  13. Muller, R., et al. Automatic Detection of Highly Organized Theta Oscillations in the Murine EEG. Journal of Visualized Experiments. (121), e55089 (2017).
  14. Papazoglou, A., et al. Gender specific hippocampal whole genome transcriptome data from mice lacking the Cav2.3 R-type or Cav3.2 T-type voltage-gated calcium channel. Data in Brief. 12, 81-86 (2017).
  15. Papazoglou, A., et al. Gender-Specific Hippocampal Dysrhythmia and Aberrant Hippocampal and Cortical Excitability in the APPswePS1dE9 Model of Alzheimer's Disease. Neural Plasticity. 2016, 7167358 (2016).
  16. Papazoglou, A., et al. Motor Cortex Theta and Gamma Architecture in Young Adult APPswePS1dE9 Alzheimer Mice. PLOS ONE. 12 (1), e0169654 (2017).
  17. Siwek, M. E., et al. Altered theta oscillations and aberrant cortical excitatory activity in the 5XFAD model of Alzheimer's disease. Neural Plasticity. , 781731 (2015).
  18. Welch, T. M., Church, M. W., Shucard, D. W. A method for chronically recording brain-stem and cortical auditory evoked potentials from unanesthetized mice. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 60 (1), 78-83 (1985).
  19. Church, M. W., Gritzke, R. Effects of ketamine anesthesia on the rat brain-stem auditory evoked potential as a function of dose and stimulus intensity. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 67 (6), 570-583 (1987).
  20. van Looij, M. A., et al. Impact of conventional anesthesia on auditory brainstem responses in mice. Hearing Research. 193 (1-2), 75-82 (2004).
  21. Schomer, D. L., da Silva, F. L. Niedermeyer's Electroencephalography: Basic Principles, Clinical Applications, and Related Fields. , Lippincott Williams & Wilkins. (2011).
  22. De Cosmo, G., Aceto, P., Clemente, A., Congedo, E. Auditory evoked potentials. Minerva Anestesiology. 70 (5), 293-297 (2004).
  23. Rosburg, T. Auditory N100 gating in patients with schizophrenia: A systematic meta-analysis. Clinical Neurophysiology. 129 (10), 2099-2111 (2018).
  24. DiLalla, L. F., McCrary, M., Diaz, E. A review of endophenotypes in schizophrenia and autism: The next phase for understanding genetic etiologies. American Journal of Medical Genetics Part C Seminar in Medical Genetics. 175 (3), 354-361 (2017).
  25. Walsh, P., Kane, N., Butler, S. The clinical role of evoked potentials. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 76 Suppl 2, ii16-ii22 (2005).
  26. Opgen-Rhein, C., Neuhaus, A., Urbanek, C., Dettling, M. New strategies in schizophrenia: impact of endophentotypes. Psychiatrische Praxis. 31 Suppl 2, S194-S199 (2004).
  27. Knipper, M., Van Dijk, P., Nunes, I., Ruttiger, L., Zimmermann, U. Advances in the neurobiology of hearing disorders: recent developments regarding the basis of tinnitus and hyperacusis. Progress in Neurobiology. 111, 17-33 (2013).
  28. Miller, C. A., Brown, C. J., Abbas, P. J., Chi, S. L. The clinical application of potentials evoked from the peripheral auditory system. Hearing Research. 242 (1-2), 184-197 (2008).
  29. Manouilenko, I., Humble, M. B., Georgieva, J., Bejerot, S. Brainstem Auditory Evoked Potentials for diagnosing Autism Spectrum Disorder, ADHD and Schizophrenia Spectrum Disorders in adults. A blinded study. Psychiatry Research. 257, 21-26 (2017).
  30. Talge, N. M., Tudor, B. M., Kileny, P. R. Click-evoked auditory brainstem responses and autism spectrum disorder: A meta-analytic review. Autism Research. 11 (6), 916-927 (2018).
  31. Hamed, S. A. The auditory and vestibular toxicities induced by antiepileptic drugs. Expert Opinion in Drug Safety. 16 (11), 1281-1294 (2017).
  32. Ismi, O., et al. The Effect of Methylphenidate on the Hearing of Children with Attention Deficit Hyperactivity Disorder. International Archive in Otorhinolaryngology. 22 (3), 220-224 (2018).
  33. Michna, M., et al. Cav1.3 (alpha1D) Ca2+ currents in neonatal outer hair cells of mice. Journal of Physiology. 553 (Pt 3), 747-758 (2003).
  34. Platzer, J., et al. Congenital deafness and sinoatrial node dysfunction in mice lacking class D L-type Ca2+ channels. Cell. 102 (1), 89-97 (2000).
  35. Willaredt, M. A., Ebbers, L., Nothwang, H. G. Central auditory function of deafness genes. Hearing Research. 312, 9-20 (2014).
  36. Yee, B. K., Singer, P. A conceptual and practical guide to the behavioural evaluation of animal models of the symptomatology and therapy of schizophrenia. Cell Tissue Research. 354 (1), 221-246 (2013).
  37. Fahey, J. R., Katoh, H., Malcolm, R., Perez, A. V. The case for genetic monitoring of mice and rats used in biomedical research. Mammalian Genome. 24 (3-4), 89-94 (2013).
  38. Hunsaker, M. R. Comprehensive neurocognitive endophenotyping strategies for mouse models of genetic disorders. Progress in Neurobiology. 96 (2), 220-241 (2012).
  39. Turner, J. G., Parrish, J. L., Hughes, L. F., Toth, L. A., Caspary, D. M. Hearing in laboratory animals: strain differences and nonauditory effects of noise. Computational Medicine. 55 (1), 12-23 (2005).
  40. Neumann, P. E., Collins, R. L. Genetic dissection of susceptibility to audiogenic seizures in inbred mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5408-5412 (1991).
  41. Meier, S., Groeben, H., Mitzner, W., Brown, R. H. Genetic variability of induction and emergence times for inhalational anaesthetics. European Journal of Anaesthesiology. 25 (2), 113-117 (2008).
  42. Majewski-Tiedeken, C. R., Rabin, C. R., Siegel, S. J. Ketamine exposure in adult mice leads to increased cell death in C3H, DBA2 and FVB inbred mouse strains. Drug Alcohol Dependence. 92 (1-3), 217-227 (2008).
  43. Bonthuis, P. J., et al. Of mice and rats: key species variations in the sexual differentiation of brain and behavior. Frontiers in Neuroendocrinology. 31 (3), 341-358 (2010).
  44. Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 102 (3), 153-159 (2012).
  45. Jonasson, Z. Meta-analysis of sex differences in rodent models of learning and memory: a review of behavioral and biological data. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 28 (8), 811-825 (2005).
  46. Prendergast, B. J., Onishi, K. G., Zucker, I. Female mice liberated for inclusion in neuroscience and biomedical research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 40, 1-5 (2014).
  47. Ingham, N. J., Pearson, S., Steel, K. P. Using the Auditory Brainstem Response (ABR) to Determine Sensitivity of Hearing in Mutant Mice. Current Protocols in Mouse Biology. 1 (2), 279-287 (2011).
  48. Tucker-Davis Technologies. SigGenRZ Manual. , Available from: https://www.tdt.com/files/manuals/SigGenRZ_Manual.pdf (2012).
  49. Bogaerts, S., Clements, J. D., Sullivan, J. M., Oleskevich, S. Automated threshold detection for auditory brainstem responses: comparison with visual estimation in a stem cell transplantation study. BMC Neuroscience. 10, 104 (2009).
  50. Probst, F. J., et al. A point mutation in the gene for asparagine-linked glycosylation 10B (Alg10b) causes nonsyndromic hearing impairment in mice (Mus musculus). PLOS ONE. 8 (11), e80408 (2013).
  51. Alvarado, J. C., Fuentes-Santamaria, V., Gabaldon-Ull, M. C., Blanco, J. L., Juiz, J. M. Wistar rats: a forgotten model of age-related hearing loss. Frontiers in Aging Neuroscience. 6, 29 (2014).
  52. Du, P., Kibbe, W. A., Lin, S. M. Improved peak detection in mass spectrum by incorporating continuous wavelet transform-based pattern matching. Bioinformatics. 22 (17), 2059-2065 (2006).
  53. Daubechies, I. Ten lectures on wavelets. , Society for Industrial and Applied Mathematics. Philadelphia, PA. (1992).
  54. Pearson, J. D., et al. Gender differences in a longitudinal study of age-associated hearing loss. Journal of the Acoustical Society of America. 97 (2), 1196-1205 (1995).
  55. Murphy, M. P., Gates, G. A. Hearing Loss: Does Gender Play a Role? Medscape Womens Health. 2 (10), 2 (1997).
  56. Henry, K. R. Males lose hearing earlier in mouse models of late-onset age-related hearing loss; females lose hearing earlier in mouse models of early-onset hearing loss. Hearing Research. 190 (1-2), 141-148 (2004).
  57. Ison, J. R., Allen, P. D., O’Neill, W. E. Age-related hearing loss in C57BL/6J mice has both frequency-specific and non-frequency-specific components that produce a hyperacusis-like exaggeration of the acoustic startle reflex. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 8 (4), 539-550 (2007).
  58. Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses. Hearing Research. 130 (1-2), 94-107 (1999).
  59. Zhou, X., Jen, P. H., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).
  60. Lundt, A., et al. Cav3.2 T-Type Calcium Channels Are Physiologically Mandatory For The Auditory System. Neuroscience. , In Press (2019).

Tags

Deze maand in JoVE amplitude auditief systeem middeling binauraal hersenstam klik gehoor drempel latency monauraal systemische neurofysiologie Tone Burst Wavelet
Data-acquisitie en analyse in hersenstam evoked respons-Audiometrie bij muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lundt, A., Soos, J., Henseler, C.,… More

Lundt, A., Soos, J., Henseler, C., Arshaad, M. I., Müller, R., Ehninger, D., Hescheler, J., Sachinidis, A., Broich, K., Wormuth, C., Papazoglou, A., Weiergräber, M. Data Acquisition and Analysis In Brainstem Evoked Response Audiometry In Mice. J. Vis. Exp. (147), e59200, doi:10.3791/59200 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter