Summary
في فيفو نماذج الثدييات من تشوهات العظام الحرجة الحجم ضرورية للباحثين دراسة آليات الشفاء والعلاجات العظام. نقدم لك هنا، على بروتوكول لإنشاء عيوب استنساخه، القطاعي، فخذي في الفئران التي استقرت باستخدام التثبيت الخارجي.
Abstract
أبحاث العظام تعتمد اعتماداً كبيرا على نماذج حيوانية لدراسة آليات للعظام شفاء في فيفو ، فضلا عن التحقيق في أساليب علاج جديدة. عيوب قطعي الحجم الحرجة تمثل تحديا لعلاج سريرياً، وجهود البحث يمكن أن تستفيد من نموذج حيوانات صغيرة موثوقة والاسعافية لعيب فخذي المجزأ. في هذه الدراسة، نقدم بروتوكولا جراحي أمثل لخلق عيب 5 مم جدلي حاسم متسقة واستنساخه في عظم الفخذ الفئران استقرت مع التبعي خارجية. الذي قد استقرت بجهاز تكييف التبعي خارجية أوستيكتومي جدلي أجرى باستخدام رقصة مخصصة لوضع 4 بيكورتيكالي أسلاك كيرشنر،. منشار العظام تتأرجح تم استخدامه لإنشاء هذا العيب. أما اسفنجة الكولاجين وحدها أو اسفنجة الكولاجين غارقة في رهبمب-2 كان مزروع في العيب، وشفاء العظام تم رصد أكثر من 12 أسبوعا باستخدام الصور الشعاعية. بعد 12 أسبوعا، كانت التضحية بالفئران، والتحليل النسيجي تم إجراؤها على عنصر التحكم قصت وتعامل قصبة. تشوهات العظام التي تحتوي على فقط الكولاجين الأسفنج أدت إلى غير الأعضاء في الاتحاد، بينما العلاج رهبمب-2 أسفرت عن تشكيل إعادة عرض العظم القاسي وجديدة بيريوستيل. الحيوانات تعافي تماما بعد زرع، والخارجية تثبيت أثبتت نجاحها في تحقيق استقرار العيوب فخذي ما يزيد على 12 أسبوعا. يمكن تطبيق هذا النموذج المبسط الجراحية سهولة دراسة شفاء العظام واختبار الحيوية العظام الجديدة والعلاجات التجدد في فيفو.
Introduction
جراحة العظام من الصدمات النفسية تركز على علاج طائفة واسعة من الكسور المعقدة. العظام المجزأ جدلي الحرجة أثبتت العيوب يصعب علاجه طبيا بسبب انخفاض قدرة التجدد في العضلات المحيطة بها والسمحاق، فضلا عن عدم ترجمة الأوعية1. تقنيات المعالجة الحديثة تشمل التثبيت المنطوق مع تطعيم العظم، وتأخر تطعيم العظم (ماسكويليت)، ونقل العظام، والانصهار، أو البتر2،،من34. في معظم المرضى الذين لديهم المتنقلة الدالة الاحتفاظ بعد الصدمات التي مر بها مع أطرافه القاصي يعمل بشكل جيد، وهو إنقاذ أطرافهم وضوح أفضل خيار علاج5. غالباً ما تتطلب علاجات إنقاذ هذه التدخلات الجراحية نظموا خلال دورة علاج طويل. قد اقترح بعض الكتاب أن التثبيت الخارجي أعلى بالمقارنة مع التثبيت الداخلي لهذه التطبيقات بسبب تلف الأنسجة انخفض خلال غرس، انخفض مزروع المساحة السطحية، وزيادة قابلية ضبط بعد العملية الجراحية التبعي6. ومع ذلك، معشاة المحتملين تجري حاليا لمساعدة في توضيح هذا الجدل الداخلية مقابل الخارجية التثبيت في كسور مفتوحة شديدة في الساق7. للأسف، تستمر معدلات المضاعفات وفشل كبير مع العلاج أما المحدد،8،9. أما طريقة العلاج، فيما يتعلق بفقدان العظام القطاعي، الجراح يجب أن يتعامل مع العيوب جدلي قطعي أن تحديات كبيرة. تصحيح العيوب قطعي يجب تحقيق أقصى قدر من الاستقرار العظام وفي نفس الوقت تعزيز10،عملية أوستيوجينيك11.
نظراً لأهمية سريرية، بعد انخفاض حجم، عيوب المجزأ جدلي حاسم الحجم، طراز حيوانية فعالة، واستنساخه أمرا ضروريا لتمكين فرق البحث للنهوض بأساليب العلاج وتحسين النتائج السريرية في نهاية المطاف. يحتاج الباحثون لدراسة في فيفو الفسيولوجية آليات الشفاء في نموذج حيوانات الثديية. على الرغم من وجود هذه نماذج تثبيت الخارجي الفعل12،13،،من1415، ونأمل أن توفر أسلوباً أكثر موثوقية لنقابات العمال في الحيوانات غير المعالجة، وانخفاض التكاليف من خلال اختيار مواد التبعي بأسعار معقولة، ومخطط بروتوكول جراحية واضحة للتطبيق السهل للدراسات المستقبلية. والهدف الأساسي من هذا البروتوكول إنشاء نموذج يمكن الاعتماد عليها واستنساخه لعيب جدلي حاسم في الفئران. وجرى تقييم الإجراء بتقييم الاستقرار والعظام شفاء في قصبة الفئران أكثر من 12 أسبوعا. الأهداف الثانوية التي شملت: صنع نموذج أسعار معقولة كتكلفة فعالة قدر الإمكان، تبسيط النهج الجراحية وتحقيق الاستقرار، وضمان الأخلاقية رعاية الحيوانات. فريق البحوث والمؤلفين أجروا تجارب أولية مع مجموعة من المواد الحيوية المختلفة والعلاجات التجدد المحتملة لتحسين الشفاء في هذا العيب المجزأ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
على الفئران المستخدمة في هذه الدراسة وتلقى الرعاية اليومية وفقا "المبادئ التوجيهية وبرايتون" "القتل الرحيم للحيوانات": 2013 الطبعة16. رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة في جامعة ويسكونسن-ماديسون تقييمها والموافقة عليها هذا البروتوكول التجريبي قبل بدء المشروع.
1-الحيوانات
- استخدام سبراغ داولي أووتبريد الفئران الذكور وزنها حوالي 350 غ.
2-الإعداد لعظم Morphogenetic البروتين-2 (رهبمب-2) غارقة السقالات الأسفنج
ملاحظة: إعداد سقالة يجب أن تحدث قبل غرس في عظم الفخذ (راجع الخطوة 6.14).
- اتبع إرشادات الشركة المصنعة للاستخدام مجموعة من الأدوات الاختلاس ثابتة رهبمب-2 العظام التي تحتوي على الكولاجين الأسفنج والمجففة بالتبريد رهبمب-2، والمياه المعقمة لإعادة تشكيل17. الحفاظ على العقم، إعادة تشكيل رهبمب-2 مع الماء المعقم لتركيز 1.5 ملغ/مل.
- باستخدام مقص معقم ومسطرة عقيمة، قطع الأسفنج رهبمب-2 غارقة الكولاجين لإعادة تشكيل لتناسب 5 مم × 3 مم × 3 مم عيب.
- استخدام المحاقن، توزيع الحل رهبمب-2 بالتساوي على الأسفنج الكولاجين حيث أنه يتم امتصاصه.
3-إعداد جهاز تثبيت خارجي مخصص
ملاحظة: انظر الشكل 1A لقائمة أكثر اكتمالا من الأبعاد.
- قطع الألومنيوم ورقة الأسهم (6061، نوع 0.088 "سمك) إلى اثنين قطعة (1.4" x 6 ") باستخدام بانوراما أو أداة أخرى مناسبة.
- جبل قطعة واحدة في آلة الطحن، واستخدام مطحنة مثقاب كربيد 90°-نقطة 1/8 "، قطع أربعة' الخامس 'الأخاديد (0.035" العميق) الطول. ترك قطعة أخرى مجاناً من التخفيضات.
- قص ألواح فردية من 0.3 "العرض من الاثنين قطعة (الشكل 1B). قياس، وحفر ثقوب المسمار للموضوع 4-40. اضغط على لوحة مع الأخاديد 'الخامس' مع الصفحات 4-40. حفر اللوحة دون الأخاديد لحفر هيئة المسمار #4.
- الرمال كل قطعة مستديرة الزوايا وتقليل الوزن (الشكل 1).
- برغي القطع إلى جانب 4-40 و 18-8 الفولاذ المقاوم للصدأ زر الرأس كاب مسامير (0.25 ") حيث تكون الأخاديد دافق ضد لوحة عادي (الشكل 1)
4-الإجراء التخدير والتسكين
- حمل التخدير عن طريق وضع الفئران في الغرفة التعريفي تقديم ل 4 س2دور/دقيقة مع إيسوفلوراني 4%.
تنبيه: يجب تجنب استنشاق غاز مخدر موظفي البحوث والحفاظ على غطاء مناسب والتهوية في المختبر. - إزالة الفئران من الدائرة بعد أن يفقد الفئران منعكس الاستقامة وإرفاق مخروط الآنف ووضع جرعة الصيانة للتخدير عن طريق الآنف (معدل الإنجاز2 س إلى إيسوفلوراني 2-3 لتر في الدقيقة ونسبة 0.8%).
- وضع الفئران في لوحة تدفئة أو تحت ضوء الاحترار لمنع انخفاض حرارة الجسم.
- تأكيد عمق كاف للتخدير معسر إصبع القدم أو اختبار العاكسة بالبيبرال.
- تطبيق تزييت العيون لمنع جفاف القرنية.
- تسليم حقن تحت الجلد للإفراج عن تمديد البوبرينورفين (1 مغ/كغ) على الجذع/دورسوم الفئران، بعيدة عن موقع الجراحة، لتوفير التسكين لمدة 3 أيام بعد الجراحة.
5-إعداد العقيم والمضادات الحيوية بريفينتاتيفيس
- حلق المنطقة المحيطة هيندليج باستخدام خط الوسط البطني وخط الوسط الظهرية، الضلعال 13 والقدم كهوامش.
- منطقة فرك حلق باستخدام شاش 2 × 2 العقيمة غارقة مع 10% بوفيدون تليها 70% EtOH (4 مرات كل منها بالتناوب).
- إدارة حقن العضلي من سيفازولين (20 مغ/كغ) في الفخذ من المنطوق.
- إدارة انروفلوكساسين (0.25 مغ/مل) في مياه الشرب لمدة 7 أيام بعد لمواصلة حماية المضادات الحيوية.
- وضع الفئران في تغذية العلاج (مثلاً، Uniprim) طوال مدة الدراسة لمنع التهابات الجهاز السري.
- تطبيق مرهم مضاد حيوي مزدوج الواجهة دبوس الجلد مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام بعد.
ملاحظة: تجنب أي دبوس التثبيت الخارجية أو المشبك التيسير التي يمكن أن تسهم في تطوير العدوى.
6-الجراحة
ملاحظة: جعل تضافر الجهود المبذولة للحفاظ على حقل العقيمة ومساحة العمل واتباع أسلوب تعقيم في جميع أرجاء القضية بأكملها.
- تمديد الساق حلق عن طريق ثني fenestrated، لزجة واضحة وتغطية مقاعد البدلاء الجراحية في المناشف المعقمة لإنشاء حقل عقيمة.
- جس عظم الفخذ واستخدام شفرة #15 لإنشاء شق أنتيرولاتيرال عن طريق الجلد تمتد من الرضفة إلى trochanter أكبر في عظم الفخذ الدانية.
- بعناية جداً لفافة الساق الجانبية على طول الغشاء إينتيرموسكولار لفصل vastus lateralis عضلة الفخذ الأسفل من أوتار الركبة جيدة حتى يتم كشف عظم الفخذ الجانبية. الحفاظ على الإدراج وتر الوي المختطف في تروتشانتير أكبر.
- القيام تشريح أنسجة لينة كفافى أتروماتيك دقيق، وفضح عظم الفخذ في diaphysis منتصف به ابتداء على السطح الأفقي. للقيام بذلك، استخدم شفرة #15 بلطف قطع العضلات بعيداً عن العظم الكامنة عن طريق الحفاظ الشفرة موازية ضد كفاف سطح العظام. استخدام مصعد periosteal لرفع العضلات بعيداً عن العظام مكشوفة كما أنه يتم تشريح والمضي قدما حول رمح فخذي حتى تم مسح 7-10 ملم من وسط ديافيسيس الأنسجة اللينة على كل الأطراف لإعداد أوستيكتومي.
ملاحظة: تجنب الإصابة إلى حزمة neurovascular فخذي الآنسي. - إدراج أربعة أسلاك كيرشنر (ك) 1.0 مم: 2 الدانية و 2 القاصي في عظم الفخذ عمودي لعظم الفخذ الجانبية، توجه الجانبي على التوالي إلى الآنسي. ضمان إشراك جميع المسامير كلا كورتيسيس (بيكورتيكال) لقدر كاف من الاستقرار (الشكل 2A).
- بدء تشغيل مع دبوس القاصي معظم أولاً، فقط على مستوى ابيكونديلي الأفقي. مسح لعظم الفخذ الجانبية البعيدة الرقصة المكان وإدراج سلك ك تلميح خيوط 1.0.
- تحديد الحفاظ على موقف الرقصة على العظام، حيث ستدخل دبوس الأكثر الدانية العظم استناداً إلى الثقوب الرقصة. حالما يتم تحديد الموقف، بعناية جداً موازية للألياف لوتر الوي حسب الحاجة إلى خلق فجوة صغيرة في الأنسجة لطرف الدانية ليمر، وبالتالي التقليل إلى أدنى حد الأضرار الوتر علاجية المنشأ. حفر 1.0 مم غير مترابطة كسلك في هذه الفجوة، مرة أخرى ضمان الدبوس يشرك كلا كورتيسيس (الشكل 2).
- الحفاظ على موقف الرقصة على اتصال العظام وحفر 1.0 مم الخيوط كسلكين، واحدة على أي من جانبي الموقع عيب مستقبلا. ضمان إشراك دبابيس كلا كورتيسيس (الشكل 2).
- ضع التبعي الخارجية بار مستوى 1 سم فوق الجلد والمسمار محكم، تأمين الشريط في المكان. مقطع أطوال دبوس الزائد (الشكل 2D).
- إعداد أوستيكتومي (عيب إنشاء) عن طريق وضع ضام صغيرة، منحنى حول عظم الفخذ الأمامي والخلفي لحماية الأنسجة اللينة المحيطة بها، والعضلات، وحزمة نيوروفاسكولار. استخدام تتأرجح السهمي ~ 5 مم شهد بليد، وخلق بحذر شديد عيب القطاعي 5 مم من خلال diaphysis منتصف. تطبيق خفيف الضغط حتى مع شاهد لتجنب الكسر لا لزوم لها (الشكل 2E).
- تطبيق مبالغ صغيرة للري (درجة حرارة الغرفة 0.9% العقيمة العادية المالحة (NS)) حسب الحاجة أثناء إنشاء عيب لتجنب الحرارية ونخر العظام.
- مسح الجرح باستخدام 10 مل NS بعد إنشاء هذا العيب.
- إدارة 0.1 مل من بوبيفاكيني 0.25% مع أدرينالين (1: 200، 000) للجرح كمسكن ومضيق للأوعية.
- إدراج السقالة (5 ملم × 3 مم × 3 ملم) من الأسفنج الكولاجين أو رهبمب-2 غارقة الأسفنج (من الخطوة 2) في العيب. ينبغي أن الحجم كل سقالة مناسب تمتد بطول وحجم العيب، مساعدة الأسفنج البقاء في الموقف.
ملاحظة: عند هذه النقطة، مرناً المجمعات قد تكون على استعداد وحقن كما هو موضح في الخطوات أدناه 7.1-7.3 إذا تقوم بتصوير الإضاءة الحيوية. - إغلاق الطائرة العضلات باستخدام نمط توقف بسيطة مع خياطة الامتصاص 4-0. إغلاق طبقة الجلد باستخدام نمط سوبكوتيكولار قيد تشغيل مع خياطة الامتصاص 4-0 والجلد الغراء سد الفجوات حول دبابيس بارزة.
- إزالة الفئران من مخروط الآنف، تبقى على منصة التدفئة، وترصد باستمرار حتى الفئران قادرة على الحفاظ على الدوام موقفا منتصبة. في هذه المرحلة، وضع في قفص نظيف لاسترداد.
7-إعداد مرناً الرصاصية والتصوير بالإضاءة الحيوية
ملاحظة: ينبغي إجراء تعداء مع مجمعات مرناً أثناء جراحة يوم واحد قبل تصوير التﻷلؤ. استخدام تقنيات عقيمة عند التعامل مع مرناً.
- ميكس 10 ميليلتر من ترميز مرناً جوسايا لوسيفراس (تركيز المخزون من 1 ميكروغرام/ميليلتر) مع 30 ميليلتر من عامل ترانسفيكتينج ليبيديك.
- السماح للمجمعات الدهنية مرناً بشكل بحضانة لمدة 5 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة. عامل ترانسفيكتينج ليبيديك سوف تتكثف جزيئات مرناً، استقرار لهم وتعزيز كفاءة تعداء.
ملاحظة: إذا لم يتم استخدام المجمعات فورا، تخزينها في الجليد لأقصى قدر ح 1. - استخدام 20 ميليلتر ماصة مجهزة بالنصائح التي تمت تصفيتها، حقن نصف حجم المجمعات مرناً للغايات البعيدة والقريبة من العيب، على التوالي.
- في اليوم التالي، 3 دقيقة قبل التصوير، تخدير الفئران باستخدام إيسوفلوراني المستنشق كما هو موضح سابقا في "الخطوة 4-1".
- ضع الفئران في في فيفو التصوير غرفة مجهزة بمخروط الآنف إيصال isoflurane الصيانة (isoflurane 0.8 في المائة، ومعدل الإنجاز2 س من 2-3 لتر في الدقيقة).
- حقن كويلينتيرازيني حراكه في المحلول الملحي بجرعة 4 مغ/كغ من وزن الجسم بالقرب من العيب.
- الحصول على الصور الإضاءة الحيوية مع في فيفو نظام (إيفيس) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة18التصوير.
8-تصوير البروتوكول
- وبعد معايرة آلة التصوير الإشعاعي العادي، نظام الأشعة سينية19، تخدير الفئران باستخدام إيسوفلوراني المستنشق كما هو موضح سابقا (انظر الخطوة 4.1) ووضع الفئران في مخروط الآنف باستنشاق إيسوفلوراني (0.8% إيسوفلوراني، س2 معدل الإنجاز من 2-3 لتر في الدقيقة) للأشعة عظم الفخذ الصورة (AP).
- بينما الفئران في ريكومبينسي القصية، مقدما اللكتات الجراحية إلى الأمام، الثناء في الورك وخنق المشتركة. فليكس خنق المشترك إلى ما يقرب من 90°. الشريط الجانب أخمص القدم مخلب أسفل، قريبة من جدار الجسم. ضع الساق إلى الأمام من عظم الفخذ للقضاء على إمكانية فرض العظام. لتقدم طفيف اختطاف الورك، بوضع اسفنجة شفاف (حوالي 15 مم) في منطقة الفخذ. ثم الحصول على صورة (الجمجمة والذيلية) الأمامي الخلفي لعظم الفخذ.
- كرر هذا AP رأي الشعاعي عظم الفخذ مباشرة بعد الجراحة، 4 أسابيع و 12 أسبوعا. استخدم الشريط وشاش لموقف مناسب أقصى الحيوان للجودة وتصوير متسقة.
- إزالة الفئران من مخروط الآنف وترصد باستمرار حتى الفئران قادرة على الحفاظ على الدوام موقفا منتصبة. ثم، ضع مرة أخرى إلى القفص.
9-النسيجي الداخلي
- Euthanize الفئران في دائرة مع استنشاق أول أكسيد الكربون2 وفقا للمعايير الأخلاقية وبرايتون16.
- في أعقاب القتل الرحيم، يحلق في اللكتات وإزالة الجلد من أقصى المنطوق ديسارتيكولاتي عظم الفخذ في الورك. بعناية إزالة جميع الأنسجة اللينة من عظم الفخذ المنطوق (بما في ذلك جميع العضلات والاوتار والأربطة). تترك سوى طبقة رقيقة من العضلات المحيطة بالموقع عيب لحماية منطقة الشفاء من أضرار غير مقصودة أثناء التشريح.
- ضع عظم الفخذ في 10% "محايدة مخزنة الفورمالين" في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-4 أيام للسماح بالتثبيت. الحفاظ فورمالين 15:1 إلى نسبة حجم الأنسجة. تغيير الحل مرة واحدة في منتصف الطريق من خلال عملية التثبيت.
- ديكالسيفي عظم الفخذ في حل الرقم الهيدروجيني 6.5 (يدتا) حمض 15% الإيثيلين لمدة 3-4 أسابيع. جمع الصور الشعاعية المسلسل لتحديد نقطة النهاية ديكالسيفيكيشن.
- تقسم عظم الفخذ طوليا مع قطع من عرفت الخلفي في الطائرة منتصف السهمي. يقدم الأنسجة للتضمين القياسية البارافين والهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ.
- إرسال شرائح ح & ه لأخصائي للتقييم النسيجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إجراء عملية جراحية في ساعة واحدة تقريبا بجراح واحد مع مساعدة مساعد واحد. بعد التحسين الجراحية، داخلها، ومضاعفات ما بعد الجراحة تم التقليل إلى حد كبير واستخدام جهاز الرقصة ضمان حجم ثابت (5 × 3 × 3 مم) والتعريب من عيوب فخذي. الفئران الإسعافية الانتعاش التالية مباشرة من التخدير ولا يبدو أن يكون أي تغيير الأنماط السلوكية؛ مشيه ما لم يكن أنتالجيك، وأنهم لا يبدو أن انزعاج التبعي الخارجية.
أسلاك ك عدم ترابط اختيرت لدبوس الدانية أكثر (الشكل 2)، كما كان pin الدانية الاختطار الأعلى لكسر عندما كانت تستخدم الخيوط الأسلاك. في بعض الحالات، لا سيما في مراقبة الحيوانات دون رهبمب-2 أو السقالات العيوب التي أظهرت أي دليل على تكوين التئام العظام، وكسرت نصائح كسلك واحد أو أكثر بعد حوالي 8 أسابيع كما رأينا في الأسفنج التحكم فقط الأشعة من عظم الفخذ قصت ( 3 الشكل).
تم تحليل الصور الشعاعية وعلم الأنسجة (وصمة عار ح & ه) لتقييم مستويات شفاء العظام. مراقبة سلبية العيوب التي تتضمن فقط اسفنجة الكولاجين أظهر أي دليل على سد تكون العظم بين حواف العظام القريبة والبعيدة (الشكل 3، الشكل 4). يمكن رؤية كمية صغيرة من جديد يعيد البناء العظام المتاخمة مباشرة إلى حافة عظم قص؛ العيب نفسه يظهر الافتقار إلى المواد عظمى ووجود الغضاريف، وبعض دموي المتبقية (الشكل 4). العيوب التي تحتوي على رهبمب-2 غارقة الأسفنج أظهرت العظام كبيرة الشفاء في أقرب وقت 4 أسابيع بعد الجراحة، كما هو موضح من خلال سد القاسي راديوباك عبر العيب في الشكل 3. قبل 12 أسبوعا، ترسب المعادن الجديدة الهامة (الشكل 4، ملحوظة: جديدة العظام، PC: periosteal قاسية) شكلت في جميع أنحاء العيب. يمكن رؤية العظام periosteal جديدة هامة في توسيع القاسي من حافة قطع عظم الفخذ، ووضعت spicules العظام المنسوجة ورقائقي طوال العيب. ترسب الغضاريف لا ينظر إلى (الشكل 4).
وأجرى أيضا علم الأنسجة (وصمة عار ح & ه) لكل عنصر تحكم غير مصاب ومثال عظم الفخذ المصابة (الشكل 5). عظم الفخذ المصابة هو توسيع كبير، تظهر عليه بوادر لفعل بطانة العظم التسلل إلى قشرة العظام. تشير الأسهم إلى مناطق ارتشاف العظم باثولوجي اوستيوكلاست بوساطة. قشرة عظم مصابة لا يزال الاتفاق ومع لحاء رقائقي محددة بوضوح. جرعات المضادات الحيوية الأمثل لتشمل التغطية القصوى بعد. في حين يمكن أن تحدث العدوى المحيطة بموقع عيب، استمرار الإدارة من المضادات الحيوية موضعياً حول دبوس مواقع وفي المياه والنظام الغذائي أثبتت نجاحها في التقليل من الإصابة بعد العملية الجراحية.
كذلك التصوير باستخدام نظام التصوير في فيفو (إيفيس) يوضح قدرة الخلايا طرحه على تصور داخل العيب بعد غرس التبعي الخارجية (الشكل 6). يمكن بسهولة إزالة لتصوير اللوحة الخارجية والاستعاضة عنها عند الانتهاء. لومينيسسي الخلايا في تجويف النخاع بعد تعداء مع الرصاصية مرناً لوسيفراس جوسايا ترميز. ويتركز على أعلى مستوى من التﻷلؤ في موقع العيب فخذي وهو عدم إعاقة الإشارة بدبابيس تثبيت الجهاز. وهذا يبشر بالخير للدراسات المستقبلية التي تعتمد على الإضاءة الحيوية أو الأسفار لقياس تغيرات بيولوجية مثل تعبير الجين أو البروتين أثناء عملية الشفاء.
رقم 1: تلفيق التبعي الخارجية- A: التخطيطي كندي من التبعي الخارجية المجمعة مع أبعاد المشروح للتصنيع السليم. كل التبعي يتكون من اثنين من ألواح الألومنيوم عقدت معا بمسامير اثنين. ب: يتم قطع ألواح من 1.4 "6" صفائح الألومنيوم مع الأخاديد 'الخامس' قطع في أسفل الورقة. ج: يتم حفر فتحات المسامير اللولبية الموجودة في اللوحات (الخيوط في اللوحة مع الأخاديد 'الخامس') وجميع الحواف والزوايا هي غطى بالرمل للجولة، وتقليل الوزن. د: شددت التبعي الخارجية المجمعة مع مسامير (4-40 × 0.25 "، 18-8 الفولاذ المقاوم للصدأ زر الرأس cap) مرة دبابيس في المكان في الأخاديد' الخامس ' في الدواخل صفائح الألومنيوم. دبوس الأيسر غير مترابطة وهي الأكثر الدانية في عظم الفخذ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التخطيطي من وضع دبوس والتنسيب التبعي، وخلق عيب. A: يتم وضع دبوس القاصي (1.0 مم الخيوط كسلك) في منطقة مشاشي epicondyle استخدام الرقصة (المستطيل الأزرق) لتوجيه إدخال pin الصحيح. يتم وضع الرقصة على سطح الفخذ أنتيرولاتيرال. ب: يتم وضع دبوس الدانية (1.0 مم غير مترابطة ك سلك) استخدام الرقصة بعد إجراء شق صغير في الوتر الوي. ج: دبابيس الأوسط (1.0 مم الخيوط كسلك) يتم إدراجها باستخدام الرقصة. د: هو إزالة الرقصة ولوحات 2 مرفقة بالمسامير باستخدام مسامير 2 لتأمين اللوحات. اللوحات شددت 1 سم فوق مستوى الجلد لتجنب الضغط على الجلد. ﻫ: يتم استخدام منشار تتأرجح السهمي لإنشاء عيب 5 ملم بين دبابيس الأوسط اثنين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تمثيلية عالية الاستبانة الأشعة تظهر العظام الشفاء مع العلاج رهبمب-2- تظهر الصور للاسفنج الكولاجين المراقبة السلبية والمجموعات الأسفنج غارقة رهبمب-2 في 0, 4 و 12 أسبوعا بعد. مجموعة العلاج رهبمب-2 المعارض الشفاء كبيرة بعد 4 أسابيع مع القسوة التي تغطي العيب. نهايات عظم الفخذ مراقبة سلبية لا تندمل مع سد العظام ويبقى العيب غير الأعضاء في اتحاد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4 الرقم: ويعتبر تكوين العظام الجديدة الهامة مع العلاج رهبمب-2- غارقة الممثل 4 × تكبير الصور النسيجي ح & ه للاسفنج الكولاجين المراقبة السلبية ورهبمب-2 مجموعات الأسفنج على حافة قطع عظم الفخذ، وداخل هذا العيب. تشكيل عظم جديد حول عظم الفخذ حافة عنصر التحكم، ولكن امتدادات كبيرة العظام trabecular الجديدة، فضلا عن المشروع القاسي بيريوستيل من عظم الفخذ المعالجة. يعتبر أي مادة عظمى داخل العيب السيطرة، بينما يمكن ملاحظة تكوين العظام الكبيرة في جميع أنحاء عيب المعالجة رهبمب-2. ملحوظة: العظام الجديدة، واو: عظم الفخذ، والغضاريف c:، h: النزيف، الكمبيوتر: periosteal قاسية. شريط الحجم: 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
5 الرقم: عظم الفخذ المصابة المعارض علامات الخلية الملتهبة وتضخم. ح & ه الصور النسيجي لعظم مصابة مقارنة بعظم الفخذ مصابة، على مرأى ومسمع وفي التكبير 4 x مواقع محاصر. ويظل قشرة فخذي مصابة تنظيماً وتحديداً، مع تسجيل القليل من التهاب. عظم الفخذ المصابة ويوسع إلى حد كبير، كما رأينا في العرض الكامل، وهو كسر القشرة حسب المناطق ارتشاف ونخر (مجموعات خلية الأرجواني هو مبين بالأسهم السوداء). واو: عظم الفخذ. شريط الحجم: 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: تم الكشف عن الخلل في إشارة لوسيفراس جاوسيا. ضيائية الخلايا transfected مع لوسيفراس جوسايا مرناً يتم تصويرها مع إيفيس بعد إزالة اللوحة الخارجية. الأحمر يشير إلى شدة استضاءة أعلى في موقع العيب فخذي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نماذج حيوانية صغيرة من إصابات العظام مثل الكسور العظمية كاملة تمكين البحث أن يستكشف آليات تكون العظم، وتقييم إمكانيات العلاجية الحيوية20. تطرح هذه الدراسة الفئران نموذج عيب المجزأ استقرت بالتبعي خارجية مخصصة بسهولة يمكنك استخراج فريق المختبر والهندسة الطبية لإجراء مزيد من الدراسات لإصلاح العظام أوستيوسينثيتيك الحاملة.
الدراسات السابقة استخدام العيوب الحجم الحرج في نماذج الفئران عادة تعتمد على التثبيت الداخلية لوحات21،22،،من2324. على الرغم من أن أسلوب التثبيت أما مقبولة سريرياً، التثبيت الخارجي مزايا متميزة التسبب في اختلال الأنسجة اللينة وفقدان الدم، انخفاض إجمالي مساحة مزروع للتقليل من فرص للاستعمار الجرثومي، أقل ويسمح التعديل بعد العملية الجراحية والتدخلات الجراحية نظموا6. وقد استخدمت النماذج الحيوانية كسر التثبيت الخارجية السابقة مواد لوحة مختلفة، اشترط دبوس، و/أو العظام قطع الطرق12،،من1314. سبب التبعي خارجي في هذا البروتوكول في حلقة العمل في المختبر مع الألومنيوم منخفضة التكلفة ويمكن أن يكون تم تجديده بسهولة، تم التقليل من النفقات. ويوفر هذا يسمح التبعي خارجية اقتصادا الباحثين القيام بتجارب مع عدة مجموعات الحيوانات دون أن يقتصر على الناحية المالية. مقارنة بنموذج تثبيت داخلي، ونحن نعتقد أن هذا النظام أبسط من الناحية الفنية وأكثر استنساخه في نموذج حيوانات صغيرة. في تجربتنا مع هذه النماذج، التثبيت الداخلي هو إلى حد كبير أكثر تطلبا من الناحية الفنية ويمكن أن تتطلب يزرع تشكيلة مخصص. للمعارف، وصاحبي هذا البروتوكول العام فريدة من نوعها في استخدامها للرقصة خصيصا جنبا إلى جنب مع عامل تصميم تكييف التبعي خارجية معدنية15، تمثل سيناريو السريرية المشتركة فضلا عن استعماله عظم تتأرجح شاهد على نحو أفضل تجريد periosteal يقوم بإعداد مواقع كسر للتثبيت. ملاحظة أخيرة على استخدام منشار تتأرجح في هذا النموذج هو أن الحرارة المتولدة وتعطل بيريوستيل التي تحدث يوفر عنصر نهائي للتحكم في تشكيل نموذج غير الأعضاء في الاتحاد. كانت تجربتنا أن مع أساليب أخرى، في هذه النماذج الحيوانية، محققين تخاطر بالضوابط الشفاء.
لضمان نجاح العمليات الجراحية، ينبغي الحرص على العديد من الخطوات الحاسمة: عندما إينسيسينج وإجراء تشريح كفافى لفضح عظم الفخذ من المحيطة بالعضلات، وتجنب الانزعاج الوركي الأعصاب كاودالي، سفن فخذي ميديالى، و وتر الوي بروكسيمالي. الحرص على موقف الرقصة الأجهزة الموازية ومطاردة ضد المسطحة، الوجه أنتيرولاتيرال من عظم الفخذ حيث تكون كافة أطراف التحديد العمودي للعظام. وهذا تأكيد على المحاذاة المناسبة من التبعي الخارجية والحد من احتمالات الكسر دبوس. ترتيب وضع دبوس وجدت لتكون الأكثر مباشرة وكان القاصي أولاً، تليها الدانية وثم كلاهما الأوسط دبابيس. وهذا يسمح لأقل اضطراب وتر الوي بدبوس الدانية. وأخيراً، من المهم أن يوضع كل دبوس بيكورتيكالي، اختراق كلا كورتيسيس حتى أن لم يكن مرة أخرى الخروج من العظام أو التحول في تجويف النخاع.
واستخدمت آلة الأشعة سينية قادرة على التصوير الإشعاعي عالية الاستبانة لرصد حالة شفاء العظام كما يمكن تصور التغيرات النوعية بسهولة وغير إينفاسيفيلي مع مرور الوقت. ومع ذلك، الساق متسقة لتحديد المواقع أمر حاسم لتفسير الشعاعية الدقيقة الاختلافات في تحديد المواقع قد تكون مضللة. النتائج من هذه الدراسة بالاتفاق مع الأعمال السابقة مما يدل على أن وجود عيب فخذي 5 مم يمنع الشفاء العفوي العظام في الفئران العادية25. ولذلك، أي الشفاء هو لاحظت مع العلاجات المضافة مثل غارقة رهبمب-2 الأسفنج يمكن أن يعزى نهائياً إلى معاملة كل منهما (الشكل 3).
وتشمل الشواغل المحتملة لهذه التقنية دبوس الكسر وتخفيف، والعدوى. مشاكل مع الكسر دبوس الدانية في التجارب الأولية دفع التحول من أسلاك ك الخيوط لغير مترابطة. دبابيس عدم ترابط أقوى ميكانيكيا ولكن أيضا خطرا أكبر للتراجع عن من القشرة. خاصة في تشوهات العظام فارغة، قد قطع أسلاك ك أو تشريد حوالي 8 أسابيع بسبب تحميل دبوس دوري المطولة وعدم شفاء (وبالمثل لركوب الدراجات/الانحناء مشبك الورق). واستخدم نظام المضادات الحيوية صارمة لتشمل حقن سيفازولين فورا، والتطبيق اليومي مرهم مضاد حيوي في الموقع، وشق 7 أيام انروفلوكساسين إضافة إلى مياه الشرب، وتغذية العلاج. هذا البروتوكول المضادات الحيوية، جنبا إلى جنب مع التقنيات الجراحية المناسبة المبينة أعلاه، التقليل من الإصابة (الشكل 5).
واحدة من مزايا إضافية لاستخدام التثبيت الخارجي في نموذج حيوان إزالة سهلة مشهدا عيب واستبدال بعد التصوير. وهذا يتيح أكثر فعالية في فيفو التصوير تقنيات الاعتماد على الأسفار أو التﻷلؤ لتقييم التغييرات مثل تعبير الجين أو البروتين. على سبيل المثال، أننا أظهرنا أنه يمكن تصور الخلايا في تجويف النخاع transfected مع الرصاصية مرناً لوسيفراس جوسايا ترميز مع إيفيس. يبين الشكل 6 الذي هو عدم إعاقة القدرة على الكشف عن إشارة التﻷلؤ بهذا النهج التثبيت الخارجي كما أنها قد تكون مع لوحات داخلية، ومسامير، أو مسامير إينتراميدولاري21،،من2223 , 24-يسمح هذا البروتوكول الجراحية فعالة من حيث التكلفة واستنساخه لخلق متسقة وتحقيق الاستقرار لوجود عيب فخذي الحجم الحرج الذي يحاكي الإدارة السريرية الأولية لهذه الكسور المعقدة. إنشاء نموذج الحيوان موثوق بها أمر بالغ الأهمية لأي علاجات تجريبية للاستخدام السريري في نهاية المطاف. نموذجنا أثبتت نتائج يمكن التنبؤ بها، والحد الأدنى من التغييرات السلوكية أو عدم الراحة في حيواناتنا. قد يستخدم هذا النموذج مع مجموعة متنوعة من السقالات على أساس مادة بيولوجية بالاقتران مع تقنيات التصوير المستخدمة في هذه الورقة لأغراض الاختبار متعدية الجنسيات المستقبلية. وهو أملنا في أن الباحثين في العمل مع هذا النموذج، سوف تكون قادرة على استنباط طرق جديدة لعلاج العيوب العظمية الحرجة في المرضى المصابين بصدمات. هذا يمكن أن يساعد في تجنب الاعتلال والتكلفة في علاجات طويلة ويعمل حاليا وربما خفض عدد حالات بتر الأطراف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب مصالح مالية أو منافع. وهناك فوائد لا تلقاها المؤلف من هذه المادة مباشرة أو غير مباشرة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل "منحة معدات المعاهد الوطنية للصحة" 1S10OD023676-01 مع الدعم الإضافي المقدم من خلال جامعة ويسكونسن في الإدارات لجراحة العظام وإعادة التأهيل ومدرسة الطب والصحة العامة. نود أن نعترف كاربوني مركز السرطان دعم المنح P30 CA014520 UW واستخدام "مرفق التصوير الحيوانات الصغيرة"، فضلا عن "منحة التدريب في المعاهد الوطنية للصحة" 5T35OD011078-08 للدعم من مارتن H.. ونشكر أيضا مايكل وماري سو شانون لدعمهم "الشراكة التجدد العضلي الهيكلي".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sterile Saline | Baxter | 2F7124 | Used for irrigating wound and rehydration |
| 10% Iodine/Povidone | Carefusion | 1215016 | Used to prep skin |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370094 | Used as fixative |
| 1mm non-threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1003.15 | Sterilized, used for the most proximal pin |
| 1mm threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1005.15 | Sterilized, used for the 3 most distal pin slots |
| 2x2 gauze | Covidien | 4006130 | Sterilized, used to prep skin and absorb blood |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | 4015304 | Used to close muscle and skin layers |
| 4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws | Generic | External fixator assembly | |
| 4200 Cordless Driver | Stryker | OR-S-4200 | Used to drill kirschner wires |
| 4x4 gauze | Covidien | 1219158 | Sterilized, used to absorb blood |
| 70 % Ethanol | Used to prep skin | ||
| Baytril | Bayer Healthcare LLC, Animal health division | 312.10010.3 | Added to water as an antibiotic |
| Cefazolin | Hikma Pharmaceuticals | 8917156 | Pre-op antibiotic |
| CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7205 | Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo |
| Double antibiotic ointment | Johnson & Johnson consumer Inc | 8975432 | Applied to pin sites post-op as wound care |
| Dual Cut Microblade | Stryker | 5400-003-410 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP120-500 | Used to decalcify bone to prep for histology |
| Extended Release Buprenorphine | ZooPharm | Used as 3 day pain relief | |
| Fenestrated drapes | 3M | 1204025 | Used to establish sterile field |
| Handpiece cord for TPS | Stryker | OR-S-5100-4N | Used to create 5mm defect in femur |
| Heating pad | K&H Pet Products | 121239 | Rat body temperature maintenance |
| Hexagonal head screwdriver | Wiha | 263/1/16 " X 50 | External fixator tightening |
| Induction chamber | Generic | Anesthesia for rats | |
| Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2 | Medtronic | 7510200 | Clinically relevant treatment used as positive control |
| Isoflurane | Clipper | 10250 | Anesthesia for rats |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | Bioluminescence imaging modality |
| Jig | Custom | Used to place bicortical pins | |
| Lipofectamine MessengerMAX | Fisher Scientific | LMRNA003 | mRNA complexing agent that enables mRNA delivery |
| Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000)) | APP Pharmaceuticals, LLC | NDC 63323-468-37 | Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction |
| Sterile water | Hospira | 8904653 | Used as solvent for cefazolin powder |
| Titanium external fixator plates | Custom | Prepared in house with scrap titanium and milling machine | |
| Total Performance System (TPS) Console | Stryker | OR-S-5100-1 | Used to create 5mm defect in femur |
| TPS MicroSaggital Saw | Stryker | OR-S-5100-34 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ultrafocus Faxitron with DXA | Faxitron | High resolution radiographic imaging modality | |
| Uniprim rat diet | Envigo | TD.06596 | Medicated rat diet |
| Universal Handswitch for TPS | Stryker | OR-S-5100-9 | Used to create 5mm defect in femur |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | Skin closure |
References
- Filipowska, J., Tomaszewski, K. A., Niedźwiedzki, Ł, Walocha, J. A., Niedźwiedzki, T. The role of vasculature in bone development, regeneration and proper systemic functioning. Angiogenesis. 20 (3), 291-302 (2017).
- Charalambous, C. P., Akimau, P., Wilkes, R. A. Hybrid monolateral-ring fixator for bone transport in post-traumatic femoral segmental defect: A technical note. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 129 (2), 225-226 (2009).
- Xing, J., et al. Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering. The Journal of Surgical Research. 192 (2), 454-463 (2014).
- Chadayammuri, V., Hake, M., Mauffrey, C. Innovative strategies for the management of long bone infection: A review of the Masquelet technique. Patient Safety in Surgery. 9 (32), (2015).
- Koettstorfer, J., Hofbauer, M., Wozasek, G. E. Successful limb salvage using the two-staged technique with internal fixation after osteodistraction in an effort to treat large segmental bone defects in the lower extremity. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 132 (19), 1399-1405 (2012).
- Fragomen, A. T., Rozbruch, S. R.
- O’Toole, R. V., et al. A prospective randomized trial to assess fixation strategies for severe open tibia fractures: Modern ring external fixators versus internal fixation (FIXIT Study). Journal of Orthopaedic Trauma. 31, S10-S17 (2017).
- Fürmetz, J., et al. Bone transport for limb reconstruction following severe tibial fractures. Orthopedic Reviews. 8 (1), 6384 (2016).
- Dohin, B., Kohler, R. Masquelet’s procedure and bone morphogenetic protein in congenital pseudarthrosis of the tibia in children: A case series and meta-analysis. Journal of Children's Orthopaedics. 6 (4), 297-306 (2012).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11, 45-54 (2015).
- Pascher, A., et al. Gene delivery to cartilage defects using coagulated bone marrow aspirate. Gene Therapy. 11 (2), 133-141 (2004).
- Glatt, V., Matthys, R. Adjustable stiffness, external fixator for the rat femur osteotomy and segmental bone defect models. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Betz, O. B., et al. Direct percutaneous gene delivery to enhance healing of segmental bone defects. The Journal of Bone and Joint Surgery. 88 (2), 355-365 (2006).
- Fang, J., et al. Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogenic plasmid genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5753-5758 (1996).
- Kaspar, K., Schell, H., Toben, D., Matziolis, G., Bail, H. J. An easily reproducible and biomechanically standardized model to investigate bone healing in rats, using external fixation. Biomedizinische Technik. 52 (6), Berlin. 383-390 (2007).
- Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. American Veterinary Medical Association. , (2013).
- McKay, W. F., Peckham, S. M., Badura, J. M. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft). International Orthopaedics. 31 (6), 729-734 (2007).
- Living lmage Software. , Perkin Elmer. (2006).
- Bassett, J. H. D., Van Der Spek, A., Gogakos, A., Williams, G. R. Quantitative X-ray imaging of rodent bone by faxitron. Methods in Molecular Biology. , 499-506 (2012).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Lieberman, J. R., et al. The effect of regional gene therapy with bone morphogenetic protein-2-producing bone-marrow cells on the repair of segmental femoral defects in rats. The Journal of Bone and Joint Surgery. 81 (7), 905-917 (1999).
- Tsuchida, H., Hashimoto, J., Crawford, E., Manske, P., Lou, J. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats. Journal of Orthopaedic Research. 21 (1), 44-53 (2003).
- Jiang, H., et al. Novel standardized massive bone defect model in rats employing an internal eight-hole stainless steel plate for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2162-2171 (2018).
- Baltzer, A. W., et al. Genetic enhancement of fracture repair: Healing of an experimental segmental defect by adenoviral transfer of the BMP-2 gene. Gene Therapy. 7 (9), 734-739 (2000).
- Li, Y., et al. Bone defect animal models for testing efficacy of bone substitute biomaterials. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (3), 95-104 (2015).
