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Neuroscience

Aquisição e análise de dados na audiometria de resposta evocada de tronco encefálico em camundongos

Published: May 10, 2019 doi: 10.3791/59200
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 3, 4, 5, 5, 6, 1,7, 1, 1
1Experimental Neuropsychopharmacology, Federal Institute for Drugs and Medical Devices, 2KBRwyle GmbH, 3Cognitive Neurophysiology, Department of Psychiatry and Psychotherapy, Faculty of Medicine, University of Cologne, 4Molecular and Cellular Cognition, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 5Institute of Neurophysiology, Faculty of Medicine, University of Cologne, 6Federal Institute for Drugs and Medical Devices (BfArM), 7Thescon GmbH

Summary

A audiometria evocada da resposta do brainstem é uma ferramenta importante na neurofisiologia clínica. Atualmente, a audiometria de resposta evocada do tronco encefálico também é aplicada na ciência básica e nos estudos pré-clínicos envolvendo modelos animais farmacológicos e genéticos. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada de como as respostas auditivas do tronco encefálico podem com sucesso ser gravadas e analisadas nos ratos.

Abstract

A audiometria evocada da resposta do brainstem (BERA) é da relevância central na neurofisiologia clínica. Como outras técnicas de potencial evocado (EP), tais como potenciais evocados visualmente (VEPs) ou potenciais evocados somatossensoriais (SEPs), os potenciais evocado auditivos (AEPs) são desencadeados pela apresentação repetitiva de estímulos idênticos, o a resposta electroencephalographic (EEG) de que é calculada subseqüentemente a média tendo por resultado as deflexões positivas (p) e negativas (n) distintas. Nos seres humanos, tanto a amplitude quanto a latência de picos individuais podem ser utilizadas para caracterizar alterações na velocidade de sincronização e condução nos circuitries neuronais subjacentes. É importante ressaltar que os AEPs também são aplicados na ciência básica e pré-clínica para identificar e caracterizar a função auditiva em modelos animais farmacológicos e genéticos. Ainda mais, modelos animais em combinação com testes farmacológicos são utilizados para investigar possíveis benefícios no tratamento da perda auditiva neurossensorial (por exemplo, déficits auditivos induzidos por idade ou ruído). Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada e Integrativa de como gravar auditivo brainstem-evocado respostas (ABRs) em camundongos usando clique e Tone-Burst aplicação. Um foco específico deste protocolo está em habitação animal pré-experimental, anestesia, gravação ABR, processos de filtragem de ABR, análise de função de crescimento de amplitude baseada em wavelet automatizada e detecção de latência.

Introduction

Um aspecto central da fisiologia cerebral é sua capacidade de processar informações ambientais, resultando em diferentes saídas intrínsecas ou extrínsecos, como aprendizado, memória, reações emocionais ou respostas motoricas. Várias abordagens experimentais e diagnósticas podem ser usadas para caracterizar a responsividade eletrofisiológica de tipos de células neuronais individuais ou clusters/conjuntos de neurônios dentro de um circuito neuronal relacionado a estímulos. Essas técnicas eletrofisiológicas abrangem diferentes dimensões espaço-temporais no micro, meso-e macrosescala1. O nível da microescala inclui a tensão e as aproximações atuais da braçadeira em modalidades diferentes da remendo-braçadeira usando, por exemplo, os neurônios cultivados ou agudamente dissociados1. Estas técnicas in vitro permitem a caracterização de entidades de corrente individual e sua modulação farmacológica2,3. Uma desvantagem essencial, no entanto, é a falta de informação sistêmica no que diz respeito à integração e ao processamento de informações de micro e macrocircuitos. Este prejuízo é parcialmente superado pelas técnicas in vitro da Mesoscale, tais como matrizes multieletrodos que permitem gravações multieletrodos extracelulares simultâneas não só em neurônios cultivados, mas também em fatias cerebrais agudas4, 5. Considerando que as microcircuitarias podem ser preservadas nas fatias cerebrais em uma extensão específica (por exemplo, no hipocampo), as interconexões de longo alcance são tipicamente perdidas6. Em última análise, para estudar as interconexões funcionais dentro de circuitries neuronais, as técnicas eletrofisiológicas in vivo sistêmicas na macrosescala são o método de escolha7. Estas abordagens incluem, entre outras coisas, a superfície (epidural) e profundas (intracerebral) EEG gravações que são realizadas em ambos os seres humanos e modelos animais1. Os sinais de EEG baseiam-se predominantemente na entrada sináptica sincronizada em neurônios piramidais em diferentes camadas corticais que podem ser inibitórias ou excitatórias no principal, apesar da predominância geral da entrada excitatória8. Em cima da sincronização, os deslocamentos potencial-baseados pós-sináptica excitatórios em campos elétricos extracelular são somados para dar forma a um sinal da força suficiente a ser gravado no escalpe usando elétrodos de superfície. Notavelmente, uma gravação de couro cabeludo detectável de um eletrodo individual requer a atividade de 10000 de neurônios piramidais e um arsenal complexo de dispositivos técnicos e ferramentas de processamento, incluindo um amplificador, processos de filtragem (filtro passa-baixo, filtro passa-alto, filtro de entalhe), e eletrodos com propriedades específicas do condutor.

Na maioria das espécies animais experimentais (ou seja, camundongos e ratos), a abordagem de EEG de couro cabeludo baseada em humanos não é tecnicamente aplicável, pois o sinal gerado pelo córtex subjacente é muito fraco devido ao número limitado de neurônios piramidais sincronizados9, 10,11. Em roedores, eletrodos de superfície (couro cabeludo) ou eletrodos subdérmicos são assim severamente contaminados por eletrocardiograma e artefatos predominantemente eletromiogramas que fazem gravações de EEG de alta qualidade impossíveis9,11, 12. when que usa ratos e ratos livremente moventes não, é conseqüentemente obrigatório gravar diretamente do córtice através dos elétrodos epidural ou das estruturas profundas, intracerebral para assegurar a conexão física direta da ponta de detecção eletrodo de chumbo/implantado para os aglomerados de células neuronais de geração de sinal. Estas aproximações de EEG podem ser executadas em uma instalação tethered de contenção do sistema ou em usar a aproximação implantáveis nonrestringing da telemetriaderádio de EEG9,10,11. Ambas as técnicas têm seus prós e contras e podem ser uma abordagem valiosa na caracterização qualitativa e quantitativa da atividade de susceptibilidade/apreensão convulsiva, ritmicidade circadiana, arquitetura do sono, atividade oscilatória e sincronização, incluindo análise de frequência de tempo, análise de fonte, etc.9,10,13,14,15,16,17.

Considerando que os sistemas amarrados e a telemetria de rádio permitem gravações de EEG circunstâncias de contenção/semirestraining ou nonrestringing, respectivamente, as circunstâncias experimentais relacionadas não combinam as exigências para gravações de ABR. A última demanda por estímulos acústicos definidos que são apresentados repetitivamente ao longo do tempo com posições definidas de um altifalante e de um animal experimental e níveis de pressão sonora controlados (SPLs). Isso pode ser conseguido tanto pela fixação da cabeça condições de restrição ou após a anestesia18,19. Para reduzir o estresse experimental, os animais são normalmente anestesiados durante a experimentação do PEATE, mas deve-se considerar que a anestesia pode interferir na ABRs19,20.

Como uma característica geral, o EEG é construído de freqüências diferentes em uma escala da tensão de 50-100 μV. frequências de fundo e amplitudes dependem fortemente do estado fisiológico do animal experimental. No estado acordado, predominam as frequências beta (β) e gama (γ) com menor amplitude. Quando os animais se tornam sonolento ou adormecem, surgem frequências alfa (α), (θ) e Delta (δ), exibindo aumento da amplitude do EEG21. Uma vez que um canal sensorial (por exemplo, a via acústica) é estimulado, a propagação da informação é mediada através da atividade neuronal através do sistema nervoso periférico e central. Tal estimulação sensorial (por exemplo, acústica) aciona os chamados EPs ou respostas evocadas. Notavelmente, os potenciais relacionados a eventos (ERPs) são muito mais baixos em amplitude do que o EEG (ou seja, apenas alguns microvolts). Assim, todo o ERP individual baseado em um único estímulo seria perdido de encontro ao fundo do EEG da elevado-amplitude. Portanto, uma gravação de um ERP requer a aplicação repetitiva de estímulos idênticos (por exemplo, cliques em gravações ABR) e a média subsequente para eliminar qualquer atividade de fundo EEG e artefatos. Se as gravações de ABR são feitas em animais anestesiados, é fácil usar eletrodos subdérmicos aqui.

Principalmente, os AEPs incluem EPs de curta latência, que normalmente estão relacionados a ABRs ou BERA, e ainda mais, potenciais de início tardio, como EPs de midlatência (respostas de midlatência [MLR]) e EPs22de longa latência. É importante ressaltar que o distúrbio no processamento de informações da informação auditiva é, muitas vezes, uma característica central das doenças neuropsiquiátricas (doenças desmielinizantes, esquizofrenia, etc.) e associada às alterações da AEP23,24 ,25. Considerando que as investigações comportamentais só são capazes de revelar comprometimento funcional, os estudos de AEP permitem uma análise espaciotemporal precisa da disfunção auditiva relacionada a estruturas neuroanatômicas específicas26.

ABRs como cedo, a curto-latência de EPs acusticamente são normalmente detectados após moderada a alta-intensa aplicação clique, e pode ocorrer até sete picos ABR (WI-wVII). As ondas mais importantes (Wi-wV) estão relacionadas às seguintes estruturas neuroanatômicas: wi ao nervo auditivo (porção distal, dentro da orelha interna); WII ao núcleo coclear (porção proximal do nervo auditivo, terminação do tronco encefálico); WIII ao complexo Olivar superior (SOC); WIV ao lemnisco lateral (ll); WV à terminação do lemnisco lateral (ll) dentro do colículo inferior (CI) no lado contralateral27 (Figura complementar 1). Deve-se notar que WII-wV são susceptíveis de ter mais de uma estrutura anatômica da via auditiva ascendente contribuindo para eles. Notavelmente, a correlação exata de picos e estruturas subjacentes do trato auditivo ainda não está totalmente esclarecida.

Na Audiologia, a ABRs pode ser utilizada como ferramenta de triagem e diagnóstico e para o monitoramento cirúrgico28,29. É mais importante para a identificação de Disacusia, hypacusis e anacusia (por exemplo, na perda auditiva relacionada à idade, perda auditiva induzida por ruído, perda auditiva metabólica e congênita, perda auditiva assimétrica e déficits auditivos devido a deformidades ou malformações, lesões e neoplasias)28. As ABRs também são relevantes como um teste de triagem para crianças hiperativas, intelectualmente deficientes ou para outras crianças que não seriam capazes de responder à audiometria convencional (por exemplo, em doenças neurológicas/psiquiátricas como ADHD, MS, autismo etc.29 , 30) e no desenvolvimento e montagem cirúrgica de implantes cocleares28. Finalmente, os ABRs podem fornecer insights valiosos sobre os potenciais efeitos colaterais ototóxicos de neuropsicofármacos, como antiepilépticos31,32.

O valor da tradução do conhecimento neurofisiológico obtido a partir de modelos farmacológicos ou transgênicos para o ser humano tem sido demonstrado em inúmeros ajustes, particularmente no nível de ERPs em paradigmas auditivos em camundongos e ratos33, 34,35. Novas percepções sobre os AEPs precoces alterados e as alterações associadas no processamento da informação auditiva em camundongos e ratos podem, assim, ser traduzidas para os seres humanos e é de importância central na caracterização e endofenotipagem de auditivo, neurológico e doenças neuropsiquiátricas no futuro. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada de como os ABRs podem com sucesso ser gravados e analisados nos ratos para finalidades científicas, toxicológicas, e farmacológicas básicas.

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Protocol

Todos os procedimentos animais foram realizados de acordo com as orientações do Conselho alemão de cuidados com os animais e todos os protocolos foram aprovados pela Comissão institucional e nacional de cuidados com os animais (Landesamt für Natur, Umwelt, und Verbraucherschutz, State Escritório de Renânia do Norte-Vestfália, departamento de natureza, meio ambiente e consumismo [LANUV NRW], Alemanha). Os autores certificam ainda que toda a experimentação animal foi realizada de acordo com o guia nacional de institutos de saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório (NIH publications no. 80-23) revisado 1996 ou o Reino Unido animais (procedimentos científicos) Act 1986 e as orientações associadas, ou a Directiva do Conselho das Comunidades Europeias de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE) e de 22 de setembro de 2010 (2010/63/UE). Foi feito um esforço específico para minimizar o número de animais utilizados e seu sofrimento (estratégia de 3R [substituição, redução e refinamento]).

1. animais experimentais

  1. Seleção de animais e espécies experimentais
    1. Realizar estudos de PEATE em roedores/modelos de roedores (ou seja, camundongos ou ratos) que cumpram os requisitos de homologia, isomorfismo e previsibilidade relacionados a uma doença humana específica. Isso é de importância específica em termos de aspectos básicos na neurociência translacional.
      Nota: considere que as variedades variadas disponíveis do rato e do rato podem mostrar diferenças em características fisiológicas e fisiopatológicas básicas36,37,38. Estas especificidades relacionadas com a linha do rato/rato têm de ser tidas em conta no planeamento experimental.
    2. Considere alterações específicas do rato e rato-estirpe na fisiologia e farmacologia que possam ter um impacto nos experimentos electrofisiológicos (por exemplo, sensibilidades anestésicas alteradas, rítmica circadiana, susceptibilidade à convulsão [audiogênica], idade, e fundo genético)39,40,41,42.
    3. Inclua a estratificação específica de gênero no desenho do estudo. Lembre-se de que o ciclo estral pode afetar gravemente a suscetibilidade anestésica, a rítmica central, a dependência circadiana e a atividade convulsiva (convulsões auditivas) e o processamento de informações sensoriais (auditivas)43,44 , 45. assim, realize uma análise específica de gênero.
      Nota: restringir a ratos machos se a capacidade financeira e experimental é limitada, embora vários parâmetros neurofisiológicos de fêmeas normalmente ciclismo não parecem apresentar maior variabilidade em comparação com machos46.
  2. Habitação e manuseamento de animais
    1. Ratos ou ratos da casa em gaiolas individualmente ventiladas dentro de uma instalação animal.
    2. Mova os animais experimentais da facilidade animal aos armários ventilados situados em salas de laboratório especiais pretendidas para a anestesia, a colocação do elétrodo de ABR, e as gravações ABR.
    3. Certifique-se de que os animais estão alojados em um armário ventilado condições ambientais padrão (isto é, com uma temperatura de 21 ± 2 ° c, umidade relativa de 50%-60%, e um ciclo claro/escuro convencional de 12/12 h). Permita que os animais aclimatizem e se adaptem a este padrão circadiano por pelo menos 14 dias antes da experimentação subsequente.
    4. Use as gaiolas desobstruídas do policarbonato tipo II (26,7 cm x 20,7 cm x 14,0 cm, uma área de 410 cm2) para ratos da carcaça nos grupos de 3-4 e use as gaiolas desobstruídas do policarbonato tipo III (42,5 cm x 26,6 cm x 18,5 cm, uma área de 800 cm2) para ratos. Forneça o acesso ad libitum à água potável e às pelotas padrão do alimento.
    5. Evite a separação/isolamento dos animais experimentais antes e após as gravações de ABR, pois o isolamento pode exercer estresse severo afetando os resultados experimentais. Assim, coloc os animais de volta em sua gaiola Home depois da anestesia, da colocação do elétrodo de ABR, e das gravações ABR.
    6. Não aplique condições de moradia abertas, pois estão sujeitas a uma variedade de desvantagens experimentais, particularmente em estudos auditivos. Armários ventilados, em vez disso, protegem do estresse acústico antes e entre os procedimentos auditivos experimentais que poderiam levar à perda auditiva neurossensorial (por exemplo, perda auditiva induzida por ruído) e, portanto, afetam os resultados.
    7. Utilize o equipamento sanitário, anestésico e técnico específico do rato e rato para que nem ratos nem ratos possam sentir a presença de cada um como a percepção sensorial mútua de espécies rivais pode dar origem a factores de confundimento evitáveis nos estudos.

2. anestesia do rato

  1. Realize anestesia usando anestésicos injetáveis. Prepare uma combinação de cloridrato de cetamina (dosagem de roedores: 100 mg/kg) e cloridrato de xilazina (dosagem de roedores: 10 mg/kg) em 0,9% NaCl ou solução de Ringer e injetar o animal intraperitonealmente com base no seu peso corporal.
    Observação: a narcose inalatória via isoflurano não é recomendada, pois o procedimento de PEATE normalmente requer um compartimento de atenuação de som e uma gaiola de Faraday, resultando em limitações espaciais dentro da configuração de gravação. Embora muitos anestésicos atuem no sistema NMDA e, obviamente, influenciem os resultados da gravação do PEATE, uma abordagem de restrição não-anestésica em gravações de PEATE não é recomendada como procedimentos de restrição consciência induzem estresse dramático ao animal, com formação de artefato subsequente grave em ABRs.
  2. Observe os animais cuidadosamente para a profundidade da anestesia, realizando uma pitada de cauda, pinça de pé, e monitoramento da taxa de respiração (camundongos: 150-220 respirs/min). Se necessário, verifique se é possível ofegamento e contracto.
    Observação: diferentes linhas de mouse ou modelos farmacológicos de mouse podem apresentar diferentes sensibilidades à anestesia. O mesmo se aplica a modelos de mouse mutante. A intubação endotraqueal não é uma obrigação neste ambiente experimental e não é recomendada. Como a intubação aumenta o risco de trauma para a traquéia e infecção, o benefício/risco de intubação endotraqueal durante o procedimento de PEATE é negativo.

3. aspectos gerais dos arranjos e instrumentação perianestésicos

  1. Aplique o calor suplementar durante e depois das gravações abr usando um cobertor de aquecimento homeotérmica para manter a temperatura do núcleo do corpo do animal. Mantenha o último em 36.5-38.0 ° c (100.4 ° f).
    Nota: a hipotermia é um factor de risco em pequenos roedores devido à sua elevada proporção de superfície corporal (superfície do corpo do rato = 10,5 x (peso em g)2/3; superfície do corpo do rato = 10,5 x (peso em g)2/3) ao volume do corpo.
  2. Cubra os olhos do animal com pomada de lágrima artificial à base de petróleo ou dexpantenol a 5% durante todo o processo de gravação de ABR para evitar a dessecação da córnea. Continue este procedimento até que o reflexo intermitente seja totalmente restaurado.
  3. Esterilizar os instrumentos experimentais (ver a tabela de materiais) utilizando uma autoclave ou desinfetantes.
    Nota: recomenda-se o uso de um esterilizador de instrumentos cirúrgicos à base de calor com grânulos de vidro.
  4. Para a colocação exata do elétrodo de ABR, use um microscópio cirúrgico binocular da ampliação com uma fonte luminosa fria para a iluminação intensa através das guias de luz móveis flexíveis ou Self-supporting.
  5. Use um revestimento de laboratório limpo, um facemask, uma tampa da cabeça, e luvas estéreis durante a manipulação animal experimental e experimentação.
    Nota: os instrumentos e suprimentos ideais podem variar entre laboratórios e devem atender aos padrões específicos e institucionais do laboratório.

4. gravações ABR

Nota: o protocolo descrito aqui é baseado em um sistema ABR comercialmente disponível para gravações monaural e Binaural. É importante ressaltar que a questão científica a ser abordada deve atender às especificações técnicas do sistema ABR utilizado. A análise do PEATE de gravações Binaural, por exemplo, pode ser utilizada para investigar a codificação lateral dos estímulos auditivos na via auditiva e estudar a assimetria lateral periférica em doenças neuropsiquiátricas.

  1. Realize uma calibração das frequências de estimulação em cada dia da gravação, colocando um microfone conectado a um pré-amplificador e o sistema de processamento (veja a tabela de materiais) dentro do compartimento de atenuação de som no local com o correto orientação onde o ouvido murino experimental será posicionado.
    1. Ligue o pré-amplificador ligado ao microfone pelo menos 5 min antes da calibração para permitir a equilibração do sistema.
    2. Ligue o osciloscópio.
    3. Posicione o microfone conectado a um pré-amplificador dentro do compartimento de atenuação de som para imitar a orelha Murina experimental.
    4. Abra o software de processamento e aquisição disponível comercialmente (consulte a tabela de materiais).
    5. Selecione o arquivo de calibração Cal200K dentro do software para ativar o modo de configuração de calibração e escolher os parâmetros de acordo com as condições experimentais.
    6. Use o sistema de processador para executar o procedimento de calibração. Certifique-se de que as especificações técnicas do microfone e do altifalante em termos de limites de SPL, faixa de frequência e distribuição harmonizam.
    7. Selecione e inicie o protocolo de estimulação de clique predefinido.
    8. Execute um único clique SPL (preferivelmente, o SPL máximo) para verificar que o espectro de estímulos sadios como analisados pela transformação rápida de Fourier em linha (FFT) do osciloscópio combina exigências (escala de energia substancial).
    9. Selecione e inicie o protocolo de estimulação de Tom-Burst predefinido dentro do intervalo de interesse (por exemplo, 1-42 kHz).
    10. Confirme o espectro de frequência dos estímulos de teste acústico gravados usando um osciloscópio e FFT on-line.
      Nota: a calibração diária do sistema e as frequências de estimulação são necessárias para garantir que as frequências de estimulação e os SPLs estejam dentro de intervalos de trabalho aceitáveis.
  2. Coloc o rato anestesiado dentro de um compartimento atenuando sadio alinhado com espuma acústica.
    Nota: o compartimento inteiro deve ser coberto por uma gaiola de Faraday (metal engrenado feito-à-medida ou um comercial) para proteger as gravações ABR da interferência elétrica externa e para protegê-las do ruído.
  3. Para a gravação de potenciais auditivos evocados de tronco encefálico monaural, insira eletrodos subdérmicos em aço inoxidável no vértice, axial da pinnae (eletrodo positivo [+]) e ventrolateral do Pinna direito ou esquerdo (eletrodo [-] negativo), dependendo da orelha a ser medido. Para gravações Binaural, coloque os eletrodos negativos em ambos os pinnae direito e esquerdo. Posicione o eletrodo de aterramento no quadril do animal (Figura complementar 1).
    1. Antes da inserção, formar uma forma de gancho na ponta do eletrodo de aço inoxidável para que a fixação subdérmica dos eletrodos é garantida47.
  4. Realize medições de impedância de todos os eletrodos antes de cada gravação para verificar o posicionamento/condutividade adequada do eletrodo. Use o botão de verificação de impedância no headstage de quatro canais para verificar cada nível de impedância do eletrodo.
    Nota: a impedância deve ser inferior a 5 kΩ.
  5. Registre ABRs condições de campo livre usando um único altifalante (largura de banda de frequência, por exemplo, a 1-65 kHz) colocado 10 cm oposto ao rostro dos animais (a borda principal do altifalante perpendicular ao eixo interaural do rato). Certifique-se de que a posição das orelhas da cabeça/rato do rato é a do microfone de calibração, consoante a distância específica escolhida entre o altifalante e o microfone durante a calibração.
    Nota: em vez de condições de campo livre, tubo de orelha também pode ser usado. No entanto, precauções especiais e testes são necessários para determinar SPLs nessas configurações.
  6. Programe os protocolos de estímulo para os cliques e rajadas de Tom usando software autoprogramado ou comercialmente disponível (veja a tabela de materiais). Os parâmetros de estímulo individuais listados abaixo precisam ser adicionados à interface gráfica do usuário relacionada.
    1. Comece com a configuração da entidade de estímulo de clique (ou seja, um estímulo de duração de 100 μs com polaridade alternada [alternando entre condensação e rarefação] e a energia substancial definida. Use esta entidade do estímulo para analisar e determinar os limiares do clique, a simetria do ABR da orelha esquerda e direita, as amplitudes do ABR W (I-IV), e as latências de W (I-IV) mais tarde.
    2. Inicie o software e use a janela de configuração para adicionar os parâmetros de estímulo de clique. Clique em executar para executar o protocolo.
    3. Continue com a configuração da segunda entidade do estímulo, que é um burst do Tom de 4,5 ms (pulso sinusoidal transiente) da polaridade alterna com ascensão do envelope de Hann e épocas da queda de 1,5 ms cada um (duração do tempo da porta/rampa). Considere uma duração mínima de burst de Tom de 3 ms, particularmente para rajadas de Tom de baixa frequência. Use este estímulo para analisar e identificar limiares auditivos específicos de frequência em todos os genótipos.
    4. Semelhante à etapa 4.6.2, use a janela de configuração para adicionar parâmetros de estímulo de estouro de Tom e clique em executar para executar o protocolo (conforme indicado pelo fabricante48).
    5. Para estudos de Tom Burst, programe a faixa de frequência adequada a ser testada dependendo da questão científica (por exemplo, de 1-42 kHz em etapas de 6 kHz). Certifique-se de que os intervalos de frequência a serem aplicados atendem às capacidades técnicas do altifalante (neste caso, um altifalante magnético multicampo com uma largura de banda de frequência de 1-65 kHz para condições de campo livre ou fechado).
    6. Para calcular a média, defina o número de estímulos acústicos sequenciais (cliques ou rajadas de Tom), por exemplo, a 300X com uma taxa de 20 Hz.
    7. Aumente os SPLs em etapas de 5 dB para cliques e etapas de 10 dB para rajadas de Tom, começando de 0 dB até 90 dB (aumentando o modo SPL).
      Nota: ambos os modos de SPL crescente e decrescente têm sido descritos na literatura. O tamanho da etapa SPL pode ser adaptado devido a perguntas científicas.
  7. Determine uma duração de aquisição de dados de ABR de 25 MS, iniciando com um período basal de 5 ms antes do início do estímulo acústico individual (pré-abr basal) e excedendo uma seção de 10 ms de ABR por outra linha de base de 10 ms (linha de base pós-Abr) (Figura complementar 1 ).
  8. Aplique uma taxa de amostragem apropriada para a aquisição de dados ABR (por exemplo, 24,4 quilohertz) e o filtro do bandpass (passagem elevada: 300 hertz, passagem baixa: 5 quilohertz) usando um filtro de 6 pólos de Butterworth. Ative o filtro de entalhe, se necessário.
    Nota: a taxa de amostragem e as características do filtro podem ser adaptadas devido a requisitos experimentais.
  9. Transfira os sinais bioelétricos resultantes gravados dos eletrodos subdérmicos para um estágio principal e avance para um pré-amplificador com amplificação apropriada (por exemplo, 20 vezes).
  10. Use um software de processamento de sistema ABR específico para coordenar o controle de alto-falante e aquisição, processamento, média e gerenciamento de dados do ABR.
  11. Tente executar os protocolos ABR inteiros (para limiares auditivos evocados por clique e Tom, amplitude de pico e análise de pico de latência, etc.) dentro de cerca de 45 min. Isso corresponde ao tempo de narcose profunda usando 100/10 mg de cetamina/xilazina intraperitonealmente.
  12. Certifique-se de que a calibração, programação/ajustes para apresentação de estímulo e aquisição, configurações de filtro, etc. estão funcionando como esperado antes de anestesiando o animal e realizando a gravação real.

5. análise do PEATE

  1. Análise do limiar de audição de PEATE-evoked de clique e Tom
    1. Execute a deteção automatizada do limiar baseada em publicações mais adiantadas para evitar inconsistências potenciais na determinação do limiar de abr pela inspeção visual/estimativa49,50,51,52.
    2. Defina três janelas de tempo distintas (TWs) para calcular a relação sinal-ruído (SNR): TW1 (0-5 ms), TW2 (5-15 ms) e TW3 (15-25 MS) (Figura complementar 1).
    3. Calcule o desvio padrão do ruído da linha de base dentro dos dois TWs distintos (isto é, TW1 e TW3) onde nenhum AEPs é observado. Este cálculo pode ser feito usando o software Self-programado.
    4. Calcule para cada medida SPL dentro de um registro ABR definindo a média e o desvio padrão para os dados agrupados de TW1 e TW3.
    5. Redefinir todas as amostras de gravação individualmente pela média calculada correspondente para remover qualquer offset DC.
    6. Para determinação do limiar auditivo, identificar o menor NPS (DB) onde pelo menos um valor de amplitude de onda (wI-wIV) na janela de tempo de resposta do abr (TW2) excedeu o quatro vezes do desvio padrão calculado anteriormente.
      Nota: se nenhuma onda ABR foi detectada para a análise do ponto inicial do clique e da freqüência no SPL máximo, um nível de limiar nominal de 100dB é atribuído à orelha.
  2. Análise de latência de onda e amplitude de onda ABR
    1. Conduza uma aproximação wavelet-baseada usando o wavelet mexicano do chapéu para determinar o arranjo temporal-seqüencial de ondas positivas (p) (picos) assim como as ondas (n) negativas (poços) usando um wavelet padrão pela transformação wavelet contínua (CWT)-baseada algoritmo de correspondência de padrões52 (Figura complementar 1).
      1. Matematicamente, o CWT é representado da seguinte forma53.
        Equation
        Aqui, s (t) é o sinal, a é a escala, b é a tradução, o (t) é a mãe wavelet, a, a, b(t) é o wavelet dimensionado e traduzido, e C é a matriz 2D de coeficientes de wavelet.
    2. Inicialmente, use a medição 55-dB de cada PEATE para identificar os melhores parâmetros de escala para cada onda a ser passada para o CWT, o que resulta em três classes: escalas 0,5-4 para todas as ondas n, 0,5-6 para todas as ondas p, e 0,5-12 para WIV como esta é a mais ampla onda dentro das amostras.
      Nota: o 55 dB SPL foi escolhido como ondas são geralmente mais proeminentes aqui e pode ser detectado de forma confiável.
    3. Prove todas as classes para detectar confiantemente a colocação temporal correta de WI-wIV dentro de todas as medidas do DB 55.
    4. Para determinar o ABR WI-wIV na ordem temporal exata dentro da medida do DB 55, os p-picos e os n-picos (poços) são identificados em uma seqüência fixa usando posições relativas de picos previamente identificados para limitar a janela de tempo de verificações subsequentes.
    5. Uma vez que todos os nove picos são identificados em 55 dB, use valores relacionados como pontos de partida para o quadro de busca temporal para as medições de pressão sonora adjacentes (50 dB e 60 dB) antes da identificação dos picos 1-9 é repetido.
    6. Dessa forma, determine p-e n-picos de todos os níveis de dB (55-0 dB e 60-90 dB), se possível. Uma vez que um p-e n-pico não é mais identificado pela análise wavelet, seu arranjo temporal é definido calculando o deslocamento temporal do pico para qualquer outro pico identificado no nível de dB anterior.
    7. Aplicando o deslocamento temporal aos picos a qualquer outro p-e n-pico dentro do nível de decibéis atual resulta em um máximo de oito posições temporais determinadas para os picos indefinidos onde a média é tomada como a aproximação mais próxima.
    8. Para avaliar a função de crescimento da amplitude e a comparação da latência de todas as ondas (WI-wIV), caracterizar as amplitudes máximas e as latências médias de cada um dos picos-p dentro do período de tempo dos n-picos relacionados.
    9. Verifique visualmente todos os resultados com base na ferramenta de wavelet automática autoprogramado depois, e, se necessário, exclua o ABR individual decorre das estatísticas se eles não atenderam aos critérios de inclusão/qualidade rigorosos.
      Nota: na análise automatizada e na inspeção visual de ABRs, uma aproximação dobro-cega é recomendada.

6. cuidados pós-operatórios e tratamento pós-ABR

  1. Monitore continuamente os animais até que recuperem a consciência e sejam capazes de manter a recumbência esternal.
  2. Não devolver um animal que sofreu gravações ABR para a empresa de outros animais até que tenha recuperado totalmente.
  3. Injetar carprofeno (rato: 1x 5-10 mg/kg, por via subcutânea; rato: 1x 2,5-5,0 mg/kg, por via subcutânea) para o tratamento da dor pós-operatória.
    Nota: o tratamento duradouro da dor não é exigido porque os elétrodos da gravação do ABR são introduzidos subcutaneously.
  4. Postoperatively, alimentam pelotas umedecidas a fim facilitar a captação do alimento. Observe cuidadosamente os alimentos (~ 15 g/100 g de peso corporal/dia; ~ 5 g/24 h) e água (~ 15 mL/100 g de peso corporal/dia; ~ 5 mL/24 h) consumo.
  5. Monitore os animais de perto para o retorno de suas posturas e comportamentos normais.
    Nota: a administração sistêmica de antibióticos como enrofloxacina ou trimetoprim-sulfonamida não é recomendada aqui, pois a colocação do eletrodo subdérmico é de apenas uma invasividade mínima. A aplicação de antibióticos deve ser restringida a menos que ocorram sinais de inflamação local ou generalizada.
  6. Recuperação pós-experimental de seguimento após gravações de ABR controlando o peso corporal do animal.

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Representative Results

As gravações de ABR evocadas por estouro de clique e Tom podem ser usadas para avaliar diferenças de limiar auditivo, função de crescimento de amplitude e comparação de latência. Os ABRs Click-evoked no modo crescente SPL são representados na Figura 1 para controles e duas linhas de mouse exemplares mutantes que são deficientes para o cav3,2 T-tipo tensão-gated CA2 + Channel (i.e., CAv3,2+/- e CA v3,2 mutantes nulos [Cav3,2-/-]). Como descrito acima, uma investigação específica de gênero é geralmente recomendada, devido a diferenças específicas do sexo nos parâmetros auditivos nos seres humanos54,55 e camundongos56,57. ABRs para Free-Field Click (0,1 ms) e Tone Burst (1 – 42 kHz em 6 kHz passos, 4,5 ms no total com um 1,5 ms tempo de rampa) estímulos acústicos foram registrados como descrito no protocolo. Note que os potenciais vértice-positivos são plotados como deflexões ascendentes como representado em gravações Click-evoked representativas para a fêmea CAv3,2+/+ (Figura 1a), CAv3,2+/- (Figura 1b ) e CAv3,2-/- camundongos (Figura 1C). Nesse cenário, as ABRs representativas em fêmeas sugeriram um aumento do limiar auditivo de PEATE-evocado e alteração da função de crescimento da amplitude em ratos fêmeas CAv3,2-/- em comparação com CAv3,2+/+ e CAv 3,2+/- animais. A mesma tendência foi observada para os machos que sugeriram um aumento dos limiares de PEATE-evoked e amplitudes reduzidas em CAv2,3-/- comparado aos controles e heterozygous CAv3,2+/- camundongos. Os ABRs evocados por rajada de Tom exemplar são representados na Figura 2 para as fêmeas cav3,2+/+, CAv3,2+/-e CAv3,3-/- camundongos (todos os animais tinham 20 semanas de idade).

Como primeiro passo na análise do desempenho auditivo geral, foram investigados ABRs com clique-evocado para diferentes SPLs (0 – 90 dB) utilizando o sistema automatizado de detecção de limiar de ABR descrito na seção 5 do protocolo (Figura 3). Os animais analisados foram pareados por idade, pois o envelhecimento pode ter impacto dramático na perda auditiva neurossensorial58,59. Em seguida, foram analisadas as possíveis alterações nos níveis de limiar de PEATE evocados por diferentes frequências de burst de Tom (1 – 42 kHz, Figura 4). Nas linhas de mouse exemplares, CAv2,3+/- e CAv3,2-/- exibiram limiares auditivos aumentados de Click e Tone em relação aos controles (todos os animais tinham 20 semanas de idade).

Usando a aproximação wavelet-baseada esboçada acima, a função do crescimento da amplitude do clique-evoked e a análise da latência da forma de onda do ABR foram realizadas (FigURE 5 e FigURE 6, respectivamente). Este último permite a introspecção na influência armazenamento possível do gene do interesse no processamento auditivo da informação dentro da orelha interna e do brainstem.

Figure 1
Figura 1: ABRs Click-evoked nos controles e nos ratos do mutante (CAv3,2+/-, CAv3,2-/-). Os ABRs representativos obtidos de(a) CAv3,2+/+, (B) CAv3,2+/-, e (C) CAv3,2-/- ratos fêmeas em cima da estimulação do clique no modo crescente do SPL (de 0 – 90 dB com 5 dB SPL passos). Para a média, cada entidade de estímulo foi aplicada 300 vezes em 20 Hz. O início do estímulo acústico é indicado por uma linha vermelha vertical. Este valor é modificado de Lundt et al.60. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: ABRs evocados por rajada de Tom em controles e camundongos mutantes (CAv3,2+/-, CAv3,2-/-). Representante ABRs de (a) CAv3,2+/+, (B) CAv3,2+/-, e (C) CAv3,2-/- camundongos fêmeas após rajadas de Tom de 1 – 42 kHz (6 kHz passos) em um SPL de 80 dB. Para a média, cada entidade de estímulo foi apresentada 300 vezes em 20 Hz. O início do estímulo acústico é indicado por uma linha vermelha vertical. Este valor é modificado de Lundt et al.60. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: limiares auditivos baseados em PEATE com Click-evoked em controles e camundongos mutantes (CAv3,2+/-, CAv3,2-/-). Limiar auditivo audiométrico Click-evocado de (A) fêmea e(B) masculino CAv3,2+/+ (feminino: n = 12; masculino: n = 13), CAv3,2+/- (feminino: n = 10; masculino: n = 9), e CAv3,2-/- camundongos (feminino: n = 10; masculino: n = 9). Os dados são plotados como média ± SEM. significâncias estatísticas foram determinadas utilizando-se o nível α = 0, 5 e p-valores definidos como *p < 0, 5; * *p < 0, 1; p < 0, 1; p < 0, 1. Este valor é modificado de Lundt et al.60. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Limiares auditivos de Tone Burst-evoked abr-based em controles e camundongos mutantes (CAv3,2+/-, CAv3,2-/-). 1 – 42 kHz (6 kHz Steps) limiares auditivos audiométricos com base em PEATE-evocados ABR para CAv3,2+/+ (feminino: n = 12; masculino: n = 12; ▲), CAv3,2+/- (feminino: n = 10; masculino: n = 8; ■), e CAv3,2-/- animais (feminino: n = 10; masculino: n = 9; ○). Os dados são plotados como média ± sem. significâncias estatísticas foram determinadas por meio de α-level = 0, 5 e p-valores definidos como *p < 0, 5; * *p < 0, 1; p < 0, 1; p < 0, 1. Este valor é modificado de Lundt et al.60. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: função de crescimento de amplitude em gravações ABR baseadas em clique em controles e camundongos mutantes (CAv3,2+/-, CAv3,2-/-). Amplitude de wI-wIV (em microvolts) plotada de encontro a um SPL crescente (nos decibéis) para a análise estalada-EVOKED da onda de abr em CAv3,2+/+ (fêmea: n = 12; macho: n = 11; linha preta que representa o curva de controle aproximada, incluindo o intervalo de confiança de 95% em cinza), CAv3,2+/- (feminino: n = 8; masculino: n = 7; ■) e CAv3,2-/- animais (feminino: n = 7; masculino: n = 9 ; ○). Ambos os ratos CAv3,2-/- fêmeas e machos exibem um aumento significativamente tardio do crescimento da amplitude em todos os SPLs crescentes para (a e B) wI, (C e D) wII, e (G e H) WIV em comparação com os camundongos CAv3,2+/+ e CAv3,2+/- . ( E e F) Para WIII, apenas cav3,2-/- camundongos machos exibiu um atraso significativo no crescimento da amplitude em todo o SPL crescente em comparação com a fêmea CAv3,2-/- animais. Os dados são apresentados como média ± SEM. significâncias estatísticas foram determinadas utilizando-se o nível α = 0, 5 e p-valores definidos como *p < 0, 5; * *p < 0, 1; p < 0, 1; p < 0, 1. Este valor é modificado de Lundt et al.60. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: análise de latência ao clicar-evocado ABR gravações em controles e camundongos mutantes (CAv3,2+/-, CAv3,2-/-). Latências (em milissegundos) para cada onda de abr (w I– wIV) em 65 dB SPL são retratadas para CAv3,2+/+ (feminino: n = 12; masculino: n = 11), CAv3,2+/- (feminino: n = 8; masculino: n = 7) e Cav3,2-/- camundongos (feminino: n = 8; masculino: n = 9). Observe que a análise de latência também pode ser realizada em níveis de sensação específicos. Os dados são representados como média ± SEM. significâncias estatísticas foram determinadas utilizando-se o nível α = 0, 5 e p-valores definidos como *p < 0, 5; * *p < 0, 1; p < 0, 1; p < 0, 1. Este valor é modificado de Lundt et al.60. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Complementar Figura 1: arquitetura do PEATE e posicionamento do eletrodo. (A) registro de abr representativo em 65 dB SPL. A linha de base inicial (TW1,5MS) foi seguida pelo estímulo teste (Click ou Tone burst) e TW2 (10 ms) contendo os primeiros potenciais evocados do tronco encefálico. A TW2 foi seguida por outra linha de base (TW3, 10 ms). Os períodos basais foram utilizados para calcular o DP do ruído basal. Sempre que uma onda de ABR individual (WI– wIV) amplitude excedeu o DP do ruído basal em quatro vezes, o limiar auditivo foi atingido. Para a comparação de amplitude de onda e latência, uma abordagem wavelet baseada em "chapéu mexicano" foi realizada para detectar automaticamente picos negativos (linhas listradas azul-amarelas) e picos positivos (linhas listradas vermelho-cinzentas). As cruzes verdes indicam as amplitudes máximas absolutas da onda de ABR e não exibem valores aproximados baseados na aproximação wavelet. (B) para as gravações de abr, foram utilizados eletrodos de aço inoxidável subdérmicos com ponta em forma de gancho. O eletrodo de referência foi colocado no quadril esquerdo, o eletrodo positivo (+) foi posicionado no vértice (axial da pinnae), e o eletrodo negativo (-) foi introduzido ventrolateral do Pinna direito, dependendo se uma gravação monaural ou Binaural foi Realizado. Este valor é modificado de Lundt et al.60. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Este protocolo fornece uma descrição detalhada e Integrativa de como gravar respostas evocadas auditivas do tronco encefálico nos ratos. Coloca o foco específico no pré-tratamento animal, na anestesia, e em fatores de confundimento metodológicos potenciais. Estes últimos incluem, entre outros, sexo, linha do mouse, idade e condições de moradia. Deve-se notar que todos esses fatores podem ter impacto na perda auditiva neurossensorial e aspectos fundamentais do processamento da informação auditiva. Assim, a estratificação adequada dos estudos de perfil auditivo é obrigatória.

A instrumentação de gravações AEP tem evoluído tremendamente nos últimos 50 – 60 anos, e hoje em dia, sistemas de gravação de ABR comerciais estão disponíveis que têm melhorado e simplificado a aplicação da técnica, mas também introduziram novas armadilhas. Alguns desses aspectos são discutidos aqui. Primeiro, o usuário deve se acostumar com o sistema ABR, ou seja, a instrumentação composta por computador desktop ou laptop, o pré-amplificador, o amplificador, a caixa de entrada do eletrodo e os potenciais transdutores (por exemplo, alto-falantes, fones de inserção, supra-aural auscultadores e osciladores ósseos). Notavelmente, as condições de gravação são de importância central. Devido à sua alta susceptibilidade, as gravações de ABR precisam ser protegidas para protegê-las da contaminação com ruídos elétricos externos e para garantir uma relação sinal-ruído adequada.

Outro aspecto importante é a instrumentação propriamente dita (por exemplo, o gerador de estímulos, Transdutores e gatilhos). Os tipos de estímulos mais comumente usados em camundongos são 100 μs cliques e rajadas de curta duração com uma amplitude modulada e/ou propriedades de frequência. Os transdutores podem apresentar uma variedade de estímulos acústicos a uma orelha ou a ambas as orelhas. Aqui nós apresentamos resultados de ABR usando um único altifalante rostral ao animal experimental. No entanto, outras abordagens também são possíveis, incluindo fones de ouvido de inserção em estilo Tubal ou em uma orelha ou ambas as orelhas. Fones de ouvido supra-aural como usados em humanos não são viáveis em camundongos. Como a literatura ilustra, diferentes abordagens podem ser bem-sucedidas, e elas devem ser adaptadas dependendo das necessidades experimentais. A atenção especial deve ser dada à rigor do disparador que é essencial para a média do sinal porque este pulso digital determina quando cada estímulo individual é apresentado. Para gravações apropriadas, o início do gatilho e do estímulo deve ser síncrono, representando o ponto de tempo zero. Os sistemas de gravação ABR disponíveis comercialmente normalmente incluem gatilhos autocontidos quando os estímulos individuais são apresentados. Em muitos sistemas, existem entradas externas que permitem uma conexão de um gerador de estímulo externo e um gatilho associado. Em ambos os casos, acabou por ser valioso para controlar as características de estímulo e gatilho usando um osciloscópio externo. Atenção especial também deve ser dada aos parâmetros de aquisição (por exemplo, amplificação diferencial, filtragem, analógico versus filtros digitais, modelos de filtro e parâmetros de média de sinal). Notavelmente, os parâmetros apresentados no protocolo aqui apresentados correspondem às exigências experimentais dos resultados exemplares descritos acima. No entanto, podem ser necessárias adaptações, por exemplo, na taxa de amostragem, número de estímulos aplicados para a média e sua frequência de aplicação, dependendo das configurações experimentais.

Finalmente, alguns comentários breves devem ser feitos na impedância do elétrodo, nos tipos do elétrodo, e na colocação do elétrodo. Os eletrodos atuam como antenas, pegando mudanças de tensão abaixo da pele. A colocação do eletrodo subcutâneo é obrigatória, pois a mera aplicação de eletrodos na pele ou no couro cabeludo não é adequada devido à resistência da camada externa da pele (i.e., o estrato córneo). Considerando que em seres humanos a condutividade elétrica é normalmente melhorada por raspa células mortas da pele e a aplicação de um gel eletrólito ou pasta, isso geralmente não é feito e adequado em camundongos onde os eletrodos subdérmicos são usados. A relação do elétrodo e da pele dá forma à impedância do elétrodo que inclui as propriedades elétricas do condutor no total. As propriedades do condutor incluem as propriedades do material do eletrodo e a área de superfície do eletrodo de contato, propriedades do tecido, incluindo os detritos (óleo, sujeira, suor, etc.), e a solução de eletrólitos. O material do elétrodo inclui a prata, o ouro, a platina, a ligação, a lata, e o aço inoxidável com baixa impedância e baixos potenciais do elétrodo. Deve-se tomar cuidado para que o material do eletrodo seja inerte condições de gravação. Com a prata, isso é conseguido usando os chamados eletrodos complexos (ou seja, cloreto de prata-prata [Ag-AgCl] eletrodos). Neste caso, a camada dupla elétrica permite uma troca livre de íons que reduz ainda mais a impedância. Recomenda-se frequentemente que a impedância do elétrodo não deva exceder 5 kΩ e que a impedância dos elétrodos individuais (pelo menos três) é comparável. Recomenda-se também que a impedância do intereletrodo esteja abaixo de 2 kΩ. O eletrodo de gravação representa um fio metálico longo com um revestimento isolante. O eletrodo de arame é conectado através de um plugue para o equipamento de gravação, na maioria dos casos o pré-amplificador/amplificador. Em camundongos, a outra extremidade do fio do eletrodo é geralmente acúmulo de um eletrodo de agulha que pode ser deixado em linha reta ou — melhor — arcusado. Outros tipos do elétrodo, tais como o disco-ou o copo-dado forma, não importa se são para a reutilização ou o descartável pregelled, é restrito para usar-se nos seres humanos e não aplicável aos ratos.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Christina Kolb (centro alemão de doenças neurodegenerativas [DZNE]) e ao Dr. Robert Stark (DZNE) por sua assistência na criação de animais e na assistência à saúde animal. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Instituto Federal de medicamentos e dispositivos médicos (Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte, BfArM, Bonn, Alemanha).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AEP/OAE Software for RZ6 (BioSigRZ software) Tucker-Davis Technologies (TDT) BioSigRZ
Binocular surgical magnification microscope Zeiss Stemi 2000 0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000
Cages (Macrolon) Techniplast 1264C, 1290D
Carprox vet, 50mg/ml Virbac Tierarzneimittel GmbH PZN 11149509
Cold light source Schott KL2500 LCD 9.705 202
Cotton tip applicators (sterile) Carl Roth EH12.1
Custom made meshed metal Faraday cage (stainless steel, 2 mm thickness, 1 cm mesh size) custom made custom made
5% Dexpanthenole (Bepanthen eye and nose creme) Bayer Vital GmbH PZN: 01578681
Disposable Subdermal stainless steel Needle
electrodes, 27GA, 12mm		 Rochester Electro-Medical, Inc. S03366-18
Surgical drape sheets (sterile) Hartmann PZN 0366787
Ethanol, 70% Carl Roth 9065.5
1/4'' Free Field Measure Calibration Mic Kit Tucker-Davis Technologies (TDT) PCB-378C0
Gloves (sterile) Unigloves 1570
Graefe Forceps-curved, serrated FST 11052-10
GraphPad Prism 6 Software, V6.07 GraphPad Prism Software, Inc. https://www.graphpad.com/
Heat-based surgical instrument sterilizer FST 18000-50
Homeothermic
heating blanked		 ThermoLux 461265 / -67
Ketanest S (Ketamine), 25mg/ml Pfizer PZN 08707288
Ringer’s solution (sterile) B.Braun PZN 01471434
Matlab software MathWorks, Inc. https://de.mathworks.com/products/matlab.html
Medusa 4-Channel Low Imped. Headstage Tucker-Davis Technologies (TDT) RA4LI
Medusa 4-Channel Pre-Amp/Digitizer Tucker-Davis Technologies (TDT) RA4PA
Microphone PCB Pieztronics 378C01
Multi Field Speaker- Stereo Tucker-Davis Technologies (TDT) MF1-S
Oscilloscope Tektronix DPO3012
Optical PC1 express card for Optibit Interface) Tucker-Davis Systems (TDT) PO5e
Askina Braucel pads (cellulose absorbet pads) B.Braun PZN 8473637
Preamplifier PCB Pieztronics 480C02
RZ6 Multi I/O Processor system (BioSigRZ) Tucker-Davis Technologies (TDT) RZ6-A-PI
0.9% saline (NaCl, sterile) B.Braun PZN:8609255
SigGenRZ software Tucker-Davis Technologies (TDT) https://www.tdt.com/
Software R (version 3.2.1) + Reshape 2 (Version 1.4.1) + ggplot 2 (version 1.0.1) + datatable (version 1.9.4), + gdata (version 2.13.3), + pastecs (version 1.3.18), + waveslim (version 1.7.5), + MassSpecWavelet (version 1.30.0) The R Foundation, R Core Team 2015 Open Source Software (freely distributable)
Sound attenuating cubicle Med Associates Inc. ENV-018V
Standard Pattern Forceps, 12cm and 14.5 cm length FST 11000-12, 11000-14
Leukosilk tape BSN medical GmbH & Co. KG PZN 00397109
Tissue Forceps- 1x2 Teeth 12 cm FST 11021-12
Uniprotect ventilated cabinet Bioscape THF3378
Ventilated cabinet Tecniplast 9AV125P
Xylazine (Rompun), 2% Bayer Vital GmbH PZN 1320422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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