Summary
In vivo zoogdieren modellen van kritische en middelgrote bot gebreken zijn essentieel voor de onderzoekers bestuderen van genezing mechanismen en orthopedische therapieën. Hier introduceren we een protocol voor de oprichting van femur, reproduceerbaar, Gesegmenteerde defecten in ratten gestabiliseerd met behulp van externe fixatie.
Abstract
Orthopedisch onderzoek leunt op dierlijke modellen bestuderen van mechanismen van bot in vivo genezing, alsook het onderzoeken van de nieuwe behandelingstechnieken. Kritische en middelgrote Gesegmenteerde defecten zijn uitdagend voor de behandeling van klinisch en onderzoeksinspanningen kunnen profiteren van een betrouwbare, ambulante kleine diermodel van een segmentale femorale defect. In deze studie presenteren wij een geoptimaliseerde chirurgische protocol voor het consistente en reproduceerbare creëren van een kritische diaphyseal defect 5 mm in een rat dijbeen gestabiliseerd met een externe fixator. De diaphyseal ostectomy werd uitgevoerd met behulp van een aangepaste mal te plaatsen 4 Kirschner draden bicortically, die werden gestabiliseerd met een aangepast externe fixator apparaat. Een oscillerende zaag bot werd gebruikt voor het maken van het gebrek. Een collageen spons alleen of een collageen spons, gedrenkt in rhBMP-2 het gebrek werd ingeplant en de genezing van de bot meer dan 12 weken met behulp van röntgenfoto's werd gecontroleerd. Na 12 weken, ratten werden opgeofferd en histologische analyse werd uitgevoerd op het verwijderde besturingselement en dijbeen behandeld. Bot gebreken met alleen collageen spons resulteerde in non-adhesie, terwijl rhBMP-2 behandeling de vorming van een periosteal hardvochtig en nieuwe bot verbouwing leverde. Dieren goed herstelde na implantatie en externe fixatie succes in het stabiliseren van de femorale gebreken meer dan 12 weken. Deze gestroomlijnde chirurgische model kan gemakkelijk worden toegepast om te studeren bot genezing en testen van nieuwe orthopedische biomaterialen en regeneratieve therapieën in vivo.
Introduction
Orthopedisch trauma chirurgie richt zich op de behandeling van een breed scala van complexe fracturen. Kritische diaphyseal regiogebonden bot gebreken hebben bewezen moeilijk te behandelen klinisch als gevolg van het verminderde regeneratieve vermogen van de omliggende spier en het periosteum evenals het falen van gelokaliseerde angiogenese1. Moderne behandelingstechnieken omvatten operatieve fixatie met bottransplantaat, vertraagd bottransplantaat (Masquelet), bone vervoer, fusie of amputatie2,3,4. Bij de meeste patiënten hebben ambulante functie behouden na hun trauma, met goed functionerende distale ledematen, is ledemaat restwaarde duidelijk een betere behandeling optie5. Deze berging behandelingen vereisen vaak geënsceneerde chirurgische ingrepen in de loop van een lange behandeling. Sommige auteurs hebben gesuggereerd dat externe fixatie is superieur ten opzichte van de oppervlakte van de inwendige fixatie voor deze toepassingen als gevolg van de verminderde weefselschade tijdens de implantatie, daalde geïmplanteerd, en verhoogde postoperatieve verstelbaarheid van het fixatiemiddel6. Een prospectieve gerandomiseerde gecontroleerde trial is echter momenteel aan de gang om te helpen verduidelijken deze controverse van interne versus externe fixatie in ernstige open fracturen van de tibia7. Helaas bestaan belangrijke complicatie en mislukking tarieven met beide behandeling geselecteerd,8,9. Met beide methoden van de behandeling, met betrekking tot de gesegmenteerde botverlies, moet de chirurg kampen met segmentale diaphyseal gebreken die significante uitdagingen presenteren. Correcties van gesegmenteerde defecten moeten maximaliseren bot stabilisatie en tegelijkertijd het verbeteren van het proces van de osteogenic10,11.
Als gevolg van het klinische belang, maar het lagere volume, kritische en middelgrote diaphyseal Gesegmenteerde defecten, is een effectief, reproduceerbaar diermodel noodzakelijk om onderzoeksteams verder behandelingstechnieken en uiteindelijk klinische resultaten te verbeteren. Onderzoekers moeten bestuderen in vivo fysiologische genezing mechanismen in een diermodel voor zoogdieren. Hoewel dergelijke modellen van externe fixatie al bestaan12,13,14,15, hopen we om een betrouwbaarder methode voor niet-vakbonden in de onbehandelde dieren, daling van de kosten door de keuze van betaalbare fixatiemiddel materialen en het overzicht van een eenvoudige chirurgische protocol voor de gemakkelijke toepassing op toekomstige studies. Het hoofddoel van dit protocol is om een betrouwbare en reproduceerbare model van een kritische diaphyseal defect bij ratten. De procedure werd door de beoordeling van de stabilisatie en het bot genezing in rat dijbeen meer dan 12 weken beoordeeld. De secundaire doelstellingen opgenomen: waardoor een betaalbare model als een rendabel mogelijk, vereenvoudiging van de chirurgische benadering en stabilisatie, en het waarborgen van ethische verzorging van de dieren. De auteurs en het onderzoeksteam verricht voorbereidende experimenten met een aantal verschillende biomaterialen en potentiële regeneratieve therapieën om genezing in dit segment defect.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De ratten gebruikt in deze studie ontvangen dagelijkse verzorging overeenkomstig de AVMA richtsnoeren voor de euthanasie van dieren: 2013 editie16. Het institutionele Animal Care en gebruik Comité aan de Universiteit van Wisconsin-Madison geëvalueerd en dit experimentele protocol goedgekeurd voordat het project is begonnen.
1. dieren
- Gebruik de outbred mannelijke Sprague-Dawley ratten die weegt ongeveer 350 g.
2. voorbereiding van bot morfogenetische eiwit-2 (rhBMP-2) gedrenkte spons steigers
Opmerking: Steiger voorbereiding moet optreden vlak vóór implantatie in het dijbeen (zie stap 6.14).
- Volg de instructies van de fabrikant voor het gebruik van een gevestigde rhBMP-2 bone graft kit met een collageen spons, gelyofiliseerd rhBMP-2 en steriel water voor reconstitutie17. Handhaving van de steriliteit, reconstrueren de rhBMP-2 met de steriel water tot een concentratie van 1,5 mg/mL.
- Met behulp van steriele schaar en een steriele heerser, trim de rhBMP-2 doorweekte collageen spons te hervormen om te passen een 5 x 3 mm x 3 mm defect.
- Behulp van een spuit, de rhBMP-2 oplossing gelijkmatig verdelen over de collageen spons zodat het wordt geabsorbeerd.
3. voorbereiding van de aangepaste externe fixatie apparaat
Opmerking: Zie figuur 1A voor de meer volledige lijst van afmetingen.
- Aluminium blad voorraad (type 6061, 0.088" dikte) op twee gesneden stukken (1.4" x 6") met behulp van een decoupeerzaag of ander passend gereedschap.
- Mount een stuk in de freesmachine en vier "V" groeven (0,035" diep) met behulp van een 1/8" 90°-punt carbide boor molen, snijden in de lengte. Laat het andere stuk gratis van bezuinigingen.
- Knippen van afzonderlijke platen van 0.3" breedte van de twee stukken (figuur 1B). Meten en boor de schroefgaten voor 4-40 draad. Tik op de plaat met "V" groeven met de wol 4-40. De plaat zonder groeven voor een #4 schroef lichaam boor boor.
- Zand beide stukken ronde hoeken en het verminderen van gewicht (Figuur 1 c).
- Schroef stukken samen met 4-40, 18-8 RVS knop hoofd cap schroeven (0,25") zodat de groeven zijn flush tegen de vlakte plaat (Figuur 1 d)
4. verdoving procedure en analgesie
- Verdoving door het plaatsen van de rat in inductie kamer leveren van 4 L O2/min met 4% Isofluraan induceren.
Let op: Onderzoek personeel moeten voorkomen van inademing verdoving gas en onderhouden van goede kap en ventilatie in het laboratorium. - Verwijder de rat uit de zaal nadat de rat restarmen reflex verliest, hechten een neus kegel en plaats op de onderhoudsdosis van verdoving via de neus (O2 levering tarief tot 2-3 L/min en 0,8% Isofluraan).
- Plaats de rat op de verwarming pad of onder de opwarming van de aarde licht te voorkomen hypothermie.
- Bevestig de voldoende diepte van verdoving door knijpen de teen of de ooglidreflex reflex testen.
- Smering van toepassing op ogen om te voorkomen dat het drogen uit het hoornvlies.
- Leveren een subcutane injectie van uitgebreid-release buprenorfine (1 mg/kg) op de kofferbak/dorsum van de rat, ver van de chirurgische site, analgesie voorzien tot 3 dagen na de operatie.
5. aseptische voorbereiding en antibiotica preventatives
- Scheren gebied rond hindleg met behulp van de 13th rib, de voet, de dorsale middellijn en de ventral midline als marges.
- Scrub geschoren gebied met steriel gaas van 2 x 2 gedrenkt met 10% Povidon-jodium gevolgd door 70% EtOH (4 keer met elk, afwisselend).
- Een intramusculaire injectie van cefazolin (20 mg/kg) in de operatieve quadriceps beheren.
- Beheren enrofloxacin (0,25 mg/ml) in drinkwater voor 7 dagen postoperatief voor voortdurende antibiotische bescherming.
- Ratten op gemedicineerde diervoeders (bijvoorbeeld Uniprim) voor de duur van de studie ter voorkoming van pin landstreekbesmettingen plaatsen.
- Toepassing dubbele antibiotische zalf op de huid-pins interface eenmaal dagelijks voor 3 dagen postoperatief.
Opmerking: Voorkomen van eventuele externe fixatie pin of klem losmaken die kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van een infectie.
6. de chirurgische procedure
Opmerking: Maken een gezamenlijke inspanning te handhaven een steriel veld en werkruimte en steriele techniek in het geheel van de zaak te volgen.
- Uitbreiden geschoren been via fenêtré, duidelijk kleverige draperen en dekking chirurgische Bank in steriele handdoeken om een steriele veld te maken.
- Palperen van het dijbeen en het gebruik van een mes #15 maken een anterolateral incisie via de huid die zich uitstrekt van de knieschijf tot de grotere trochanter op het proximale dijbeen.
- Zorgvuldig incise de laterale been fascia langs het intermuscular septum te scheiden de vastus lateralis spier van de quadriceps anteriorly van de hamstrings posteriorly totdat de laterale femur is blootgesteld. Behoud van de abductor gluteos pees plaatsing op de grotere trochanter.
- Een zorgvuldige, atraumatische ze weke dissectie uitvoeren en het bovenbeen op het halverwege diaphysis begint op de laterale oppervlak blootstellen. Om dit te doen, gebruik u een mes #15 te voorzichtig snijden de spier uit de buurt van het onderliggende bot doordat het mes parallel tegen de omtrek van het oppervlak van bot. Gebruik een periosteal lift om te heffen van de spier uit de buurt van het blootgestelde bot zoals het is ontleed en gaan rond de femorale schacht tot 7-10 mm van de centrale diaphysis is gewist van weke delen aan alle kanten om voor ostectomy te bereiden.
Opmerking: Voorkomen schade aan de mediale femorale neurovasculaire bundel. - Steek vier draden van 1,0 mm Kirschner (k): 2 proximale en distale in het loodrecht op de laterale femur, dijbeen 2 rechte lateraal naar mediaal geregisseerd. Zorgen ervoor dat alle pinnen aanspannen om beide cortices (bicortical) voor voldoende stabiliteit (figuur 2A).
- Begin met de distale-meeste pin eerst, net op het niveau van de laterale epicondylus. Plaats mal spoel aan de laterale distale femur en steek een 1.0 schroefdraad tip k-draad.
- Het handhaven van de positie van de mal op het bot, identificeren waar de meest proximale pin treedt het bot op basis van de gaten van de mal. Zodra de positie wordt bepaald, zorgvuldig incise parallel aan de vezels van de pees gluteos zoals nodig voor het maken van een kleine opening in het weefsel om de proximale pincode te passeren, dus het minimaliseren van iatrogene schade aan de pees. Boor een 1,0 mm niet-threaded k-draad in deze leemte opnieuw zorgen voor dat de pin zich bezighoudt met beide cortices (figuur 2B).
- Handhaven van de mal in contact met het bot en boor twee 1,0 mm schroefdraad k-draden, een aan beide zijden van de toekomstige defect-site. Zorgen ervoor pinnen aanspannen om beide cortices (figuur 2C).
- Plaats de externe fixator bar niveau 1 cm boven de huid en schroef strak, vergrendeling van de bar in plaats. De overtollige pin lengtes (figuur 2D) illustraties.
- Voorbereiden op het ostectomy (gebrek creatie) door het plaatsen van een kleine, gebogen oprolmechanisme rond de anterieure en posterieure dijbeen ter bescherming van de omliggende weke delen, spieren en neurovasculaire bundel. Met behulp van een ~ 5 mm Sagittaal oscillerende blade zag, heel voorzichtig maken een segmentale defect van 5 mm door de medio diaphysis. Het toepassen van een licht, zelfs druk met de zaag om te voorkomen dat geen onnodige fractuur (figuur 2E).
- Toepassing van kleine hoeveelheden van irrigatie (kamertemperatuur 0,9% steriele normale zout (NS)) zoals nodig tijdens het maken van defect Voorkom thermische necrose van het bot.
- Spoel de wond met behulp van 10 mL voor NS na het maken van het gebrek.
- Beheren van 0,1 mL van een 0,25% bupivacaine met epinefrine (1:200, 000) op de wond als een pijnstiller en een vasoconstrictor.
- Invoegen de steiger (5 x 3 x 3 mm) of rhBMP-2 en collageen spons gedrenkt spons (vanaf stap 2) in het defect. Elke steiger moet op passende wijze worden aangepast omspannen de lengte en de omvang van het defect, de spons in positie blijven helpen.
Opmerking: op dit punt, mRNA complexen kunnen worden voorbereid en geïnjecteerd zoals beschreven in stappen 7,1-7.3 hieronder als bioluminescentie imaging wilt uitvoeren. - Sluit het vliegtuig van de spier met behulp van de eenvoudige onderbroken patroon met 4-0 absorbeerbare hechtdraad. Sluit de laag van de huid met behulp van een lopende subcuticular patroon met 4-0 absorbeerbare hechtdraad en huid lijm om de leemten rond de uitstekende pinnen.
- De rat uit de neus, nog op het pad van de verwarming, verwijderen en controleren doorlopend afgespeeld, totdat de rat vermag consequent een rechtop houding. Op dit moment plaats in een schone kooi te herstellen.
7. bereiding van complexvorm mRNA en bioluminescentie beeldvorming
Opmerking: Transfectie met mRNA complexen moet worden uitgevoerd tijdens de operatie 1 dag vóór de luminescentie imaging. Steriele technieken gebruiken bij het verwerken van mRNA.
- Mix 10 µL van mRNA codering voor Gaussia luciferase (voorraad concentratie van 1 µg/µL) met 30 µL van de lipidic transfecting agent.
- Toestaan voor de mRNA-lipide-complexen te vormen door gedurende ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen. De lipidic transfecting agent zal de mRNA moleculen, condenseren ze stabiliseren en verbetering van de efficiëntie van de transfectie.
Opmerking: Als de complexen niet direct gebruikt zijn, slaan ze in ijs voor een maximum van 1 uur. - Met behulp van een 20 µL pipet uitgerust met gefilterde tips, injecteren helft van het volume van mRNA complexen tot aan de uiteinden van het distale en proximale van het gebrek, respectievelijk.
- De volgende dag, 3 min vóór imaging, anesthetize de rat met behulp van de geïnhaleerde Isofluraan zoals eerder is beschreven in stap 4.1.
- Plaats de rat in een in vivo imaging kamer uitgerust met een neus kegel leveren van onderhoud Isofluraan (0,8% Isofluraan, O2 levering snelheid van 2-3 L/min).
- Injecteren coelenterazine geresuspendeerde in een zoutoplossing bij een dosis van 4 mg/kg lichaamsgewicht in de nabijheid van het defect.
- Verwerven bioluminescentie beelden met de in vivo imaging systeem (IVIS) volgens de fabrikant instructies18.
8. imaging Protocol
- Na het kalibreren van de gewone radiografische machine, een X-ray systeem19, anesthetize rat gebruik van geïnhaleerde Isofluraan als eerder beschreven (Zie stap 4.1) en de positie van de rat in een neus kegel met geïnhaleerde Isofluraan (0,8% Isofluraan, O2 de snelheid van de levering van 2-3 L/min) voor een radiografie van de dijbeen anteroposterior (AP).
- Terwijl de rat sternale lighouding wordt, verder de chirurgische stuk vooruit, op de heup buigen en gezamenlijke verstikken. Buig het verstikken gewricht tot ongeveer 90°. Tape de poot plantaire kant naar beneden, dicht tegen de muur van het lichaam. Positie het onderbeen naar voren uit het dijbeen te elimineren de mogelijkheid van de botten boven elkaar plaatsen. Om lichte ontvoering van de heup, plaatst u een doorschijnend spons (ongeveer 15 mm dik) in de lies-regio. Dan krijgen een anterior-posterior (Cranio-caudal) beeld van het dijbeen.
- Herhaal deze AP dijbeen radiografische weergave onmiddellijk na de operatie, 4 weken, en 12 weken. Gebruik tape en gaas te positioneren op de juiste manier van het dier extremiteit voor kwaliteit en consistente beeldbewerking.
- Verwijderen van de rat uit de neus en volgen voortdurend totdat de rat vermag consequent een rechtop houding. Dan, plaats terug in de kooi.
9. histologische Procedure
- Ratten in een kamer met geïnhaleerde CO2 volgens AVMA ethische normen16euthanaseren.
- Volgende euthanasie, scheren van het stuk, verwijder de huid van de operatieve extremiteit en disarticulate dijbeen op de heup. Verwijder voorzichtig alle weke delen van het operatieve dijbeen (met inbegrip van alle spieren, pezen en ligamenten). Laat alleen een dunne laag van spier rondom de defect-site om de helende regio te beschermen tegen onbedoelde schade tijdens dissectie.
- Plaats het dijbeen in 10% neutraal gebufferd formaline bij kamertemperatuur gedurende 3-4 dagen te voorzien van fixatie. Houd een formaline 15:1 uit weefsel volumeverhouding. Wijzig de oplossing zodra halverwege het proces fixatie.
- Decalcify het bovenbeen in een 15% ethyleendiamminetetra (EDTA) pH 6,5 zuuroplossing voor 3-4 weken. Verzamelen van seriële röntgenfoto's om te bepalen van botontkalking eindpunt.
- Bisect het dijbeen lengterichting met een verlaging van anterior to posterior in het mid-Sagittaal vlak. Indienen van weefsel voor standaard paraffine insluiten en haematoxyline en eosine (H & E) kleuring.
- H & E dia's naar een patholoog histologisch beoordeling verzenden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chirurgische ingrepen werden uitgevoerd in ongeveer een uur door een chirurg met behulp van een assistent. Na chirurgische optimalisatie, intra- en postoperatieve complicaties waren sterk geminimaliseerd en gebruik van het apparaat van de mal gegarandeerd consistent grootte (5 x 3 x 3 mm) en localisatie van femur gebreken. Ratten werden ambulante onmiddellijk daaropvolgende herstel van anesthesie en niet lijken te hebben eventuele gewijzigde gedragspatronen; hun gang was niet antalgic, en ze niet lijken te worden verstoord door de externe fixator.
Zonder schroefdraad k-draden werden gekozen voor de meest proximale pin (figuur 2B), zoals de proximale pin had het hoogste risico op breken wanneer schroefdraad draden werden gebruikt. In sommige gevallen, met name in controle controle dieren zonder rhBMP-2 of steigers die defecten bleek geen bewijs van genezing/biomineralisatie, één of meer k-draads tips brak na ongeveer 8 weken, zoals gezien in de spons alleen radiografie van de verwijderde dijbeen ( Figuur 3).
Röntgenfoto's en histologie (H & E vlek) werden geanalyseerd om te kunnen beoordelen van niveaus van bot genezing. Negatieve controle gebreken met alleen een collageen spons toonde geen bewijs van overbruggen osteogenesis tussen de randen van de proximale en distale bot (Figuur 3, , Figuur 4). Een kleine hoeveelheid van het remodelleren van nieuw bot te zien direct aan de rand van gesneden dijbeen; het defect zelf toont een gebrek aan benige materiaal, de aanwezigheid van kraakbeen, en sommige residuele hematoom (Figuur 4). Defecten met rhBMP-2 geweekt spons aangetoond aanzienlijke bot genezing zo spoedig 4 weken na de operatie, zoals blijkt uit de radiopaak hardvochtig overbruggen over het gebrek in Figuur 3. Bij 12 weken, belangrijke nieuwe minerale afzetting (Figuur 4, NB: nieuw bot, PC: periosteal ongevoelig) gedurende het gebrek heeft gevormd. Belangrijke nieuwe periosteal bot kan worden gezien in de wrede zich uitstrekt van de rand geslepen dijbeen en botsplinters van geweven en lamellaire bot hebben ontwikkeld gedurende het defect. Kraakbeen afzetting is niet gezien (Figuur 4).
Histologie (H & E vlek) werd ook uitgevoerd voor zowel een niet-geïnfecteerde control en een voorbeeld van een geïnfecteerde dijbeen (Figuur 5). De besmette dijbeen is aanzienlijk vergroot, tekenen van een endosteale reactie infiltreert in de cortex van het bot. Pijlen geven gebieden van pathologische bot osteoclast-gemedieerde resorptie. De niet-geïnfecteerde dijbeen cortex blijft compact en met een duidelijk afgebakende lamellaire cortex. Toediening van antibiotica is geoptimaliseerd om maximale dekking postoperatief. Terwijl infectie rond de defect-site kan het optreden van, verdere toediening van antibiotica topisch rond pin sites en in water en dieet succesvol bij het minimaliseren van postoperatieve infectie.
Verdere beeldvorming met behulp van In Vivo Imaging systeem (IVIS) illustreert het vermogen van bioluminescente cellen worden gevisualiseerd binnen het defect na implantatie van de externe fixator (Figuur 6). De externe plaat kan gemakkelijk worden verwijderd voor imaging en vervangen na voltooiing. Cellen in de Wallenberg holte luminesce na transfectie met complexvorm mRNA-codering voor Gaussia luciferase. Het hoogste niveau van luminescentie is gericht op de site van het femur defect en het signaal niet wordt verhinderd door de fixatie apparaat pinnen. Dit is veelbelovend voor toekomstige studies vertrouwen op Bioluminescentie of fluorescentie te meten van de biologische veranderingen zoals een gen of eiwit expressie tijdens het genezingsproces.
Figuur 1: Vervaardiging van externe fixator. A: CAD schematische voorstelling van de geassembleerde externe fixator met geannoteerde afmetingen voor goede fabricage. Elke fixatiemiddel is samengesteld uit twee aluminium platen samengehouden door twee schroeven. B: platen zijn gesneden uit 1.4 "x 6" aluminium platen met "V" groeven gesneden in het onderste blad. C: schroefgaten worden geboord in de platen (schroefdraad in de plaat met "V" groeven) en alle randen en de hoeken zijn geschuurd ronde en het verminderen van gewicht. D: geassembleerde externe fixator is aangescherpt met schroeven (4-40 x 0,25", 18-8 RVS knop hoofd GLB) zodra pinnen plaats in de"V"groeven op de binnenkant van de aluminium platen zijn. De linker pin is niet-threaded en meest proximale op het dijbeen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Schematische van pin plaatsing, fixatiemiddel plaatsing en defect creatie. A: de distale pin (1,0 mm schroefdraad k-wire) is geplaatst bij de epicondylus metafyse regio met behulp van de mal (blauwe rechthoek) om te leiden van de juiste pin inbrengen. De mal wordt geplaatst op de anterolateral femorale oppervlak. B: de proximale pin (1,0 mm niet-threaded k-wire) is geplaatst met behulp van de mal na het maken van een kleine incisie in de gluteos pees. C: de middelste pinnen (1,0 mm schroefdraad k-draads) zijn ingevoegd met behulp van de mal. D: de mal wordt verwijderd en de 2 platen zijn gekoppeld aan de pinnen gebruik van de 2 schroeven ter beveiliging van de platen. De platen zijn 1 cm boven de huid niveau om te voorkomen dat de druk op de huid verstrakt. E: een Sagittaal oscillerende zaag is gebruikt voor het maken van een defect van 5 mm tussen de twee middelste pinnen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Vertegenwoordiger high-resolution röntgenfoto's tonen bot genezing met behandeling van de rhBMP-2. Beelden voor de negatieve controle collageen spons en de rhBMP-2 doorweekte spons groepen staan op 0, 4 en 12 weken postoperatief. De rhBMP-2 behandelde groep vertoont aanzienlijke genezing na 4 weken met wrede spanning het gebrek. De negatieve controle dijbeen eindigt niet met het overbruggen van bot doen genezen en het gebrek blijft een niet-Unie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Belangrijke nieuwe biomineralisatie wordt gezien met behandeling van de rhBMP-2. Vertegenwoordiger 4 x vergroot H & E histologische beelden voor de negatieve controle collageen spons en de rhBMP-2 geweekt spons groepen aan de rand van gesneden dijbeen, zowel binnen het gebrek. Nieuw bot gevormd rond de rand van de dijbeen besturingselement, maar belangrijke uitbreidingen van zowel nieuw trabecular bot evenals het periosteal hardvochtig project van het behandelde dijbeen. Geen benige materiaal wordt gezien binnen het besturingselement defect, terwijl belangrijke biomineralisatie kan worden waargenomen in de rhBMP-2 behandelde defect. NB: nieuw bot F: dijbeen, C: kraakbeen, H: bloeding, PC: periosteal ongevoelig. Schaal bar: 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Infected dijbeen vertoont hypertrofie en inflammatoire cel markers. H & E histologische beelden van een niet-geïnfecteerde dijbeen ten opzichte van een geïnfecteerde dijbeen, in volledige weergave en bij 4 x vergroting van de doos locaties. De niet-geïnfecteerde femorale cortex blijft georganiseerd en afgebakend, met weinig tekenen van ontsteking. De besmette dijbeen vergroot sterk, zoals te zien in de volledige weergave, en de cortex wordt verdeeld door gebieden van resorptie en necrose (paarse cel clusters aangegeven door zwarte pijlen). F: dijbeen. Schaal bar: 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Gaussia luciferase signaal gedetecteerd in het defect. Luminescentie van cellen transfected met Gaussia luciferase die mRNA is beeld met IVIS na verwijdering van de externe plaat. Rood geeft de hoogste intensiteit van de luminescentie op de site van het femur defect. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kleine dierlijke modellen van orthopedische letsels zoals volledige botbreuken inschakelen onderzoek dat de mechanismen voor osteogenesis en beoordeling van de therapeutische mogelijkheden van biomaterialen20verkent. Deze studie introduceert een rat regiogebonden defect model gestabiliseerd door een aangepaste externe fixator die een lab en biomedische technologie team gemakkelijk voor verdere studies van dragende osteosynthetic bot reparatie reproduceren kan.
Eerdere studies met behulp van kritische en middelgrote gebreken in rat modellen vaak, is afhankelijk van interne fixatie platen21,22,23,24. Hoewel beide methoden fixatie klinisch acceptabel is, heeft externe fixatie de duidelijke voordelen van het veroorzaakt minder verstoring van de weke delen en bloedverlies, verminderen de totale geïmplanteerde oppervlakte om te minimaliseren van kansen voor bacteriële kolonisatie, en rekening houdend met de postoperatieve verstelbaarheid en geënsceneerde chirurgische ingrepen6. Vorige externe fixatie dierlijke fractuur modellen hebben gebruikt verschillende plaat materialen, effectuering van de pin en/of been snijden methoden12,13,14. Omdat de externe fixator in dit protocol was gemaakt in het lab workshop met low cost aluminium en kan gemakkelijk worden opgeknapt, werden de kosten geminimaliseerd. Dit biedt dat een voordelige externe fixator kunt onderzoekers voor het uitvoeren van experimenten met meerdere dieren groepen zonder financieel wordt beperkt. In vergelijking tot een inwendige fixatie model, wij zijn van mening dat dit systeem technisch eenvoudiger en meer in een kleine diermodel kunnen worden gereproduceerd is. In onze ervaring met deze modellen, inwendige fixatie is aanzienlijk meer technisch veeleisende en aangepaste-machinaal implantaten kan vereisen. De auteurs kennis, dit algemene protocol is uniek in het gebruik van een douane-ontworpen mal in combinatie met een aangepast metaal externe fixator ontwerp15, evenals het gebruik van een oscillerende bone zag beter vertegenwoordigen het gangbare klinische scenario van strippen van periosteal uitgevoerd ter voorbereiding van de fractuur sites voor fixatie. Een laatste opmerking over het gebruik van een oscillerende zaag in dit model is dat de opgewekte warmte en de verstoring van de periosteal die zich voordoet een sluitstuk van controle bij de vorming van een niet-Unie-model. Onze ervaring is geweest dat met andere methoden, in deze diermodellen, onderzoekers het risico lopen van de besturingselementen voor genezing.
Chirurgische om succes te verzekeren, zorg op verschillende kritische stappen moet worden genomen: bij het gebeuren en het uitvoeren van de ze dissectie om het dijbeen uit de omliggende spieren, bloot te vermijden verontrustende de ischialgie zenuwen caudally, de femorale schepen mediaal, en de gluteos pees proximally. Zorg voor de positie van de mal apparaten parallel en spoel tegen de flat, anterolateral gezicht van het dijbeen, zodat alle pinnen precies loodrecht op de bone zijn. Dit zal de juiste uitlijning van de externe fixator bevestigen en verminderen de kans op breuk van de pin. De volgorde van plaatsing van de pin gevonden te zijn eenvoudigste was distale eerst, gevolgd door proximale en vervolgens beide midden pinnen. Dit toegestaan voor minder verstoring van de gluteos pees door de proximale pin. Tot slot is het belangrijk dat elke pin bicortically wordt geplaatst, doordringen van beide cortices, zodat het niet terug uit het bot of verschuiving in de Wallenberg holte.
Een x-ray machine geschikt voor hoge resolutie radiografie werd gebruikt voor het controleren van bot-genezende status als kwalitatieve veranderingen kunnen worden gevisualiseerd gemakkelijk en niet-gebeurt na verloop van tijd. Consistente been positionering is echter cruciaal voor nauwkeurige radiografische interpretatie, zoals verschillen in positionering misleidend wellicht. Resultaten van deze studie zijn in overeenstemming met eerdere werk aan te tonen dat een 5 mm femorale defect voorkomt dat spontane bot genezing in normale ratten25. Dus dat is genezing opgemerkt met toegevoegde therapieën zoals de rhBMP-2 gedrenkt spons definitief kan worden toegeschreven aan de respectievelijke behandeling (Figuur 3).
Mogelijk zorgen voor deze techniek behoren pin breuk, losraken en infectie. Problemen met proximale pin breuk in voorbereidende tests gevraagd een overstap van schroefdraad aan niet-threaded k-draad. Zonder schroefdraad pinnen zijn mechanisch sterker maar ook meer risico van afhaakt van de cortex. Met name in lege bot gebreken, k-draden kunnen breken of worden ontheemd ongeveer 8 weken te wijten aan de langdurige cyclische pin laden en gebrek aan genezing (ook fietsen/buigen van een paperclip). Een strikte antibiotica regime werd gebruikt om een onmiddellijke cefazolin injectie, de dagelijkse toepassing van antibiotische zalf op de site van de incisie, 7 dagen voor enrofloxacin toegevoegd aan drinkwater en een gemedicineerde diervoeders. Dit antibioticum protocol, samen met de juiste chirurgische technieken hierboven beschreven geminimaliseerd infectie (Figuur 5).
Een van de extra voordelen van het gebruik van externe fixatie in een diermodel is gemakkelijk verwijderen voor een onbelemmerd uitzicht op het defect en vervanging na imaging. Hierdoor effectiever in vivo beeldvormende technieken afhankelijk van de fluorescentie- of luminescentie te beoordelen van wijzigingen zoals de gen of eiwit expressie. Bijvoorbeeld, hebben wij aangetoond dat cellen in de Wallenberg holte transfected met complexvorm mRNA-codering voor Gaussia luciferase kon worden gevisualiseerd met IVIS. Figuur 6 illustreert dat luminescentie signaal detectievermogen niet wordt verhinderd door deze externe fixatie aanpak als het kan met interne platen, schroeven, of intramedullaire nagels21,22,23 , 24. dit kosteneffectief en reproduceerbare chirurgische protocol voorziet in consistente creatie en stabilisatie van een kritische en middelgrote femorale gebrek dat de eerste klinische behandeling van deze complexe fracturen bootst. De oprichting van een betrouwbare diermodel is essentieel voor een experimentele behandelingen die bestemd zijn voor het uiteindelijke klinische gebruik. Ons model heeft aangetoond voorspelbare resultaten en minimale gedragsveranderingen of ongemak in onze dieren. Dit model kan worden gebruikt met een verscheidenheid van biomaterial gebaseerde steigers in combinatie met de beeldvormingstechnieken gebruikt in dit document voor toekomstige translationeel testdoeleinden. Het is onze hoop dat in het werken met dit model, onderzoekers kundig voor bedenken nieuwe manieren zitten zal om kritische beenderige afwijkingen bij trauma patiënten behandelen. Dit kan helpen voorkomen van de morbiditeit en kosten in langdurige behandelingen momenteel werkzaam en eventueel het aantal amputaties te verkleinen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen of voordelen. Er zijn geen voordelen die direct of indirect door de auteurs van dit artikel ontvangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door een subsidie van NIH apparatuur 1S10OD023676-01 met extra ondersteuning geboden via de Universiteit van Wisconsin afdelingen van orthopedie en revalidatie en School van geneeskunde en de volksgezondheid. Wij wensen te erkennen van de UW Carbone Cancer Center ondersteunen Grant P30 CA014520 en het gebruik van hun kleine dier Imaging faciliteit, evenals de NIH opleiding Grant 5T35OD011078-08 voor ondersteuning van H. Martin. Wij danken ook Michael en Mary Sue Shannon voor hun steun aan het spier-en regeneratie-partnerschap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sterile Saline | Baxter | 2F7124 | Used for irrigating wound and rehydration |
| 10% Iodine/Povidone | Carefusion | 1215016 | Used to prep skin |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370094 | Used as fixative |
| 1mm non-threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1003.15 | Sterilized, used for the most proximal pin |
| 1mm threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1005.15 | Sterilized, used for the 3 most distal pin slots |
| 2x2 gauze | Covidien | 4006130 | Sterilized, used to prep skin and absorb blood |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | 4015304 | Used to close muscle and skin layers |
| 4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws | Generic | External fixator assembly | |
| 4200 Cordless Driver | Stryker | OR-S-4200 | Used to drill kirschner wires |
| 4x4 gauze | Covidien | 1219158 | Sterilized, used to absorb blood |
| 70 % Ethanol | Used to prep skin | ||
| Baytril | Bayer Healthcare LLC, Animal health division | 312.10010.3 | Added to water as an antibiotic |
| Cefazolin | Hikma Pharmaceuticals | 8917156 | Pre-op antibiotic |
| CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7205 | Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo |
| Double antibiotic ointment | Johnson & Johnson consumer Inc | 8975432 | Applied to pin sites post-op as wound care |
| Dual Cut Microblade | Stryker | 5400-003-410 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP120-500 | Used to decalcify bone to prep for histology |
| Extended Release Buprenorphine | ZooPharm | Used as 3 day pain relief | |
| Fenestrated drapes | 3M | 1204025 | Used to establish sterile field |
| Handpiece cord for TPS | Stryker | OR-S-5100-4N | Used to create 5mm defect in femur |
| Heating pad | K&H Pet Products | 121239 | Rat body temperature maintenance |
| Hexagonal head screwdriver | Wiha | 263/1/16 " X 50 | External fixator tightening |
| Induction chamber | Generic | Anesthesia for rats | |
| Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2 | Medtronic | 7510200 | Clinically relevant treatment used as positive control |
| Isoflurane | Clipper | 10250 | Anesthesia for rats |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | Bioluminescence imaging modality |
| Jig | Custom | Used to place bicortical pins | |
| Lipofectamine MessengerMAX | Fisher Scientific | LMRNA003 | mRNA complexing agent that enables mRNA delivery |
| Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000)) | APP Pharmaceuticals, LLC | NDC 63323-468-37 | Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction |
| Sterile water | Hospira | 8904653 | Used as solvent for cefazolin powder |
| Titanium external fixator plates | Custom | Prepared in house with scrap titanium and milling machine | |
| Total Performance System (TPS) Console | Stryker | OR-S-5100-1 | Used to create 5mm defect in femur |
| TPS MicroSaggital Saw | Stryker | OR-S-5100-34 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ultrafocus Faxitron with DXA | Faxitron | High resolution radiographic imaging modality | |
| Uniprim rat diet | Envigo | TD.06596 | Medicated rat diet |
| Universal Handswitch for TPS | Stryker | OR-S-5100-9 | Used to create 5mm defect in femur |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | Skin closure |
References
- Filipowska, J., Tomaszewski, K. A., Niedźwiedzki, Ł, Walocha, J. A., Niedźwiedzki, T. The role of vasculature in bone development, regeneration and proper systemic functioning. Angiogenesis. 20 (3), 291-302 (2017).
- Charalambous, C. P., Akimau, P., Wilkes, R. A. Hybrid monolateral-ring fixator for bone transport in post-traumatic femoral segmental defect: A technical note. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 129 (2), 225-226 (2009).
- Xing, J., et al. Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering. The Journal of Surgical Research. 192 (2), 454-463 (2014).
- Chadayammuri, V., Hake, M., Mauffrey, C. Innovative strategies for the management of long bone infection: A review of the Masquelet technique. Patient Safety in Surgery. 9 (32), (2015).
- Koettstorfer, J., Hofbauer, M., Wozasek, G. E. Successful limb salvage using the two-staged technique with internal fixation after osteodistraction in an effort to treat large segmental bone defects in the lower extremity. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 132 (19), 1399-1405 (2012).
- Fragomen, A. T., Rozbruch, S. R.
- O’Toole, R. V., et al. A prospective randomized trial to assess fixation strategies for severe open tibia fractures: Modern ring external fixators versus internal fixation (FIXIT Study). Journal of Orthopaedic Trauma. 31, S10-S17 (2017).
- Fürmetz, J., et al. Bone transport for limb reconstruction following severe tibial fractures. Orthopedic Reviews. 8 (1), 6384 (2016).
- Dohin, B., Kohler, R. Masquelet’s procedure and bone morphogenetic protein in congenital pseudarthrosis of the tibia in children: A case series and meta-analysis. Journal of Children's Orthopaedics. 6 (4), 297-306 (2012).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11, 45-54 (2015).
- Pascher, A., et al. Gene delivery to cartilage defects using coagulated bone marrow aspirate. Gene Therapy. 11 (2), 133-141 (2004).
- Glatt, V., Matthys, R. Adjustable stiffness, external fixator for the rat femur osteotomy and segmental bone defect models. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Betz, O. B., et al. Direct percutaneous gene delivery to enhance healing of segmental bone defects. The Journal of Bone and Joint Surgery. 88 (2), 355-365 (2006).
- Fang, J., et al. Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogenic plasmid genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5753-5758 (1996).
- Kaspar, K., Schell, H., Toben, D., Matziolis, G., Bail, H. J. An easily reproducible and biomechanically standardized model to investigate bone healing in rats, using external fixation. Biomedizinische Technik. 52 (6), Berlin. 383-390 (2007).
- Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. American Veterinary Medical Association. , (2013).
- McKay, W. F., Peckham, S. M., Badura, J. M. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft). International Orthopaedics. 31 (6), 729-734 (2007).
- Living lmage Software. , Perkin Elmer. (2006).
- Bassett, J. H. D., Van Der Spek, A., Gogakos, A., Williams, G. R. Quantitative X-ray imaging of rodent bone by faxitron. Methods in Molecular Biology. , 499-506 (2012).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Lieberman, J. R., et al. The effect of regional gene therapy with bone morphogenetic protein-2-producing bone-marrow cells on the repair of segmental femoral defects in rats. The Journal of Bone and Joint Surgery. 81 (7), 905-917 (1999).
- Tsuchida, H., Hashimoto, J., Crawford, E., Manske, P., Lou, J. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats. Journal of Orthopaedic Research. 21 (1), 44-53 (2003).
- Jiang, H., et al. Novel standardized massive bone defect model in rats employing an internal eight-hole stainless steel plate for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2162-2171 (2018).
- Baltzer, A. W., et al. Genetic enhancement of fracture repair: Healing of an experimental segmental defect by adenoviral transfer of the BMP-2 gene. Gene Therapy. 7 (9), 734-739 (2000).
- Li, Y., et al. Bone defect animal models for testing efficacy of bone substitute biomaterials. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (3), 95-104 (2015).
