Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Farelerde beyin sapı uyarılmış yanıt odyometrisi veri edinme ve Analizi

Published: May 10, 2019 doi: 10.3791/59200
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 3, 4, 5, 5, 6, 1,7, 1, 1
1Experimental Neuropsychopharmacology, Federal Institute for Drugs and Medical Devices, 2KBRwyle GmbH, 3Cognitive Neurophysiology, Department of Psychiatry and Psychotherapy, Faculty of Medicine, University of Cologne, 4Molecular and Cellular Cognition, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 5Institute of Neurophysiology, Faculty of Medicine, University of Cologne, 6Federal Institute for Drugs and Medical Devices (BfArM), 7Thescon GmbH

Summary

Beyin sapı uyarılmış reaksiyon odyometrisi klinik nörofizyolojide önemli bir araçtır. Günümüzde hem farmakolojik hem de genetik hayvan modellerini içeren temel bilim ve preklinik çalışmalarda beyin sapı uyarılmış yanıt Odyometri de uygulanır. Burada işitme beyin tepkileri yanıtlarının farelerde nasıl başarıyla kaydedilip analiz edileceğini ayrıntılı bir şekilde tarif ediyoruz.

Abstract

Beyin sapı uyarılmış reaksiyon odyometrisi (BERA) klinik nörofizyolojide merkezi alaka düzeyine sahiptir. Görsel olarak uyarılan potansiyeller (VEPs) veya somatoduyusal uyarılmış potansiyeller (SEPs) gibi diğer uyarılmış potansiyel (EP) teknikleri gibi, işitsel uyarılmış potansiyeller (AEPs) aynı stimüllerin tekrarlayan sunumu ile tetiklenir, daha sonra ortalama olarak farklı pozitif (p) ve negatif (n) sapmaları ile sonuçlanan Elektroensefalografi (EEG) tepkisi. İnsanlarda, altta yatan nöronal devrelere senkronizasyon ve iletim hızı değişiklikleri karakterize etmek için her iki genlik ve bireysel dorukların gecikme kullanılabilir. Daha da önemlisi, AEPs, farmakolojik ve genetik hayvan modellerinde işitsel fonksiyonun tanımlanması ve karakterize edilmesi için temel ve preklinik bilimlere de uygulanır. Daha da fazla, farmakolojik test ile birlikte hayvan modelleri sensorineval işitme kaybı tedavisinde potansiyel faydaları araştırmak için kullanılır (örneğin, Yaş veya gürültü kaynaklı işitme açıkları). Burada, tıklama ve ton patlaması uygulamasını kullanarak farelerde işitsel beyin-uyarılmış yanıtların (ABRs) Nasıl kaydetmelerine ilişkin ayrıntılı ve entegratif bir açıklama sağlıyoruz. Bu protokolün belirli bir odak öncesi deneysel hayvan konut, anestezi, ABR kayıt, ABR filtreleme süreçleri, otomatik dalgalı bazlı genlik büyüme fonksiyon Analizi ve gecikme algılama üzerinde.

Introduction

Beyin fizyolojisinin merkezi bir yönü, öğrenme, bellek, duygusal reaksiyonlar veya motorik tepkiler gibi farklı içsel veya ekstrensek çıktıda sonuçlanan çevresel bilgileri işleme yeteneğidir. Çeşitli deneysel ve tanı yaklaşımlar, bireysel nöronal hücre türlerinin veya bir uyarıcı ile ilgili nöronal devrelerde nöronların kümeleri/toplulukların elektrofizyolojik tepkisini karakterize etmek için kullanılabilir. Bu elektrofizyolojik teknikler mikro-, meso-ve macroscale1' de farklı uzamsal boyutları kapsar. Mikroölçek seviyesi, örneğin, kültürlü veya akut ayrılmış nöronlar1kullanarak farklı yama-kelepçe modlarında gerilim ve akım kelepçe yaklaşımlar içerir. Bu in vitro teknikleri bireysel mevcut varlıkların karakterizasyonu ve farmakolojik modülasyon2,3için izin verir. Ancak temel bir dezavantajı, mikro ve makrodevre bilgi entegrasyonu ve işleme ile ilgili olarak sistemik bilginin eksikliği. Bu bozukluk, sadece kültürlü nöronlar değil, aynı zamanda akut beyin dilimleri4, aynı anda ekstrasellüler multielektrot kayıtları için izin multielektrot dizileri gibi mesoscale In vitro teknikleri ile kısmen üstesinden gelen, 5. mikrodevreler Beyin dilimleri içinde belirli bir ölçüde (örneğin, Hippocampus) korunmuş olabilir, uzun menzilli bağlantı genellikle6kaybolur. Sonuçta, nöronal devrelerde fonksiyonel bağlantıları incelemek için, macroscale 'de sistemik in vivo elektrofizyolojik teknikler seçim yöntemidir7. Bu yaklaşımlar arasında, diğer şeylerin yanı sıra, yüzey (epidural) ve derin (intracerebral) EEG kayıtları hem insanlar ve hayvan modelleri1gerçekleştirilir. EEG sinyalleri ağırlıklı olarak uyarıcı giriş8genel üstünlüğü rağmen inhibitör veya uyarıcı olabilir farklı kortikal katmanlarda piramit nöronlar üzerinde senkronize sinaptik girişe dayanmaktadır. Senkronizasyon üzerine, ekstrasellüler elektrik alanlarında uyarıcı postsinaptik potansiyel tabanlı vardiya yüzey elektrotları kullanarak kafa derisi üzerinde kaydedilecek yeterli mukavemet sinyali oluşturmak için toplanır. Özellikle, bireysel bir elektrot algılanabilir bir kafa derisi kayıt piramit nöronların 10000 aktivite ve teknik cihazlar ve işleme araçları, bir amplifikatör de dahil olmak üzere karmaşık bir silah, filtreleme süreçleri (düşük pass filtre, gerektirir yüksek geçişli filtre, çentik filtre) ve özel iletken özelliklere sahip elektrotlar.

En deneysel hayvan türlerinde (yani, fareler ve fareler), insan bazlı kafa derisi EEG yaklaşımı Teknik olarak uygulanamaz, altta yatan korteks tarafından oluşturulan sinyal senkronize piramit nöronların sınırlı sayıda nedeniyle çok zayıf olduğu gibi9, 10,11. Kemirgenler, yüzey (kafa derisi) elektrotları veya subdermal elektrotlar böylece ciddi Elektrokardiyogram ve yüksek kaliteli EEG kayıtları imkansız hale ağırlıklı elektromyogram eserler tarafından kontamine olan9,11, 12., bu nedenle doğrudan epidural elektrotlar ya da derin, intraserebral yapıları yoluyla korteks gelen algılama ucu doğrudan fiziksel bağlantı sağlamak için ya da kaydetmek için zorunlu olan anestezize serbestçe hareketli fareler ve fareler kullanırken sinyal üreten nöronal hücre kümeleri için kurşun/implante elektrot. Bu EEG yaklaşımlar ya bir kısıtlayıcı gergin sistem kurulum veya nonrestraining implante EEG radyo telemetri yaklaşımı kullanarak gerçekleştirilebilir9,10,11. Her iki tekniği de onların artıları ve eksileri var ve nöbet duyarlılık/nöbet aktivitesi, sirkadiyen ritmik, uyku mimarisi, osilasyon aktivitesi ve senkronizasyon nitel ve niceliksel karakterizasyonu değerli bir yaklaşım olabilir, zaman sıklığı analizi, kaynak analizi, vb9,10,13,14,15,16,17dahil.

Gergin sistemler ve radyo telemetri kısıtlama/semirestyağmur veya kısıtsızlık koşulları altında EEG kayıtları için izin verirken, sırasıyla, ilgili deneysel koşullar ABR kayıtları için gereksinimlerle eşleşmiyor. Bir hoparlör ve deneysel hayvan ve kontrollü ses basıncı seviyeleri (SPLs) tanımlı pozisyonları ile zamanla sürekli olarak sunulan tanımlanmış akustik uyaranlara için ikinci talep. Bu durum, yasaklama koşulları altında ya da18,19. Deneysel stres azaltmak için, hayvanlar normalde ABR deney sırasında anestezize, ama anestezi ABRS ile müdahale olabilir düşünülebilir19,20.

Genel bir karakteristik olarak, EEG 50-100 μV voltaj aralığında farklı frekanslarda inşa edilmiştir. arka plan frekansları ve genlikleri güçlü deneysel hayvanın fizyolojik durumuna bağlıdır. Uyanık durumda, Beta (β) ve gama (γ) daha düşük amplitüd frekansları baskın. Hayvanlar uykuya dalarak veya uyurken, Alfa (α), teta (θ) ve Delta (δ) frekansları ortaya çıktığında, artan EEG genliği21' i sergiler. Bir duyusal kanal (örn., akustik yol) uyarıldığında, bilgi yayılımı periferik ve merkezi sinir sistemi aracılığıyla nöronal aktivite yoluyla aracılaşmış olur. Bu duyusal (örn. Akustik) stimülasyon, EPs veya uyarılmış tepkiler olarak adlandırılır. Özellikle, olay ile ilgili potansiyeller (ERPs) EEG daha genlik çok daha düşüktür (yani, sadece birkaç mikrovoltlar). Böylece, tek bir uyarıcı dayalı herhangi bir bireysel ERP yüksek genlik EEG arka plan karşı kaybolur. Bu nedenle, bir ERP kaydı özdeş uyaranların tekrarlayan uygulama gerektirir (örneğin, ABR kayıtları tıklamalar) ve sonraki herhangi bir EEG arka plan etkinliği ve eserler ortadan kaldırmak için Ortalama. ABR kayıtları anestezileştirilmiş hayvanlarda yapılırsa, burada subdermal elektrotlar kullanımı kolaydır.

Temelde, AEPs normalde ABRs veya BERA ile ilgili kısa gecikme EPs, ve daha sonraki başlangıç potansiyelleri gibi Orta gecikme EPs (Orta gecikme yanıt [MLR]) ve uzun gecikme EPs22içerir. Daha da önemlisi, işitsel bilgilerin bilgi işlemede rahatsızlığı genellikle Nöropsikiyatri hastalıklarının (demyelasyon hastalıkları, şizofreni vb.) merkezi bir özelliğidir ve AEP değişikliklerle ilişkilidir23,24 ,25. Davranışsal araştırmalar sadece fonksiyonel bozukluğu açığa çıkarabilecek durumda ise, AEP çalışmaları belirli nöroanatomik yapılarla ilgili işitsel disfonksiyonun kesin uzamsal analizine izin verir26.

Erken, kısa gecikmeli akustik EPs olarak ABRs normalde orta yüksek yoğun tıklama uygulaması üzerine tespit edilir ve yedi ABR zirveleri (Wı-wVII) kadar ortaya çıkabilir. En önemli dalgalar (Wı-wV) aşağıdaki nöroanatomik yapıları ile ilişkilidir: Işitme sinirine Wi (distal kısmı, iç kulak içinde); WII Cochlear çekirdeğine (işitsel sinirin proksimal kısmı, beyin sapı fesih); WIII üstün olivary KOMPLEKSI (SoC) için; WIV lateral lemniskusu için (ll); WV yan lemniskusu (ll) ' in alt koliculus (IC) içinde Kontralateral tarafta27 (Tamamlayıcı Şekil 1) içinde feshi. Bu WII-wV büyük olasılıkla onlara katkı artan işitsel yol birden fazla anatomik yapısına sahip olduğunu unutulmamalıdır. Özellikle, tepelerin ve işitsel sistemin altta yatan yapıların tam korelasyon hala tamamen açıklığa kavuşturulmaz.

Odyolojide, ABRS bir tarama ve tanı aracı olarak ve cerrahi izleme için28,29olarak kullanılabilir. Dysacusis, hypacusis ve anacusis (örn. yaşa bağlı işitme kaybı, gürültü kaynaklı işitme kaybı, metabolik ve konjenital işitme kaybı, asimetrik işitme kaybı ve deformiteler nedeniyle işitme açıkları veya malformasyonlar, yaralanmalar ve neoplazmlar)28. ABRs aynı zamanda hiperaktif, entelektüel Engelli çocuklar için veya geleneksel Odyometri (örneğin, DEHB, MS, otizm vb. gibi nörolojik/psikiyatrik hastalıklarda) yanıt verebilen diğer çocuklar için bir tarama testi olarak da ilgilidir.29 , 30) ve koklear implantların gelişimi ve cerrahi montaj28. Son olarak, ABRS antiepileptik31,32gibi potansiyel ototokezik yan-nöropsikoloji, etkileri içine değerli bir fikir verebilir.

Farmakolojik veya transjenik fare modellerinden insanlara elde edilen nörofizyolojik bilginin çevirisinin değeri, özellikle fareler ve fareler33işitsel paradigmalar Içinde Erps düzeyinde çok sayıda ayarlar gösterildi, 34,35. Değiştirilmiş erken AEPs ve fareler ve fareler içinde işitsel bilgi işleme ilişkili değişiklikler içine yeni anlayış bu nedenle insanlara çevrilebilir ve işitsel, nörolojik karakteristik ve endophenotyping merkezi öneme sahiptir ve gelecekte nöropsikiyatrik hastalıklar. Burada, ABRs 'nin temel bilimsel, toksikolojik ve farmakolojik amaçlar için farelerde nasıl başarıyla kaydedilip analiz edileceğini ayrıntılı bir açıklama sağlıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri Alman hayvan bakımı Konseyi yönergelerine göre yapılmıştır ve tüm protokoller, yerel kurumsal ve ulusal hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (Landesamt für Natur, Umwelt, und Verbraucherschutz, State Kuzey Ren-Vestfalya ofisi, Doğa, çevre ve tüketim bölümü [LANUV NRW], Almanya). Yazarlar daha da tüm hayvan deney bakım ve laboratuar hayvanları kullanımı (NıH yayınlar No 80-23) için sağlık Kılavuzu Ulusal Enstitüleri uyarınca yürütülmüştür teyit 1996 veya INGILTERE hayvanlar (bilimsel prosedürler) Yasası revize 1986 ve ilişkili yönergeler veya 24 Kasım 1986 (86/609/EEC) ve 22 Eylül 2010 (2010/63/EU) Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi. Özel çaba kullanılan hayvanların sayısını ve onların acı (3R [değiştirme, azaltma ve iyileştirici] strateji) en aza indirmek için yapılmıştır.

1. deneysel hayvanlar

  1. Deneysel hayvanların ve türlerin seçimi
    1. Homoloji, izomorfilizm ve belirli bir insan hastalığına ilişkin öngörülebilirlik gereksinimlerini karşılayan kemirgenler/kemirgen modellerde (fare veya fareler) ABR çalışmaları gerçekleştirin. Bu translasyonel Nörobilim temel yönleri açısından spesifik öneme sahiptir.
      Not: mevcut çeşitli fare ve sıçan suşlarının temel fizyolojik ve patofizyolojik özellikleri36,37,38farklılıkları gösterebilir düşünün. Bu fare/sıçan hattı ile ilgili özellikler deneysel planlamada dikkate alınmalıdır.
    2. Fizyoloji ve farmakolojide elektrofizyolojik deneyler üzerinde etkisi olabilecek fare ve sıçan-gerinim-spesifik değişimleri düşünün (örn. değiştirilmiş anestezik hassasiyetler, sirkadiyen ritmik, [Audiogenic] nöbet duyarlılığını, yaşı, ve genetik arka plan)39,40,41,42.
    3. Çalışma tasarımına cinsiyete özgü tabakalaşmayı ekleyin. Bu karşılaştırsaydın döngüsü ciddi anestezik duyarlılık etkileyebilir unutmayın, merkezi ritmik, sirkadiyen bağımlılığı, ve nöbet aktivitesi (işitsel nöbetler) ve duyusal (işitsel) bilgi işleme43,44 , 45. böylece, cinsiyete özgü bir analiz gerçekleştirin.
      Not: Eğer mali ve deneysel Kapasite sınırlıdır erkek fareler için kısıtlayın, normalde Bisiklet kadınlarda çeşitli nörofizyolojik parametreler erkeklerde46karşılaştırıldığında artan değişkenlik sergiler görünmüyor rağmen.
  2. Hayvan konut ve taşıma
    1. Ev fareler veya fareler bir hayvan tesisi içinde ayrı havalandırılmış kafeslerde.
    2. Anestezi, ABR elektrot yerleştirme ve ABR kayıtları için tasarlanmış özel laboratuar odalarında bulunan havalandırılmış dolapları hayvan tesisinden deneysel hayvanları taşıyın.
    3. Hayvanların standart çevre koşullarında (yani, 21 ± 2 °C,% 50-60% bağıl nem ve geleneksel 12/12 h ışık/karanlık döngüsüyle) havalandırmalı bir kabine yerleştirildiğinden emin olun. Hayvanların boyunca uyum sağlamasına ve bu sirkadiyen desen için en az 14 gün önce sonraki deney için uyum sağlar.
    4. Kullanım açık Polikarbonat kafesler tip II (26,7 cm x 20,7 cm x 14,0 cm, bir alan 410 cm2) için bir alanı ve kullanım açık Polikarbonat kafesler tip III (3-4 cm x 42,5 cm x 26,6 cm, bir alan 18,5 cm2) fareler için. İçme suyuna ve standart gıda pelletine reklam Isteğe bağlı erişimi sağlayın.
    5. Yalıtım, deneysel sonuçları etkileyen şiddetli stres oluşturabilir gibi ABR kayıtları önce ve sonra deneysel hayvanların ayrım/yalıtım kaçının. Böylece, anestezi, ABR elektrot yerleştirme ve ABR kayıtları aşağıdaki hayvanları geri ev kafesi içine yerleştirin.
    6. Özellikle işitsel çalışmalarda, çeşitli deneysel dezavantajları tabi olduğu için açık konut koşulları uygulamaz. Havalandırmalı dolaplar, bunun yerine, akustik stresden önce ve deneysel işitsel prosedürler arasında, aksi takdirde sensorineval işitme kaybına neden olabilir (örneğin, gürültü kaynaklı işitme kaybı) ve böylece sonuçları etkiler.
    7. Kullanmak fare ve sıçan Özel sıhhi, anestezik, ve teknik ekipman böylece ne fareler ne de fareler birbirleriyle rekabet türlerinin karşılıklı duyusal algı olarak birbirleriyle varlığı hissediyemez çalışmalarda kaçınılmazın şok faktörlerine yol verebilir.

2. Mouse anestezi

  1. Enjekte edilebilir anestezik kullanarak anestezi gerçekleştirin. Hazırlamak ketamin hidroklorür (kemirgen doz: 100 mg/kg) ve xylazine hidroklorür (kemirgen doz: 10 mg/kg) içinde 0,9% NaCl veya Ringer çözelti ve enjekte hayvan intraperitoneal vücut ağırlığı dayalı.
    Not: ABR prosedürü normalde Ses zayıflatma bölmesi ve Faraday kafesi gerektirdiği için Isoflurane aracılığıyla Inhalasyon narkoz tavsiye edilmez, kayıt kurulumu içinde uzamsal sınırlamalar ile sonuçlanır. Birçok anestezik NMDA sistemi üzerinde hareket ve açıkçası ABR kayıt sonuçları etkisi olsa da, ABR kayıtlarında olmayan bir anestezik yasaklama yaklaşımı bilinç altında kısıtlayıcı prosedürler hayvan dramatik stres neden olarak tavsiye edilmez, ile ABRs içinde şiddetli sonraki artifakı oluşumu.
  2. Bir kuyruk tutam, ayak tutam ve izleme solunum hızı (fareler: 150-220 breaths/min) gerçekleştirerek anestezi derinliği için hayvanları dikkatle gözlemlemek. Mümkünse nefes nefese ve karşı için kontrol edin.
    Not: farklı fare çizgileri veya farmakolojik fare modelleri anesteziye farklı duyarlılıklar gösterebilir. Aynı mutant fare modelleri için geçerli tutar. Endotrakeal entübasyon Bu Deneysel ortamda bir gerek değildir ve önerilmez. Entübasyon trakea ve enfeksiyona travma riskini artırdığı için, ABR prosedürü sırasında endotrakeal entübasyon yararı/riski negatiftir.

3. perianesetik düzenlemeler ve enstrümantasyon genel yönleri

  1. Hayvan vücudu çekirdek sıcaklığını korumak için bir homeothermic Isıtma battaniye kullanarak ve sonrası ABR kayıtları ek sıcaklık uygulayın. En son 36,5-38.0 °C ' de (98.6-100.4 °F) koruyun.
    Not: hipotermi küçük kemirgenler vücut yüzeyi yüksek oranı nedeniyle bir risk faktörüdür (fare gövdesi yüzeyi = 10,5 x (ağırlık g)2/3; sıçan gövdesi yüzeyi = 10,5 x (ağırlık g)2/3) vücut hacmine.
  2. Kornea kurutmaması için tüm ABR kayıt sürecinde petrol bazlı suni gözyaşı merhem veya% 5 Dexpanthenol ile hayvanın gözlerini kapın. Yanıp sönen refleks tamamen restore olana kadar bu prosedüre devam edin.
  3. Bir otoklav veya dezenfektanlar kullanarak deneysel aletleri sterilize edin ( malzeme tablosunabakın).
    Not: cam boncuk ile ısı bazlı cerrahi enstrüman Sterilizatörü kullanımı tavsiye edilir.
  4. Tam ABR elektrot yerleşimi için, esnek veya kendinden destekleyici hareketli ışık kılavuzları ile yoğun aydınlatma için soğuk ışık kaynağına sahip bir binoküler cerrahi büyütme mikroskop kullanın.
  5. Deneysel hayvan taşıma ve deney sırasında temiz bir laboratuar ceket, bir facemask, bir baş kapak ve steril eldiven kullanın.
    Not: optimum enstrümanlar ve sarf malzemeleri Labs arasında değişebilir ve laboratuvara özel ve kurumsal standartları karşılaması gerekir.

4. ABR kayıtları

Not: burada açıklanan protokol, mono ve binaural kayıtlar için ticari olarak kullanılabilen bir ABR sistemine dayanır. Daha da önemlisi, ele alınması gereken bilimsel soru, kullanılan ABR sisteminin teknik özelliklerini karşılaması gerekir. Örneğin, Binaural kayıtların ABR analizi, işitsel yol işitsel uyaranların lateral kodlama araştırmak ve nöropsikiyatrik hastalıklarda periferik lateral asimetri incelemek için kullanılabilir.

  1. Bir ön amplifikatör ve işleme sistemine bağlı bir mikrofon yerleştirerek kayıt her gün stimülasyon frekansları kalibrasyonu gerçekleştirin ( malzeme tablosunabakın) doğru ile yerde Ses zayıflatma bölmesi içinde deney duvar kulak konumlandırılacak oryantasyon.
    1. Sistemin dengelenmesine izin vermek için Kalibrasyondan en az 5 dakika önce mikrofona bağlı ön amplifikatörü açın.
    2. Osiloskop açın.
    3. Deneysel duvar kulağı taklit etmek için mikrofon ses zayıflatmak kübik içinde bir önamplifikatör bağlı konumlandırın.
    4. Ticari olarak kullanılabilen işleme ve edinme yazılımını açın ( malzeme tablosunabakın).
    5. Kalibrasyon yapılandırma modunu etkinleştirmek ve deneysel koşullara göre parametreler seçmek için yazılım içindeki kalibrasyon Cal200K dosyasını seçin.
    6. Kalibrasyon prosedürünü yürütmek için işlemci sistemini kullanın. Mikrofon ve hoparlörlerin SPL sınırları, frekans aralığı ve dağıtım açısından teknik belirtimlerinin uyumlaştırılmasını sağlayın.
    7. Önceden tanımlanmış tıklama stimülasyon protokolünü seçin ve başlatın.
    8. Tek bir tıklama SPL çalıştırın (tercihen, maksimum SPL), osiloskop Online Hızlı Fourier dönüşümü (FFT) tarafından analiz olarak ses uyaranların spektrumunun gerekliliklerini (önemli enerji aralığı) eşleştiğini doğrulamak için.
    9. Önceden tanımlanmış ton-patlama stimülasyon protokolünü ilgi aralığı içinde seçin ve başlatın (örn. 1-42 kHz).
    10. Bir osiloskop ve çevrimiçi FFT kullanarak kaydedilmiş Akustik test uyaranların frekans spektrumunu onaylayın.
      Not: stimülasyon frekanslarının ve SPLs 'in kabul edilebilir çalışma aralıkları içinde olduğunu garanti etmek için sistem ve stimülasyon frekansları günlük kalibrasyonu gereklidir.
  2. Akustik köpük ile kaplı bir ses zayıflatan küülü içine anestezik fare yerleştirin.
    Not: Tüm kabin, ABR kayıtlarını harici elektrik parazitinden korumak ve onları gürültüden korunmak için bir Faraday kafesi (özel olarak yapılmış meshlenmiş metal veya ticari bir) ile kapsanmalıdır.
  3. Mono beyin-uyarılmış işitsel potansiyelleri kaydı için, tepe kısmında subdermal paslanmaz çelik elektrotlar yerleştirin, yaprakçıkların eksenel (pozitif [+] elektrot) ve sağ veya sol Pinna ventrolateral (negatif [-] elektrot) bağlı kulak ölçülecek. Binaural kayıtlar için, hem sağ hem de sol pinnae negatif elektrotlar yerleştirin. Zemin elektrot hayvanın kalça konumlandırın (Tamamlayıcı Şekil 1).
    1. Ekleme işleminden önce, Paslanmaz Çelik elektrot ucunda bir kanca şekli oluşturur, böylece elektrotların subdermal fiktasyonu47garanti edilir.
  4. Uygun elektrot konumlandırma/iletkenliğini doğrulamak için her kayıt öncesinde tüm elektrotların empedansı ölçümleri gerçekleştirin. Her elektrot empedansı seviyesini doğrulamak için dört kanallı başlık üzerindeki empedans onay düğmesini kullanın.
    Not: empedans 5 kΩ ' dan az olmalıdır.
  5. Tek bir hoparlör kullanarak serbest alan koşullarında kayıt ABRS (frekans bant genişliği, örneğin, 1-65 kHz at) hayvanların kürsü (hoparlörün önde gelen kenar Mouse 'un interaural eksenine dik dikey) 10 cm karşısında yerleştirilir. Kalibrasyon sırasında hoparlör ile mikrofon arasındaki seçilen belirli mesafeye bağlı olarak, fare kafası/fare kulaklarının pozisyonunun kalibrasyon mikrofonunun olduğundan emin olun.
    Not: serbest alan koşulları yerine, kulak borusu da kullanılabilir. Ancak, bu ayarlarında SPLs belirlemek için özel önlemler ve testler gereklidir.
  6. Kendi kendine programlanmış veya ticari olarak kullanılabilen yazılımları kullanarak tıklama ve ton patlamaları için uyarıcı protokolleri programlamak ( malzeme tablosunabakın). Aşağıda listelenen bireysel uyarıcı parametreleri ilgili grafik kullanıcı arayüzüne eklenmesi gerekir.
    1. Tıklama uyarıcı varlığın konfigürasyonu ile başlayın (yani, alternatif polarite ile 100 μs süre uyarıcı [yoğuşma ve rarefaction arasında geçiş] ve tanımlanan önemli enerji. Tıklayın eşikleri, sol ve sağ kulak ABR simetri, ABR W (ı-IV) amplitütler ve w (ı-IV) gecikme süreleri üzerinde analiz etmek ve belirlemek için bu uyarıcı varlığı kullanın.
    2. Yazılımı başlatın ve tıklama uyarıcı parametrelerini eklemek için yapılandırma penceresini kullanın. Protokol çalıştırmak için Yürüt ' ü tıklatın.
    3. Bir 4,5 MS ton patlaması (geçici sinüzoidal nabız) hann zarf yükselişi ve 1,5 MS Güz süreleri ile alternatif polarite (Gate/rampa zaman süresi) olan ikinci uyarıcı varlığı, yapılandırma ile devam edin. Özellikle düşük frekanslı ton patlamaları için minimum ton patlama süresini 3 ms olarak düşünün. Tüm genotiplerde frekansa özgü işitme eşiklerini analiz etmek ve tanımlamak için bu uyarıcı kullanın.
    4. Adım 4.6.2 benzer şekilde, ses patlaması uyarıcı parametreleri eklemek için yapılandırma penceresini kullanın ve (üretici48tarafından belirtildiği gibi) protokolünü çalıştırmak için Execute 'ı tıklatın.
    5. Ses patlaması çalışmaları için, bilimsel soruya (örn. 1-42 kHz 'den 6 kHz adımda) bağlı olarak test edilecek uygun frekans aralığını programlamak. Uygulanacak frekans aralıklarının hoparlördeki teknik yetenekleri karşılığından emin olun (Bu durumda, 1-65 kHz Frekans bant genişliğine sahip bir multifield manyetik hoparlör, ücretsiz veya kapalı alan koşulları için).
    6. Ortalama olarak, örneğin, 20 Hz hızında 300x olarak sıralı akustik uyaranların (tıklama veya ton patlamaları) sayısını ayarlayın.
    7. 0 dB 'den 90 dB 'ye (SPL modunu artırarak) başlayarak, tıklamalar için 5 dB adımda SPLs ve ton patlamaları için 10 dB adım artırın.
      Not: literatürde hem artan hem de azalan SPL modları açıklanmıştır. SPL adım boyutu bilimsel sorular nedeniyle adapte olabilir.
  7. Bireysel akustik uyarıcı başlangıcı (Pre-ABR taban çizgisi) öncesinde 5 MS temel dönemi ile başlayan ve başka bir 10 MS temel (Post-ABR taban çizgisi) ile 10 MS ABR bölümünü aşan 25 MS oranında bir ABR veri edinme süresini belirleyin (Tamamlayıcı Şekil 1 ).
  8. 6 kutuplu Butterworth filtresini kullanarak ABR veri edinme (örn. 24,4 kHz) ve bant geçiren filtresi (yüksek pass: 300 Hz, düşük pass: 5 kHz) için uygun bir örnekleme hızı uygulayın. Gerekirse çentik filtresini etkinleştirin.
    Not: örnekleme hızı ve filtre özellikleri deneysel gereksinimler nedeniyle uyarlanabilir.
  9. Subdermal elektrotlardan kaydedilen sonuç biyoelektrik sinyallerini bir kafa aşamasına aktarın ve uygun amplifikasyon (örn. 20 kat) ile bir ön amplifikatör için daha ileri ileriye doğru.
  10. Hoparlör kontrolünü ve ABR edinme, işleme, ortalama ve veri yönetimini koordine etmek için belirli bir ABR sistem işleme yazılımı kullanın.
  11. Yaklaşık 45 dk içinde tüm ABR protokolleri (tıklama ve ton patlama-uyarılmış işitme eşikleri, tepe genliği ve en yüksek gecikme analizi, vb.) yürütmeye çalışın. Bu 100/10 mg ketamin/xylazine intraperitoneally kullanarak derin narkoz zaman karşılık gelir.
  12. Uyarıcı sunum ve edinme, filtre ayarları, vb. için kalibrasyon, programlama/ayarlamalar hayvan anestezize ve gerçek kayıt gerçekleştirmeden önce beklendiği gibi çalıştığınızdan emin olun.

5. ABR Analizi

  1. Tıklama ve ton patlama-uyarılmış ABR işitme eşik Analizi
    1. Görsel muayene/tahmin49,50,51,52tarafından ABR eşik belirlenmesi olası tutarsızlıkları önlemek için önceki yayınları temel alarak otomatik eşik algılama gerçekleştirin.
    2. Sinyal-gürültü oranını (SNR) hesaplamak için üç farklı zaman pencereleri (TWs) tanımlayın: TW1 (0-5 ms), tw2 (5-15 MS) ve tw3 (15-25 MS) (Tamamlayıcı Şekil 1).
    3. Herhangi bir AEPs görülmez iki ayrı TWs (i.e., TW1 ve tw3) içinde temel gürültü standart sapmasını hesaplayın. Bu hesaplama, kendi kendine programlanmış yazılım kullanılarak yapılabilir.
    4. Bir ABR kaydı ayarı içinde her SPL ölçümü için, TW1 ve tw3' ün havuza alınmış verileri için Ortalama ve standart sapmayı hesaplayın.
    5. Tüm kayıt örneklerini, herhangi bir DC uzaklığı kaldırmak için karşılık gelen hesaplanan ortalama tarafından ayrı olarak sıfırlayın.
    6. İşitme eşiği belirlenmesi için, ABR yanıt süresi penceresindeki (TW2) en az bir dalga genlik değerinin (wı-wIV) en düşük SPL (DB) değerini, önceden hesaplanan standart sapmanın dört katına aştığını tanımlayın.
      Not: maksimum SPL 'de tıklama ve frekans eşik analizi için hiçbir ABR dalgası algılandığında, kulaklarına 100dB nominal eşik seviyesi atanır.
  2. ABR dalga genlik ve dalga gecikme Analizi
    1. Sürekli dalgacık Transform (CWT) tarafından varsayılan bir dalgalar kullanarak pozitif (p) dalgaların (zirveler) yanı sıra negatif (n) dalgaların (çukurları) temporal sıralı düzenini belirlemek için Meksika şapka dalgasını kullanarak bir dalgalı-tabanlı yaklaşım gerçekleştirin-tabanlı Model eşleştirme algoritması52 (Tamamlayıcı Şekil 1).
      1. Matematiksel olarak, CWT53aşağıdaki gibi temsil edilir.
        Equation
        Burada, s (t) sinyal, a ölçek, b çeviri, ψ(t) anne dalgacık, ψa, b(t) ölçekli ve tercüme Wavelet, ve C 2D matris Dalgacık katsayıları.
    2. İlk olarak, her ABR 'nin 55-dB ölçümünü kullanarak her dalga için en iyi ölçek parametrelerini belirlemek için, bu da üç sınıfta sonuçlanır: tüm n-dalgalar için 0,5-4, tüm p dalgaları için 0,5-6 ve WIV için 0,5-12 olarak bu çok geniş örnekleri içinde dalga.
      Not: 55 dB SPL dalgalar genellikle burada en belirgin ve güvenilir bir şekilde tespit edilebilir olarak seçildi.
    3. Tüm 55 db ölçümlerinde wı-wIV doğru temporal kollokasyon güvenilir bir şekilde algılamak için tüm sınıfları kanıtlamak.
    4. 55 dB ölçüm içinde doğru temporal sırada ABR Wı-wIV belirlemek için, p-zirveler ve n-doruklarını (çukurları) zaman penceresini sınırlamak için önceden tanımlanan dorukların göreli pozisyonları kullanarak sabit bir sırada tanımlanır sonraki taramaları.
    5. Tüm dokuz zirveler 55 dB 'de belirlendikten sonra, ilgili değerleri, bitişik ses basıncı ölçümleri (50 dB ve 60 dB) için temporal arama çerçevesi için başlangıç noktaları olarak kullanın ve bu da en fazla 1-9 tekrarlanır.
    6. Bu şekilde, p-ve n-doruklarına tüm dB düzeyleri (55-0 dB ve 60-90 dB) mümkünse belirleyin. Bir kez p-ve n-Peak artık dalgacık analizi ile tanımlandığında, temporal düzenleme önceki DB düzeyinde tanımlanan diğer zirve için zirve temporal uzaklık hesaplanarak ayarlanır.
    7. Geçerli desibel düzeyi içinde diğer p-ve n-Peak doruklarına temporal uzaklık uygulama en fazla sekiz belirlenen temporal pozisyonlar için Ortalama en yakın yaklaşma olarak alınır, tanımlanmamış zirveler için sonuçlanır.
    8. Tüm dalgaların genlik büyüme fonksiyonunu ve gecikme karşılaştırmasını değerlendirmek için (Wı-wIV), ilgili n-doruklarının zaman dilimi içinde p-doruklarının her biri için maksimum amplitüs ve ortalama gecikme süresini karakterize edilir.
    9. Görsel olarak kendi kendine programlanmış otomatik dalgacık aracına göre tüm sonuçları kontrol edin ve gerekirse, katı ekleme/kalite ölçütlerini karşılamayabilir, bireysel ABR istatistiklerden çalışır hariç.
      Not: her iki otomatik analiz ve ABRs görsel muayene, Çift kör bir yaklaşım önerilir.

6. post-operatif bakım ve post-ABR tedavisi

  1. Onlar bilincine sahip ve sternal recumbency korumak edebiliyoruz kadar sürekli hayvanları izlemek.
  2. Tamamen kurtarılana kadar diğer hayvanların şirkete ABR kayıtları geçirmiş bir hayvan iade etmeyin.
  3. Postoperatif ağrı tedavisi için Karprofen (fare: 1x 5-10 mg/kg, subkutan; sıçan: 1x 2.5-5.0 mg/kg, subkutan) enjekte edin.
    Not: ABR kayıt elektrotları subkutan takılı olarak uzun ömürlü ağrı tedavisi gerekli değildir.
  4. Postoperatif dönemde gıda alımı kolaylaştırmak için nemlendirilmiş Pellet beslemeler. Dikkatle gıda gözlemlemek (~ 15 g/100 g vücut ağırlığı/gün; ~ 5 g/24 h) ve su (~ 15 mL/100 g vücut ağırlığı/gün; ~ 5 mL/24 h) tüketimi.
  5. Normal duruş ve davranışlarının dönüşü için hayvanları yakından izleyin.
    Not: enrofloksasin etken maddelerini veya trimethoprim-sülfonamid gibi antibiyotiklerin sistemik yönetimi burada tavsiye edilmez, subdermal elektrot yerleştirme sadece minimal invasiveness olduğu gibi. Yerel veya Genelleştirilmiş inflamasyon belirtileri oluşmadığı sürece antibiyotiklerin uygulanması kısıtlanabilir.
  6. Hayvan vücut ağırlığı kontrol ederek ABR kayıtları sonra takip sonrası deneysel kurtarma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İşitme eşiği farklılıklarını, genlik büyüme fonksiyonunu ve gecikme süresini karşılaştırmayı değerlendirmek için tıklama ve ton patlama-uyarılmış ABR kayıtları kullanılabilir. SPL artan modda tıklayın-uyarılmış ABRs kontrol için Şekil 1 ve cav3,2 T tipi voltaj-Gated CA2 + kanal (yani, CAv3,2+/- ve CA eksikliği iki örnek mutant fare hatları tasvir edilir v3,2 null mutantlar [Cav3,2-/-]). Yukarıda belirtildiği gibi, insanlarda54,55 ve fareler56,57işitsel parametrelerde seks özgü farklar nedeniyle, cinsiyete özgü bir soruşturma genellikle tavsiye edilir. ABRs serbest alan tıklama (0,1 MS) ve ton patlaması (1 – 42 kHz 6 kHz adımda, 4,5 MS toplam bir 1,5 MS rampa süresi ile) akustik uyaranlara protokolde açıklandığı şekilde kaydedildi. Köşe pozitif potansiyelleri, kadın CAv3,2+/+ (Şekil 1a), CAv3,2+/- (Şekil 1b) için temsilcilik tıklama-Evoked kayıtlarında tasvir olarak yukarı sapmalar olarak çizilir unutmayın ) ve CAv3,2-/- fareler (Şekil 1C). Bu ortamda, dişilerde temsilci ABRs, CAv3,2+/+ ve CA v 'ye kıyasla kadın CAv3,2-/- farelerde artan tıklama-uyarılmış ABR işitme eşiği ve değiştirilmiş genlik büyüme fonksiyonunu önerdi 3,2+/- hayvanlar. Aynı eğilim, CAv2,3-/- kontroller ve heterozigot CAv3,2+/- fareler ile karşılaştırıldığında, artan bir tıklama-uyarılmış ABR eşikleri ve azaltılmış amplitütler önerilen erkekler için gözlenmiştir. Örnek ton Burst-uyarılmış ABRs kadın CAv3,2+/+, CAv3,2+/-ve CAv3,3-/- fareler için Şekil 2 ' de tasvir edilir (tüm hayvanlar 20 hafta yaşındadır).

Genel işitme performansını analiz eden ilk adım olarak, protokolün 5. bölümünde açıklanan otomatik ABR eşik algılama sistemi kullanılarak farklı SPLs (0 – 90 dB) için tıklama ile uyarılan ABRs incelenmiştir (Şekil 3). Analiz edilen hayvanların yaşlılık olarak eşleştirilmesinin sensorineval işitme kaybı58,59üzerinde dramatik bir etkisi olabilir. Ardından, ABR eşik düzeylerinde farklı ton patlama frekansları (1 – 42 kHz, Şekil 4) tarafından uyarılan olası değişiklikler incelendi. Örnek fare satırlarında, CAv2,3+/- ve CAv3,2-/- kontrollere göre artan tıklama ve ton patlaması ile ilgili işitme eşiklerini sergiledi (tüm hayvanlar 20 hafta yaşındadır).

Yukarıda özetlenen wavelet tabanlı yaklaşımı kullanarak, tıklama-uyarılmış ABR amplitüd büyüme fonksiyonu ve ABR dalga gecikme Analizi gerçekleştirildi (sırasıylaFigure 5 ve Figure 6). İkincisi, iç kulak ve beyin sapı içinde işitsel bilgi işleme ilgi geni olası zamanmekansal etkisi içine anlayış sağlar.

Figure 1
Şekil 1: kontroller ve mutant fareler (CAv3,2+/-, CAv3,2-/-) tıklayın-uyarılmış ABRS. Temsilcisi ABRS (A) CAv3,2+/+, (B) CAv3,2+/-ve (C) CAv3,2-/- kadın fareler üzerine tıklayın stimülasyon artan SPL modunda (itibaren elde 0 – 90 dB ile 5 dB SPL basamakları). Ortalama olarak, her uyarıcı varlığı 20 Hz 'de 300 kez uygulandı. Akustik uyarıcı başlangıcı dikey kırmızı çizgi ile belirtilir. Bu rakam Lundt ve al.60güncellenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: kontroller ve mutant fareler (CAv3,2+/-, CAv3,2-/-) içinde ton Burst-uyarılmış ABRS. (A) CA v 3,2+/+, (B) CAv3,2+/-ve (C) CAv3,2-/- dişi fareler, 1 – 42 KHz (6 kHz basamaklar) ses patlamaları sonrasında, 80 DB 'lik bir SPL 'den temsilci ABRS. Ortalama olarak, her uyarıcı varlığı 20 Hz 'de 300 kez sunuldu. Akustik uyarıcı başlangıcı dikey kırmızı çizgi ile belirtilir. Bu rakam Lundt ve al.60güncellenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: kontroller ve mutant fareler (CAv3,2+/-, CAv3,2-/-) tıklayın-uyarılmış ABR tabanlı işitme eşikleri. Tıklayın-uyarılmış odyometrik işitme eşik (A) kadın ve (B) erkek CAv3,2+/+ (kadın: n = 12; erkek: n = 13), CAv3,2+/- (kadın: n = 10; erkek: n = 9) ve CAv3,2-/- fareler (kadın: n = 10; erkek: n = 9). Veriler ortalama ± SEM olarak çizilir. Istatistiksel anlama α-Level = 0,05 ve p-değerleri *p < 0,05 olarak tanımlanan kullanılarak belirlendi; * *p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Bu rakam Lundt ve al.60güncellenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Kontroller ve mutant fareler (CAv3,2+/-, CAv3,2-/-) ses Burst-uyarılmış ABR tabanlı işitme eşikleri. 1 – 42 kHz (6 kHz adımlar) CAv3,2+/+ için ses patlaması-uyarılmış ABR tabanlı odyometrik işitme eşikleri (dişi: n = 12; erkek: n = 12; ▲), CAv3,2+/- (kadın: n = 10; erkek: n = 8; ■), ve CAv3,2-/- hayvanlar (kadın: n = 10; erkek: n = 9; ○). Data ortalama ± SEM olarak çizilir. istatistiksel bilgiler α-level = 0,05 ve p-değerleri *p < 0,05 olarak tanımlanır; * *p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Bu rakam Lundt ve al.60güncellenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: kontroller ve mutant fareler (CAv3,2+/-, CAv3,2-/-) tıklama tabanlı ABR kayıtlarında genlik büyüme işlevi. Wı– wIV amplitüd (mikrovoltlar), CAv3,2+/+ ' da tıklama UYARıLMıŞ ABR dalga analizi için artan bir SPL (desibel cinsinden) karşı çizilen (kadın: n = 12; erkek: n = 11; siyah çizgi, gri renkte 95% güven aralığı dahil olmak üzere yaklaşık kontrol eğrisi), CAv3,2+/- (dişi: n = 8; erkek: n = 7; ■) ve CAv3,2-/- hayvanlar (kadın: n = 7; erkek: n = 9 ; ○). Her ikisi de CAv3,2-/- kadın ve erkek fareler sergi önemli ölçüde gecikme artan SPLs boyunca genlik büyüme artış (A ve B) wı, (C ve D) wII, ve (G ve H) WIV CAv3,2+/+ ve CAv3,2+/- fareler ile karşılaştırıldığında. (E ve F) WIIIiçin, sadece cav3,2-/- erkek fareler kadın CAv3,2-/- hayvanlar ile karşılaştırıldığında artan SPL genelinde genlik büyüme önemli bir gecikme gösteriliyor. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulur. Istatistiksel bilgiler α-Level = 0,05 ve p-değerleri *p < 0,05 olarak tanımlanır; * *p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Bu rakam Lundt ve al.60güncellenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: kontroller ve mutant fareler (CAv3,2+/-, CAv3,2-/-) tıklayın-uyarılmış ABR kayıtları üzerine gecikme analizi. 65 dB SPL 'de her ABR dalgası (wı– wIV) için gecikme süreleri (milisaniye cinsinden) CAv3,2+/+ (kadın: n = 12; erkek: n = 11), CAv3,2+/- (kadın: n = 8; erkek: n = 7) ve Cav3,2-/- fareler (dişi: n = 8; erkek: n = 9). Gecikme analizi de belirli duygu düzeylerinde gerçekleştirilebilir unutmayın. Veriler ortalama ± SEM olarak tasvir edilir. Istatistiksel bilgiler α-Level = 0,05 ve p-değerleri *p < 0,05 olarak tanımlanır; * *p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Bu rakam Lundt ve al.60güncellenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 1: ABR mimarisi ve elektrot konumlandırma. (A) 65 dB SPL 'de temsilci ABR kaydı. İlk temel (tw1,5MS) test uyarıcı (tıklama veya ton patlama) ve tw2 (10 MS) erken beyin-uyarılmış potansiyelleri içeren izledi. TW2 başka bir temel IZLEDI (tw3, 10 MS). Taban çizgisi gürültüsünün SD 'yi hesaplamak için temel dönemler kullanılmıştır. Her bir ABR dalgası (wı– wIV) genlik, satır taban çizgisi parazitinin SD 'yi dört kat aştığında, işitme eşiğine ulaşıldı. Dalga genliği ve gecikme karşılaştırma için, bir "Meksika şapka"-tabanlı dalgacık yaklaşım otomatik olarak negatif doruklarını (mavi-sarı çizgili çizgiler) ve pozitif doruklarını (kırmızı-gri çizgili çizgiler) algılamak için yapılmıştır. Yeşil Haç mutlak maksimum ABR dalga amplitütler gösterir ve dalgacık yaklaşımına göre yaklaşık değerleri görüntülemez. (B) ABR Recordings için, kanca şeklindeki uçlu subdermal paslanmaz çelik elektrotlar kullanılmıştır. Referans elektrot sol kalça yerleştirilir, pozitif (+) elektrot tepe noktasında konumlandırılmış (pinnae eksenel), ve negatif (-) elektrot doğru Pinna bir mono veya Binaural kayıt olmasına bağlı olarak ventrolateral eklenmiş Yürütülen. Bu rakam Lundt ve al.60güncellenmiştir. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol, farelerde işitsel uyarılmış beyin sapı yanıtlarının nasıl kaydetili olduğunu ayrıntılı ve bütünleştirici bir açıklama sağlar. Hayvan ön tedavisi, anestezi ve potansiyel metodolojik mantık faktörleri üzerine spesifik odaklanma verir. İkincisi dahil, diğerleri arasında, cinsiyet, fare çizgisi, yaş, ve konut koşulları. Tüm bu faktörlerin sensorineval işitme kaybı ve işitsel bilgi işleme temel yönleri üzerinde bir etkisi olabilir unutulmamalıdır. Böylece, işitsel profil oluşturma çalışmalarının uygun tabakalaşması zorunludur.

AEP kayıtlarının enstrümantasyon son 50 – 60 yıl içinde muazzam evrimleşmiş, ve günümüzde, ticari ABR kayıt sistemleri gelişmiş ve teknik uygulama Basitleştirilmiş ama aynı zamanda yeni tuzaklar tanıttı mevcuttur. Bu yönlerden bazıları burada tartışılmaktadır. İlk olarak, Kullanıcı ABR sisteme alışmalıdır, yani, masaüstü veya dizüstü bilgisayar oluşan enstrümantasyon, preamplifikatör, amplifikatör, elektrot giriş kutusu, ve potansiyel dönüştürücerler (örn., hoparlörler, kulaklık eklemek, Supra-Aural kulaklık ve kemik osilatörler). Özellikle, kayıt koşulları merkezi öneme sahiptir. Yüksek duyarlılık nedeniyle, ABR kayıtlarının harici elektrik gürültüsü ile kontaminasyondan korunmak ve yeterli sinyal-gürültü oranını garanti altına almak için korumalı olması gerekir.

Başka bir önemli yönü enstrümantasyon kendisi (örneğin, uyarıcı jeneratör, dönüştürücülerin ve Tetikleyiciler). Farelerde en sık kullanılan Uyarı türleri 100 μs tıklamaları ve modülasyonlu genlik ve/veya frekans özellikleriyle kısa süreli ton patlamaları vardır. Dönüştürücerler, bir kulak veya her iki kulak için de çeşitli akustik uyaranlara sunabilir. Burada deneysel hayvan tek bir hoparlör rostral kullanarak ABR sonuçları sundu. Ancak, bir kulak veya her iki kulaktaki tubal tarzı kesici uç kulaklıklar da dahil olmak üzere diğer yaklaşımlar da mümkündür. İnsanlarda kullanılan Supra-Aural kulaklıklar farelerde uygulanabilir değildir. Literatürde gösterildiği gibi, farklı yaklaşımlar başarılı olabilir ve deneysel ihtiyaçlarına göre adapte edilmelidir. Bu dijital nabız her bir uyaranın ne zaman sunulacağını belirlerken, sinyal ortalamasını almak için gerekli olan tetikleyicinin doğru şekilde ödenmesini özel olarak dikkate almak gerekir. Doğru kayıtlar için, tetikleyici ve uyarıcı başlangıcı zaman noktası sıfır temsil eden, eşzamanlı olmalıdır. Ticari olarak kullanılabilen ABR kayıt sistemleri, bireysel uyaranlara sunulduğunda normalde kendi kendine içerdiği Tetikleyiciler içerir. Birçok sistemde, harici bir uyarıcı jeneratör ve ilişkili bir tetikleyici bir bağlantı sağlayan dış girişler vardır. Her iki durumda da, harici bir osiloskop kullanarak uyarıcı ve tetik özelliklerini kontrol etmek için değerli olduğu ortaya çıktı. Ayrıca satın alma parametrelerine (örn. diferansiyel amplifikasyon, filtreleme, Analog ve dijital filtreler, filtre tasarımları ve sinyal ortalamasını alan parametreler) özel olarak dikkat edilmelidir. Özellikle, burada gösterilen protokolde sunulan parametreler, yukarıda tasvir edilen örnek sonuçların deneysel gerekliliklerine uygundur. Ancak, örnekleme hızında örneğin uyarlamalar, ortalamalar için uygulanan uyaranların sayısı ve uygulama sıklığı, deneysel ayarlara bağlı olarak gerekli olabilir.

Son olarak, bazı kısa Yorumlar elektrot empedansı, elektrot türleri ve elektrot yerleştirme yapılmalıdır. Elektrotlar antenler gibi hareket ederek cildin altındaki voltaj değişikliklerini alıyor. Deri veya kafa derisi üzerinde elektrotların sadece uygulanması gibi subkutan elektrot yerleştirme zorunludur dış cilt tabakası direnci nedeniyle uygun değildir (yani, stratum corneum). İnsanlarda elektrik iletkenliği normalde ölü deri hücreleri ve bir elektrolit jel veya hamur uygulama abrading tarafından geliştirilmiş iken, bu genellikle yapılır ve subdermal elektrotlar kullanılan fareler uygun değildir. Elektrot ve cildin arayüzü, toplam iletken elektrik özelliklerini içeren elektrot empedansı oluşturur. İletken özellikleri elektrot malzeme özellikleri ve temas elektrot yüzey alanı, enkaz (yağ, kir, ter, vb) dahil olmak üzere doku özellikleri ve elektrolit çözeltisi içerir. Elektrot malzemesi gümüş, altın, platin, kurşun, kalay ve düşük empedans ve düşük elektrot potansiyelleri ile paslanmaz çelik içerir. Elektrot malzemesi kayıt koşullarında etkisiz olduğu dikkate alınmalıdır. Gümüş ile, bu sözde karmaşık elektrotlar kullanılarak elde edilir (yani, gümüş-gümüş klorür [AG-AgCl] elektrotlar). Bu durumda, elektrik çift katmanlı daha fazla empedansı azaltan iyonlarının ücretsiz değişimi için izin verir. Genellikle elektrot empedansı 5 kΩ ' ı geçmemelidir ve bireysel elektrotların empedansı (en az üç) karşılaştırılabilir olduğunu tavsiye edilir. Ayrıca interelektrot empedansı 2 kΩ altında olması önerilir. Kayıt elektrot yalıtım kaplama ile uzun bir metal tel temsil eder. Tel elektrot, çoğu durumda ön amplifikatör/amplifikatör olan kayıt ekipmanına bir fiş üzerinden bağlanır. Farelerde, elektrot telinin diğer ucu genellikle düz veya daha iyi-arcuated bırakılabilecek bir iğne elektrot birikmesi olduğunu. Disk veya bardak şeklinde olanlar gibi diğer elektrot tipleri, yeniden kullanım için olup olmadığını veya tek kullanımlık Pregelled, insanlar ve fareler için geçerli değil kullanımı sınırlıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Yazarlar Dr Christina Kolb (nörodejeneratif hastalıklar için Alman merkezi [DZNE]) ve Dr Robert Stark (DZNE) hayvan ıslahı ve hayvan sağlık bakım onların yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Federal Ilaçlar ve Tıbbi aygıtlar Enstitüsü (Bundesınstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte, BfArM, Bonn, Almanya) tarafından mali olarak destekleniyordu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AEP/OAE Software for RZ6 (BioSigRZ software) Tucker-Davis Technologies (TDT) BioSigRZ
Binocular surgical magnification microscope Zeiss Stemi 2000 0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000
Cages (Macrolon) Techniplast 1264C, 1290D
Carprox vet, 50mg/ml Virbac Tierarzneimittel GmbH PZN 11149509
Cold light source Schott KL2500 LCD 9.705 202
Cotton tip applicators (sterile) Carl Roth EH12.1
Custom made meshed metal Faraday cage (stainless steel, 2 mm thickness, 1 cm mesh size) custom made custom made
5% Dexpanthenole (Bepanthen eye and nose creme) Bayer Vital GmbH PZN: 01578681
Disposable Subdermal stainless steel Needle
electrodes, 27GA, 12mm		 Rochester Electro-Medical, Inc. S03366-18
Surgical drape sheets (sterile) Hartmann PZN 0366787
Ethanol, 70% Carl Roth 9065.5
1/4'' Free Field Measure Calibration Mic Kit Tucker-Davis Technologies (TDT) PCB-378C0
Gloves (sterile) Unigloves 1570
Graefe Forceps-curved, serrated FST 11052-10
GraphPad Prism 6 Software, V6.07 GraphPad Prism Software, Inc. https://www.graphpad.com/
Heat-based surgical instrument sterilizer FST 18000-50
Homeothermic
heating blanked		 ThermoLux 461265 / -67
Ketanest S (Ketamine), 25mg/ml Pfizer PZN 08707288
Ringer’s solution (sterile) B.Braun PZN 01471434
Matlab software MathWorks, Inc. https://de.mathworks.com/products/matlab.html
Medusa 4-Channel Low Imped. Headstage Tucker-Davis Technologies (TDT) RA4LI
Medusa 4-Channel Pre-Amp/Digitizer Tucker-Davis Technologies (TDT) RA4PA
Microphone PCB Pieztronics 378C01
Multi Field Speaker- Stereo Tucker-Davis Technologies (TDT) MF1-S
Oscilloscope Tektronix DPO3012
Optical PC1 express card for Optibit Interface) Tucker-Davis Systems (TDT) PO5e
Askina Braucel pads (cellulose absorbet pads) B.Braun PZN 8473637
Preamplifier PCB Pieztronics 480C02
RZ6 Multi I/O Processor system (BioSigRZ) Tucker-Davis Technologies (TDT) RZ6-A-PI
0.9% saline (NaCl, sterile) B.Braun PZN:8609255
SigGenRZ software Tucker-Davis Technologies (TDT) https://www.tdt.com/
Software R (version 3.2.1) + Reshape 2 (Version 1.4.1) + ggplot 2 (version 1.0.1) + datatable (version 1.9.4), + gdata (version 2.13.3), + pastecs (version 1.3.18), + waveslim (version 1.7.5), + MassSpecWavelet (version 1.30.0) The R Foundation, R Core Team 2015 Open Source Software (freely distributable)
Sound attenuating cubicle Med Associates Inc. ENV-018V
Standard Pattern Forceps, 12cm and 14.5 cm length FST 11000-12, 11000-14
Leukosilk tape BSN medical GmbH & Co. KG PZN 00397109
Tissue Forceps- 1x2 Teeth 12 cm FST 11021-12
Uniprotect ventilated cabinet Bioscape THF3378
Ventilated cabinet Tecniplast 9AV125P
Xylazine (Rompun), 2% Bayer Vital GmbH PZN 1320422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sporns, O., Tononi, G., Kotter, R. The human connectome: A structural description of the human brain. PLOS Computational Biology. 1 (4), e42 (2005).
  2. Bebarova, M. Advances in patch clamp technique: towards higher quality and quantity. General Physiology and Biophysics. 31 (2), 131-140 (2012).
  3. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
  4. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  5. Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
  6. Heuschkel, M. O., Fejtl, M., Raggenbass, M., Bertrand, D., Renaud, P. A three-dimensional multi-electrode array for multi-site stimulation and recording in acute brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 114 (2), 135-148 (2002).
  7. Kimiskidis, V. K. Transcranial magnetic stimulation (TMS) coupled with electroencephalography (EEG): Biomarker of the future. Reviews in Neurology. 172 (2), 123-126 (2016).
  8. Nunez, P. L. Toward a quantitative description of large-scale neocortical dynamic function and EEG. Behavioral Brain Science. 23 (3), 371-437 (2000).
  9. Lundt, A., et al. EEG Radiotelemetry in Small Laboratory Rodents: A Powerful State-of-the Art Approach in Neuropsychiatric, Neurodegenerative, and Epilepsy Research. Neural Plasticity. 2016, 8213878 (2016).
  10. Papazoglou, A., et al. Non-restraining EEG Radiotelemetry: Epidural and Deep Intracerebral Stereotaxic EEG Electrode Placement. Journal of Visualized Experiments. 112 (112), e54216 (2016).
  11. Weiergraber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system. Brain Research Brain Research Protocols. 14 (3), 154-164 (2005).
  12. Kallstrand, J., Nehlstedt, S. F., Skold, M. L., Nielzen, S. Lateral asymmetry and reduced forward masking effect in early brainstem auditory evoked responses in schizophrenia. Psychiatry Research. 196 (2-3), 188-193 (2012).
  13. Muller, R., et al. Automatic Detection of Highly Organized Theta Oscillations in the Murine EEG. Journal of Visualized Experiments. (121), e55089 (2017).
  14. Papazoglou, A., et al. Gender specific hippocampal whole genome transcriptome data from mice lacking the Cav2.3 R-type or Cav3.2 T-type voltage-gated calcium channel. Data in Brief. 12, 81-86 (2017).
  15. Papazoglou, A., et al. Gender-Specific Hippocampal Dysrhythmia and Aberrant Hippocampal and Cortical Excitability in the APPswePS1dE9 Model of Alzheimer's Disease. Neural Plasticity. 2016, 7167358 (2016).
  16. Papazoglou, A., et al. Motor Cortex Theta and Gamma Architecture in Young Adult APPswePS1dE9 Alzheimer Mice. PLOS ONE. 12 (1), e0169654 (2017).
  17. Siwek, M. E., et al. Altered theta oscillations and aberrant cortical excitatory activity in the 5XFAD model of Alzheimer's disease. Neural Plasticity. , 781731 (2015).
  18. Welch, T. M., Church, M. W., Shucard, D. W. A method for chronically recording brain-stem and cortical auditory evoked potentials from unanesthetized mice. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 60 (1), 78-83 (1985).
  19. Church, M. W., Gritzke, R. Effects of ketamine anesthesia on the rat brain-stem auditory evoked potential as a function of dose and stimulus intensity. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 67 (6), 570-583 (1987).
  20. van Looij, M. A., et al. Impact of conventional anesthesia on auditory brainstem responses in mice. Hearing Research. 193 (1-2), 75-82 (2004).
  21. Schomer, D. L., da Silva, F. L. Niedermeyer's Electroencephalography: Basic Principles, Clinical Applications, and Related Fields. , Lippincott Williams & Wilkins. (2011).
  22. De Cosmo, G., Aceto, P., Clemente, A., Congedo, E. Auditory evoked potentials. Minerva Anestesiology. 70 (5), 293-297 (2004).
  23. Rosburg, T. Auditory N100 gating in patients with schizophrenia: A systematic meta-analysis. Clinical Neurophysiology. 129 (10), 2099-2111 (2018).
  24. DiLalla, L. F., McCrary, M., Diaz, E. A review of endophenotypes in schizophrenia and autism: The next phase for understanding genetic etiologies. American Journal of Medical Genetics Part C Seminar in Medical Genetics. 175 (3), 354-361 (2017).
  25. Walsh, P., Kane, N., Butler, S. The clinical role of evoked potentials. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 76 Suppl 2, ii16-ii22 (2005).
  26. Opgen-Rhein, C., Neuhaus, A., Urbanek, C., Dettling, M. New strategies in schizophrenia: impact of endophentotypes. Psychiatrische Praxis. 31 Suppl 2, S194-S199 (2004).
  27. Knipper, M., Van Dijk, P., Nunes, I., Ruttiger, L., Zimmermann, U. Advances in the neurobiology of hearing disorders: recent developments regarding the basis of tinnitus and hyperacusis. Progress in Neurobiology. 111, 17-33 (2013).
  28. Miller, C. A., Brown, C. J., Abbas, P. J., Chi, S. L. The clinical application of potentials evoked from the peripheral auditory system. Hearing Research. 242 (1-2), 184-197 (2008).
  29. Manouilenko, I., Humble, M. B., Georgieva, J., Bejerot, S. Brainstem Auditory Evoked Potentials for diagnosing Autism Spectrum Disorder, ADHD and Schizophrenia Spectrum Disorders in adults. A blinded study. Psychiatry Research. 257, 21-26 (2017).
  30. Talge, N. M., Tudor, B. M., Kileny, P. R. Click-evoked auditory brainstem responses and autism spectrum disorder: A meta-analytic review. Autism Research. 11 (6), 916-927 (2018).
  31. Hamed, S. A. The auditory and vestibular toxicities induced by antiepileptic drugs. Expert Opinion in Drug Safety. 16 (11), 1281-1294 (2017).
  32. Ismi, O., et al. The Effect of Methylphenidate on the Hearing of Children with Attention Deficit Hyperactivity Disorder. International Archive in Otorhinolaryngology. 22 (3), 220-224 (2018).
  33. Michna, M., et al. Cav1.3 (alpha1D) Ca2+ currents in neonatal outer hair cells of mice. Journal of Physiology. 553 (Pt 3), 747-758 (2003).
  34. Platzer, J., et al. Congenital deafness and sinoatrial node dysfunction in mice lacking class D L-type Ca2+ channels. Cell. 102 (1), 89-97 (2000).
  35. Willaredt, M. A., Ebbers, L., Nothwang, H. G. Central auditory function of deafness genes. Hearing Research. 312, 9-20 (2014).
  36. Yee, B. K., Singer, P. A conceptual and practical guide to the behavioural evaluation of animal models of the symptomatology and therapy of schizophrenia. Cell Tissue Research. 354 (1), 221-246 (2013).
  37. Fahey, J. R., Katoh, H., Malcolm, R., Perez, A. V. The case for genetic monitoring of mice and rats used in biomedical research. Mammalian Genome. 24 (3-4), 89-94 (2013).
  38. Hunsaker, M. R. Comprehensive neurocognitive endophenotyping strategies for mouse models of genetic disorders. Progress in Neurobiology. 96 (2), 220-241 (2012).
  39. Turner, J. G., Parrish, J. L., Hughes, L. F., Toth, L. A., Caspary, D. M. Hearing in laboratory animals: strain differences and nonauditory effects of noise. Computational Medicine. 55 (1), 12-23 (2005).
  40. Neumann, P. E., Collins, R. L. Genetic dissection of susceptibility to audiogenic seizures in inbred mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5408-5412 (1991).
  41. Meier, S., Groeben, H., Mitzner, W., Brown, R. H. Genetic variability of induction and emergence times for inhalational anaesthetics. European Journal of Anaesthesiology. 25 (2), 113-117 (2008).
  42. Majewski-Tiedeken, C. R., Rabin, C. R., Siegel, S. J. Ketamine exposure in adult mice leads to increased cell death in C3H, DBA2 and FVB inbred mouse strains. Drug Alcohol Dependence. 92 (1-3), 217-227 (2008).
  43. Bonthuis, P. J., et al. Of mice and rats: key species variations in the sexual differentiation of brain and behavior. Frontiers in Neuroendocrinology. 31 (3), 341-358 (2010).
  44. Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 102 (3), 153-159 (2012).
  45. Jonasson, Z. Meta-analysis of sex differences in rodent models of learning and memory: a review of behavioral and biological data. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 28 (8), 811-825 (2005).
  46. Prendergast, B. J., Onishi, K. G., Zucker, I. Female mice liberated for inclusion in neuroscience and biomedical research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 40, 1-5 (2014).
  47. Ingham, N. J., Pearson, S., Steel, K. P. Using the Auditory Brainstem Response (ABR) to Determine Sensitivity of Hearing in Mutant Mice. Current Protocols in Mouse Biology. 1 (2), 279-287 (2011).
  48. Tucker-Davis Technologies. SigGenRZ Manual. , Available from: https://www.tdt.com/files/manuals/SigGenRZ_Manual.pdf (2012).
  49. Bogaerts, S., Clements, J. D., Sullivan, J. M., Oleskevich, S. Automated threshold detection for auditory brainstem responses: comparison with visual estimation in a stem cell transplantation study. BMC Neuroscience. 10, 104 (2009).
  50. Probst, F. J., et al. A point mutation in the gene for asparagine-linked glycosylation 10B (Alg10b) causes nonsyndromic hearing impairment in mice (Mus musculus). PLOS ONE. 8 (11), e80408 (2013).
  51. Alvarado, J. C., Fuentes-Santamaria, V., Gabaldon-Ull, M. C., Blanco, J. L., Juiz, J. M. Wistar rats: a forgotten model of age-related hearing loss. Frontiers in Aging Neuroscience. 6, 29 (2014).
  52. Du, P., Kibbe, W. A., Lin, S. M. Improved peak detection in mass spectrum by incorporating continuous wavelet transform-based pattern matching. Bioinformatics. 22 (17), 2059-2065 (2006).
  53. Daubechies, I. Ten lectures on wavelets. , Society for Industrial and Applied Mathematics. Philadelphia, PA. (1992).
  54. Pearson, J. D., et al. Gender differences in a longitudinal study of age-associated hearing loss. Journal of the Acoustical Society of America. 97 (2), 1196-1205 (1995).
  55. Murphy, M. P., Gates, G. A. Hearing Loss: Does Gender Play a Role? Medscape Womens Health. 2 (10), 2 (1997).
  56. Henry, K. R. Males lose hearing earlier in mouse models of late-onset age-related hearing loss; females lose hearing earlier in mouse models of early-onset hearing loss. Hearing Research. 190 (1-2), 141-148 (2004).
  57. Ison, J. R., Allen, P. D., O’Neill, W. E. Age-related hearing loss in C57BL/6J mice has both frequency-specific and non-frequency-specific components that produce a hyperacusis-like exaggeration of the acoustic startle reflex. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 8 (4), 539-550 (2007).
  58. Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses. Hearing Research. 130 (1-2), 94-107 (1999).
  59. Zhou, X., Jen, P. H., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).
  60. Lundt, A., et al. Cav3.2 T-Type Calcium Channels Are Physiologically Mandatory For The Auditory System. Neuroscience. , In Press (2019).

Tags

Bu ay Jove sayı 147 genlik işitsel sistem ortalama Binaural beyin sapı tıklama işitme eşik gecikme mono sistemik Nörofizyoloji ton patlaması Dalgacık
Farelerde beyin sapı uyarılmış yanıt odyometrisi veri edinme ve Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lundt, A., Soos, J., Henseler, C.,… More

Lundt, A., Soos, J., Henseler, C., Arshaad, M. I., Müller, R., Ehninger, D., Hescheler, J., Sachinidis, A., Broich, K., Wormuth, C., Papazoglou, A., Weiergräber, M. Data Acquisition and Analysis In Brainstem Evoked Response Audiometry In Mice. J. Vis. Exp. (147), e59200, doi:10.3791/59200 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter